JPS62265988A - 発酵法によるｌ−アルギニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は発酵法によるＬ−アルギニンの製造法に関する
。Ｌ−アルギニンは医薬品、食品あるいは動物飼料その
他の広い分野で種々の用途を有する。

従来の技術 従来、コリネ型グルタミン酸生産菌を用いてＬ−アルギ
ニンを発酵法で生産する方法としては、アルギニンアナ
ログに耐性の菌株を使用する方法〔アグリカルチュラル
・バイオロジカル・ケミストリイ（Ａｇｒ、　　９ｉｏ
１．　Ｃｈｅｍ、＞　３６　、　１８７５（１９７２）
。

ジ丁−ナル・オブ・ジェネラル・アンド・アプライド・
ミクロハイオロジイ（Ｊ、　Ｇｅｎ、Ａｐｐ！、！わｃ
ｒｏｂｉｏｌ、　＞１９　、３３９（１９７３）および
特公昭４８−３３９１号公報〕、コリネバクテリウム属
に属し、ピリミジンアナログ耐性を有する微生物を用い
る方法（特公昭５７−５０４７９号公報）、Ｌ−アルギ
ニン生合成系に関与する遺伝子とベクターＤ　Ｎ　Ａと
の組換え体ＤＮＡを保有させた菌株を用いる方法（特開
昭６０−６６９８９号公報）、核酸またはアミノ酸要求
性と２−チアゾールアラニン耐性を併有する微生物を用
いる方法（特開昭５４−４４０９６号公報、特公昭５４
−３７２３５号公報）、ブレビバクテリウム属またはコ
リネバクテリウム属に属し、モノフルオロ酢酸に耐性を
有する微生物を用いる方法（特開昭５７−１８９８９号
公報）などが知られている。

発明が解決しようとする問題点 医薬品、食品、動物飼料など広い分野で利用されるＬ−
アルギニンを工業的により安価に製造する方法の開発が
望まれている。

問題点を解決するための手段 本発明者は、Ｌ−アルギニンの生産能の向上した菌株を
得るために研究を重ねた。その結果、単独では生育狙害
を示さない濃度のモノフルオロ酢酸およびアルギニンア
ナログ双方の存在下で生育阻害を示す菌株を変異処理し
て得られる上記の生育阻害を示さない菌株が、侵れたＬ
−アルギニン生産能を有することを見出し、本発明を完
成した。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明は、コリネ型グルタミン酸生産菌に属し、モノフ
ルオロ酢酸存在下でアルギニンアナログに対して耐性を
有しかつＬ−アルギニン生産能を有する微生物を培地に
培養し、培養物中にＬ−アルギニンを生成蓄積させ、該
培養物からＬ−アルギニンを採取することを特徴とする
発酵法によるＬ−アルギニンの製造法を提供する。

本発明で用いられる微生物は、コリネ型グルタミン酸生
産菌に属し、モノフルオロ酢酸存在下でアルギニンアナ
ログに耐性でかつＬ−アルギニン生産能を有する微生物
であればいずれも用いることができる。具体的な例とし
て、コリネバクテリＨ−４３１３，Ｈ−４３１４などが
あげられる。

本発明に用いられる親株としてはすでにＬ−アルギニン
を生産することが知られているコリネ型グルタミン酸生
産菌の変異株が用いられる。さらに下記に示したコリネ
型グルタミン酸生産菌の野生株も親株として使用できる
。

コリネバクテリウム・グルタミクム　　　　　　　　　
ＡＴＣＣ１３０３２コリネバクテリウム・アセトアシド
フィルム　　　　　ＡＴＣＣ１３８３７コリネバクテリ
ウム・リリウム　　　　　　　　　　　ＡＴＣＣ１５９
９０ブレビバクテリウム・フラバム　　　　　　　　　
　　ＡＴＣＣ１４０６７プレピバクテリウム・ラクトフ
ァーメンタム　　　　　ＡＴＣＣ１３８０９ブレビバク
テリウム・ディバリカラム　　　　　　　　ＡＴＣＣ１
４０２０コリネ型グルタミン酸生帝菌に属する微生物が
Ｌ−アルギニン生産能を有するためには、アルギニンハ
イドロキサメート、Ｄ−アルギニン、核酸アナログなど
の薬剤に対する耐性を付与させればよいことが知られて
いる。

本発明における変異株の誘導は、紫外線照射やＮ−メチ
ル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグアニジンなどによる
化学処理など、通常用いられる変異処理方法により行う
ことができる。

変異処理した菌株から本発明の変異株を分離するには単
独では生育阻害を示さない濃度のモノフルオロ酢酸およ
びアルギニンアナログ双方の存在下で生育阻害を示す濃
度の両薬剤を含む最少培地寒天平板上に生育する変異株
を取得すればよい。

本発明方法に使用する菌株の具体的に好適な例としては
、アルギニン生産菌コリネバクテリウムａｃｅｔｏａｃ
ｉｄｏｐｈｉｌｕ＋＋＋）　　Ｈ−４３１０（本菌株は
コリネバクテリウム・アセトアシドフィルムＡＴＣＣ１
３８７０を変異処理し、アルギニンハイドロキサメート
耐性、２−チアゾールアラニン耐性、６−アザウラシル
耐性を付与した菌株である）を親株とし、この親株を変
異処理して得られたモノフルオロ酢酸存在下でアルギニ
ンアナログに対して耐性を示す下記の菌株があげられる
。

