JPH04293492A - Ｌ−バリンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酵素反応により高収量
で効率よくＬ−バリンを製造する方法に関するものであ
る。Ｌ−バリン、は必須アミノ酸の一つとして人間およ
び動物の栄養上重要な役割をするものであり、医薬、食
品、飼料添加剤等の需要が近年急激に増加している。

【０００２】

【従来の技術】Ｌ−バリンの工業的製法としては、他の
アミノ酸の場合と同様に立体異性体が存在するので、化
学合成法ではＬ−体のみの製造は困難であり、主として
発酵法によっている。しかしながら、公知の発酵法によ
るＬ−バリンの製法では、対糖収率が低いことや、Ｌ−
バリンの蓄積に限界があるため、新たな観点でＬ−バリ
ンを効果的に生成させる方法の提供が強く望まれていた
。本発明者らは、先にビオチン要求性のコリネ型細菌に
属する微生物をグルコースを含有する水溶液にて酵素反
応させることにより、高収量でＬ−バリンを製造する方
法を提案した（特開昭６３−２６７２８５号公報参照）
。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記の酵素法
によるＬ−バリンの製造をさらに効率的に行う方法を提
供しようとするものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、ビオチン要求
性のコリネ型細菌に属する微生物菌体を、グルコースお
よび窒素源を含有する水溶液にて酵素反応させて該溶液
中にＬ−バリンを生成せしめるに際し、該溶液中にＬ−
乳酸あるいはその塩、またはＤＬ−乳酸あるいはその塩
を存在させることを特徴とするＬ−バリンの製造法を提
供するものである。

【０００５】本発明の方法は、微生物菌体の増殖を全く
伴わない条件下に、Ｌ−バリンを製造する酵素反応のみ
によるＬ−バリンの製造法である。本発明に使用される
微生物は、ビオチン要求性のコリネ型細菌に属するもの
であり、好ましくはエタノール資化性のものである。こ
の中には、Ｌ−バリン生産菌が含まれる。

【０００６】微生物菌体の具体例としては、例えばブレ
ビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ　　ＢＰ
−１４９７）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２
３３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１４９８）、ブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＴ−１
１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１５００）、ブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＤ−２１（ＦＥＲＭＰ
−１４９９）を挙げることができる。

【０００７】なお、上記（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１４９８
）は（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１４９７）を親株としてＬ−
α−アミノ酪酸耐性を積極的に付与されたエタノール資
化性微生物であり（特公昭５９−２８３９８号公報）、
（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１５００）は（ＦＥＲＭ　　ＢＰ
−１４９７）を親株としたＬ−α−アミノ酪酸トランス
アミナーゼ高活性変異株である（特開昭６２−５１９９
８号公報）。また、（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１４９９）は
（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１４９７）を親株としたＤ−α−
アミノ酪酸デアミナーゼ高活性変異株である（特開昭６
１−１７７９９３号公報）。これらの微生物菌体の他に
、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴ
ＣＣ　６８７１，同ＡＴＣＣ　１３７４５、同ＡＴＣＣ
　１３７４６、ブレビバクテリウム・デバリカタム（Ｂ
ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ
）ＡＴＣＣ　１４０２０等を用いることもできる。

【０００８】本発明に使用されるビオチン要求性のコリ
ネ型細菌に属する微生物は、微生物菌体そのままでも、
また公知の手法で固定化したものでも用いることができ
る。固定化手法としては、例えば菌体をアクリルアミド
等の重合性モノマーにより固定化する方法、アルギン酸
塩またはカラギーナン等の適当な担体に不溶化させる方
法等がある。

【０００９】本発明で使用されるビオチン要求性のコリ
ネ型細菌に属する微生物菌体の調製に用いられる培地は
、特に限定されるものではなく一般の微生物に使用され
るものでよい。培地の窒素源としては、アンモニア、硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム
、尿素等を単独または混合して用いることができる。

【００１０】無機塩としては、リン酸一水素カリウム、
リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられ
る。この他に、菌の生育およびＬ−バリン生成に必要で
あれば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステ
ィ−プリカー、カザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を
培地に添加してもよい。

【００１１】培養は通気撹拌、振盪等の好気的条件下で
行い、培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５
℃である。培養中のｐＨは５〜１０、好ましくは７〜８
付近であり、その調節は酸またはアルカリを添加して行
われる。

