JP2810739B2 - 発酵法によるｌ―スレオニンの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、バリンアナログに耐性を有し、かつＬ−ス
レオニン生産能を有するエシェリヒア属に属する微生物
を用いるＬ−スレオニンの製造法に関する。

Ｌ−スレオニンは、アミノ酸製剤などの医薬品として
有用であるだけでなく、飼料添加用としても利用できる
アミノ酸である。

従来の技術 従来、発酵法によるＬ−スレオニンの製造法として
は、エシェリヒア属に属し、ポレリジン感受性を示す微
生物を用いる方法（特公昭51−6752）、エシェリヒア属
に属し、ジアミノピメリン酸とメチオニンの要求性を示
し、かつスレオニンの生合成系がスレオニンのフィード
バック阻害に対して抵抗性を示す微生物が用いる方法
（特公昭56−10037）、セラチア属に属し、スレオニン
脱水素酵素が欠損し、かつスレオニン代謝拮抗物質に耐
性を示す微生物を用いる方法（特公昭52−48195）、コ
リネバクテリウム属に属し、α−アミノ−β−ヒドロキ
チ吉草酸およびＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システ
インに耐性で、かつメチオニンの要求性を有する微生物
を用いる方法（特開昭47−19087）、ブレビバクテリウ
ム属に属し、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸および
Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システインに耐性で、
かつロイシンの要求性を有する微生物を用いる方法（特
開昭50−31093）、ブレビバクテリウム属に属し、α−
アミノ−β−ヒドロキチ吉草酸およびＳ−（２−アミノ
エチル）−Ｌ−システインに耐性で、かつＬ−イソロイ
シンおよびリジンの要求性を有する微生物を用いる方法
（特開昭58−224684）、エシェリヒア属に属し、リファ
ンピシン、リジン、メチオニン、アスパラギン酸および
ホモセリンの少なくとも１種に耐性を有するか、または
Ｌ−スレオニンの分解能の低下した微生物を用いる方法
（特開昭63−273487）などが知られている。

発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、アミノ酸製剤や飼料添加物として有
用なＬ−スレオニンを、より収率よく安価に製造する方
法を提供することにある。

課題を解決するための手段 本発明によれば、エシェリヒア属に属し、バリンアナ
ログに耐性を有し、かつＬ−スレオニン生産能を有する
微生物を、培地に培養し、培養物中にＬ−スレオニンを
生成蓄積させ、該培養物よりＬ−スレオニンを採取する
ことを特徴とする発酵法によるＬ−スレオニンの製造法
を提供することができる。

以下に本発明を詳細に説明する。

本発明に使用する微生物としては、エシェリヒア属に
属し、Ｌ−スレオニン生産能を有する微生物であればい
ずれも用いることができる。

バリンのアナログとしては、バリン、バリンヒドロキ
サメート、Ｎ−メチルバリン、α−アミノ酪酸、２−チ
アゾールアラニンなどが知られておりいずれのアナログ
も使用できる。

バリンアナログに対する耐性変異株は、エシェリヒア
属に属するＬ−スレオニン生産菌を通常の変異手段によ
り変異させ、上記の性質を付与することにより取得でき
る。好適な菌株としてはエシェリヒア・コリＨ−7538や
Ｈ−7600をあげることができる。エシェリヒア属に属す
るスレオニン生産菌には、副生のアミノ酸が少ないとい
う利点がある。

以下に本発明の耐性変異株の取得方法を具体的に説明
する。

エシェリヒア・コリＨ−4258（FERM BP−985、ジアミ
ノピメリン酸要求性、メチオニン要求性、α−アミノ−
β−ヒドロキシ吉草酸耐性、リファンピシン耐性）にＮ
−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NT
G）を用いて常法の変異処理（0.2mg/ml、30℃、30分
間）を施す。バリンヒドロキサメート（1g/）を含む
最少培地（グルコース5g/、NH₄Cl 2g/、KH₂PO₄2g/
、MgSO₄・7H₂O0.1g/、Fe₂（SO₄）₃20mg/、ジアミ
ノピメリン酸50mg/、DL−メチオニン50mg/、寒天20
g/ pH7.2）に塗布する。30℃で２〜６日間培養し、
生育してくる耐性株のコロニーを取得する。バリンヒド
ロキサメート耐性変異株50株を釣菌し、Ｌ−スレオニン
生産試験にかけ、親株よりＬ−スレオニン生産能が向上
した菌株を選ぶ（本菌株をエシェリヒア・コリＨ−7538
という。）。また、バリンヒドロキサメートのかわりに
α−アミノ酪酸を2g/用いる以外は上記と同様の操作
をおこないα−アミノ酪酸耐性変異体を取得する（本菌
株をエシェリヒア・コリＨ−7600という。）。これらの
菌株はブタペスト条約にもとづいて平成１年12月21日付
で工業技術院微生物工業技術研究所にそれぞれFERM BP
−2696、FERM BP−2698として寄託されている。

