JPH03198786A - 発酵法によるｌ―スレオニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、バリンアナログに耐性を有し、かつＬ−スレ
オニン生産能を有するエシェリヒア属に属する微生物を
用いるＬ−スレオニンの製造法に関する。

Ｌ−スレオニンは、アミノ酸製剤などの医薬品として有
用であるだけでなく、飼料添加用としても利用できるア
ミノ酸である。

従来の技術 従来、発酵法によるＬ−スレオニンの製造法としては、
エシェリヒア属に属し、ボレリジン感受性を示す微生物
を用いる方法（特公昭５ｌ−６７５２）、エシェリヒア
属に属し、ジアミノピメリン酸とメチオニンの要求性を
示し、かつスレオニンの生合成系がスレオニンのフィー
ドバック阻害に対して抵抗性を示す微生物を用いる方法
（特公昭５６１００３７）、セラチア属に属し、スレオ
ニン脱水素酵素が欠損し、かつスレオニン代謝拮抗物質
に耐性を示す微生物を用いる方法（特公昭５２−４８１
９５）、コリネバクテリウム属に属し、α−アミノ−β
−ヒドロキシ吉草酸および５−（２−アミノエチル）Ｌ
−システィンに耐性で、かつメチオニンの要求性を有す
る微生物を用いる方法（特開昭４７−１９０８７）、ブ
レビバクテリウム属に属し、α−アミノ−βヒドロキシ
吉草酸および５−（２−アミノエチル）Ｌ−システィン
に耐性で、かつロイシンの要求性を有する微生物を用い
る方法（特開昭５Ｏ−３１０９３）、ブレビバクテリウ
ム属に属し、α−アミノ−βヒドロキシ吉草酸および５
−（２−アミノエチル）Ｌ＝システィンに耐性で、かつ
Ｌ−イソロイシンおよびリジンの要求性を有する微生物
を用いる方法（特開昭５８−２２４６８４）、エシェリ
ヒア属に属し、リファンピシン、リジン、メチオニン、
アスパラギン酸およびホモセリンの少なくとも１種に耐
性を有するか、またはＬ−スレオニンの分解能の低下し
た微生物を用いる方法（特開昭６３−２７３４８７）な
どが知られている。

発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、アミノ酸製剤や飼料添加物として有用
なＬ−スレオニンを、より収率よく安価に製造する方法
を提供することにある。

課題を解決するための手段 本発明によれば、エシェリヒア属に属し、バリンアナロ
グに耐性を有し、かつＬ−スレオニン生産能を有する微
生物を、培地に培養し、培養物中にＬ−スレオニンを生
成蓄積させ、該培養物よりＬ−スレオニンを採取するこ
とを特徴とする発酵法によるＬ−スレオニンの製造法を
提供することができる。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明に使用する微生物としては、エシェリヒア属に属
し、Ｌ−スレオニン生産能を有する微生物であればいず
れも用いることができる。

バリンのアナログとしては、バリン、バリンヒドロキサ
メート、Ｎ−メチルバリン、α−アミノ酪酸、２−チア
ゾールアラニンなどが知られておりいずれのアナログも
使用できる。

バリンアナログに対する耐性変異株は、エシェリヒア属
に属するＬ−スレオニン生産菌を通常の変異手段により
変異させ、上記の性質を付与することにより取得できる
。好適な菌株としてはエシェリヒア・コリＨ−７５３８
やＨ−７６００をあげることができる。エシェリヒア属
に属するスレオニン生産菌には、副生のアミノ酸が少な
いという利点がある。

以下に本発明の耐性変異株の取得方法を具体的に説明す
る。

エシェリヒア・コＩＪＨ−４２５８（四ｌ’１Ｍ　ＢＰ
−９８５、ジアミノピメリン酸要求性、メチオニン要求
性、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性、リファン
ピシン耐性）にＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮニトロソ
クアニジン（ＮＴＧ）を用いて常法の変異処理（０，２
ｍｇ／ｍ＋！、３０℃、３０分間）を施す。バリンヒド
ロキサメー）（Ｉｇ／ｆｌ）を含む最少培地（グルコー
ス５ｇ／β、ＮＨ４（１２ｇ／β、ＫＨ２ＰＯ４２ｇ／
、ｆ！、Ｍｇ５０＋・７Ｈ２００，１ｇ／ｊｌ！、Ｆ　
ｅ２（Ｓｏ、）ａ　２０ｍｇ／　１２、ジアミノピメリ
ン酸５０ｍｇ／ＣＤＬ−メチオニン５０ｍｇ／Ａ、寒天
２０ｇ／＊　　ｐＨ７，２）に塗布する。

３０℃で２〜６日間培養し、生育してくる耐性株のコロ
ニーを取得する。バリンヒドロキサメート耐性変異株５
０株を釣菌し、Ｌ−スレオニン生産試験にかけ、親株よ
りＬ−スレオニン生産能が向上した菌株を選ぶ（本菌株
をエシェリヒア・コリＨ−７５３８という。）。また、
バリンヒドロキサメートのかわりにα−アミノ醋酸を２
ｇ／ｆｌ用いる以外は上記と同様の操作をおこないα−
アミノ醋酸耐性変異株を取得する（本菌株をエシェリヒ
ア・コリＨ−７６００という。）。これらの菌株はブダ
ペスト条約にもとづいて平成１年１２月２１日付で工業
技術院微生物工業技術研究所にそれぞれＦＥＲＭ　　Ｂ
Ｐ−２６９６、ＦＥＲＭ　　ＢＰ２６９８として寄託さ
れている。