【００１２】培養開始時のグルコース濃度は、好ましく
は１〜５（ｗｔ／ｖｏｌ）％、さらに好ましくは２〜３
（ｗｔ／ｖｏｌ）％である。培養期間は０．５〜３日間
、最適期間は１〜２日間である。このようにして得られ
た培養物から菌体が集められ、これを水または適当な緩
衝液で洗浄することにより、つぎの酵素反応に使用され
る微生物菌体が得られる。

【００１３】本発明においては、上記で調製された微生
物菌体自体またはその固定化物の存在下に、少なくとも
グルコースおよび窒素源を含有する水溶液にて酵素反応
させるに際し、該溶液中にＬ−あるいはＤＬ−乳酸また
はその塩を０．１〜４（ｗｔ／ｖｏｌ）％、好ましくは
０．５〜２（ｗｔ／ｖｏｌ）％存在させることが重要で
ある。乳酸に塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、
カルシウム塩、アンモニウム塩等が用いられる。

【００１４】該水溶液は、通常完全合成培地が用いられ
るが、ここで完全合成培地とは、化学構造が公知の無機
窒素源および／または無機塩を含有する水溶液のことで
ある。完全合成培地の無機窒素源としては、アンモニア
、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニ
ウム、リン酸アンモニウム等を、また無機塩としては、
リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マ
グネシウム、硫酸マンガン、硫酸鉄等を例示することが
できる。これら無機窒素源および無機塩は単独または混
合して用いることができる。

【００１５】これら無機窒素源および／または無機塩の
水溶液としての濃度は、通常の微生物菌体の培養に使用
されるものと同程度の範囲でよく、特に限定されない。 完全合成培地の一例を示すと、（ＮＨ４）２ＳＯ４　　
２３ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４０．５ｇ／ｌ；Ｋ２ＨＰＯ４
　　０．５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　０．５ｇ
／ｌ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　２０ｐｐｍ；ＭｎＳＯ
４・４〜６Ｈ２Ｏ　　２０ｐｐｍを含有する、ｐＨ７．
６の水溶液である。上記のように、本発明に使用される
完全合成培地は、ビオチンまたはビオチンを含む天然物
は含有されない。ビオチンを含有しないアミノ酸、ビタ
ミン、糖類等は添加することができる。

【００１６】本発明の酵素反応における微生物菌体の使
用量は、特に制限されるものではないが、一般に１〜５
０（ｗｔ／ｖｏｌ）％の濃度で使用することもがきる。 酵素反応は、約２０〜５０℃、好ましくは約３０〜４０
℃の温度で通常約１０〜７２時間行われる。酵素反応は
、反応に用いられるグルコースおよび窒素源を含有する
水溶液中の溶存酸素濃度が０．０５ｐｐｍ以上、８ｐｐ
ｍ以下となるように反応系中に空気または酸素を、連続
または間歇的に供給して行うのが好ましい。上記の方法
により得られる反応液中に生成したＬ−バリンの分離、
精製は、発酵法におけるアミノ酸の分離、精製と同様の
方法、例えば公知のイオン交換処理法または沈殿法等に
より行うことができる。

【００１７】

【実施例】実験例 以下の実験例において、Ｌ−バリンの定性はペーパーク
ロマトグラフのＲｆ値、微生物定量法による生物活性値
により確認した。定量は高速度液体クロマトグラフィー
（島津ＬＣ−５Ａ）にて行った。また、下記の実施例に
おいて、％は特記しないかぎりいずれも（ｗｔ／ｖｏｌ
）％を意味する。

【００１８】実施例−１ 培地（尿素０．４％、硫安１．４％、ＫＨ２ＰＯ４　　
０．０５％、Ｋ２ＨＰＯ４０．０５％、ＭｇＳＯ４・７
Ｈ２Ｏ　　０．０５％、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　　２ｐ
ｐｍ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　２ｐｐｍ、ＭｎＳＯ４・
４〜６Ｈ２Ｏ　　２ｐｐｍ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　
２ｐｐｍ、ＮａＣｌ　　２ｐｐｍ、ビオチン２００μｇ
／ｌ、チアミン塩酸塩　　１００μｇ／ｌ、カザミノ酸
　　０．１％、酵母エキス　　０．１％）１００ｍｌを
５００ｍｌ容三角フラスコに分注、滅菌し、ｐＨ７に調
節した後、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
を植菌し、無菌的にグルコースを５ｇ／ｌの濃度になる
ように加え、３０℃にて２日間振盪培養を行った。

