JPH0346113B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

＜産業上の利用分野＞ 本発明は、発酵法によるＬ−スレオニンの製造
方法に関するものである。 ＜従来の技術＞ プロビデンシア属に属する微生物を用いる発酵
法によるＬ−スレオニンの製造法としては、メチ
オニン代謝拮抗物質に耐性を有し、かつＬ−スレ
オニン生産性を有する微生物を用いる方法（特開
昭61−216698号公報）や、生育のためにＬ−ロイ
シンを必要とし、かつＬ−スレオニン生産能を有
する微生物を用いる方法（特開昭61−260891号公
報）が知られている。 ＜発明が解決しようとする問題点＞ しかし、これらの方法によるＬ−スレオニンの
生成蓄積濃度、または、糖などの原料からのＬ−
スレオニン生成収率は十分に満足できるものでは
なかつた。 ＜問題点を解決するための手段および作用＞ 発明者らは、さらに生産性の高いＬ−スレオニ
ンの製造方法について鋭意研究した結果、プロビ
デンシア属に属しＬ−スレオニン生産能を有する
微生物に、Ｌ−ホモセリンに対して耐性を付与す
ることによつて、Ｌ−スレオニン生産性が向上す
ることを見い出し本発明に到達した。 すなわち、本発明は、プロビデンシア属に属
し、Ｌ−ホモセリンに対する耐性を有し、かつＬ
−スレオニン生産能を有する微生物を培養して、
培養液中にＬ−スレオニンを生成蓄積せしめ、前
記培養液よりＬ−スレオニンを採取することを特
徴とする発酵法によるＬ−スレオニンの製造法で
ある。 次に本発明を詳細に説明する。 本発明で用いられる微生物はプロビデンシア属
に属し（バージーのマニユアル・オブ・システマ
テイク・バクテリオロジー第一巻（1984）、第495
〜496頁に従う）、Ｌ−ホモセリンに対して耐性を
有する微生物である。 かかる性質を有していれば、他の栄養要求性、
他の薬剤抵抗性を持つものでも本発明の範囲に含
まれる。特にＬ−ホモセリン耐性に加え、Ｌ−イ
ソロイシンまたは、Ｌ−ロイシンに対する栄養要
求性ないし1eaky型要求性、α−アミノ−β−ヒ
ドロキシ吉草酸などスレオニン代謝拮抗物質に対
する耐性およびエチオニンなどメチオニン代謝拮
抗物質に対する耐性は、Ｌ−スレオニン生成能に
有効に作用するので、これらのいくつかの特性な
いしはすべての特性をあわせ持つ微生物がより好
ましく用いられる。 本発明で用いられる変異株の代表的なものとし
ては、例えば、プロビデンシア・レトゲリHSR1
−33（FERM Ｐ−9192）が挙げられる。 この変異株は、プロビデンシア・レトゲリ
OTR28−31（α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸
耐性、Ｌ−エチオニン耐性、チアイソロイシン耐
性、オキシチアミン耐性、Ｌ−ロイシン要求性、
Ｌ−イソロイシン要求性ないしleaky型要求性）
を親株として、通常の変異処理方法によつて得ら
れたもので、Ｌ−ホモセリンに耐性を有する変異
株である。 変異株の誘導は、通常の変異処理法によつて行
うことができる。すなわち、Ｌ−ホモセリンに耐
性を有する変異株を得るには、親株を紫外線照射
するか、あるいは、変異誘発剤（例えば、Ｎ−メ
チル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、
エチルメタンスルホン酸など）で処理したのち、
親株が十分生育できないような濃度のＬ−ホモセ
リンを含む固体培地で、親株に比べて有意に生育
可能な菌株を取得すればよい。 本発明におけるＬ−ホモセリン耐性株とは、そ
の親株より強い耐性を有する菌株のことであり、
好ましくは親株の24時間後の相対生育度が40％以
下になるようなＬ−ホモセリン濃度を含む培地で
培養した場合の相対生育度が50％以上を示すよう
なものをいう。 例えば、Ｌ−ホモセリン耐性株の場合は、Ｌ−
ホモセリン１ｇ／となるように添加した培地で
培養した時の24時間後の生育度が、無添加の場合
の50％以上のものをＬ−ホモセリン耐性株とい
う。 ここで、相対生育度は、培養液の660nｍにお
ける吸光度を測定し、各菌株のＬ−ホモセリンを
添加していない培養液の吸光度を100％として表
わした場合の相対吸光度で示すものとする。 本発明におけるＬ−スレオニン生産用の培地
は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応
じてその他の有機微量成分を含有する通常の培地
である。 炭素源としては、グルコース、フラクトース、
でん粉およびセルロースの加水分解物、糖蜜など
の糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸などの
ごとき有機酸、グリセロールのごときアルコール
類などを２〜15％、窒素源として、酢酸アンモニ
ウムのごとき有機アンモニウム塩、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、
硝酸アンモニウムのごとき無機アンモニウム塩、
アンモニアガス、アニモニア水、尿素などを0.5
〜4.0％、有機微量栄養素としては、Ｌ−イソロ
イシンなどの被要求物質が0.001〜0.4％、または
必要に応じてコーンステイープリカー、ペプト
ン、酵母エキスなど０〜４％をそれぞれ適当量含
有する培地が好適に用いられる。これらの他に、
リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄
７水和物、硫酸マンガン４−６水和物などが微量
成分として少量添加される。 培養は、好気的条件で行う。培養の間、培地の
PHは５から９に、温度は24〜37℃に調節し、48〜
120時間振とうまたは通気培養すれば好ましい結
果が得られる。 培養液よりＬ−スレオニンを採取するには、通
常の方法を用いることができる。例えば、菌体を
除去した培養液をPH２に塩酸で調製したのち、
強酸性カチオンイオン交換樹脂に通液後、希アン
モニア水で吸着成分を溶出し、脱アンモニア後、
濃縮する。これにアルコールを添加し、冷却保存
下で生成した結晶を集め、Ｌ−スレオニンを得る
ことができる。 ＜実施例＞ 以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。 実施例 １ Ａ （ホモセリン耐性株の分離） プロビデンシア・レトゲリOT28−31（α−
アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性、Ｌ−エチ
オニン耐性、チアイソロイシン耐性、オキシチ
アミン耐性、Ｌ−ロイシン要求性、Ｌ−イソロ
イシン要求性ないしleaky型要求性）の菌体に
常法によりＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジン処理（300μｇ／ml、30℃で20
分）したのち、この細胞をＬ−ホモセリン１
ｇ／、Ｌ−ロイシン50mg／、Ｌ−イソロイ
シン50mg／添加した寒天培地（グルコース
0.5％、硫安0.1％、リン酸第１カリウム0.3％、
リン酸第２カリウム0.7％、硫酸マグネシウム
７水和物0.01％を含む完全合成培地）に塗布し
た。 次に30℃にて、５〜７日培養し、Ｌ−ホモセ
リン耐性株プロビデンシア・レトゲリHSR1−
33を取得した。 Ｂ （ホモセリン耐性株の耐性度） 下記第１表に示す各菌株を液体ブイヨン培地
を用いて30℃で７時間振とう培養し、生育した
菌体を集菌し生理食塩水でよく洗浄した。この
菌体懸濁液を、それぞれＬ−ホモセリン0.01、
0.5、１ｇ／の濃度で含む最少培地（培地組
成：グルコース0.5％、硫安0.1％、リン酸第１
カリウム0.3％、リン酸第２カリウム0.7％、硫
酸マグネシウム７水和物0.01％、Ｌ−イソロイ
シン0.005％、Ｌ−ロイシン0.005％）５mlに植
菌して、30℃で24時間培養し、各菌株の生育度
を調べた。その結果は、第１表に示すとおりで
ある。ただし、Ｌ−ホモセリンは、市販のもの
を用いた。 本発明方法で使用するＬ−ホモセリン耐性株
プロビデンシア・レトゲリHSR1−33では、親
株のプロビデンシア・レトゲリOTR28−31と
比較して、Ｌ−ホモセリンによつて生育が阻害
されず、Ｌ−ホモセリンに対する耐性を獲得し
ていることが明らかである。

