JPH04112795A - 発酵法によるｌ―トリプトファンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、発酵法によるＬ−トリプトファンの製造法に
関する。Ｌ　−）　ＩＪブトファンは、医薬品、食品あ
るいは飼料添加物などとして有用なアミノ酸である。

従来の技術 従来、コリネ型グルタミン酸生産菌に属する微生物を用
いた発酵法によるＬ−１Ｊブトフアンの製造法としては
、Ｌ−チロシンおよびＬ−フェニルアラニンを要求し、
かつチロシンアナログまたはフェニルアラニンアナログ
の一つもしくは二つ以上に耐性を有するコリネバクテリ
ウム属に属する微生物を用いる方法（特公昭５１−１９
０３７）、５−メチルトリプトファンなどのトリプトフ
ァンアナログに耐性を有する微生物を用いる方法（特公
昭４８−１８８２８、特公昭５１−３８７９５、特公昭
５３−３９５１？）、ヒスチジン要求株を用いる方法（
特公昭４７−４５０５＞、ピルビン酸キナーゼ活性の低
下または欠失したブレビバクチリウム属に属する微生物
を用いる方法（特開昭６２−２５３３９１）　、ホスホ
エノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性が低下または
欠失したコリネバクテリウム属に属する微生物を用いる
方法（特開平１−３１７３９５）などが知られている。

発明が解決しようとする課題 飼料添加物などとして有用なＬ　−）　Ｕブトファンを
、工業的により効率よく安価に製造する方法が求められ
ている。

課題を解決するための手段 本発明は、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属し、アミノキノリン誘導体またはフェノチア
ジン誘導体に耐性を有し、かつＬトリプトファン生産能
を有する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−１Ｊブ
トフアンを生成蓄積させ、該培養物からＬ−）Ｕブトフ
ァンを採取することを特徴とするＬ−トリプトファンの
製造法を提供する。

以下に本発明の詳細な説明する。

アミノキノリン誘導体とは、アミノキノリン骨格を有す
る物質で、例えば、クロロキン（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎ
ｅ）、アモジアキン＜ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ＞などの
４−アミノキノリン誘導体や、プリマキン（ρｒｉｍａ
ｑ旧ｎｅ）、ペンタキン（ｐｅｎｔａｑｕｉｎａ）など
の８−アミノキノリン誘導体などが挙げられる。また、
これら物質のリン酸塩あるいは塩酸塩などの塩も利用で
きる。これらの物質は、いずれも抗マラリア薬（ａｎｔ
ｉｍａｌａｒｉａｌｄｒｕｇｓ）として知られている。

またフェノチアジン誘導体とは、フェノチアジン骨格を
有する物質で、例えば、フェノチアジンをはじめ、ジメ
チルアミノ側鎖系誘導体のプロマジン（ｐｒｏｍａｚｉ
ｎｅＬクロルプロマジン（ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎ
ｅ）、プロメタジン（ｐｒｏｌＴｌｅｔｈａｚｉｎｅ）
などが挙げられる。

また、これら物質の塩酸塩などの塩も利用できる。

これらの物質は、いずれも抗精神病薬（ａｎｔｉｐｓｙ
ｃｈｏｔｉｃｄｒｕｇｓ）として知られている。

本発明で用いられる微生物としては、コリネ型グルタミ
ン酸生産菌として知られているコリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属に属する微生物であって、Ｌ
−）　ＩＪブトファン生産能を有し、しかもアミノキノ
リン誘導体またはフェノチアジン誘導体に耐性を有する
微生物であればいずれでもよい。

アミノキノリン誘導体またはフェノチアジン誘導体に耐
性を有するＬ　−）　ＩＪブトファン生産菌は、公知の
Ｌ　−）　ＩＪブトファン生産能を有する菌株にアミノ
キノリン誘導体またはフェノチアジン誘導体に対する耐
性変異を付与することによって取得することができる。

また、野生株から誘導したアミノキノリン誘導体または
フェノチアジン誘導体に耐性を有する変異株に、栄養要
求性、アナログ耐性などのＬ−）！Ｊブトファン生産性
を向上させる変異を付与することによっても得ることが
できる。Ｌ−）！Ｊブトファン生産性変異株は、Ｌ−チ
ロシンおよびＬ−フェニルアラニンノ要求性、マたはア
ミノ酸アナログ耐性を育する菌株として取得することが
できる〔農芸化学会誌、５０　（１）、ｐ、Ｒ７９（１
９７６）　］。

本発明における了ミノキノリン誘導体またはフェノチア
ジン誘導体に耐性を有する変異株は、紫外線照射やＮ−
メチル−Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニジン（以下
ＮＴＧと略す）、亜硝酸などの化学処理など、通常用い
られる変異処理方法により変異処理したのち、親株が生
育できないような濃度の各種アミノキノリン誘導体また
はフェノチアジン誘導体を含む寒天平板培地で生育可能
な菌株を採取すればよい。