なお、本発明で用いられた変異株と、親株（Ｈ４２５８
株）を、バリンヒドロキサメートあるいはα−アミノ酪
酸を含む最少寒天培地上で、３０℃、２４時間培養した
ときの生育の程度を比較した結果を第１表で示す。

第　　　　１　　　　表 十：良く生育する ±：やや生育する ：生育しない 本発明の微生物によるＬ−スレオニンの生産は、通常の
培養法にて実施可能である。使用培地としては、炭素源
、窒素源、無機物そのほか使用菌株の必要とする微量の
栄養素を程よく含有する培地ならば、合成培地または天
然培地いずれも使用可能である。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、ラクトー
ス、糖蜜、澱粉または粗糖の加水分解物などの炭水化物
、ピルビン酸、酢酸、プロピオン酸、ギ酸、フマール酸
、リンゴ酸などの有機酸などが用いられる。さらに微生
物の資化性によっては、グリセリン、エタノールなどの
アルコールなども用いられる。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、酢酸アンモニウム、燐酸アンモニウムな
どの各種無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、アミ
ン類、そのほか含窒素化合物、ならびにペプトン、肉エ
キス、コーン・ステイープ・リカー、カゼイン加水分解
物、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物
などが用いられる。

無機物としては、燐酸第一カリウム、燐酸第二カリウム
、燐酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウ
ム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウ
ムなどが用いられる。

培養は振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条
件下、温度２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃、ｐ
　Ｈ５〜９、好ましくは中性付近に保持しておこなわれ
、通常２〜７日で完了する。

培地のｐＨ調整は炭酸カルシウム、無機または有機の酸
、アルカリ溶液、アンモニア、ｐＨ緩衝液などによって
おこなわれる。

培養終了後、培養液から菌体などの沈殿物を除去し、イ
オン交換処理法、濃縮法、塩析法などを併用することに
より、培養液からＬ−スレオニンを回収することができ
る。

以下に本発明の詳細な説明する。

実施例１ エシェリヒア・コリＨ−７５３８、Ｈ−７６００および
親株であるＨ−４２５８を、グルコース２０ｇ／β、ペ
プトン１０ｇ／Ｃ酵母エキスＬｏｇ／ｊＬＮａｃｊ２　
２．５ｇ／ｊ２、ジアミノピメリン酸０．５ｇ／ｊｌ！
の組成からなる種培地（ｐＨ７，４）で、３０℃、１６
時間振盪培養した。得られた種培養液１００ｍ１を１１
の下記発酵培地を含む２ｊ２の発酵槽に植菌し、温度３
０℃、攪拌数８００ｒｐｍ、通気量１β／ｍｉｎ、にて
培養した。培養中のｐＨ調整および窒素源の供給はアン
モニア水でおこない、ｐＨは約６．５に維持した。グル
コースを適宜供給しつつ、８０時間培養をおこなった。

その際のＬ−スレオニンの生産量を高速液体クロマトグ
ラフィー法により定量し、結果を第２表にまと狛だ。

発酵培地の組成は以下の通りである。

グルコース４０　ｇ＃、（ＮＨ，）２ＳＯ４１２ｇ／β
、ＫＨ２Ｐ０，２ｇ／β、Ｍｇ５Ｏ＜・７　Ｈ２Ｏ１ｇ
／ｊｌ！−ジアミノピメリン酸０．９ｇ／β、ＤＩ−−
メチオニン０．３ｇ／β、コーン・ステイープ・リカー
５ｇ＃ｌ’（ｐＨ７，４） Ｈ−７５３８株を用いて得たＬ−スレオニン含有培養物
１１を遠心分離（３，００Ｏｒｐｍ、　１０分）にかけ
菌体その他の不純物を除去した。得られた上澄液を強酸
性陽イオン交換樹脂ダイヤイオン５ＫＩ（Ｈ型）のカラ
ムに通し、Ｌ−スレオニンを吸着させ、水洗後０．５規
定のアンモニア水で溶出して、Ｌ−スレオニン画分を集
めた。集めた両分を濃縮し、エタノールを加えて冷却下
で保存することにより、純度９８％以上のＬ−スレオニ
ンの結晶が３０ｇ得られた。

第　　　　２　　　　表 −４２５８ ７５３８バリンヒドロキ サメート耐性 ３６．３ ３８．５ Ｈ−７６００α−アミノ酪酸耐性 ４０．３ 発明の効果 本発明によれば、アミノ酸製剤や飼料添加物として有用
なＬ−スレオニンを、収率よく安価に製造することがで
きる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. エシェリヒア属に属し、バリンアナログに耐性を有し、
   かつＬ−スレオニン生産能を有する微生物を培地に培養
   し、培養物中にＬ−スレオニンを生成蓄積させ、該培養
   物よりＬ−スレオニンを採取することを特徴とする発酵
   法によるＬ−スレオニンの製造法。