【表】 実施例 ２ （Ｌ−スレオニン生産菌の培養およびＬ−スレ
オニンの生産） 第２表に示す各菌株を液体ブイヨン培地を用い
て30℃、20時間振とうして前培養したのち、115
℃、10分間オートクレーブで滅菌した下記組成の
発酵培地40mlを含む１容三角フラスコに接種
し、30℃、150rpm、振幅３cmの条件下で72時間
培養した。 発酵用培地 グルコース（別滅菌） ８％ （NH₄）₂SO₄ ３％ KH₂PO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.04％ Fe⁺⁺ 2ppm Mn⁺⁺ 2ppm Ｌ−イソロイシン 0.005％ Ｌ−ロイシン 0.06％ CaCO₃（別滅菌） ４％ PH ７（KOHで中和） 培養終了後、培養液から菌体、炭酸カルシウム
を除去し、その液中のＬ−スレオニンを自動ア
ミノ酸分析計（日本電子JLC・200A）で定量し
たところ、第２表に示す結果を得た。

【表】 スレオニン生成収率は、消費グルコースに対す
る生成スレオニン重量収率で表わした。 本発明のプロビデンシア・レトゲリHSR1−33
は、親株のプロビデンシア・レトゲリOTR28−
31と比較して、蓄積量、生成収率とも、顕著に高
いＬ−スレオニンを生産した。 実施例 ３ 第３表に示す菌株を、液体ブイヨン培地で30
℃、20時間、振とう培養し、これを実施例２の発
酵用培地のうち、（NH₄）₂SO₄を0.5％、グルコー
スを4.0％とした以外は同様の培地800mlを分注し
たガラス製小型ジヤーフアーメンターへ、接種サ
イズ10％となるように接種した。30℃、800rpm、
通気量1vvmで、通気撹拌培養を開始した。PH調
節および窒素源の供給は、25％アンモニア水で行
ない、PHは6.5〜8.0に維持した。グルコース、
KH₂PO₄、MgSO₄・7H₂O、Ｌ−ロイシンおよび
Ｌ−イソロイシンを断続的に添加しながら、72時
間培養したところ、第３に示すような結果を得
た。

【表】 プロビデンシア・レトゲリHSR1−33の培養液
より菌体を除き、その液500mlを強カチオン交
換樹脂ダイヤイオンSK−1B（Ｈ型のカラムにと
おした。カラムを水洗後、2Nアンモニア水でカ
ラムの吸着成分を溶出し、脱色後減圧濃縮した。 これにエタノールを加え、冷却し、生成した結
晶を集めて乾燥した結果、純度96％以上のＬ−ス
レオニン33.1ｇを得た。 ＜発明の効果＞ 本発明法により、高い収率および高い蓄積濃度
でＬ−スレオニン生成が可能となり、よち安価な
Ｌ−スレオニン生産が可能となる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ プロビデンシア（Providencia）属に属し、
   Ｌ−ホモセリン耐性を有し、かつＬ−スレオニン
   生産能を有する微生物を培養して、培養液中にＬ
   −スレオニンを生成蓄積せしめ、前記培養液より
   Ｌ−スレオニンを採取することを特徴とする発酵
   法によるＬ−スレオニンの製造法。