JPH04356194A

JPH04356194A - Ｌ−リジンの製造法

Info

Publication number: JPH04356194A
Application number: JP2772191A
Authority: JP
Inventors: Masato Terasawa; 真人寺沢; Miki Ikuta; ミキ生田; Hideaki Yugawa; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Priority date: 1991-01-30
Filing date: 1991-01-30
Publication date: 1992-12-09

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】【０００１】【産業上の利用分野】本発明は、酵素反応により高収量
で効率よくＬ−リジンを製造する方法に関するものであ
る。Ｌ−リジン、は必須アミノ酸の一つとして人間およ
び動物の栄養上重要な役割をするものであり、医薬、食
品、飼料添加剤等の需要が近年急激に増加している。【０００２】【従来の技術】Ｌ−リジンの工業的製法としては、他の
アミノ酸の場合と同様に立体異性体が存在するので、化
学合成法ではＬ−体のみの製造は困難であり、主として
発酵法によっている。しかしながら、公知の発酵法によ
るＬ−リジンの製法では、対糖収率が低いことや、Ｌ−
リジンの蓄積に限界があるため、新たな観点でＬ−リジ
ンを効果的に生成させる方法の提供が強く望まれていた
。本発明者らは、先に特定の微生物菌体をグルコースを
含有する水溶液にて酵素反応させることにより、高収量
でＬ−リジンを製造する方法を提案した（特開平２−４
２９９５公報参照）。【０００３】【発明が解決しようとする課題】本発明は上記の酵素法
によるＬ−リジンの製造をさらに効率的に行う方法を提
供しようとするものである。【０００４】【課題を解決するための手段】本発明は、ビオチン要求
性およびＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（
以下これを「ＡＥＣ」と称す）耐性を有し、コリネ型細
菌に属する微生物菌体の存在下、グルコースを含有する
水溶液にて酵素反応させて該溶液中にＬ−リジンを生成
せしめるに際し、該微生物菌体としてエタノールを主炭
素源とする培地で培養されたものを用いることを特徴と
するＬ−リジンの製造法を提供するものである。【０００５】本発明に使用される微生物は、ビオチン要
求性及びＡＥＣ耐性を有し、コリネ型細菌に属するもの
である。具体的には、例えばブレビバクテリウム・フラ
バム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）
ＭＪ−２３３−Ｌ−１１（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１００９４
、以下ＭＪ−２３３−Ｌ−１１と記す）、ブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ−２３３−Ｌ−１２（ＦＥＲＭ　
　Ｐ−１００９５、以下ＭＪ−２３３−Ｌ−１２と記す
）を挙げることができる。なお、これら微生物は、ブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ　　
ＢＰ−１４９７、以下ＭＪ−２３３と記す）を親株とし
て、ＡＥＣ耐性を積極的に付与されたものである。【０００６】本発明に使用されるビオチン要求性及びＡ
ＥＣ耐性を有するコリネ型細菌に属する微生物は、微生
物菌体そのままでも、また公知の手法で固定化したもの
でも用いることができる。固定化手法としては、例えば
菌体をアクリルアミド等の重合性モノマーにより固定化
する方法、アルギン酸塩またはカラギーナン等の適当な
担体に不溶化させる方法等がある。【０００７】本発明で使用されるＡＥＣ耐性変異株は、
次の操作により得ることができる。紫外線照射または化
学的薬剤（例えばＮ−メチル−Ｎ’−Ｎ−ニトロソグア
ニジン）処理によりＬ−リジン生産菌株への変異を誘起
させた後、この菌懸濁液をＡＥＣ及びＬ−スレオニンを
含有する平板培地（尿素０．２％、硫安０．７％、ＫＨ
２ＰＯ４　　０．０５％、Ｋ２ＨＰＯ４　　０．０５％
、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．０５％、ＦｅＳＯ４・７
Ｈ２Ｏ　　６ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ　　
６ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　６ｍｇ／ｌ、ビ
オチン２００μｇ／ｌ、チアミン塩酸塩１００μｇ／ｌ
、ＡＥＣ２ｇ／ｌ、Ｌ−スレオニン１．２ｇ／ｌ、寒天
２．０ｇ／ｌ、グルコース２％）に滅菌後添加し、３０
℃にて数日間培養し、生じた大コロニーを分離すること
