JPH03195493A - 発酵法によるｌ―プロリンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は発酵法によるＬ−プロリンの製造法に関する。

Ｌ−プロリンは抗生物質の原料など医薬品原料として重
要であり、その安価な製造方法が望まれている。

〈従来の技術〉 従来、発酵法によるＬ−プロリンの製造法としては、た
とえば、コリネバクテリウム属、クルチア属などに属す
る微生物を用いる方法が知られている（相田ら編「アミ
ノ酸発酵」（１９８６）Ｐ２１８〜２４２学会出版セン
ター）。

〈発明が解決しようとする課題〉 しかしながら、従来法においては、発酵法によるＬ−プ
ロリン生産能を有する微生物として限られたものしか見
出されていなかった。

く課題を解決するための手段および作用〉そこで本発明
者らは従来の微生物とは興なり、大腸菌に対する変異技
術・遺伝子操作技術が容易に適用可能な大腸菌近緑の属
に属する微生物であって、かつＬ−プロリン生産能を有
する微生物を広く検索、研究した結果、プロビデンシア
属に属する微生物によって通常の炭素源を含有する栄養
培地にＬ−プロリンを著量蓄積せしめることができるこ
とを見出し、本発明に到達した０本発明のプロビデンシ
ア属に属する微生物が著量のＬ−プロリンを生産した事
実はまだ知られていない。

すなわち、本発明はプロビデンシア属に属し、Ｌ−プロ
リン生産能を有する微生物を培養して、培地中にＬ−プ
ロリンを生成蓄積せしめ、ついで該培地よりＬ−プリロ
ンを採取することを特徴とする発酵法によるＬ−プロリ
ンの製造法である。

以下、本発明を具体的に説明する。

本発明で用いられる微生物はプロビデンシア属に属する
（バージ−のマニアル・オブ・システマティック・バク
テリオロジー第１巻（１９８４））微生物である。かか
る微生物のうち、特にプロリン代謝拮抗物質に耐性を有
する微生物が優れた効果を発揮する。ここでプロリン代
謝拮抗物質としては、たとえばチアゾリン−４−カルボ
ン酸、３，４−デヒドロプロリン、アゼチジン−２−カ
ルボン酸などが挙げられる。もちろん、他の要求性、他
の薬剤抵抗性の性質をもつものでも本発明の範囲に含ま
れる。

本発明で用いられる微生物の代表的なものとしては、た
とえばプロビデンシア・レトゲリＳＰＲＯＲ１−２（Ｆ
ＥＲＭ　Ｐ−１１１Ｌ＋９）、プロビデンシア・レトゲ
リＤＨＰＲ７−２（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１１１５０）　、
プロビデンシア・レトゲリＡＺＣＲ１２−１（ＦＥＲＭ
　　Ｐ−１１１５１）などが挙げられる。

これらの変異株はプロビデンシア・レトゲリＡＴＣＣ２
１１１８（Ｌ−イソロイシン要求性）より誘導されたも
ので、プロリン代謝拮抗物質のうち、プロビデンシア・
レトゲリ５ＰＲＯＲ１−２はチアゾリン−４−カルボン
酸に耐性な変異株である。また、プロビデンシア・レト
ゲリＤＨＲＰ７−２およびプロビデンシア・レトゲリＡ
ＺＣＲ１２−１はプロビデンシア・レトゲリ５ＰＲＯＲ
Ｉ−２より誘導されたもので、それぞれ３，４−デヒド
ロプロリンに耐性、アゼチジン−２−カルボン酸に耐性
な変異株である。

変異株の誘導は、通常の変異処理法によって比較的容易
に取得できる。すなわち、プロリン代謝拮抗物質に耐性
を有する変異株を得るには、親株を紫外線照射するか、
あるいは変異誘発剤（たとえばＮ−メチル−Ｎ′−二ト
ローＮ−二トロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸
など）で処理した後、親株が生育できないような量のプ
ロリン代謝拮抗物質を含む固体培地で生育可能な菌株を
採取すればよい。

本発明で使用するプロリン代謝拮抗物質耐性株とはチア
ゾリン−４−カルボン酸の場合、その濃度が７．５　ｍ
　Ｍ、３，４−デヒドロプロリンおよびアゼチジン−２
−カルボン酸の場合その濃度が５ｍＭとなるよう添加し
た培地で培養した時の４０時間後の生育度が７０％以上
のものをいう、ここで生育度は、培養液の６６０　ｎｍ
における吸光度を測定し、各菌株のプロリン代謝拮抗物
質を添加していない培養液の吸光度を１００％として表
わした場合の相対吸光度で示す。

