JPS6244193A - 発酵法によるl−スレオニンの製造方法 - Google Patents
発酵法によるl−スレオニンの製造方法Info
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- JPS6244193A JPS6244193A JP18392585A JP18392585A JPS6244193A JP S6244193 A JPS6244193 A JP S6244193A JP 18392585 A JP18392585 A JP 18392585A JP 18392585 A JP18392585 A JP 18392585A JP S6244193 A JPS6244193 A JP S6244193A
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- Japan
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明は、発酵法によるL−スレオニンの製造法に関す
る。L−スレオニンは、必須アミノ酸の1つてあり、医
薬品、飼料添加物として重要であり、その安価な製造方
法が望まれている。
る。L−スレオニンは、必須アミノ酸の1つてあり、医
薬品、飼料添加物として重要であり、その安価な製造方
法が望まれている。
〈従来の技(・11〉
グロビデン/ア属に、1萬する微生物を用いる発酵法に
よるし一スレオニン製造法は知られていない。
よるし一スレオニン製造法は知られていない。
ただし、パージエイズ マニュアル オプシステマテイ
ノク パクテリオロジー第11!。
ノク パクテリオロジー第11!。
(1984)で一部プロビデンシア二に分類変更された
旧プロプウス属に属する微生肉を用いた発酵法によるL
−スレオニンの製造方法としては、L−イソロイノン要
求性株を用いる方法(特公昭43−4440号公報)や
、α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸に耐性を有し、
かつイソロイシン要求性を葺する微生物を用いる方法(
日本農芸化学会講演要旨集p9 (1970) )が知
られている。
旧プロプウス属に属する微生肉を用いた発酵法によるL
−スレオニンの製造方法としては、L−イソロイノン要
求性株を用いる方法(特公昭43−4440号公報)や
、α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸に耐性を有し、
かつイソロイシン要求性を葺する微生物を用いる方法(
日本農芸化学会講演要旨集p9 (1970) )が知
られている。
く本発明が解決しようとする問題点〉
しかし、これらの方法によるL−スレオニンの生成蓄積
濃度、または、洟などの原料からのし一スレオニン生成
収率は、十分に満足できるものではなかった。
濃度、または、洟などの原料からのし一スレオニン生成
収率は、十分に満足できるものではなかった。
く問題点を解決するための手段および作用〉本発明者ら
は、さらに生産性の高いL−スレオニンの製造方法につ
いて、鋭意研究した結果、プロビデンシア属に属し、L
−スレオニ/生産能を有する微生物にL−イソロイシン
代謝拮抗物itこ耐性を付与する事によって、L−スレ
オニンの蓄消濃度、生成収率が著しく向上することを見
い出し、本発明に到達した。本発明のごとく、イソロイ
シン代謝拮抗物スに対する耐性を付与した微生物を用い
ることにより、L−スレオニンの生成量および収率が著
しく向上することは未だ知られていない。
は、さらに生産性の高いL−スレオニンの製造方法につ
いて、鋭意研究した結果、プロビデンシア属に属し、L
