JPH0313874B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は発酵法によるＬ−スレオニンの製造法
に関するものである。 〔従来の技術〕 プロビデンシア属に属する微生物を用いる発酵
法によるＬ−スレオニンの製造法はまだ知られて
いない。ただし、バージーのマニユアル・オブ・
システマテイツク・バクテリオロジー第１巻
（1984）で一部プロビデンシア属に分類変更され
た旧プロテウス属に属する微生物を用いた発酵法
によるＬ−スレオニンの製造方法としては、Ｌ−
イソロイシン要求株を用いる方法（特公昭43−
4440号公報）やα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草
酸に耐性を有し、かつＬ−イソロイシン要求性を
有する微生物を用いる方法（日本農芸化学会講演
要旨集p.9（1970））が知られている。 〔発明が解決しようとする問題点〕 しかし、これらの方法によるＬ−スレオニンの
生成蓄積濃度、または糖などの原料からのＬ−ス
レオニン生成収率は十分に満足できるものではな
かつた。 〔問題点を解決するための手段および作用〕 本発明者らはさらに生産性の高いＬ−スレオニ
ンの製造方法について鋭意研究した結果、プロビ
デンシア属に属しＬ−スレオニン生産能を有する
微生物にアスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を付
与することにより、Ｌ−スレオニン蓄積濃度、生
成収率が著しく向上することを見い出し本発明に
到達した。 すなわち、本発名はプロビデンシア属に属し、
アスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有し、かつ
Ｌ−スレオニン生産能を有する微生物を培養して
培養液中にＬ−スレオニンを蓄積せしめ、該培養
液よりＬ−スレオニンを採取することを特徴とす
る発酵法によるＬ−スレオニンの製造法である。 プロビデンシア属に属する微生物のアスパラギ
ン酸代謝拮抗物質に耐性を有する変異株は、これ
まで分離されたことがない。また、コリネバクテ
リウム属に属し、アスパラギン酸代謝拮抗物質に
耐性を有する変異株を用いてＬ−リジンを製造す
ることは公知である（特公昭57−9798号公報）
が、本発明のごとく、プロビデンシア属に属する
微生物のアスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有
する変異株が、Ｌ−スレオニンを著量生成蓄積せ
しめ得ることは、まつたく知られていない。 ここでアスパラギン酸代謝拮抗物質とは、プロ
ビデンシア属に属する微生物の(1)生育を阻害し、
その生育阻害がＬ−アスパラギン酸の添加により
回復する物質または(2)Ｌ−アスパラギン酸生合成
系に関与する酵素の制御作用および阻害作用を示
し、その制御あるいは阻害がＬ−アスパラギン酸
の添加により回復する物質のことである。 アスパラギン酸代謝拮抗物質としては、例えば
アスパラギン酸ヒドロキサメート、α−メチルア
スパラギン酸、β−メチルアスパラギン酸、シス
テインスルフイン酸、ジフルオロコハク酸、ハダ
シジン等が挙げられる。本発明で用いられる微生
物はプロビデンシア属に属し（バージーのマニユ
アル・オブ・システマテイツク・バクテリオロジ
ー第１巻（1984）、第495〜496頁に従う）、アスパ
ラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有する微生物であ
る。かかる性質を有していれば、他の要求性、他
の薬剤抵抗性をもつものでも本発明の範囲に含ま
れる。またＬ−イソロイシンに対する栄養要求性
およびＬ−ロイシンに対する栄養要求性、α−ア
ミノ−β−ヒドロキシ吉草酸等スレオニンアナロ
ーグに対する耐性およびエチオニン等メチオニン
アナローグに対する耐性はＬ−スレオニン生成能
に有効に作用するので、これらのいくつかの特性
ないしはすべての特性をあわせ持つ微生物が親株
としてより好ましく用いられる。またこれらの特
性は通常の変異誘導操作により付与することが可
能である。ここでいう栄養要求性とは広義の意味
であり、不完全欠失型（いわゆるleaky型）も含
むものである。さらにその要求物質の生合成前駆
物資で要求性が満足される場合も含むものであ
る。 本発明で用いられる変異変の代表的なものとし
ては例えば以下のものがある。プロビデンシア・
レトゲリTP5−25（FERMP−8228）。 この変異株はプロビデンシア・レトゲリ
FPSS25（FERMP−8227）、（α−アミノ−β−ヒ
ドロキシ吉草酸耐性、Ｌ−イソロイシン要求性、
Ｌ−エチオニン耐性、Ｌ−ロイシン要求性、ピル
ベートキナーゼウイーク）を親株として、通常の
変異処理方法によつて得られたもので、アスパラ
ギン酸ヒドロキサメートに耐性の変異株である。 変異株の誘導は親株を紫外線照射するか、ある
いは変異誘発剤（例えばＮ−メチル−N′−ニト
ロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスル
ホン酸等）で処理した後、親株が生育できないよ
うな濃度のアスパラギン酸代謝拮抗物質を含む固
定培地で生育可能な菌株を採取すればよい。 アスパラギン酸代謝拮抗阻害剤耐性変異株とは
親株よりアスパラギン酸代謝拮抗物質に強い耐性
を有する株のことであり、好ましくは親株の相対
生育度が30％以下を示すアスパラギン酸代謝拮抗
物質の濃度範囲において60％以上の相対生育を示
す変異株のことである。ここで相対生育度は培養
液の660nｍにおける吸光度を測定し、各菌株の
アスパラギン酸代謝拮抗物質を添加していない培
養液の吸光度を100％として表わした場合の相対
吸光度で示す。耐性を検定する場合のアスパラギ
ン酸代謝拮抗物質は市販のものを用いた。本発明
において用いる菌株とその親株のDL−アスパラ
ギン酸ヒドロキサメートに対する耐性を検定した
結果を実施例１に示す。 本発明におけるＬ−スレオニン生産用の培地
は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応
じてその他の有機微量成分を含有する通常の培地
である。 炭素源としては、グルコース、フラクトース、
でん粉およびセルロースの加水分解物、糖密等の
糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の如き
有機酸、グリセロールの如きアルコール類等を２
〜15％、窒素源として、酢酸アンモニウムの如き
有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニ
ウムの如き無機アンモニウム塩、アンモニアガ
ス、アンモニア水、尿素等を0.5〜4.0％、有機微
量栄養素としては、Ｌ−イソロイシン等の被要求
物質が0.001〜0.4％、または必要に応じてコーン
ステイーブリカー、ベプトン、酵母エキス等０〜
４％をそれぞれ適当量含有する培地が好適に用い
られる。これらの他にリン酸カリウム、硝酸マグ
ネシウム、硫酸第１鉄７水和物、硫酸マンガン４
−６水和物等が微量成分として少量添加される。 培養は、好気的条件で行なう。培養の間、培地
のPHは５から９に、温度は24〜37℃に調節し、48
〜120時間振とうまたは通気培養すれば好ましい
結果が得られる。 培養液よりＬ−スレオニンを採取するには、例
えば菌体を除去した培養液をPH２に塩酸で調製
したのち、強酸性カチオンイオン交換樹脂に通液
後、希アンモニア水で吸着成分を溶出し、脱アン
モニア後、濃縮する。これにアルコールを添加
し、冷却保存下で生成した結晶を集め、Ｌ−スレ
オニンを得ることができる。 実施例 以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。 実施例 １ （DL−アスパラギン酸ヒドロキサメート耐性
株の分離） プロビデンシア・レトゲリFPSS25（FERMP−
8827）（α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性、
Ｌ−イソロイシン要求性、Ｌ−エチオニン耐性、
Ｌ−ロイシン要求性、ピルベートキナーゼウイー
ク）の菌体に常法によりＮ−メチル−N′−ニト
ロ−Ｎ−ニトロソグアニジン処理（300μｇ／ml、
30℃で10分）した後、この細胞をDL−アスパラ
ギン酸ヒドロキサメート２ｇ／添加した寒天培
地（グルコース0.5％、硫安0.1％、リン酸第１カ
リウム0.3％、リン酸第２カリウム0.7％、硫酸マ
グネシウム７水和物0.01％、Ｌ−イソロイシン
0.005％、Ｌ−ロイシン0.005％を含む最少培地）
に塗布した。次に30℃にて６〜８日培養し、生じ
た大きなコロニーを釣菌分離して、DL−アスパ
ラギン酸ヒドロキサメート耐性株（プロビデンシ
ア・レトゲリTP5−25（FERMP−8228））を取得
した。 実施例 ２ （DL−アスパラギン酸ヒドロキサメート耐性
変異株の耐性度） 下記第１表に示す各菌株を液体ブイヨン培地を
用いて30℃で16時間振とう培養し、生育した菌体
を集菌し生理食塩水で洗浄した。この菌体懸濁液
をDL−アスパラギン酸ヒドロキサメート０、
0.5、1.0、2.0、3.0ｇ／の濃度で含む最少培地
（グリコース0.5％、硫安0.1％、リン酸第１カリ
ウム0.3％、リン酸第２カリウム0.7％、硫酸マグ
ネシウム７水和物0.01％、Ｌ−イソロイシン
0.005％、Ｌ−ロイシン0.005％）５mlに植菌し
て、30℃にて培養し各菌株の対数増殖中期の生育
度を調べた。その結果は第１表に示すとおりであ
る。本発明方法で使用するDL−アスパラギン酸
ヒドロキサメートに耐性な変異株（プロビデンシ
ア・レトゲリTP5−25（FERMP−8228））では、
親株のプロビデンシア・レトゲリFPSS25
（FERMP−8227）と比較して、高濃度のDL−ア
スパラギン酸ヒドロキサメートによつて生育が阻
害されず、強いDL−アスパラギン酸ヒドロキサ
メート耐性を獲得していることを示している。

