JPH03195492A - 発酵法によるｌ―トリプトファンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、Ｌ−トリプトファン生産能を有するコリネ型
グルタミン酸生産菌に属する微生物を、し−子ロシンお
よびＬ−フェニルアラニンを含有する発酵液を添加した
培地に培養し、培養物中にり、　−トＩＪブトファンを
生成蓄積させ、該培養物からＬ−トリプトファンを採取
することを特徴とする発酵法によるＬ−トリプトファン
の製造法に関する。

従って本発明はバイオインダス）　ＩＪ−の産業分野に
関し、特に医薬、食品あるいは飼料添加物として有用な
Ｌ　−）　ＩＪブトファンの製造分野に関する。

従来の技術 従来、コリネ型グルタミン酸生産菌に属する微生物を用
いた発酵法によるＬ−）ＩＪブトファンの製造法として
は、Ｌ−チロシンおよびＬ−フェニルアラニンを要求し
、かつチロシンアナログまたはフェニルアラニンアナロ
グの一つもしくは二つ以上に耐性を有するコリネバクテ
リウム属に属する微生物を用いる方法（特公昭５ｌ−１
９０３７）　、５メチルトリプトフアンなどのトリプト
ファンアナログに耐性を有する微生物を用いる方法（特
公昭４Ｂ−１８８２８、特公昭５１−３８７９５、特公
昭５３−３９５１７）、ヒス子ジン要求株を用いる方法
（特公昭４７−４５０５）、ピルビン酸キナーゼ活性の
低下または欠失したブレビバクテリウム属に属する微生
物を用いる方法（特開昭６２−２５３３９１）　、ホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性が低下また
は欠失したコリネバクテリウム属に属する微生物を用い
る方法（特願昭６３−２４１６８８）などが知られてい
る。

これらの微生物を利用するＬ−）ＩＪブトファンの製造
法において、従来生育に要求する物質以外に酵母エキス
、ペプトンなど種々の物質を培地に添加して生産性を高
める方法が試みられている。

しかしながらこれらの物質は高価なうえ、生産性を高め
る方法としても満足できるものではなかった。

発明が解決しようとする課題 飼料添加物などとして有用なＬ　−）　ＩＪブトファン
を、工業的により効率よ（安価に製造する方法が求めら
れている。

課題を解決するための手段 本発明は、Ｌ−）ＩＪブトファン生産能を有するコリネ
型グルタミン酸生産菌に属する微生物を、Ｌ−チロシン
およびＬ−フェニルアラニンヲ含有する発酵液を添加し
た培地に培養し、培養物中にＬ−）！Ｊブトファンを生
成蓄積させ、該培養物からＬ−トリプトファンを採取す
ることを特徴とする発酵法によるＬ〜トリプトファンの
製造法を提供する。

本発明で用いられるＬ−）！Ｉブトファン生産能を有す
る微生物としては、コリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属などに属するコリネ型グルタミン酸生産
菌で、Ｌ−トリプトファン生産能を有する微生物であれ
ばいずれでもよい。Ｌトリプトファン生産性変異株は、
Ｌ−チロシンおよびＬ−フェニルアラニンの要求性や、
アミノ酸アナログ耐性を有する菌株として取得すること
ができる〔農茅化学会誌、５０　（１）、ｐ、　Ｒ７９
（１９７６）　］。

］Ｌ−チロシおよびＬ−フェニルアラニンを含有する発
酵液は、Ｌ−チロシンまたはＬ−フェニルアラニン生産
能を有する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−チロ
シンまたはＬ−フェニルアラニンを生成蓄積させた発酵
液であればいずれも用いることができる。

ＩＬｌｔＬ−チロシンまたはＬ−フェニルアラニン生産
能を有する微生物としては、コリネ型グルタミン酸生産
菌またはエシェリヒア属に属し、Ｌ−チロシンまたはＬ
−フェニルアラニン生産能を有する微生物であればいず
れでもよい。

本発明によるＬ−トリプトファンの生産は、Ｌ−チロシ
ンおよびＬ−フェニルアラニンを含有する発酵液を培地
に添加する以外は、通常の培養法で実施可能である。使
用培地としては、炭素源、窒素源、無機物その他使用菌
株の必要とする微量の栄養素をほどよく含有するものな
らば、合成培地または天然培地いずれも使用可能である
。

炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトー
ス、シュークロース、マルトース、マンノース、澱粉、
澱粉加水分解物、糖蜜などの炭水化物、ポリアルコール
、ピルビン酸、フマール酸、乳酸、酢酸などの各種有機
酸が使用できる。さらに微生物の資化性によって、炭化
水素、アルコール類なども用いられる。特に廃糖蜜は好
適に用いられる。

窒素源としてはアンモニアまたは塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム
などの各種無機および有機アンモニウム塩類あるいは尿
素および他の窒素含有物質ならびにペプトン、ＮＺ−ア
ミン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカ
ー、カゼイン加水分解物、フィツシュミールまたはその
消化物などの窒素含有有機物など種々のものが使用可能
である。

さらに無機物としては、リン酸第−水素カリウム、リン
酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄
、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどを使用する。

培養は、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件
下に行う。培養温度は一般に２０〜４０℃が好適である
。培地のｐＨは、中性付近に維持することが望ましい。

培養期間は通常１〜５日間である。

培養液からＬ−）ＩＪプトフγンを採取する方法は、培
養終了後、菌体を除去して濃縮晶析する方法、活性炭処
理あるいはイオン交換樹脂処理などの公知の方法によっ
て行われる。

Ｌ−チロシンおよびＬ−フェニルアラニンを含有する発
酵液は、Ｌ−チロシンまたはＬ−フェニルアラニン生産
能を有する微生物を通常の培養法で培養して得られる発
酵液を単独にまたは混合して調製することができる。使
用培地としては、Ｌトリプトファン生産の場合と同様、
炭素源、窒素源、無機物その他使用菌株の必要とする微
量の栄養素をほどよく含有するものならば、合成培地ま
たは天然培地いずれも使用可能である。培養もＬ−）　
ＩＪブトファン発酵の場合と同様に実施することができ
る。

Ｌ−チロシンおよびＬ−フェニルアラニンを含有する発
酵液としては、発酵ブロスはもちろんのこと、発酵ブロ
スより菌体などを除去した戸液などがあげられる。

Ｌ−）　ＩＪブトファン発酵の培地に添加するＬ−チロ
シンおよびＬ−７工ニルアラニン発酵液はそのまま用い
てもよいが、必要に応じ高ｐＨ，すなわちｐＨ１１前後
に調整して保存したものを使用してもよい。

培地に添加する該発酵液の量は、Ｌ−）！Ｉブトファン
生産菌株により異なり、また他の培地成分をも考慮して
最適量を決定すべきであるが、通常培地１１あたりＬ−
フェニルアラニンとして５００〜２０００ｍｇ、Ｌ−チ
ロシンとして８００〜２５００ｍｇになるように添加す
るのがよい。

また該発酵液の添加時期は、Ｌ−）！Ｉブトファン発酵
の培養の開始時に培地の一部として存在させてもよいし
、培養中連続的または間欠的に添加してもよい。培養中
、炭素源、たとえば糖蜜やグルコースあるいはシューク
ロースを連続的または間欠的に添加する場合、これにと
もなって添加してもよい。

以下に実施例をあげて、本発明を具体的に説明する。

実施例 （１）Ｌ−チロシンおよびＬ−フェニルアラニン含有発
酵液の調製 フェニルアラニン生産菌であるコリネバクテリウム・グ
ルタミクムＫ　３８　（ＦＢＲＭ　０Ｐ−４５４）およ
びチロシン生産菌であるコリネバクテリウム・グルタミ
クムに４３（Ｆ［！ＲＭ　ＢＰ−４５７）をそれぞれ２
５０−の種培地（グルコース４％、ポリペプトン１．５
％、酵母エキス１．５％、食塩０．２５％、尿素０．１
％、ｐ　Ｈ７，２）を含む２１容三角フラスコに接種し
、３０℃で２８時間、２１　Ｏｒｐｍのロータリーシェ
ーカー上で振盪培養した。この種培養液１００ｍ１を７
００−の下記組成の発酵培地を含む２１ジャーファーメ
ンタ−に接種して、３０℃、通気量ＩＩｌ／ｍｉｎ、攪
拌数８００「ρｍにて培養した。培養中のｐＨ調整およ
び窒素源の供給はアンモニア水にて行い、ｐＨは約６、
１に維持した。炭素源として廃糖蜜を適宜供給しつつ、
６０時間培養を行った。

