JPH0822234B2

JPH0822234B2 - Ｌ−バリンの製造法

Info

Publication number: JPH0822234B2
Application number: JP10167787A
Authority: JP
Inventors: 真人寺沢; 昭一奈良; 恵子小浜; 真樹子福島; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1987-04-24
Filing date: 1987-04-24
Publication date: 1996-03-06
Anticipated expiration: 2011-03-06
Also published as: JPS63267285A

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は、酵素反応による新規なＬ−バリンの製造法
に関するものである。

本発明によれば、高収量で能率よくＬ−バリンを製造
することができる。

Ｌ−バリンは、必須アミノ酸の一つとして人間及び動
物の栄養上重要な役割をするもので、医薬、食品、飼料
添加剤等の需要が近年急激に増加している。

先行技術Ｌ−バリンの工業的製法としては、他のアミノ酸の場
合と同様に立体異性体が存在するので、化学合成法では
Ｌ−体のみの製造は困難となり、主として発酵法によつ
ている。

しかしながら、公知の発酵法によるＬ−バリンの製造
では、Ｌ−バリンの蓄積に限界があり、新たな観点でＬ
−バリンを著量生成させる方法の提供が求められてい
る。

発明の要旨本発明は、ビオチン要求性のブレビバクテリウム（Br
evibacterium）属に属する微生物菌体を、グルコースを
含有する水溶液にて酵素反応させて該溶液中にＬ−バリ
ンを生成せしめ、これからＬ−バリンを採取することを
特徴とするＬ−バリンの製造法を提供するものである。

発明の効果本発明によれば、グルコースを含有する水溶液中で、
ビオチン要求性のブレビバクテリウム属に属する微生物
菌体を酵素源として用いて酵素反応させると、該水溶液
中にＬ−バリンが生成し、高収量で得られる。

本発明の方法は酵素法であり、従来の発酵法に比較
し、グルコースを含有する水溶液としてグルコースを含
有する完全合成培地を使用した場合でも、発酵法で必要
とされる培地の滅菌等の煩雑な操作が必要でないので生
産管理が大巾に容易になるなど、工業的に効率よくＬ−
バリンが製造できる。

発明の具体的説明本発明の方法は、微生物菌体の増殖を全く伴わない条
件下にＬ−バリンを製造する、酵素反応のみによるＬ−
バリンの製造法を提供するものであり、この様な方法は
従来全く知られていない新規な方法である。

本発明に使用される微生物は、ビオチン要求性のブレ
ビバクテリウム（Brevibacterium）属に属するものであ
り、好ましくはエタノール資化性のものである。このな
かにはＬ−イソロイシン生産菌が含まれる。本発明に使
用される微生物菌体としては例えば、ブレビバクテリウ
ム・フラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233（FERM
BP−1497）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibac
terium flavum）MJ−233−AB−41（FERMBP−1498）、ブ
レビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavu
m）MJ−233−ABT−11（FERMBP−1500）及びブレビバク
テリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233
−ABD−21（FERMBP−1499）等であり、これらの菌が本
発明に好適に用いられる。

なお、上記の（FERMBP−1498）は、（FERMBP−1497）
を親株としてDL−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付与さ
れたエタノール資化性微生物である（特公昭59−28398
号公報３〜４欄参照）。（FERMBP−1500）は、（FERM B
P−1497）を親株としたＬ−α−アミノ酪酸トランスア
ミナーゼ高活性変異株である（特願昭60−190609号明細
書３〜５頁参照）。また、（FERM BP−1499）は（FERM
BP−1497）を親株としたＤ−α−アミノ酪酸デアミナー
ゼ高活性変異株である（特開昭61−177993号公報参
照）。

これらの微生物菌体の他にブレビバクテリウム・アン
モニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）ATCC 6
871、同ATCC 13745、同ATCC 13746、ブレビバクテリ
ウム・デバリカタム（Brevibacterium divaricatum）AT
CC 14020等を用いることもできる。

本発明に用いられるビオチン要求性のブレビバクテリ
ウム属に属する微生物菌体は、微生物菌体そのままで用
いることもできるし、又これらを公知の手法で固定化し
た固定化物を使用することもできる。この固定化手法と
しては、菌体をアクリルアミド等の重合性モノマーを用
いたり、アルギン酸塩あるいはカラギーナン等の適当な
担体に不溶化させる等がある。