なお、本発明で用いられた変異株と、親株（Ｈ−4258
株）を、バリンヒドロキサメートあるいはα−アミノ酪
酸を含む最少寒天培地上で、30℃、24時間培養したとき
の生育の程度を比較した結果を第１表で示す。

本発明の微生物によるＬ−スレオニンの生産は、通常
の培養法にて実施可能である。使用培地としては、炭素
源、窒素源、無機物そのほか使用菌株の必要とする微量
の栄養素を程よく含有する培地ならば、合成培地または
天然培地いずれも使用可能である。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、ラクト
ース、糖蜜、澱粉または粗糖の加水分解物などの炭水化
物、ピルピン酸、酢酸、プロピオン酸、ギ酸、フマール
酸、リンゴ酸などの有機酸などが用いられる。さらに微
生物の資化性によっては、グリセリン、エタノールなど
のアルコールなども用いられる。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、燐酸アンモニウム
などの各種無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、ア
ミン類、そのほか含窒素化合物、ならびにペプトン、肉
エキス、コーン・スティープ・リカー、カゼイン加水分
解物、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化
物などが用いられる。

無機物としては、燐酸第一カリウム、燐酸第二カリウ
ム、燐酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリ
ウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシ
ウムなどが用いられる。

培養は振盪培養または深部通気撹拌培養などの好気的
条件下、温度20〜40℃、好ましくは25〜35℃、pH5〜
９、好ましくは中性付近に保持しておこなわれ、通常２
〜７日で完了する。培地のpH調整は炭酸カルシウム、無
機または有機の酸、アルカリ溶液、アンモニア、pH緩衝
液などによっておこなわれる。

培養終了後、培養液から菌体などの沈殿物を除去し、
イオン交換処理法、濃縮法、塩析法などを併用すること
により、培養液からＬ−スレオニンを回収することがで
きる。

以下に本発明の実施例を説明する。

実施例１ エシェリヒア・コリＨ−7538、Ｈ−7600および親株で
あるＨ−4258を、グルコース20g/、ペプトン10g/、
酵母エキス10g/、NaCl2.5g/、ジアミノピメリン酸
0.5g/の組成からなる種培地（pH7.4）で、30℃、16時
間振盪培養した。得られた種培養液100mlを１の下記
発酵培地を含む２の発酵槽に植菌し、温度30℃、撹拌
数800rpm、通気量１/min.にて培養した。培養中のpH
調整および窒素源の供給はアンモニア水でおこない、pH
は約6.5に維持した。グリコースを適宜供給しつつ、80
時間培養をおこなった。その際のＬ−スレオニンの生産
量を高速液体クロマトグラフィー法により定量し、結果
を第２表にまとめた。

発酵培地の組成は以下の通りである。

グルコース40g/、（NH₄）₂SO₄12g/、KH₂PO₄2g/
、MgSO₄・7H₂O 1g/、ジアミノピメリン酸0.9g/、
DL−メチオニン0.3g/、コーン・スティープ、リカー5
g/（pH7.4） Ｈ−7538株を用いて得たＬ−スレオニン含有培養物１
を遠心分離（3,000rpm,10分）にかけ菌体その他の不
純物を除去した。得られた上澄液を強酸性陽イオン交換
樹脂ダイヤイオンSKI（Ｈ型）のカラムに通し、Ｌ−ス
レオニンを吸着させ、水洗後0.5規定のアンモニア水で
溶出して、Ｌ−スレオニン画分を集めた。集めた画分を
濃縮し、エタノールを加えて冷却下で保存することによ
り、純度98％以上のＬ−スレオニンの結晶が30g得られ
た。

発明の効果 本発明によれば、アミノ酸製剤や飼料添加物として有
用なＬ−スレオニンを、収率よく安価に製造することが
できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 13/00 - 13/24 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】エシェリヒア属に属し、バリンアナログに
   耐性を有し、かつＬ−スレオニン生産能を有する微生物
   を培地に培養し、培養物中にＬ−スレオニンを生成蓄積
   させ、該培養物よりＬ−スレオニンを採取することを特
   徴とする発酵法によるＬ−スレオニンの製造法。