アミノキノリン誘導体またはフェノチアジン誘導体に耐
性を存するＬ−トリプトファン生産菌の具体例としては
、プリマキン耐性変異株コリネバクテリウム・グルタミ
クムＨ，＝７８５３、クロロキン耐性変異株コリネバク
テリウム・グルタミクムＨ−７８５４およびプロマジン
耐性変異株コリネバクテリウム・グルタミクムＨ−８０
１４などが挙げられる（取得方法は実施例１に示す）。

これらの菌株は、平成２年８月ｌＯ日付で工業技術院微
生物工業技術研究所（微工研）に、それぞれＦＥＲＭ　
　ＢＰ−３０５５，ＦＥＲＭ　　ＢＰ３０５６およびＦ
ＥＲＭ　　ＢＰ−３０５７としてブダペスート条約に基
づいて寄託されている。

本発明の微生物によるＬ−トリプトファンの生産は、通
常の培養法で実施可能である。使用培地としては、炭素
源、窒素源、無機物その他使用菌株の必要とする微量の
栄養素をほどよく含有するものならば、合成培地または
天然培地いずれも使用可能である。

炭素源としてはグルコース、グリセロース、フラクトー
ス、シュークロース、マルトース、マンノース、澱粉、
澱粉加水分解物、糖蜜などの炭水化物、ポリアルコール
、ピルビン酸、フマール酸、乳酸、酢酸などの各種有機
酸が使用できる。さらに微生物の資化性によって、炭化
水素、アルコール類なども用いられる。特に廃１！ｉｌ
ｉ’は好適に用いられる。

窒素源としてはアンモニアまたは塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム
などの各種無機および有機アンモニウム塩類あるいは尿
素および他の窒素含有物質ならびにペプトン、ＮＺ−ア
ミン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカ
ー、カゼイン加水分解物、フィツシュミールまたはその
消化物などの窒素含有有機物など種々のものが使用可能
である。

さらに無機物としては、リン酸第−水素カリウム、リン
酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄
、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどを使用する。

培養は、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件
下に行う。培養温度は、一般に２０〜４０℃が好適であ
る。培地のｐＨは、中性付近に維持することが望ましい
。培養時間は、通常１〜５日間である。

培養液からＬ−トリプトファンを採取する方法は、培養
終了後、菌体を除去して濃縮晶析する方法、活性炭処理
あるいはイオン交換樹脂処理などの公知の方法によって
行われる。

以下に実施例をあげて、本発明を具体的に説明する。

実施例１．変異株の取得： Ｌ−トリプトファン生産能ををする、コリネバクテリウ
ム・グルタミクムＢＰＳ−１３（ＦＥＲＭＢＰ−１７７
７；特開平１−３１７３９５）を親株として用いた。完
全培地（粉末ブイヨン２０ｇ１酵母エキス５ｇを水１１
に含み、ｐ　Ｈ７，２に調整した培地）で３０℃、１６
時間培養した菌体を集め、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，２＞で洗浄後、菌体の濃度が約１０９細胞／献に
なるように同緩衝液に懸濁し、これにＮＴＧを最＃濃度
が５００ｇ／−となるように加え、３０℃、２０分間保
持して変異処理を行った。この変異処理菌体を同緩衝液
で洗浄後、その菌体を、リン酸プリマキン０．２ｍＭを
含有する第１表に示す組成の寒天平板培地に塗布した。

第１表　　最小培地組成 グルコース　　　　　　　　　　　１０　　　ｇ／１（
ＮＨ，）Ｈ，Ｐｏ、　　　　　　　　　１　　　ｇ／ｌ
ｌＫＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　０．２　　ｇ
／ｌＭｇ５Ｏ＝・７Ｈ２００，２ｇ／１ ＦｅＳＯ，・７Ｈ−０１０ｒｎｉｚ／ＩＭｎ　５０−　
・４〜６　Ｈ２Ｏ０，２ｍｇ／ｌＺｎ５Ｏ，・７Ｈ，Ｏ
Ｏ，９■／Ｉ Ｃｕ　Ｓ　Ｏ＝　・５　Ｈ２Ｏ０，４ｍｇ／　ｊ！Ｎ　
ａ　２Ｂ−０，・ｌ０Ｈ−００，０９ｍｇ／　１（ＮＨ
４）ａＭＯｆｆｏ２４−４Ｈ２００，０４ｍｇｚ＃ビオ
チン　　　　　　　　　　　５０　　　ｇ／ｌｐ−アミ
ノ安息香酸　　　　　　　２．５　　■／ｉサイアミン
塩酸塩　　　　　　　　１　　■／ｉＬ−チロシン　　
　　　　　　　５０　　■／１Ｌ−７エニルアラニン　
　　　　５０　　■／ｉ寒天　　　　　　　　　　　　
　１６　　　ｇ／Ｉ！（ｐＨ７，２＞ ３０℃で５〜１０日間培養し、該平板培地上に生育して
くる大きなコロニーを釣菌分離して、プリマキン耐性変
異株コリネバクテリウム・グルタミクムＨ−７８５３を
取得した。また同様の方法で処理を行い、リン酸クロロ
キン０．３ｍＭ、塩酸プロマジン０．３ｍＭをそれぞれ
含有する上記寒天平板培地上に生育してくる大きなコロ
ニーを釣菌分離して、それぞれクロロキン耐性変異株コ
リネバクテリウム・グルタミクムＨ−７８５４、プロマ
ジン耐性変異株コリネバクテリウム・グルタミクムＨ−
８０１４を取得した。