発酵培地の組成：廃１！Ｉ＆　（グルコース換算）８％
、ＫＨ，Ｐｏ、０．１％、Ｋ２ＨＰＯ，０，１％、Ｍ　
ｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ２００，１％、硫酸アンモニウム２
％、ビオチン１００Ｎ／１、ＭｎＳＯ４・７Ｈ，０１０
ｍｇ／ｉ！％　Ｆｅ５０．・７Ｈ７Ｈ２Ｏ１０／ｊ！、
コーン・スチーブ・リカー２％（ｐＨ６，８＞ この発酵終了後のし一チロシンおよびＬ−フェニルアラ
ニンの生成量は、高速液体クロマトグラフィー法により
定量した。なおし−チロシンは析出しているため、培養
液１−に６ＮＮａＯＨ溶液を５０４加え、６５℃で５分
間加熱して、Ｌ−チロシンを完全に溶解させた後定量し
た。

その結果、発酵終了時、培養液中のＬ−チロシン蓄積量
は２４ｇ／ＣＬ〜フェニルアラニン蓄積量はＬａｇ／Ｉ
！であった。

（２）Ｌ−トリプトファン生産試験 種菌としては、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴ
ＣＣ２１８５１を用いて、種培養は（１）と同様に実施
した。Ｌ−トリプトファン生産は、（１）に示した発酵
培地に、（１）で得られたＬ−チロシンおよびＬ−フェ
ニルアラニンを含有する発酵液を添加した培地を用いる
以外は、〔１〕と同様に行った。この時、培地に添加す
る発酵液は、（１）で得られたし一チロシンおよびＬ−
フェニルアラニンを含有する発酵液の１：ｌ混合液を、
あらかじめアルカリでｐＨＩＩに調整、保存したものを
用いた。この発酵混合液１５％を含有する発酵培地７０
０−を含む２１ジヤーフアメンターに種培養液１００ｍ
１を植菌して、（１）と同様に培養を行った。

対照としてＬ−チロシンおよびＬ−フェニルアラニンを
含有する発酵液を添加する代わりにＬ−チロシンおよび
Ｌ−フェニルアラニンをそれぞれ１８００ｍｇ／Ｉｌ、
１３５０ｍｇ／ｊ！となるように添加した発酵培地でも
同様に実施した。

その結果を第１表に示す。

第　　　１　　　表 使　用　培　地　　Ｌ−トリフ）７ｙン生成量（ｇ／ｌ
）発酵液添加　有り　　　　　２１．７ Ｌ−チロシンおよびＬ−フェニルアラニンを含有する発
酵液を添加して培養したときのし一トリプトファン発酵
終了液１１を遠沈し、菌体およびその他の不純物を除い
た上澄液を、強酸性陽イオン交換樹脂ダイヤイオン５Ｋ
−１０４（Ｈ＋型）　（三菱化成社ＩＩ）に通し、Ｌ−
）リブトファンを吸着させた。該樹脂を水洗後、０．５
Ｎアンモニア水で溶出した。溶出液を濃縮して得た粗Ｌ
　−）　ＩＪブトファン結晶粉末を少量の５０％熱エタ
ノール水に溶解し、活性炭処理して脱色し、冷却後１５
．８　ｇのＬ−）リブトファンの結晶が得られた。

発明の効果 本発明により、収率よく、しかも安価にＬ−トリプトフ
ァンを発酵生産することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. Ｌ−トリプトファン生産能を有するコリネ型グルタミン
   酸生産菌に属する微生物を、Ｌ−チロシンおよびＬ−フ
   ェニルアラニンを含有する発酵液を添加した培地に培養
   し、培養物中にＬ−トリプトファンを生成蓄積させ、該
   培養物からＬ−トリプトファンを採取することを特徴と
   する発酵法によるＬ−トリプトファンの製造法。