により、耐性変異株を得る。（なお、上記の％表示は特記しない限り、ｗｔ／ｖｏｌ
％を意味する。以下同じ。）【０００８】このようにして得られる代表的な耐性変異
株である前記ＭＪ−２３３−Ｌ−１１およびＭＪ−２３
３−Ｌ−１２と、その親株であるＭＪ−２３３のＡＥＣ
に対する相対生育度を第１表に示す。【０００９】【表１】　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　第１表　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　相　　対　　生　　
育　　度＊　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　ＡＥＣ添加量　　　　　　　　親株　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　ＡＥＣ耐性株　　　　ｍｇ
／ｍｌ　　　　　　　　ＭＪ２３３　　　　　　　　　
　　　ＭＪ２３３−Ｌ−１１　　　　　　　　ＭＪ２３
３−Ｌ−１２　　　　　　　　　　０　　　　　　　　
　　　　　　１００　　　　　　　　　　　　１００　
　　　　　　　　　　　１００　　　　　　０．４　　
　　　　　　　　　　　８０　　　　　　　　　　　　
１００　　　　　　　　　　　　１００　　　　　　１
．０　　　　　　　　　　　　　６０　　　　　　　　
　　　　１００　　　　　　　　　　　　　　９０　　
　　　　２．０　　　　　　　　　　　　　３５　　　
　　　　　　　　　　　８０　　　　　　　　　　　　
　　８０　　　　　　４．０　　　　　　　　　　　　
　２０　　　　　　　　　　　　　　６５　　　　　　
　　　　　　　　６０　　　　　　　【００１０】（注−１）＊相対生育度＝［（ＡＥＣ添加時の生育度Ｏ．Ｄ６１０
）÷（ＡＥＣ無添加時の生育度Ｏ．Ｄ６１０）］×１０
０として求めた値である。なお、生育度Ｏ．Ｄ６１０は
「実験農芸化学」上巻、２１２頁、朝倉書店刊）に基づ
いて測定した。【００１１】（注−２）使用した培地組成および培養方
法は次の通り。培地組成：尿素０．２％、硫安０．７％、ＫＨ２ＰＯ４
　　０．０５％、Ｋ２ＨＰＯ４　　０．０５％、ＭｇＳ
Ｏ４・７Ｈ２Ｏ　　０．０５％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
　　６ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ　　６ｍｇ
／ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　６ｍｇ／ｌ、ビオチン
２００μｇ／ｌ、チアミン塩酸塩１００μｇ／ｌ、ＡＥ
Ｃは第１表に示す量。【００１２】培養方法：上記培地１０ｍｌを２４φ大型
試験管に分注し、１２０℃で１０分間滅菌した後、かく
菌株を各々接種し、グルコースを無菌条件下に２％添加
し、３０℃で２０時間振盪培養をおこなった。なお、本
発明におけるＡＥＣ耐性株またはＡＥＣに耐性を有する
微生物とは、ＡＥＣ　　０．２％を上記培地に加え、３
０℃で２０時間振盪したときの相対生育度が８０以上の
ものと定義する。【００１３】本発明の方法に使用されるビオチン要求性
およびＡＥＣ耐性を有し、コリネ型細菌に属する微生物
菌体の調製に用いられる培地は、特に限定されるもので
はなく一般の微生物に使用されるものでよい。培地の窒
素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等を単独または混
合して用いることができる。【００１４】無機塩としては、リン酸一水素カリウム、
リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられ
る。この他に、菌の生育およびＬ−リジン生成に必要で
あれば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステ
ィ−プリカー、カザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を
培地に添加してもよい。【００１５】培養は通気撹拌、振盪等の好気的条件下で
行い、培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５
℃である。培養中のｐＨは５〜１０、好ましくは７〜８
付近であり、その調節は酸またはアルカリを添加して行
われる。【００１６】上記微生物の培養においてエタノールを培
地の主炭素源として用いることが重要である。エタノー
ルの濃度は、培養開始時において０．５〜３容量％、好
ましくは１〜２．５容量％である。培養期間は０．５〜
３日間、最適期間は１〜２日間である。このようにして
得られた培養物から菌体が集められ、これを水または適
当な緩衝液で洗浄することにより、つぎの酵素反応に使
用される微生物菌体が得られる。【００１７】本発明においては、上記で調製された微生