Ｈ−４３１１ＭＦＡ”＋ＡｒｇＨｘ” Ｈ−４３１２ＭＦＡ”＋Ｄ−Ａｒｇ” Ｈ−４３１３ＭＦＡＲ＋ＣＢＺ−Ａｒｇ”Ｈ−４３１４
Ｎ ＭＦＡＲ：モノフルオロ酢酸耐性 ＡｒｇＨＸ”　　：アルギニンハイドロキサメート耐性 Ｄ−ＡｒｇＲ：Ｄ−アルギニン耐性 ＣＢＺ−ＡｒｇＲ：Ｎ−カルボベンゾキシアルギニン耐
性 上記親株および耐性変異株は、昭和６１年４月２３日付
で工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）にそれぞ
れＦＥＲＭ　　ＢＰ　　１０１４゜１０１５．１０１６
．１０１７．１０１８として寄託されている。

親株および耐性変異株をモノフルオロ酢酸およびアルギ
ニンアナログ（アルギニンハイドロキサメート、Ｄ−ア
ルギニン、Ｎ−カルボベンゾキシアルギニン）を含む最
少寒天平成（グルコース１０　ｇ／Ｌ塩化アンモニウム
１　ｇ／Ｌ尿素２ｇ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４１ｇ／Ｎ、に２
ＨＰ０゜３ｇ／ＣＭｇＣβ２　・２Ｈ２００，４ｇ＃２
゜Ｆｅ５ｏ４　・７Ｈ２０ｌ　Ｑ　ｍｇ　／　ｌ　、　
、　Ｍ　ｎ　Ｓ　Ｏ＋’４８２０１０ｍｇ／／！、Ｚｎ
Ｓ○、・７Ｈ，０１ｍｇ／ｊ２、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２０
１ｍｇ／ｊ２゜（ＮＨ４）６ＭＯ７０２４’　４８２０
　１ｍｇ／ｊ！、ビオチン５０■／Ｌ寒天２０ｇ／β、
ｐ　Ｈ７，２）上で２４時間培養したときの生育度を第
１表に示す。

第　　　１　　　表 濃　度　　　　生育度 Ｑ　　−＋＋　　＋＋　＋＋　＋＋ ５　□　↓＋　＋＋　　＋＋　　＋＋ 〇　　　　八ｒｇｆｌＸ　　ＩＱ　　　　　　　＋＋　
　　　　　　＋＋　　　　　　　十＋　　　　　　　＋
４５　　／／　　　−＋＋　　−− ０Ｄ−Ａｒｇ　　２Ｑ　　　　　　　＋＋　　　　　　
　＋＋　　　　　　↓＋　　　　　　十士５　〃　　−
−ふ＋　− ０ＣＢＺ　　Ａｒｇ　　１０　　　　　＋＋　　　　　
　↓＋　　　　　　＋＋＋＋５　　　ｔｔ　　　−−−
＋＋ −＋一本分十分育　　＋：生育　　−：非生育また、本
発明で得られた菌株は、Ｌ−アルギニン生合成系の鍵酵
素であるＮ−アセチルゲルタモキナーゼ活性が野生株に
比べ２００倍以上に上昇している。Ｌ−アルギニン生産
菌のＮ−アセチルゲルタモキナーゼ活性が、野生株に比
べて数倍に上昇した報告はある〔アグリカルチユラル・
バイオロジカル・ケミストリイ（Ａｇｒ、　Ｒｉｏｔ、
Ｃｈｅｍ、）４３（１）、　１０５〜１１Ｈ１９７９）
　）が、２００倍以上に上昇した例はない。

従って、本発明で用いられる菌株は、Ｎ−アセチルゲル
タモキナーゼ活性が野生株に比べ２００倍以上に上昇し
た菌株としても取得することができる。Ｎ−アセチルゲ
ルタモキナーゼ活性向上株の取得は、前述した耐性変異
株の各々の菌株についてＮ−アセチルゲルタモキナーゼ
活性を測定してもよいし、公知のＬ−アルギニン生産能
の強化に有効な薬剤耐性株を取得してＮ−アセチルゲル
タモキナーゼ活性を測定してもよいし、変異処理した後
最少培地上で生育した菌株の各々についてＮ−アセチル
ゲルタモキナーゼ活性を測定して活性が望ましい程度（
野生株に比べ２００倍以上）に強化された菌株を選ぶこ
とにより行ってもよい。

Ｎ−アセチルゲルタモキナーゼ活性は鵜高の方法〔アミ
ン・アシッヅ・ヌクレイツク・アシッヅ（Ａｍｉｎｏ　
Ａｃ１ｄｓ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｃｌｓ）　１４　
、　　ｌ、　　（１９５６）］に準じて測定する。