耐性を検定する場合のプロリン代謝拮抗物質は市販のも
のを用いればよい。

本発明におけるＬ−プロリン生産用の培地は炭素源、窒
素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量
成分を含有する通常の培地である。炭素源としては、グ
ルコース、フラクトース、でん粉およびセルロースの加
水分解物、糖蜜などの糖類、フマール酸、クエン酸、コ
ハク酸などのごとき有機酸、グリセロールのごときアル
コール類などを２〜１５％、窒素源として、酢酸アンモ
ニウムのごとき有機アンモニウム塩、ＶＡ酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アン
モニウムのごとき無機アンモニウム塩、アンモニアガス
、アンモニア水、尿素などを０．５〜４％、有機微量栄
養素としては、Ｌ−イソロイシンなどの被要求物質が０
．００１〜０．４％、または必要に応じてコーンステイ
ブリカー、ペプトン、酵母エキスなど０〜４％をそれぞ
れ適当量含有する培地が好適に用いられる。かかる培地
にはこれらの他にリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、
硫酸第１鉄７水和物、硫酸マンガン４〜６水和物などを
少量添加するのが通常である。

培養は、好気的条件が望ましい、培養の間、培地のｐＨ
は５〜９に、温度は２４〜３７℃に調節し、４８〜１２
０時間振盪または通気培養すれば好ましい結果が得られ
る。

培養液からＬ−プロリンを採取するには常法で行うこと
ができる。たとえば菌体を除去した培養枦液をｐ　Ｈ２
に塩酸で調整したのち、強酸性カチオンイオン交換樹脂
に通液後、希アンモニア水で吸着成分を溶出し、脱アン
モニア後、濃縮晶析する。不純アミノ酸が混入する場合
はアルコールを添加し、不純アミノ酸を沈澱物として除
いた後、エタノール中で晶析し、し−プロリンを得るこ
とができる。

〈実施例〉 以下、実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例Ｉ Ａ、（チアゾリン−４−カルボン酸耐性変異株の分離） プロビデンシア・レトゲリＡＴＣＣ２１１１８（Ｌ−イ
ソロイシン要求性）の菌体に、常法によりＮ−メチル−
Ｎ′−二トローＮニトロソグアニジン処理（３００μｇ
　／　ｍｌ、３０℃で１０分）した後、この細胞をチア
ゾリン−４−カルボン酸２２．５　ｍ　Ｍを添加した寒
天培地（グルコース０．５％、硫安０．１％、リン酸第
１カリウム０．３％、リン酸第２カリウム０．７％、硫
酸マグネシウム７水和物０゜０１％、し−イソロイシン
０．００５％を含む最少培地）に塗布した０次に３０℃
で５〜７日培養し、生じた大きなコロニーを釣菌分離し
て、チアゾリン−４−カルボン酸耐性株（プロビデンシ
ア・レトゲリ５ＰＲＯＲＩ−２）を取得した。

Ｂ、＜３．４−デヒドロプロリン耐性変異株の分離） プロビデンシア・レトゲリ５ＰＲＯＲＩ−２（Ｌ−イン
ロイシン要求性、チアゾリン−４−カルボン酸耐性）の
菌体を実施例１−Ａと同様に変異処理した後、この細胞
を３．４−デヒドロプロリン１５ｍＭを添加した寒天培
地（グルコース０．５％、硫安０．１％、リン酸第１カ
リウム０．３％、リン酸第２カリウム０゜７％、塩化ナ
トリウム３％、硫酸マグネシウム７水和物０．０１％、
し−イソロイシン０．００５％を含む最少培地）に塗布
した。

次に３０℃で５〜７日培養し、生じた大きなコロニーを
釣菌分離して、３．４−デしドロプロリン耐性変異株（
プロビデンシア・レトゲリＤ　ＨＰ　Ｒ７−２＞を取得
した。

Ｃ，（アゼチジン−２−カルボン酸耐性変異株の分離） プロビデンシア・レトゲリ５ＰＲＯＲＩ−２（Ｌ−イソ
ロイシン要求性、チアゾリン４−カルボン酸耐性）の菌
体を実施例１−Ａと同様に変異処理した後、この細胞を
アゼチジン−２−カルボンｖｉ５　ｍ　Ｍを添加した寒
天培地（グルコース０．５％、硫安０．１％、リン酸第
１カリウム０．３％、リン酸第２カリウム０．７％、塩
化ナトリウム４％、硫酸マグネシウム７水和物０．０１
％、Ｌ−イソロイシン０゜００５％を含む最少培地）に
塗布した。

次に３０℃で５〜７日培養し、生じた大きなコロニーを
釣菌分離して、アゼチジン−２−カルボン酸耐性変異株
（プロビデンシア・レトゲリＡＺＣＲ１２−１）を取得
した。

実施例２（プロリン代謝拮抗物質耐性変異株の耐性度） 下記第１表に示す各菌株を液体ブイヨン培地を用いて３
０℃で１６時間振盪培養し、生育した菌体を集菌し、生
理食塩水で洗浄した。この菌体を第１表に示す各プロリ
ン代謝拮抗物質の各濃度を含む最少培地（実施例１にお
ける変異株分離に用いた培地と同様の培地）５ｍ１に植
菌して、３０℃にて４０時間培養し、各菌体の生青変を
調べな、その結果は第１表に示すとおりである。

