JPS62171692A - 発酵法によるｌ−スレオニンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、発酵法によるＬ−スレオニンの製造方法に関
するものである。

〈従来の技術〉 プロテウスまたはプロビデンシアに属する微生物を用い
た発酵法によるし−スレオニンの製造方法としては、し
−イソロイシン要求性株を用いる方法（特公昭４３−４
４４０号公報〉やα−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸
に耐性を有し、かつし−イソロイシン要求性を有する微
生物を用いる方法（日本農芸化学会講演要旨束９頁（１
９７０）が知られている。

〈発明が解決しようとする問題点〉 しかし、これらの方法によるＬ−スレオニンの生成蓄積
濃度、または、糖などの原料からのＬ−スレオニン生成
収率は、十分に満足できるものではなかった。

く問題点を解決するための手段および作用〉本発明者ら
は、ざらに生産性の高いＬ−スレオニンの′＃造方法に
ついて、鋭意研究した結果、プロビデンシア属に属し、
Ｌ−スレオニン生産能を有する微生物にスレオニンアル
ドラーゼ欠損性を付与することによって、し−スレオニ
ン蓄積濃度、生成数率が著しく向上することを見出し、
本発明に到達した。

本発明で用いられる微生物は、プロビデンシア属に属し
くバージ−のマニュアル・オブ・システマテイツクバク
テリオロジーＶｏ１．１（１９８４＞、第４９５〜４９
６頁に従う）、スレオニンアルドラーゼを欠損する性質
とＬ−スレオニン生成能をあわぜ持つものでおる。

また、Ｌ−イソロイシンに対する栄養要求性、α−アミ
ノ−β−ハイドロキシ吉草酸なとスレオニンアナローブ
に対する耐性およびエチオニンなどメチオニンアナロー
ブに対する耐性はＬ−スレオニン生成能に有効に作用す
るので、これらのいくつかの特性ないしはすべての特性
を市わせ持つ微生物がより好ましく用いられる。

また、これら特性は通常の変異誘導操作により付与する
ことが可能でおる。

ここでいう栄養要求性とは、広義の意味でおり、不完全
欠失型（いわゆるＬｅａｋｙ型）も含むものである。

ざらにその要求物質の生合成前駆物質で要求性が満足さ
れる場合も含むものでおる。

本発明で用いられる微生物は変異株により提（Ｗされそ
の代表的なものとしては、例えば以下のものがおる。

プロビデンシア・レトゲリＮＳ−１３３（ＦＥＲＭ　　
Ｐ−８０８２）（α−アミノ−β−ハイドロキシ古草酸
耐性、エチオニン耐性、Ｌ−イソロイシン要求性、スレ
オニンアルドラーゼ欠損性）プロビデンシア・レトゲリ
ＮＳ１３３Ｉ−６９（ＥＥＲＭ　Ｐ−８０８５）（α−
アミノ−β−ハイドロキシ古草酸耐性、エチオニン耐性
、Ｌ−イソロイシン要求性、Ｌ−ロイシン要求性、スレ
オニンアルドラーゼ欠損性）プロごデンシア・レトゲリ
ＮＳ−１３３は、プロビデンシア・レトゲリＴＹ−１（
ＦＥＲＭ　　Ｐ−８０７９、α−アミノ−β−ハイドロ
キシ古草酸耐性、エチオニン耐性、Ｌ−イソロイシン要
求性）を親株として、スレオニンアルドラーゼ欠損性変
異株として分離されたものであり、また、プロビデンシ
ア・レトゲリＮ５１３３Ｉ−６９は、プロビデンシア・
レトゲリＮＳ１３３（ＦＥＲＭ　　Ｐ−８０８２＞を親
株として、通常の変異処理方法によって、Ｌ−ロイシン
要求性味として得られたものである。