−スレオニ/生産能を有する微生物にL−イソロイシン
代謝拮抗物itこ耐性を付与する事によって、L−スレ
オニンの蓄消濃度、生成収率が著しく向上することを見
い出し、本発明に到達した。本発明のごとく、イソロイ
シン代謝拮抗物スに対する耐性を付与した微生物を用い
ることにより、L−スレオニンの生成量および収率が著
しく向上することは未だ知られていない。
すなわち、本発明は、プロビデンシア属に属し、L−ス
レオニン生産能を有する微生物のうち、イソロイシン代
謝拮抗物ズに耐性を有する微生物を培養して、培養液中
にL−スレオニンを望或M債せしめ、該培養液からL−
スレオニンを採取することを特徴とする発酵法によるL
−スレオニンの製法である。
レオニン生産能を有する微生物のうち、イソロイシン代
謝拮抗物ズに耐性を有する微生物を培養して、培養液中
にL−スレオニンを望或M債せしめ、該培養液からL−
スレオニンを採取することを特徴とする発酵法によるL
−スレオニンの製法である。
次に本発明を詳、iBに説明する。
本発明で用いられる微生物は、プロピデンジ−7ニi4
L/ (ハフ−のマニュアル・オフ・7ステマテイノ
クバクテリオロジー、第1巻、゛第495〜496頁(
1984)に従う)、イソロイシン代謝拮抗物質に耐性
を有する微生物である。ここで、イソロイシン代謝拮抗
物λとは、グロビデンシアに属するは生物の 1)生育
を阻害し、その生育阻害がL−イソロイシンの+?X
JJQにより回復する物ズ、または2) L−イソロイ
シン生合成系の酵素の抑制作用および阻害作用を示す物
質の事である。ここで、イソロイシン代入1拮抗物質と
しては、例えば、イソロイシンハイドロキサメート、チ
アイソロイシン、0−メチルスレオニン、β−メチルノ
ルロイノン等が挙げられる。かかる性質を有していれば
、他の要求性、他の薬剤抵抗性等の性質を持つものでも
本発明の範囲に含まれる。
L/ (ハフ−のマニュアル・オフ・7ステマテイノ
クバクテリオロジー、第1巻、゛第495〜496頁(
1984)に従う)、イソロイシン代謝拮抗物質に耐性
を有する微生物である。ここで、イソロイシン代謝拮抗
物λとは、グロビデンシアに属するは生物の 1)生育
を阻害し、その生育阻害がL−イソロイシンの+?X
JJQにより回復する物ズ、または2) L−イソロイ
シン生合成系の酵素の抑制作用および阻害作用を示す物
質の事である。ここで、イソロイシン代入1拮抗物質と
しては、例えば、イソロイシンハイドロキサメート、チ
アイソロイシン、0−メチルスレオニン、β−メチルノ
ルロイノン等が挙げられる。かかる性質を有していれば
、他の要求性、他の薬剤抵抗性等の性質を持つものでも
本発明の範囲に含まれる。
本発明で用いられる微生物は、上記耐性に加え、好まし
くはL−インロイシ/または、L−ロイ7ンに対する栄
I要求注ないし、1eaky型要求性を有し、かつ、ス
レオニン生合成系がスレオニンのフィードバックコント
ロールに抵抗性を有するものである。
くはL−インロイシ/または、L−ロイ7ンに対する栄
I要求注ないし、1eaky型要求性を有し、かつ、ス
レオニン生合成系がスレオニンのフィードバックコント
ロールに抵抗性を有するものである。
本発明で用いられる微生物の代表的なものとしては、例
えばグロビデンシア・レトゲ1JTP5−28 (FE
:RM P−8348)が挙げられる。
えばグロビデンシア・レトゲ1JTP5−28 (FE
:RM P−8348)が挙げられる。
この変異1未は、グロビデンシア・レトゲリATCC2
1118(L−イソロイシン要求性)から得られたα−
アミノ−β−ハイドロ*シ吉草酸耐a、L−エチオニン