物菌体自体またはその固定化物の存在下に、少なくとも
グルコースを含有する水溶液にて酵素反応が行われる。その際、該水溶液に添加されるグルコースの濃度は０．
５〜２０重量％，好ましくは１〜１０重量％である。【００１８】該水溶液は、上記のようにグルコースを含
有する水、またはリン酸あるいはトリス塩酸等の緩衝液
を用いることもできるが、好ましくはグルコースを含有
する完全合成培地が用いられる。ここで完全合成培地と
は、化学構造が公知の無機窒素源および／または無機塩
を含有する水溶液のことである。【００１９】完全合成培地の無機窒素源としては、アン
モニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム等を、また無機塩とし
ては、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、
硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸鉄等を例示する
ことができる。これら無機窒素源および無機塩は単独ま
たは混合して用いることができる。【００２０】これら無機窒素源および／または無機塩の
水溶液としての濃度は、通常の微生物菌体の培養に使用
されるものと同程度の範囲でよく、特に限定されない。完全合成培地の一例を示すと、（ＮＨ４）２ＳＯ４　　
２ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４０．５ｇ／ｌ；Ｋ２ＨＰＯ４　
　０．５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　０．５ｇ／
ｌ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　２０ｐｐｍ；ＭｎＳＯ４
・４〜６Ｈ２Ｏ　　２０ｐｐｍを含有する、ｐＨ７．６
の水溶液である。、【００２１】上記のように、本発明
に使用される完全合成培地は、ビオチンまたはビオチン
を含む天然物は含有されない。ビオチンを含有しないア
ミノ酸、ビタミン、糖類等は添加することができる。【００２２】本発明の酵素反応における微生物菌体の使
用量は、特に制限されるものではないが、一般に１〜５
０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の濃度で使用することもがきる。酵素反応は、約２０〜５０℃、好ましくは約３０〜４０
℃の温度で通常約１０〜７２時間行われる。酵素反応は
、反応に用いられるグルコースを含有する水溶液、好ま
しくはグルコースを含有する完全合成培地中の溶存酸素
濃度が０．０５ｐｐｍ以上、８ｐｐｍ以下となるように
反応系中に空気または酸素を、連続または間歇的に供給
して行うのが好ましい。【００２３】上記の方法により得られる反応液中に生成
したＬ−リジンの分離、精製は、発酵法におけるアミノ
酸の分離、精製と同様の方法、例えば公知のイオン交換
処理法または沈殿法等により行うことができる。【００２４】【実施例】実験例以下の実験例において、Ｌ−リジンの定性はペーパーク
ロマトグラフのＲｆ値、微生物定量法による生物活性値
により確認した。定量はマイクロバイオアッセイ法と高
速度液体クロマトグラフィー（島津ＬＣ−５Ａ）とを併
用して行った。また、下記の実施例において、％は特記
しないかぎりいずれもｗｔ／ｖｏｌ％を意味する。【００２５】実施例−１培地（尿素０．４％、硫安１．４％、ＫＨ２ＰＯ４　　
０．０５％、Ｋ２ＨＰＯ４０．０５％、ＭｇＳＯ４・７
Ｈ２Ｏ　　０．０５％、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　　２ｐ
ｐｍ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　２ｐｐｍ、ＭｎＳＯ４・
４〜６Ｈ２Ｏ　　２ｐｐｍ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　
２ｐｐｍ、ＮａＣｌ　　２ｐｐｍ、ビオチン２００μｇ
／ｌ、チアミン塩酸塩　　１００μｇ／ｌ、カザミノ酸
　　０．１％、酵母エキス　　０．１％）１００ｍｌを
５００ｍｌ容三角フラスコに分注、滅菌し、ｐＨ７に調
節した後、ＭＪ−２３３−Ｌ−１１を植菌し、無菌的に
エタノールを２０ｍｌ／ｌの濃度になるように加え、３
０℃にて２日間振盪培養を行った。【００２６】次に、本培養培地（エタノール２（ｖ／ｖ
）％，硫安２．３％、ＫＨ２ＰＯ４０．０５％、Ｋ２Ｈ
ＰＯ４０．０５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　０．０５
％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　２０ｐｐｍ、ＭｎＳＯ４・
４〜６Ｈ２Ｏ　　２０ｐｐｍ、ビオチン　　２００μｇ
／ｌ、チアミン塩酸塩　　１００μｇ／ｌ、カザミノ酸
　　０．３％、酵母エキス　　０．３％）１０００ｍｌ