スレオニンアルドラーゼ欠損性変異株を得るには、親株
を紫外線照射するか、あるいは変異誘発剤（例えば、Ｎ
−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニジン、エ
チルメタンスルホン酸など）で処理したのち、し−スレ
オニンを主な窒素源とし、ごく微量の酵母エキスを含む
ような平板培地にて、３０’Ｃで３〜５日培養し、生じ
た小ざなコロニーを釣菌分離する。そして、これらの菌
株のうち、休止菌体反応で、Ｌ−スレオニンからのグリ
シンの生成が親株よりも有意に少ない菌株をスレオニン
アルドラーゼ欠損性変異株として分離した。

本発明において用いる菌株と、その親株のスレオニンア
ルドラーゼ活性を検定した結果を実施例１に示す。

また、本発明においては、上記のようにして取得される
スレオニンアルドラーゼ欠損性変異株に、Ｌ−ロイシン
要求性などのスレオニン生産性を向上せしめる特性を通
常の変異誘導操作によって付与することができるので、
このような変異株を使用することもでる。

本発明におけるＬ−スレオニン生産用の培地は、炭素源
、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機
微量成分を含有する通常の培地である。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、でん粉お
よびセルロースの加水分解物、糖蜜などの糖類、フマー
ル酸、クエン酸、コハク酸などのごとき有機酸、グリセ
ロールのごときアルコール類などを２〜１５％、窒素源
として、酢酸アンモニウムのごとき有機アンモニウム塩
、Ｅｉ［アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アン
モニウム、硝酸アンモニウムのごとき無機アンモニウム
塩、アンモニアガス、アンモニア水、尿素などを０．５
〜４．０％、有機微量栄養素としでは、Ｌ−インロイシ
ンなどの被要求物質が０．００１〜０．４％、または必
要に応じてコーンステイープリカー、ペプトン、酵母エ
キスなど０〜４％をそれぞれ適当量含有する培地が好適
に用いられる。これらの他に、リン酸カリウム、硫酸マ
グネシウム、硫酸第１鉄７水和物、ｆｉＭ酸マンガン４
−６水和物などが少量添加される。

培養は、好気的条件が望ましい。培養の間、培地のｐＨ
は５〜９に、温度は２４〜３７°Ｃに調節し、４８〜１
２０時間振どうまたは、通気培養すれば好ましい結果が
得られる。

培養液からＬ−スレオニンを採取するには、例えば、菌
体を除去した培養を濾過液をｐＨ２に塩酸で調製したの
ち、強酸性カチオンイオン交換樹脂に通液後、希アンモ
ニア水で吸着成分を溶出し、脱アンモニア・後、濃縮す
る。これにアルコールを添加し、冷却保存下で生成した
結晶を集め、し−スレオニンを得ることができる。

〈実施例〉 実施例１ Ａ、（スレオニンアルドラーゼ欠損変異株の取得） プロビデンシア・レトゲリＴＹ−１（ＦＥＲＭ　　Ｐ−
８０７９、α−アミノ−β−ハイドロキシ古草酸耐性、
し−エチオニン耐性、Ｌ−イソロイシン要求性）の菌体
に通常の方法で紫外線照射し、この細胞を酵母エキス０
．０１％添加した寒天平板培地（グルコース０．５％、
Ｌ−ルあン０．５％、リン酸第１カリウム０．３％、リ
ン酸第２カリウム０．７％、硫１１マグネシウム７水和
物０．０１％、Ｌ−イソロイシン０．００５％、寒天２
％）に塗布した。次に、３０’Ｃで４〜６日培養し、生
じたコロニーのうち小ざなコロニーを釣菌分離した。

この分離した菌株の洗浄菌体を１７１１Ｍピリドキサー
ル−５′−リン酸存在下でＬ−スレオニン１０’ｊ／ｉ
と３０℃、４時間反応させ、生成したグリシンが親株と
比べて有意に少ない菌株として、　スレオニンアルドラ
ーゼ欠損株（プロごデンシア・レトゲリＮＳ−１３３＞
を取得した。

Ｂ、（スレオニンアルドラーゼ欠損性の検定）下記第１
表に示す各菌株を、し−スレオニン５３／ｉを含むブイ
ヨン培地’ｆｏｏｄで３０’０゜５時間、坂ロフラスコ
を用いて振どう培養した。