【表】 実施例 ３ （Ｌ−スレオニン生産菌の培養およびＬ−スレ
オニン生産） 第２表に示す各菌株をそれぞれ液体ブイヨン培
地で30℃、16時間振とうして前培養した後、あら
かじめ115℃、10分間蒸気減菌した下記組成の主
発酵培地40mlを含む１容三角フラスコに植え継
ぎ30℃、150rpm、振幅30cmの条件下で120時間培
養した。 発酵用培地 グルコース（別減菌） ６％ （NH₄）₂SO₄ ２％ KH₂PO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.04％ Fe 2ppm Mn 2ppm Ｌ−イソロイシン 0.0025％ Ｌ−ロイシン 0.08％ CaCO₃（別減菌） ４％ PH 7.0（KOHで中和） 培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを除去した
液中のＬ−スレオニン濃度を自動アミノ酸分析
計（日本電子JLC200A）で定量したところ第２
表に示すような結果を得た。

〔発明の効果〕

本発明法により高蓄積濃度、高収率でＬ−スレ
オニン生成が可能となり、より安価なＬ−スレオ
ニンの生産が可能となる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ プロビデンシア属に属し、アスパラギン酸代
   謝拮抗物質に耐性を有し、かつＬ−スレオニン生
   産能を有する微生物を培養して培養液中にＬ−ス
   レオニンを蓄積せしめ、該培養液よりＬ−スレオ
   ニンを採取することを特徴とする発酵法によるＬ
   −スレオニンの製造法。 ２ アスパラギン酸代謝拮抗物質がアスパラギン
   酸ヒドロキサメートである特許請求の範囲第１項
   記載の発酵法によるＬ−スレオニンの製造法。