酵素標品は以下のようにして調製する。

グルコース　２０ｇ／ｌ、ＭｇＳ○、・７Ｈ２００，５
ｇ／ｊ！、　Ｆｅ５ｏ４・７Ｈ２０１０ｍｇ／１１Ｍｎ
５○、・４Ｈ２０１ｍｇ／Ｌ硫酸アンモニウム　５ｇ／
ｌ、尿素　３ｇ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４Ｉｇ／ｊ２．ビオチ
ン　５０■／１．チアミン塩酸塩　１ｍｇ／ｊ！および
食塩５０ｍｇ／βを含む培地（ｐ　Ｈ７，２）に菌株を
植菌し、３０℃で２４時間振盪培養後集菌した。０．０
５　Ｍ　！Ｊン酸バッファー（ｐ　Ｈ７，０）で２回洗
浄しホモゲナイザーで磨砕後、１４．０００ｒｐｍで３
０分間遠心分雅して摩砕物を除き、上清を一夜透析後、
酵素標品とする。

本発明の微生物を用いてＬ−アルギニンを生産させるに
は一般にアミノ酸の発酵生産に使われる培地が使用され
る。すなわち実施例に示すように主炭素源の他、窒素源
、無機物その他の栄養物を程よく含有する培地ならば合
成培地または天然培地のいずれも使用できる。炭素源と
しては、グルコース、シュクロース、デンプン、デンプ
ン加水分解物、廃ａ蜜などの糖類、フマール酸、酢酸な
どの各種有機酸、エタノーノペメタノーノペグリ七ロー
ルなどのアルコール類などが使用できる。

窒素源としてはアンモニア、アンモニウム塩、尿素、ア
ンモニアガス、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コー
ン・スチープ・リカー、カゼイン加水分解物、フィツシ
ュミールまたはその消化物、脱脂大豆粕またはその消化
物、婦加水分解物など種々の天然物などが使用できる。

無機物としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、
塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンなどが使用
できる。使用する微生物が生育のため必要とする栄養素
は、その要求を満足させる栄養源の適当量を培地に加え
なくてはならないが、これらの物質は、窒素源として使
用される天然物に含まれて添加される場合もある。

培養は、好気的条件下で行うのがよい。培養温度は一般
には２０〜４０℃が好ましいが、菌が生育する温度であ
れば他の温度条件で実施しつる。

培養中のｐＨは中性付近に維持するのが望ましく培養日
数は通常１〜５日である。ｐＨ調整には、無機または有
機の酸性またはアルカリ性物質、尿素、アンモニアガス
、炭酸カルシウムなどが使用できる。培養液からのＬ−
アルギニンの回収はイオン交換樹脂法などの常法が用い
られる。

以下に実施例をあげて本発明を具体的に説明す実施例 廃糖蜜（グルコース換算＞　８０　ｇ／Ｉ！５ＫＨ２Ｐ
、０゜０、５　ｇ　／　１、Ｋ２ＨＰＯ−０，５ｇ／ｌ
、硫酸アンモニウム４５ｇ／Ｃ尿素２ｇ／ｌ’、炭酸カ
ルシウム３０　ｇ／ｉ２を含む生産培地（ｐＨ７，２）
２０ｍｌを３００ｍｌ容三角フラスコに調製した。予め
グルコース５０ｇ＃、ペプトン１．０ｇ／Ｌ酵母エキス
１０　ｇ／ｉ）、硫酸アンモニウム５ｇ／ＬＫＨ２Ｐ０
４５ｇ／／！、ＭｇＳＯ３・２Ｈ２００，５ｇ／（１，
ビオチア５０μｇ／ＣＮａＣｆｆ　　５ｇ／Ａ、の組成
よりなる種培地（ｐＨ７，２）６ｍｌで第２表に示す耐
性変異株およびそれらの親株を３０℃、２４時間培養し
た種培地を上記生産培地に２ｍｌ［菌し、３０℃にて７
２時間振盪培養した。それぞれの培養液中には第２表に
示したようにＬ−アルギニンが蓄積した。一方、これら
の変異株および親株のＮ−アセチルゲルタモキナーゼ活
性を鵜高の方法〔アミノ・アシッヅ・ヌクレイツク・ア
シッゾ（Ａｍｉｎｏ　Ａｃ１ｄｓ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ）　　１４．　１．　　（１９６６）　　）に
従い測定した。

結果を第２表に示す。

第　　　２　　　表 を除いたＰ液１１を強酸性イオン交換樹脂〔ダウエック
ス５０Ｘ８（Ｎａ型）、ダウケミカル社製〕のカラムに
通し、常法に従ってＬ−アルギニンを分離、精製、濃縮
、晶出し、１５．９　ｇのＬ−アルギニンの結晶を得た
。

発明の効果 本発明方法により、Ｌ−アルギニンを収率よく得ること
ができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. コリネ型グルタミン酸生産菌に属し、モノフルオロ酢酸
   存在下でアルギニンアナログに対して耐性を有しかつＬ
   −アルギニン生産能を有する微生物を培地に培養し、培
   養物中にＬ−アルギニンを生成蓄積させ、該培養物から
   Ｌ−アルギニンを採取することを特徴とする発酵法によ
   るＬ−アルギニンの製造法。