この菌体を５０ＴｒＬＭリン酸カリウムバッファー（１
１８，０＞で二度洗浄したのち、超音波処理（０°Ｃ１
’１００Ｗ、５分間）により菌体を砥砕した。

コ（７）菌体紙砕液を遠心（１０，ＯＯＯｒｐｍ、４°
Ｃ１２０ｍ１ｎ）ｂ、その上清を粗酵素液とした。

この粗酵素液を用いて、下記組成の酵素反応液系で、ス
レオニンアルドラーゼ活性を測定した。

酵素反応液 １２５７７ＬＭ　　　　Ｌ−スレオニン　　０．１　ｒ
ｎＩ！１Ｍ、ｐＨ８−５トリス−ＨＣＬ　　　０．１ｄ
バツノアー ０．９Ｍ　　　　　　　ＫＣＪ！　　　　　　　　０．
１ｍ１Ｏ，５ｍＭ　　　　　ピリドキサール　　０．１
戒−５−一リン酸 １４５ＩｔＪ　　　　アルコール　　　　０．１ｍｌデ
ヒドロゲナーゼ ２ｍＭ、　　　　　　ＮＡＤＨ０，１ｄ粗酵素液　　　
　　　　　　　　　　０．１　ｄＨ２００，３ｄ スレオニンアルドラーゼによって、スレオニンから生成
するアセトアルデヒドをＮＡＤＨの減少によって測定し
た。

第　　　１　　　表 ＊スレオニンアルドラーゼ活性は、蛋白１ｍｇ１たり、
１分間に生成するアセトアルデヒドの　μｍｏ　ｌ　ｅ
で表わした。

結果は、第１表に示すとありでおり、本発明で使用する
プロビデンシア・レトゲリＮ５１３３は、親株のプロビ
デンシア・レトゲリＴＹ−１と比べて、スレオニンアル
ドラーゼ欠損性でおることが明らかでおる。

実施例２ △、（Ｌ−ロイシン要求性変異株の取得）プロビデンシ
ア・レトゲリＮ５１３３　（ＦＥＲＭ　　Ｐ−８０８２
、α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸耐性、Ｌ−エチ
オニン耐性、Ｌ−イソロイシン要求性、スレオニンアル
ドラーゼ欠損性）の菌体に、通常の方法で紫外線照射し
、この細胞をポリペプトンＯ６Ｏ″１％添加した寒天平
板培地（グルコース０．５％、硫安０．１％、リン酸第
１カリウム０．３％、リン酸第２カリウム０．７％、硫
酸マグネシウム７水和物０．０１％、Ｌ−イソロイシン
Ｏ１Ｏ○５％、寒天２％）に塗布した。

次に、３０’Ｃで４〜６日間培養し、生じたコロニーの
うち小ざなコロニーを釣菌分離した。

分離された菌株のうちより実施例１のＢに示す方法によ
り、Ｌ−ロイシン要求性変異株を選出した。

Ｂ、（Ｌ−ロイシン要求性の検定） 下記第１表に示す各菌株を、ブイヨン寒天斜面培地で２
４時間培養しその菌体をごく微量かきとり、し−ロイシ
ン無添加およびＬ−ロイシン０．０１％添加した下記組
成の合成寒天平板培地にうすく塗布し、３０′Ｇで４〜
６日間培養しその生育の有無を観察した。し−ロイシン
無添加寒天平板培地で生育できず、Ｌ−ロイシン添加寒
天平板培地で生育するものをＬ−ロイシン要求性変異株
とした。

合成寒天培地 グルコース　　　　　　　０．５　　％（ＮＨ４）　２
３０４　　　０．１　　％ＫＨ２ＰＯ４０，３％ に２ＨＰＯ４０，７％ Ｍ　ｇＳ　Ｏ４・７Ｈ２００，０１％ Ｌ−イソロイシン　　　○、００５％ 寒　　　　　天　　　　　　　　　　　２．０　　　％
結果は第２表に示すとありであり、本発明方法で使用す
るし一ロイシン要求性株プロビデンシア・レトゲリＮ５
１３３Ｉ−６９は、親株のプロビデンシア・レトゲリＮ
５１３３との比較より明らかに、Ｌ−ロイシン要求性を
獲得している。