本発明の方法に使用される上記のビオチン要求性のブ
レビバクテリウム属に属する微生物菌体の調製に使用す
る培地は、特に限定されるものではなく一般の微生物に
使用されるものでよい。中でも好ましいものは、エタノ
ールを主炭素源とする培地である。

本発明に使用する微生物菌体の調製に使用する培地の
窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等を単独若しくは
混合して用いることが出来る。

無機塩としては、リン酸一水素カリウム、リン酸二水
素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他
に菌の生育及びＬ−イソロイシン生成に必要であれば、
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリ
カー、カザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添
加し用いる。

培養は通気撹拌、振盪等の好気的条件下で行い、培養
温度は20〜40℃、好ましくは25〜35℃で行う。培養途中
のpHは５〜10、好ましくは７〜８付近にて行い、培養中
のpHの調整には酸、アルカリを添加して行う。

培養開始時のグルコース濃度は好ましくは１〜５重量
％、更に好ましくは２〜３重量％が適する。培養期間は
0.5〜３日間、最適期間は１〜２日間である。

このようにして得られた培養物から菌体を集めて、水
又は適当な緩衝液で洗浄し、本発明の方法の酵素反応に
使用する。

本発明の方法においては、上記で調製された微生物菌
体（ここには、その固定化物も含まれる）の存在下、少
なくともグルコースを含有する水溶液にて酵素反応させ
る。ここで該水溶液に添加されるグルコースの濃度は0.
5〜20重量％、好ましくは１〜10重量％である。

該水溶液は、上記の様にグルコースを含有する水ある
いはリン酸又はトリス塩酸等の緩衝液を用いることもで
きるが、好ましくはグルコースを含有する完全合成培地
が用いられる。ここで完全合成培地とは、化学構造が公
知の無機窒素源及び／又は無機塩を含有する水溶液であ
る。本発明に用いられる完全合成培地の無機窒素源とし
ては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等が例示で
き、また無機塩としては、リン酸一水素カリウム、リン
酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、
硫酸鉄等が例示される。これらの無機窒素源、無機塩
は、単独でも２種以上混合して用いることもできる。

これら無機窒素源及び／又は無機塩の水溶液としての
濃度は、通常の微生物菌体の培養に使用される培地と同
程度の範囲でよく、特に限定されない。

完全合成培地の一例を示すと、（NH₄）₂SO₄ 2g/;K
H₂PO₄ 0.5g/;K₂HPO₄ 0.5g/;MgSO₄・7H₂O 0.5g/
;FeSO₄・7H₂O 20ppm;MnSO₄・４〜6H₂O 20ppm含有す
るpH7.6の水溶液がある。

上述の様に、本発明に使用される完全合成培地には、
ビオチン又はビオチンを含む天然物は含有されない。ビ
オチンの含有されないことの明らかな化学構造公知のア
ミノ酸、ビタミン、糖類等は添加することはできる。

本発明の方法において使用される、上記の様に調製さ
れた微生物菌体の使用量は、特に制限されるものではな
いが、一般に１〜50％（wt/vol）の濃度で使用すること
ができる。

本発明において、酵素反応は、約20〜約50℃、好まし
くは約30〜約40℃の温度で、通常約10〜約72時間行われ
る。

上記酵素反応は、反応に用いられるグルコースを含有
する水溶液、好ましくは上述のグルコースを含有する完
全合成培地、中の溶存酸素濃度が0.05ppm以上、8ppm以
下となる様に、反応系中に空気もしくは酸素を、連続又
は間歇的に供給して行うのが好ましい。

上記のような反応方法によつて得られる反応液中に生
成したＬ−バリンの分離・精製は、発酵法によるアミノ
酸の分離・精製と同様に行え、例えば公知のイオン交換
樹脂処理法あるいは、沈殿法等により行うことができ
る。

実験例以下の実験例において、Ｌ−バリンの定性は、ペーパ
ークロマトグラフのRf値、電気泳動法の移動度、微生物
定量法による生物活性値により確認した。定量はロイコ
ノストツク・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenter
oides）ATCC 8042を用いるマイクロバイオアツセイ法
と高速液体クロマトグラフイー（島津LC−5A）とを併用
して行つた。また、下記の実験例において％と表したの
は重量％を意味する。

