JPH03195494A - 発酵法によるｌ―プロリンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、発酵法によるＬ−プロリンの製造方法に関す
るものである。

し−プロリンは拮抗物質の原料など医薬品原料として重
要である。

〈従来の技術〉 従来、発酵法によるＬ−プロリンの製造法としては、た
とえば、コリネバクテリウム属、クルチア属などに属す
る微生物を用いる方法が知られている（相田ら編「アミ
ノ酸発酵」Ｐ２１８〜２４２学会出版センター（１９８
６））。

〈発明が解決しようとする課題〉 しかしながら、従来法においては、発酵法によるＬ−プ
ロリン生産能を有する微生物として限られたものしか見
出されていなかった。

く課題を解決するための手段および作用〉そこで本発明
者らは従来の微生物とは異なった微生物であって、かつ
Ｌ−プロリン生産能を有する微生物を広く検索、研究し
た結果、１０ビデンシア属に属する微生物によって通常
の炭素源を含有する栄養培地にＬ−プロリンを著量蓄積
せしめることがでいることを見出し、先に提案した。

しかし、これらの方法によるＬ−プロリンの生成蓄積濃
度または糖などの原料からのＬ−プロリン生成収率は十
分に満足できるものではなかっな。

本発明者らは、さらに生産性の高いし一プ。

リンの製造方法について鋭意研究した結果、プロビデン
シア属に属しＬ−プロリン生産能を有する微生物にＬ−
アルギニンあるいはその生合成前駆物質であるＬ−オル
ニチン、Ｌ−シトルリンに対する要求性を付与すること
によって、し−グロリン蓄積濃度、生成収率が著しく向
上することを見出し本発明に到達した。

すなわち、本発明は、プロビデンシア属に属し、生育の
ために少なくともＬ−アルギニン、Ｌ−シトルリンある
いはＬ−オルニチンを必要とし、かつし−プロリン生産
能を有する微生物を培養して、培養液中にＬ−プロリン
を生成蓄積せしめ、前記培養液よりし一プリロンを採取
す、ることを特徴とする発酵法によるＬ−プロリンの製
造方法である。

以１　本発明を具体的に説明する。

本発明で用いられる微生物はプロビデンシア属に属スる
くバージ−のマニュアル・オブ・システマティック・バ
クテリオロジーＶｏ１．１（１９８４）第４９５〜４９
６頁に従う）、生育のために少なくともＬ−アルギニン
、Ｌ−オルニチンあるいはし一シトルリンを必要とする
性質とＬ−プロリン生成能を合せもつものである。

本発明で用いられる微生物は実質的にＬ−アルギニンを
生育のために必要とする、ずなわちＬ−アルギニンの栄
養要求性を有する。しかるにＬ−アルギニンは、その生
合成前駆体であるＬ−オルニチンあるいはし一シトルリ
ンから生体内で合成されるため、微生物がそのような合
成機能を有する場合には、Ｌ−アルギニンが存在しなく
ともＬ−オルニチンあるいはＬ−シトルリンが存在すれ
ば生育できる０本発明は、そのようなＬ−アルギニンの
生合成機能を有する微生物も有しない微生物も包含する
ものであって、従って、本発明で用いられる微生物は、
生育のために少なくともし一アルギニン、Ｌ−シトルリ
ンあるいはＬ−オルニチンを必要とするものである。こ
こにいう栄養要求性とは法論の意味であり、不完全欠失
型（いわゆるＬｅ　ａｋｙ型）も含むものである。さら
にその要求物質の生合成前駆物質で要求性が満足される
場合も含むものである。

また、本発明で用いられる微生物においてチアゾリン−
４−カルボン酸などの１０リンアナローグに対する耐性
はＬ−プロリン生成能に有効に作用するので、この特性
を合せもつ微生物がより好ましく用いられる。またこの
特性は通常の変異誘導操作により付与することが可能で
ある。