を２ｌ容通気撹拌槽に仕込み、滅菌（１２０℃、２０分
間）後、上記前培養物の２０ｍｌを添加して、回転数１
０００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍ、温度３３℃、ｐＨ７．
６にて２４時間培養を行った。なお、エタノールは２（
ｖ／ｖ）％を越えないように逐次添加し、総量で８（ｖ
／ｖ）％添加した。【００２７】培養終了後、培養物５００ｍｌから遠心分
離にて集菌後、脱塩蒸留水にて二度洗浄した菌体を反応
液（硫安２ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４０．０５ｇ／ｌ、Ｋ２
ＨＰＯ４０．０５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　０
．５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　２０ｐｐｍ、Ｍｎ
ＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ　　２０ｐｐｍ、チアミン塩酸塩
　　１００μｇ／ｌ、ｐＨ７．６）１０００ｍｌに懸濁
後、これを２ｌ容通気撹拌槽に仕込み、グルコース９ｇ
を添加して、回転数３００ｒｐｍ、通気量０．１ｖｖｍ
、温度３３℃；ｐＨ７．６にて２４時間酵素反応を行っ
た。【００２８】反応終了後、遠心分離（４０００ｒｐｍ、
１５分間、４℃）にて除菌した上清液中のＬ−リジンを
定量した。さらに該上清液中の残存グルコース量を定量
装置（東亜電波工業製、グルコース自動分析装置ＧＬＵ
−１）により定量した。結果を第２表に示す。また、比
較のために、微生物培養時の培地中の主炭素源をグルコ
ース５％とした以外は上記と同様に行い、その結果を比
較例として第２表に示す。【００２９】【表２】　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　第２表　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｌ−リ
ジン生成量　　　　　　対グルコース収率　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　（ｇ／ｌ）　　　　　　
　　　　　　相対値＊（％）　　　　実施例　　　　　
　　　　　　　　　４．６　　　　　　　　　　　　　
　　　　　１２５　　比較例　　　　　　　　　　　　
　　４．４　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０
０　　　　　　　　　　＊：比較例を１００とする相対
値【００３０】実施例−２微生物菌体として、ＭＪ−２３３−Ｌ−１２を用いた以
外は実施例−１と同様に培養、酵素反応を行い、その結
果を第３表に示す。【００３１】【表３】　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　第３表　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｌ−リ
ジン生成量　　　　　　対グルコース収率　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　（ｇ／ｌ）　　　　　　
　　　　　　相対値＊（％）　　　　実施例　　　　　
　　　　　　　　　４．５　　　　　　　　　　　　　
　　　　　１２７　　比較例　　　　　　　　　　　　
　　４．０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０
０　　　　　　　　　　＊：比較例を１００とする相対
値【００３２】【発明の効果】本発明によれば、ビオチン要求性を有し
かつＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性を
有するコリネ型細菌に属する微生物菌体をエタノールが
主炭素源である培地にて培養し、これを酵素源として用
いてグルコースを含有する水溶液中で酵素反応を行うこ
とにより、該水溶液中にＬ−リジンが高収量で生成し、
対グルコース収率が大幅に向上される。【００３３】また、本発明の方法は、グルコース含有水
溶液としてグルコースを含有する完全合成培地を使用し
た場合でも、従来の発酵法で必要とされる培地の滅菌操
作等が不要であり、生産管理が大幅に容易になるなど、
工業的に効率よくＬ−リジンを製造することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　ビオチン要求性およびＳ−（２−アミ
ノエチル）−Ｌ−システイン耐性を有し、コリネ型細菌
に属する微生物菌体の存在下、グルコースを含有する水
溶液にて酵素反応させて該溶液中にＬ−リジンを生成せ
しめるに際し、該微生物菌体としてエタノールを主炭素
源とする培地で培養されたものを用いることを特徴とす
るＬ−リジンの製造法。