実施例−１培地（尿素0.4％、硫酸アンモニウム1.4％、KH₂PO₄
0.05％、K₂HPO₄ 0.05％、MgSO₄・7H₂O 0.05％、CaCl₂・
2H₂O 2ppm、FeSO₄・7H₂O 2ppm、MnSO₄・４〜6H₂O 2pp
m、ZnSO₄・7H₂O 2ppm、NaCl 2ppm、ビオチン200μg/
、チアミン・HCl 100μg/、カザミノ酸0.1％、酵
母エキス0.1％）100mlを500ml容三角フラスコに分注、
滅菌（滅菌後pH7.0）した後ブレビバクテリウム・フラ
バム（Brevibacterium flavum）MJ−233（FERM BP−149
7）を植菌し、無菌的にグルコースを5g/の濃度になる
ように加え、30℃にて２日間振盪培養を行つた。

次に、本培養培地（グルコース５％、硫酸アンモニウ
ム2.3％、KH₂PO₄0.05％、K₂HPO₄0.05％、MgSO₄・7H₂O
0.05％、FeSO₄・7H₂O 20ppm、MnSO₄・nH₂O 20ppm、ビ
オチン200μg/、チアミン・HCl 100μg/、カザミノ
酸0.3％、酵母エキス0.3％）の1000mlを２容通気撹拌
槽に仕込み、滅菌（120℃、20分間）後、前記前培養物
の20mlを添加して、回転数1000rpm、通気量1vvm、温度3
3℃、pH7.6にて24時間培養を行つた。

培養終了後、培養物500mlから遠心分離にて集菌後、
脱塩蒸留水にて２度洗浄した菌体を反応液〔（NH₄）₂SO
₄ 2g/;KH₂PO₄ 0.5g/;KH₂PO₄ 0.5g/;MgSO₄・7H
₂O 0.5g/;FeSO₄・7H₂O 20ppm;MnSO₄・４〜6H₂O 20
ppm;チアミン−塩酸 100μg/；（pH7.6）〕の1000ml
に懸濁後、該懸濁液を２容通気撹拌槽に仕込み、グル
コース20gを添加して、回転数300rpm、通気量0.1vvm、
温度33℃、pH7.6にて24時間反応を行つた。

反応終了後、遠心分離（4000rpm、15分間、４℃）に
て除菌した上清液中のＬ−バリンを定量した。

この反応終了後の培養液500mlを、強酸性陽イオン交
換樹脂（H⁺型）のカラムに通してＬ−バリンを吸着さ
せ、水洗後、0.5Nアンモニア水で溶出させたのち、Ｌ−
バリン画分を濃縮し、冷エタノールでＬ−バリンの結晶
を析出させた。結果を後に掲げる第１表に示した。

実施例−２実施例−１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233−AB−41（FE
RM BP−1498）を培養し、また実施例−１と同様の条件
にて反応させた後上清液中のＬ−バリンを定量した。ま
た、実施例−１と同様にしてＬ−バリンの結晶を析出さ
せた。結果は第２表に示した。

実施例−３実施例−１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233−ABT−11（F
ERM BP−1500）を培養し、また実施例−１と同様の条件
にて反応させた後上清液中のＬ−バリンを定量した。ま
た、実施例−１と同様にしてＬ−バリンの結晶を析出さ
せた。

結果は第３表に示した。

実施例−４実施例−１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233−ABD−21（F
ERM BP−1499）を培養し、また実施例−１と同様の条件
にて反応させた後上清液中のＬ−バリンを定量した。ま
た、実施例−１と同様にしてＬ−バリンの結晶を析出さ
せた。

結果を第４表に示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者福島真樹子茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号三菱油化株式会社中央研究所内 (72)発明者湯川英明茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号三菱油化株式会社中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ビオチン要求性のブレビバクテリウム（Br
evibacterium）属に属する微生物菌体を、グルコースを
含有する水溶液にて酵素反応させて該溶液中にＬ−バリ
ンを生成せしめ、これからＬ−バリンを採取することを
特徴とするＬ−バリンの製造法。
【請求項２】水溶液が完全合成培地である特許請求の範
囲第１項記載の方法。