耐性、L−イソロイシン要求性ないしは1eaky型要
求性、L−ロイシン要求性のグロビデンシア・レトゲリ
TP3−105より誘導されたもので、イソロイシン代
謝拮抗物冨のうちチアイソロイ7ノに耐性な変異株であ
る。
1118(L−イソロイシン要求性)から得られたα−
アミノ−β−ハイドロ*シ吉草酸耐a、L−エチオニン
耐性、L−イソロイシン要求性ないしは1eaky型要
求性、L−ロイシン要求性のグロビデンシア・レトゲリ
TP3−105より誘導されたもので、イソロイシン代
謝拮抗物冨のうちチアイソロイ7ノに耐性な変異株であ
る。
変異株の誘導は、通常の変異処理法によって比較的容易
に行なうことができる。すなわち、イソロイシン代謝拮
抗物質に耐性を有する変異株を得るには、親株を紫外線
照射するか、あるいは、変異誘発剤(例えばN−メチル
−N’+ニトロ−N−二トロソグアニシ/、エチルメタ
ンスルホン酸等)で処理したのち、親株示十分に生育で
きないような鑓のイソロイシン代謝店抗物質を含む固体
培地で、親株に比べて有、潔に生育良好な菌株を取得す
ればよい。
に行なうことができる。すなわち、イソロイシン代謝拮
抗物質に耐性を有する変異株を得るには、親株を紫外線
照射するか、あるいは、変異誘発剤(例えばN−メチル
−N’+ニトロ−N−二トロソグアニシ/、エチルメタ
ンスルホン酸等)で処理したのち、親株示十分に生育で
きないような鑓のイソロイシン代謝店抗物質を含む固体
培地で、親株に比べて有、潔に生育良好な菌株を取得す
ればよい。
本発明におけるイソロイシン代謝拮抗物d1尉性株とは
、その親株より強い耐性を有する劇株のことであり、好
ましくは親株の24時間後の相対生育度が40%以下に
なるようなイソロイシン代謝拮抗物りa度を含む培地で
培養した場合の相対生育度が50%以上を示すようなも
のを言う。
、その親株より強い耐性を有する劇株のことであり、好
ましくは親株の24時間後の相対生育度が40%以下に
なるようなイソロイシン代謝拮抗物りa度を含む培地で
培養した場合の相対生育度が50%以上を示すようなも
のを言う。
例えば、tアインロイシ/]1討性株の場合は、チアイ
ソロイシン5mIViとなるように添加した培地で培養
した時の24時間後の生育度が、無添加の場合の50%
以上のものをチアイソロイシン耐性株という。ここで生
育度は、培養液の660 nmにおける吸光度を測定し
ヶ各−株のイソロイシン代謝拮抗物質を添加してぃ7よ
い培養液の吸光度を100%として表わした場合の相対
吸光度で示すものとする。
ソロイシン5mIViとなるように添加した培地で培養
した時の24時間後の生育度が、無添加の場合の50%
以上のものをチアイソロイシン耐性株という。ここで生
育度は、培養液の660 nmにおける吸光度を測定し
ヶ各−株のイソロイシン代謝拮抗物質を添加してぃ7よ
い培養液の吸光度を100%として表わした場合の相対
吸光度で示すものとする。
本発明におけるL−スレオニン生産用の培地は、炭素源
、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有a
61 i成分を含有する通常の培地である。
、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有a
61 i成分を含有する通常の培地である。
炭素源としては、グルコース、7ラクトース、でん粉お
よびセルロースの刀口水分解物、糖密等ノ穂類、フマー
ル酸、クエン酸、コ/1り酸等ノ如き有1Lグリ七ロー
ルの如きアルコール類等を2〜15%、窒素源として、
酢酸アンモニウムの如き有機アンモニウム塩、硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、リン改アンモニウム、硝