本発明で用いられる微生物は変異株により提供されその
代表的なものとしては、たとえば、プロビデンシア・レ
トゲリＡＲＧＡ６　（ＦＢＲＭ　　Ｐ−１１１’４−’
７）（イソロイシン要求性、チアゾリン−４−カルボン
酸耐性、３．４−デヒドロプロリン耐性、Ｌ−アルギニ
ン要求性）、プロビデンシア・レトゲリＡＲＧＡＩ　Ｏ
（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１１１’＋ｇ　）　　（イソロイシ
ン要求性、チアゾリン−４−カルボン酸耐性、３，４−
デヒドロプロリン耐性、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリ
ンあるいはＬ−アルキ１ニン要求性）が挙げられる。い
ずれの株もプロビデンシア・レトゲリＤＨＰＲ７−２（
ＦＥＲＭ　　Ｐ−１１１５０）を親株として通常の変異
処理方法によってし一アルギニン要求性株、Ｌ−シトル
リン要求性株あるいはＬ−オルニチン要求性株として得
られたものである。

Ｌ−アルギニン要求性株、Ｌ−シトルリン要求性株ある
いはＬ−オルニチン要求性株を得るには親株を紫外線照
射するかあるいは変異誘発剤（たとえばＮ−メチル−Ｎ
′−二トローＮ−二トロングアニジン）で処理したのち
、ブイヨン寒天培地などの栄養培地でコロニーを作らせ
、そのコロニーを通常の最少培地（たとえばデイビスの
最少培地）およびＬ−オルニチン、Ｌ−シトルリンまた
はＬ−アルギニンを含む最少培地にレプリカし、Ｌ−オ
ルニチン、し−シトルリンまたはＬ−アルギニンを含む
最少培地上にのみ生育する菌株を釣菌分離すればよい。

本発明におけるＬ−プロリン生産用の培地は炭素源、窒
素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量
成分を含有する通常の培地である。炭素源としては、グ
ルコース、フラクトース、でん粉およびセルロースの加
水分解物、糖蜜などの糖類、フマール酸、クエン酸、コ
ハク酸などのごとき有ａＳ、グリセロールのごときアル
コール類などを２〜１５％、窒素源として、酢酸アンモ
ニウムのごとき有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウム
、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモ
ニウムのごとき８！機アンモニウム塩、アンモニアガス
、アンモニア水、尿素などを０．５〜４０％、有機微量
栄養素としては、Ｌ−イソロイシンなどの被要求物質が
０．００１〜０．４％、または必要に応じてコーンステ
イブリカー、ペプトン、酵母エキスなど０〜４％をそれ
ぞれ適当量含有する培地が好適に用いられる。かかる培
地にはこれらの他にリン酸カリウム、硫酸マグネシウム
、硫酸第１鉄７水和物、硫酸マンガン４〜６水和物など
を少量添加するのが通常である。

培養は、好気的条件が望ましい、培養の間、培地のｐＨ
は５〜９に、温度は２４〜３７℃に調節し、４８〜１２
０時間振盪または通気培養すれば好ましい結果が得られ
る。

培養液からＬ−プロリンを採取するには常法で行うこと
ができる。たとえば菌体を除去した培！ＩＰ液をｐＨ２
に塩酸で調整したのち、強酸性カチオンイオン交換樹脂
に通液後、希アンモニア水で吸着成分を溶出し、脱アン
モニア後、：ａ縮晶析する。不純アミノ酸が混入する場
合はアルコールを添加し、不純アミノ酸を沈澱物として
除いた後、エタノール中で晶析し、Ｌ−プロリンを得る
ことができる。