第　　　２　　　表 （注）＋：生育おり　　−二生育なし 実施例３ 第３表に示す各菌株をそれぞれ液体ブイヨン培地で３０
°Ｃ１１６時間搬とうして前培養したのち、あらかじめ
１１５°Ｃ，１０分間蒸気滅菌した下記組成の主発酵用
培地（ただし表−２の比較例として示した親株の場合に
はし一ロイシンは無添加）４０ｄを含む１１容、三角フ
ラスコに植継ぎ３０′Ｇ、１５０ｒｐｍ、１辰幅３　ｃ
ｍの条件下で９０時間培養した。

発酵用培地 グルコース（別滅菌）　　　　８　％ （ＮＨ４）２Ｓ０４　　　　２　％ ＫＨ２ＰＯ４０，１％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０４％ １：　ｅ　＋　＋　　　　　　　　　　２　　％Ｍ　ｎ
　＋　＋　　　　　　　　　　２　　％Ｌ−イソロイシ
ン　　　０．００２５％Ｌ−ロイシン　　　　　　　０
．０８％ＣａＣＯ３（別滅菌）　　　　４　％ ＤＨ７゜０ ７．０（ＫＯＨで中和 培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを除去したン戸液中
のＬ−スレオニン濃度を自動アミノ酸分析計（日本電子
ＪＬＣ２０ＯＡ＞で定量したところ第３表に示すような
結果を得た。

第　　　３　　　表 スレオニン生成収率は、消費グルコースに対する生成ス
レオニンの重量収率で表わした。蓄積濃度、Ｌ−スレオ
ニン生成収率ともいずれの場合も親株に比べて有意に向
上した。

実施例４ プロビデンシア・レトゲリＮＳ１３３　ｌ−６）　　９
を、液体ブイヨン培地で３０’Ｃ１１６時間娠どう培養
し、これを実施例２の発酵用培地のうち（ＮＨ４）２３
０４　を０．５％、１ｊ）Ｉ、、コー’：）、ヲ４．０
％とした培地９００ｍ１を分注したガラス製小型ジャー
ファーメンタ−へ１０％となるように接種した。３０’
Ｃで、ａｏｏｒｐｍ、通気量１ｖｖｍで、通気攪拌培養
を開始した。

ＤＨ調節および窒素源の供給は、２５％アンモニア水で
行い、ｐＨは、６．５〜８．０に維持した。

グルコースを適宜添加し、最終的に合計１２０９のグル
コース培養に用いた。

７６時間培養後、培養液中には２３．０ｙ／ｆのＬ−ス
レオニン（対グルコース重量収率１９゜１％）が生成し
た。

培養液より菌体を除き、その５００ｍ１を強力チオン交
換樹脂ダイヤイオンＳＫ・ｌ５（Ｈ型のカラムにとおし
た。カラムを水洗後、２Ｎアンモニア水でカラムの吸着
成分を溶出し、脱色後、減圧濃縮した。これにエタノー
ルを加え、冷却し、生成した結晶を集めて乾燥した結果
、純度９６％以上のＬ−スレオニンの結晶１０．４９が
得られた。

〈発明の効果〉 本発明により、高い収率および蓄積濃度でＬ−スレオニ
ンの生成が可能となり、より安価なＬ−スレオニンの生
産が可能となる。

特許出願大東し株式会社

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属に
   属し、スレオニンアルドラーゼ欠損性を有し、かつＬ−
   スレオニン生産能を有する微生物を培養して、培養液中
   にＬ−スレオニンを生成蓄積せしめ、前記培養液よりＬ
   −スレオニンを採取することを特徴とする発酵法による
   Ｌ−スレオニンの製造方法。
2. （２）使用する微生物がさらにＬ−ロイシン要求性を有
   する微生物であることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項記載の発酵法によるＬ−スレオニンの製造方法。