酸アンモニウムの如き無機アンモニウム塩、アンモニア
ガス、アンモニア水、尿素等を0.5〜4.0%、有機
微量栄養素としては、L−ロイシン等の彼要求物ズが0
.001〜0.4%、または必要に厄じてブー/ステイ
ープリカー、ペプトン、酵母エキス等O〜4%をそれぞ
れ適当λ含有する培地が用いられる。これらの他にリン
酸カリウム、硫ジマグネンクム、硫、f1第1鉄7水和
物、硫酸マンガン4−6水和物等の微世成分が少1添加
される。
よびセルロースの刀口水分解物、糖密等ノ穂類、フマー
ル酸、クエン酸、コ/1り酸等ノ如き有1Lグリ七ロー
ルの如きアルコール類等を2〜15%、窒素源として、
酢酸アンモニウムの如き有機アンモニウム塩、硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、リン改アンモニウム、硝
酸アンモニウムの如き無機アンモニウム塩、アンモニア
ガス、アンモニア水、尿素等を0.5〜4.0%、有機
微量栄養素としては、L−ロイシン等の彼要求物ズが0
.001〜0.4%、または必要に厄じてブー/ステイ
ープリカー、ペプトン、酵母エキス等O〜4%をそれぞ
れ適当λ含有する培地が用いられる。これらの他にリン
酸カリウム、硫ジマグネンクム、硫、f1第1鉄7水和
物、硫酸マンガン4−6水和物等の微世成分が少1添加
される。
培養は、好気的条件V−tテtう 。培養の一間1培地
のpHは5から9に、温度は24〜37℃に調節し、4
8〜120時間振とうまたは通気培養すれば好ましい結
果が得られる。
のpHは5から9に、温度は24〜37℃に調節し、4
8〜120時間振とうまたは通気培養すれば好ましい結
果が得られる。
培養液よりL−スレオニンを採取するには、例えば一体
を除去した培養P液をpH2に塩酸で調製したのら、強
酸性カチオン交換欄脂(こ通液後、希アンモニア水で吸
着成分を溶出し、脱アンモニア後、濃縮する。これにア
ルコールを添加し、冷却保存下で生成した結晶を集め、
L−スレオニンを得ることができる。
を除去した培養P液をpH2に塩酸で調製したのら、強
酸性カチオン交換欄脂(こ通液後、希アンモニア水で吸
着成分を溶出し、脱アンモニア後、濃縮する。これにア
ルコールを添加し、冷却保存下で生成した結晶を集め、
L−スレオニンを得ることができる。
〈実施例〉
以下、実1例により本発明を具体的に説明する。
実施例1
八、(チアイソロイシン耐性株の分離)プロビデンシア
・レトゲリTP3−105(α−アミノ−β−ハイドロ
キシ吉草酸耐性、L−イソロイシン要求性ないしはLe
axy型要求性、L−エチオニン耐性、L−ロイシン要
求性)の菌体に、′虐法によりN−メチル−N’−ニド
o −N−ニトロソグアニジン処理< 300μダ/m
1130℃で20分)したのち、この細胞を、D、 L
−チアイソロイシンL5 y/11. L−ロイシン2
9/l、L−バリン21/l添加した寒天培地(グルコ
ース0.5%、硫安0.1%、リン酸第1カリウム0.
3%、リン酸第2カリウム0.7%、硫酸マグネシウム
7水和物0.01%を含む完全合成培地)に塗布した。
・レトゲリTP3−105(α−アミノ−β−ハイドロ
キシ吉草酸耐性、L−イソロイシン要求性ないしはLe
axy型要求性、L−エチオニン耐性、L−ロイシン要
求性)の菌体に、′虐法によりN−メチル−N’−ニド
o −N−ニトロソグアニジン処理< 300μダ/m
1130℃で20分)したのち、この細胞を、D、 L
−チアイソロイシンL5 y/11. L−ロイシン2
9/l、L−バリン21/l添加した寒天培地(グルコ
ース0.5%、硫安0.1%、リン酸第1カリウム0.