上記で取得した変異株と親株（ＢＰＳ−１３＞の薬剤耐
性度を以下のようにして比較した結果を第２表、第３表
、第４表に示す。すなわち、各菌株を上記完全培地上で
３０℃、２４時間培養し、菌濃度が約１０４細胞／祇に
なるように生理食塩水に懸濁した菌液０．１ｄを、リン
酸プリマキン、リン酸クロロキンあるいは塩酸プロマジ
ンを含有する第１表記載の寒天平板培地に塗布し、３０
℃、７日間培養後の生育の度合いで、薬剤耐性度を判定
した。

いずれの変異株も親株に比較して、高濃度の薬剤によっ
て生育が阻害されず、それぞれの薬剤に対し強い耐性を
獲得していることを示している。

第 表 菌　　株　　　　０ ＢＰＳ−１３十− Ｈ−７８５３” リン酸プリマキン（「Ｍ） ０．１　　０，１５　　０．２ ＋ 第 表 菌　　　株　　　　０ ＢＰＳ−１３” Ｈ−７８５４＋＋ リン酸クロロキン（ｍＭ） ０．１０．２０．３ ： ＋ 第 表 菌　　株 塩酸プロマジン（ｍＭ） ０．１　　０．２　　　０．３ ＢＰＳ−１３ ８＝８０１４ ＋ ± ±；生育弱い ；非生胃 実施例２．Ｌ−トリプトファン生産試験：実施例１で取
得したコリネバクテリウム・グルタミクムＨ−７８５３
、Ｈ−７８５４、Ｈ−８０１４および親株であるＢＰＳ
−１３を、それぞれ２０−の種培地（グルコース２％、
ポリペプトン１．５％、酵母エキス１．５％、食塩０．
２５％、尿素０．１％、Ｌ−チロシン２００■７＃、Ｌ
−フェニルアラニン２００■／ｌｌ５ｐＨ７，２）を含
む２５０艷容三角フラスコに接種し、３０℃で２４時間
、２１Ｏｒｐｍのロータリーシェーカー上で振盪培養し
た。この種培養液２−を、２０−の下記組成の発酵培地
を含む２５０ｄ容三角フラスコに接種して、７２時間、
種培養と同様の方法で培養した。

発酵培地の組成ニゲルコース６％、ＫＨ２Ｆ０゜０．０
５％、Ｋ、ＨＰＯ，０，０５％、Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏａ・７
ＨａＯＯ，０２５％、硫安　２％、ビオチン３０、／１
、Ｍｎ５Ｏ−・７Ｈ２０１０■／ｊ！。

コーン・スチーブ・リカー　０．５％、（ａ　ＣＯｓ２
％（ｐＨ７，２） 培養後、培養液中のＬ−トリプトファン生成量を、高速
液体クロマトグラフィー法により測定した。

その結果を第５表に示す。

第　　　５　　　表 ＢＰＳ−１３ Ｈ−７８５３ Ｈ−７８５４ Ｈ−７８５３株を用いて得たＬ−）！Ｊブトファン含有
培養液２１を遠沈し、菌体および炭酸カルシウムおよび
その他の不純物を除いた上澄液を、強酸性陽イオン交換
樹脂ダイヤイオンＳ　Ｋ−１０４（Ｈ”型）（三菱化成
社製）に通し、Ｌ−）！Ｊブトファンを吸着させた。該
樹脂を水洗後、０．５Ｎアンモニア水で溶出した。溶出
液を脱塩して得た粗Ｌ−）！Ｊブトファン結晶粉末を少
量の５０％熱エタノール水に溶解し、活性炭処理して脱
色し、冷却後１２．２　ｇのＬ−）’Ｊブトファンの結
晶が得られた。

発明の効果 本発明で得られたアミノキノリン誘導体またはフェノチ
アジン誘導体に耐性を有する変異株を用いることにより
、従来のＬ−トリプトファン生産菌より高い収率でＬ−
）！Ｊブトファンを発酵生産することができる。

特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社Ｘ′真４，
７費ｔ ）騰Ｉ

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
   属に属し、アミノキノリン誘導体またはフェノチアジン
   誘導体に耐性を有し、かつＬ−トリプトファン生産能を
   有する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−トリプト
   ファンを生成蓄積させ、該培養物からＬ−トリプトファ
   ンを採取することを特徴とするＬ−トリプトファンの製
   造法。
2. （２）該アミノキノリン誘導体が、クロロキン、アモジ
   アキン、プリマキン、ペンタキンまたはその塩である請
   求項１記載の製造法。
3. （３）該フェノチアジン誘導体が、フェノチアジン、プ
   ロマジン、クロルプロマジン、プロメタジンまたはその
   塩である請求項１記載の製造法。