第 表 （注）培養液の６６０ｎｍにおける吸光度を測定し、各
菌株のプロリン代謝拮抗物質を添加していない培養液の
吸光度を１００％として表わした。

本発明方法で使用するプロリン代謝拮抗物質耐性変異株
は、それぞれの親株と比較して高濃度のプロリン代謝拮
抗物質によって生育が阻害されず、強いプロリン代謝拮
抗物質耐性を獲得していることを示している。

実施例３（Ｌ−プロリン生産菌の培養およびＬ−プロリ
ンの生産） 第２表に示す各菌株をそれぞれ液体ブイヨン培地で３０
℃、１６時間振盪して前培養した後、あらかじめ１２０
℃、１５分間蒸気滅菌した下記組成の主発酵用培地５０
ｍ１を含む１１容、三角フラスコに積”°ざ、３０℃、
１５０ｒｐｌ１振幅３ｃｘの条件−１・、第２表に示し
た時間培養した。

発酵用培地Ａ　　　発酵用培地Ｂ グルコース（別滅菌）　　　　　　　　１０％　　　　
　　　８％ＫＨ２ＰＯ４０，０５％　　　　　　　　　
　　０．１％に２ＨＰ０．　　　　　　　　　　０．０
５％（ＮＨ４）２ＳＯ４３％ Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２００，０２５％ Ｆｅ５Ｏｓ・７Ｈ２００，００１２％ ＭｎＳＯ４・　４〜５Ｈ２００，００１２％ＺｎＣｌ２
　　　　　　　　０．０００５％Ｂｉｏｔｉｎ　　　　
　　　　Ｏ，００００１％Ｔｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣＪ！
　　０．００００１％Ｐｏ１７ｐｅｐｔｏｍｅ　　Ｓ　
　　　　　　２％し一イソロイシン　　　　　　　　　
　　　　　　　０．００５％ＣａＣ０３（別滅菌）　　
　　　　　　３％　　　　　　　４％培養終了後、菌体
、炭酸カルシウムを除去したｒ液中のＬ−プロリン濃度
を自動アミノ酸分析計（日本電子ＪＬＣ３００）で定量
したところ第２表に示すような結果を得た。

２．５％ ０．０４％ ０．００１％ ０．００７２％ 第　　２　　表 実施例４ プロビデンシア・レトゲリＤ　ＨＰ　Ｒ７−２を液体ブ
イヨン培地で３０℃、１６時間振盪培養し、これを実施
例３の発酵用培地Ｂのうち（ＮＨ４）２ＳＯ４を０．５
％、グルコースを４％、Ｌ−インロイシンを０．０１２
５％とした培地９００ｍ１を分注したガラス製小型ジャ
ーファーメンタ−へ１０％となるよう接種した。３０℃
にて、８００ｒｐｌ、通気量１ｖｖｍにて、通気撹拌培
養を開始した。

ＰＨ調節および窒素源の供給は、２５％アンモニア水に
て行い、ＰＨは６．５〜８．０に維持した。

グルコースを適宜添加し、最終的に合計１９７ｇのグル
コースを培養に用いた。

７２時間培養後、培養液中には２８．３　ｔ　／　１の
Ｌ−７０リンが生成した。培養液より菌体を除き、その
５００　ｍｌを強力チオン交換樹脂ダイヤイオンＳＫ・
ＩＢ（Ｈ型）のカラムに通した。

カラムを水洗後、２Ｎアンモニア水でカラムの吸着成分
を溶出し、脱色後、減圧濃縮した。これにエタノールを
加え、生成した沈澱物を除去し、その７Ｆ液を再度減圧
濃縮後、冷却し、生成した結晶を集めて乾燥した結果、
純度９５％のＬ−プロリン結晶１２．２　ｇを得た。

〈発明の効果〉 本発明によれば、従来の微生物とは異なり、大腸菌に対
する変異技術・遺伝子操作技術が容易に適用可能な大腸
菌近緑の属に属する微生物を用いて、通常の炭素源を含
有する栄養培地にＬ−プロリンを著量蓄積せしめ、採取
することが可能となり、発酵法によりＬ−プロリンを有
効に製造することができる。

従って本発明方法は、遺伝子工学に容易に適用・応用す
ることができる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）プロビデンシア属に属し、Ｌ−プロリン生産能を
   有する微生物を培養して、培地中にＬ−プロリンを生成
   蓄積せしめ、ついで該培地中よりＬ−プロリンを採取す
   ることを特徴とする発酵法によるＬ−プロリンの製造法
   。
2. （２）微生物がプロリン代謝拮抗物質に耐性を有する請
   求項１記載の発酵法によるＬ−プロリンの製造法。
3. （３）プロリン代謝拮抗物質が、チアゾリン−４−カル
   ボン酸、３，４−デヒドロプロリンあるいはアゼチジン
   −２−カルボン酸である請求項２記載の発酵法によるＬ
   −プロリンの製造法。