3%、リン酸第2カリウム0.7%、硫酸マグネシウム
7水和物0.01%を含む完全合成培地)に塗布した。
次に30℃にて、5〜7日培養し、生じた大きなコロニ
ーを釣閃分−Wして、チアイソロイシン耐性株(プロビ
デンシア・レトゲリTP6−28)を取得した。
ーを釣閃分−Wして、チアイソロイシン耐性株(プロビ
デンシア・レトゲリTP6−28)を取得した。
B、(チアイソロイシン耐性株の耐性度)下記第1表に
示す各−抹を液体ブイヨン培地を用いて30℃で16時
間振とう培養し、生育した一体を集菌し生理食塩水でよ
く洗浄した。この一体懸U液を、チアイノロイシン0゜
2.5.5.0、l OmM ノU度で含む最少培地(
培地組成ニゲルコース0.5%、硫安0.1%、リン酸
第1カリクム0.3%、リン酸′92カリウム0.7%
、硫酸マグネシウム7水和物0.01%、L−イソロイ
シン0.001%、L−ロイシン0905%、L−バリ
ン0,05%)5++lに植1して、30℃にて24時
間培養し、各菌株の生育度を調べた。その結果は、第1
表に示すとおりである。ただし、チアイソロイシンは、
市販のもの(ングマ社製)を用いた。
示す各−抹を液体ブイヨン培地を用いて30℃で16時
間振とう培養し、生育した一体を集菌し生理食塩水でよ
く洗浄した。この一体懸U液を、チアイノロイシン0゜
2.5.5.0、l OmM ノU度で含む最少培地(
培地組成ニゲルコース0.5%、硫安0.1%、リン酸
第1カリクム0.3%、リン酸′92カリウム0.7%
、硫酸マグネシウム7水和物0.01%、L−イソロイ
シン0.001%、L−ロイシン0905%、L−バリ
ン0,05%)5++lに植1して、30℃にて24時
間培養し、各菌株の生育度を調べた。その結果は、第1
表に示すとおりである。ただし、チアイソロイシンは、
市販のもの(ングマ社製)を用いた。
本発明方法で使用するチアイソロイシン耐性株(’L’
P6−28)では、親株のプロビデンシア・レトゲリT
P3−105と比校して、チアイソロイシンによって生
育が阻害されず、チアイソロイシンに対する耐性を獲得
していることが明らかである。
P6−28)では、親株のプロビデンシア・レトゲリT
P3−105と比校して、チアイソロイシンによって生
育が阻害されず、チアイソロイシンに対する耐性を獲得
していることが明らかである。
第1表
1吸光度を100%として表わした。
実施例2
第2表に示す各菌株をそれぞれ液体プイヨ/培地で30
℃、16時間振とうして前培養したのち、あらかじめ1
15℃、IO分間蒸気域消した下記?1′fl成の主発
i3y用培地50厘lを含む500g/容壷とうフラス
コに植菌し、30℃、+10 rpm 。
℃、16時間振とうして前培養したのち、あらかじめ1
15℃、IO分間蒸気域消した下記?1′fl成の主発
i3y用培地50厘lを含む500g/容壷とうフラス
コに植菌し、30℃、+10 rpm 。
振sa 5 cMの条件下で90時1目培養した。
発酵用培地
グルコース (別滅菌) 8 %(i’
J)(4)2 S O42,5%KH2PO40,1% lV1g S O4・71(20tJ、04 %
Fe升 2 Fivl
n +) 2
NL−インロイノン 0.005 %
L−ロイシン 0.08 %CaCO
3(別滅菌) 4 ’、’6p□
7.0 (KOHで中印)培
養終了後、菌体、炭Jカル7クムを除去した′P液液中
し一スレオニン一度を、自動アミノ酸分析計(日本電子
JLC200A)で定置したとこり第2表に示すより
な結果を得た。
J)(4)2 S O42,5%KH2PO40,1% lV1g S O4・71(20tJ、04 %
Fe升 2 Fivl
n +) 2
NL−インロイノン 0.005 %
L−ロイシン 0.08 %CaCO
3(別滅菌) 4 ’、’6p□
7.0 (KOHで中印)培
養終了後、菌体、炭Jカル7クムを除去した′P液液中
し一スレオニン一度を、自動アミノ酸分析計(日本電子
JLC200A)で定置したとこり第2表に示すより
な結果を得た。
第2表
スレオニン生成収率は、消費グルコースに対する生成ス
レオニンの重重収率で表わした。
レオニンの重重収率で表わした。
本発明例のプロビデンシア・レトゲリTP6−28では
、L−スレオニ/の苗種1度、生成収率とも顕著に向上
した。
、L−スレオニ/の苗種1度、生成収率とも顕著に向上
した。
実施例3
第3表に示すg hH株を、液体ブイヨン培地で、30
℃16時間振とり層養し、これを実施例2の発酵用培地
のうち(NH4)z So4を0.5%、グルコースを