〈実施例〉 以下、実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例Ｉ Ａ、（Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチンあるいはＬ−シ
トルリン要求性変異株の取得）プロビデンシア・レトゲ
リＤＨＰＲ７−２（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１１１５”Ｏ，Ｌ
−インロイシン要求性、チアゾリン−４−カルボン酸耐
性、３．４−デしドロプロリン耐性）の菌体に、通常の
方法でＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二トロングアニ
ジン処理（３００ｕｒ／ｍｌ、３０℃で１０分）した後
、この細胞をＬＢ寒天培地（トリプトン１％、酵母エキ
ス０．５％、塩化ナトリウム０．５％、寒天１．．５％
、ｐＨ７゜５）に塗布し、３０℃、２４時間静置培養し
た。生じたコロニーを最少培地およびＬ−アルギニン、
Ｌ−シトルリン、Ｌ−オルニチン各０．　ＯＯ５％含有
した最少培地（グルコース０．５％、リン第１酸カリウ
ム０．３％、リン酸第２カリウム０．７％、硫安０．１
％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０１％、Ｌ−イソ
ロイシン０．００５％、寒天１．５％）にレプリカし、
３０℃、２４時間静置培養した。最少培地で生育がなく
、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−オルニチンを
含有した最少培地で生育した菌株を釣菌分離し、Ｌ−ア
ルギニン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−オルニチンのいずれか
の要求性株（プロビデンシア・レトゲリＡＲＧＡ６およ
びプロビデンシア・レトゲリＡＲＧＡＩＯ）を得た。

Ｂ、（要求性の検定） 下記第１表に示す各菌株を、ＬＢ寒天培地で２４時間培
養し、その菌体をごく微量かきとり、Ｌ−アルギニン、
し−シトルリン、し−オルニチンそれぞれ単独でＯ，Ｏ
Ｏ５％添加した最少培地にうずく塗布し、３０℃で２４
時間静置培養し、その生育の有無を観察した。

結果は第１表に示すとおりである。

第　　１ 表 培地で３０℃、１６時間振盪して前培養した後、あらか
じめ１２０℃、２０分間蒸気滅菌した下記組成の主発酵
用培地５０ｍ１を含む１１容、三角フラスコに植継ぎ３
０℃、１５０ｒｐＩＭ、振幅３ｃｓの条件下で７２時間
培養した。

※　＋：生育あり　　−：生育なし 本発明法で使用する１０ビデンシア・レトゲリＡＲＧＡ
６は親株プロビデンシア・レトゲリＤ　）［Ｐ　Ｒ７−
２との比較により、明らかにＬ−アルギニン要求性を獲
得しており、プロビデンシア・レトゲリＡＲＧＡ１０は
し一アルギニン、し−オルニチン、Ｌ−シトルリンのう
ちの少なくとも１つの要求性を獲得している。

実施例２ 第２表に示す各菌株をそれぞれ液体ブイヨン発酵用培地 グルコース（別滅菌） （ＮＨ４）２３０４ ＫＨ２ＰＯ。

ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０ Ｆｅ” Ｍ　ｕ　” Ｌ−イソロイシン し−アルギニン ＣａＣＯ３（別滅菌） Ｈ ８％ ２．５％ ０．１％ ０．０４％ ２１１ｐ１１ ２００亀 ０．０２％ ０．０２％ ４％ ７．０（ＫＯＨで中和） 培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを除去したｒ液中の
Ｌ−プロリン濃度を自動アミノ酸分析計（日本電子ＪＬ
Ｃ３００）で定量したところ第２表に示すような結果を
得た。

第　　２　　表 本発明により、高い蓄積濃度でＬ−プロリン生成が可能
となり、より安価なＬ−プロリンの生産が可能となる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. プロビデンシア属に属し、生育のために少なくともＬ−
   アルギニン、Ｌ−シトルリンあるいはＬ−オルニチンを
   必要とし、かつＬ−プロリン生産能を有する微生物を培
   養して、培養液中にＬ−プロリンを生成蓄積せしめ、前
   記培養液よりＬ−プロリンを採取することを特徴とする
   発酵法によるＬ−プロリンの製造方法。