【００１９】次に、本培養培地（グルコース５％，硫安
２．３％、ＫＨ２ＰＯ４　　０．０５％、Ｋ２ＨＰＯ４
０．０５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　０．０５％、Ｆ
ｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２０ｐｐｍ、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ
２Ｏ　　２０ｐｐｍ、ビオチン　　２００μｇ／ｌ、チ
アミン塩酸塩　　１００μｇ／ｌ、カザミノ酸　　０．
３％、酵母エキス　　０．３％）１０００ｍｌを２ｌ容
通気撹拌槽に仕込み、滅菌（１２０℃、２０分間）後、
上記前培養物の２０ｍｌを添加して、回転数１０００ｒ
ｐｍ、通気量１ｖｖｍ、温度３３℃、ｐＨ７．６にて２
４時間培養を行った。

【００２０】培養終了後、培養物１００ｍｌから遠心分
離にて集菌後、脱塩蒸留水にて二度洗浄した菌体を反応
液（グルコース１００ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４　０．０５
ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４０．０５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７
Ｈ２Ｏ　　０．５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　２０
ｐｐｍ、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ　　２０ｐｐｍ、チ
アミン塩酸塩　　１００μｇ／ｌ、ｐＨ８．０）５０ｍ
ｌに懸濁後、ＤＬ−乳酸ナトリウムを５ｇ／ｌの濃度で
添加して、反応を実施した。また、ｐＨ調整のため、乾
熱滅菌（１５０℃、５時間加熱）した炭酸カルシウムを
５０ｇ／ｌの濃度で添加した。反応は５００ｍｌの三角
フラスコを用い、３３℃、回転数２２０ｒｐｍにて４０
時間振とう反応を行った。反応終了後、遠心分離（４０
００ｒｐｍ、１５分間、４℃）にて除菌した上清液中の
Ｌ−バリンを定量した。結果を第１表に示す。

【００２１】

【表１】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　第１表　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　Ｌ−バリン生成量（ｇ／ｌ）　　　
　　　実施例　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　１．７　　比較例＊　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　０．８　　　　　　　　　　　　　　　　＊：ＤＬ
−乳酸ナトリウム無添加

【００２２】実施例−２ 微生物菌体として、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３−ＡＢ−４１を用いた以外は実施例−１と同様
に培養、酵素反応を行い、その結果を第２表に示す。

【００２３】

【表２】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　第２表　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　Ｌ−バリン生成量（ｇ／ｌ）　　　
　　　　　実施例　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　５．６　　比較例＊　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　２．５　　　　　　　　　　　　　　　　　　
＊：ＤＬ−乳酸ナトリウム無添加

【００２４】実施例−３ 微生物菌体として、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３−ＡＢＴ−１１を用いた以外は実施例−１と同
様に培養、酵素反応を行い、その結果を第３表に示す。

【００２５】

【表３】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　第３表　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　Ｌ−バリン生成量（ｇ／ｌ）　　　
　　　　　実施例　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　１．８　　比較例＊　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　０．９　　　　　　　　　　　　　　　　　　
＊：ＤＬ−乳酸ナトリウム無添加

【００２６】実施例−４ 微生物菌体として、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３−ＡＢＤ−２１を用いた以外は実施例−１と同
様に培養、酵素反応を行い、その結果を第４表に示す。

【００２７】

【表４】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　第４表　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　Ｌ−バリン生成量（ｇ／ｌ）　　　
　　　　　実施例　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　１．６　　比較例＊　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　０．８　　　　　　　　　　　　　　　　　　
＊：ＤＬ−乳酸ナトリウム無添加

【００２８】

【発明の効果】本発明によれば、ビオチン要求性のコリ
ネ型細菌に属する微生物菌体をグルコースおよび窒素源
を含有する水溶液中で酵素反応を行う際に、Ｌ−あるい
はＤＬ−乳酸またはその塩を添加することにより、該水
溶液中にＬ−バリンが高収量で生成し、対グルコース収
率が大幅に向上する。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ビオチン要求性のコリネ型細菌に属す
   る微生物菌体を、グルコースおよび窒素源を含有する水
   溶液にて酵素反応させて該溶液中にＬ−バリンを生成せ
   しめるに際し、該溶液中にＬ−乳酸あるいはその塩、ま
   たはＤＬ−乳酸あるいはその塩を存在させることを特徴
   とするＬ−バリンの製造法。