4.0%とした培地800i/を分注したガラス製小型
ジャーファーメンタ−へ10%となるように接種した。
℃16時間振とり層養し、これを実施例2の発酵用培地
のうち(NH4)z So4を0.5%、グルコースを
4.0%とした培地800i/を分注したガラス製小型
ジャーファーメンタ−へ10%となるように接種した。
30℃にて、800 rpm 、通気a l VVln
にて通気撹拌培養を開始した。pH調節および窒素源の
供給は、25%アンモニア水にて行ない、pf(は、6
.5〜8.0に維持した。
にて通気撹拌培養を開始した。pH調節および窒素源の
供給は、25%アンモニア水にて行ない、pf(は、6
.5〜8.0に維持した。
グルコース、KH2PO4,1νIgSOt・7H20
、L−ロイノンおよびL−インロイン/を適宜添加しな
がら、701待、司培養したところ第3表ンこ示すよう
な結果をjoだ。
、L−ロイノンおよびL−インロイン/を適宜添加しな
がら、701待、司培養したところ第3表ンこ示すよう
な結果をjoだ。
第3表
プロビデンシア・レトゲリTP6−28の培養液より一
体を除き、その500*/を強力チオン交換樹脂ダイヤ
イオンSK−IB (f(型)のカラムに通した。カラ
ムを水洗後、2Nアンモニア水でカラムの吸着成分を1
容出し、脱色後減圧、農墳した。
体を除き、その500*/を強力チオン交換樹脂ダイヤ
イオンSK−IB (f(型)のカラムに通した。カラ
ムを水洗後、2Nアンモニア水でカラムの吸着成分を1
容出し、脱色後減圧、農墳した。
これにエタノールを力日え、冷却し、生成した結晶を集
めて乾燥した結果、純度9b%以上のし一スレオニンの
結晶32.3Fが得られた。
めて乾燥した結果、純度9b%以上のし一スレオニンの
結晶32.3Fが得られた。
〈発明の効果〉
本発明法により、高い収率および高い蓄積LA度でL−
スレオニン生成が可能となり、より安価なL−スレオニ
ンの生産が町詣となる。
スレオニン生成が可能となり、より安価なL−スレオニ
ンの生産が町詣となる。
Claims (2)
- (1)プロビデンシア(Providencia)属に
属し、イソロイシン代謝拮抗物質に耐性を有し、かつL
−スレオニン生産能を有する微生物を培養して、培養液
中にL−スレオニンを生成蓄積せしめ、前記培養液より
L−スレオニンを採取することを特徴とする発酵法によ
るL−スレオニンの製造方法。 - (2)イソロイシン代謝拮抗物質が、チアイソロイシン
である特許請求の範囲第一項記載の発酵法によるL−ス
レオニンの製造方法。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18392585A JPS6244193A (ja) | 1985-08-23 | 1985-08-23 | 発酵法によるl−スレオニンの製造方法 |
EP19860111424 EP0213536B1 (en) | 1985-08-23 | 1986-08-19 | Process for producing l-threonine by fermentation |
DE8686111424T DE3684383D1 (de) | 1985-08-23 | 1986-08-19 | Verfahren zur herstellung von l-threonin durch fermentation. |
US07/652,455 US5264353A (en) | 1985-08-23 | 1991-02-07 | Process for producing L-threonine by fermentation |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18392585A JPS6244193A (ja) | 1985-08-23 | 1985-08-23 | 発酵法によるl−スレオニンの製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6244193A true JPS6244193A (ja) | 1987-02-26 |
JPH0313875B2 JPH0313875B2 (ja) | 1991-02-25 |
Family
ID=16144209
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP18392585A Granted JPS6244193A (ja) | 1985-08-23 | 1985-08-23 | 発酵法によるl−スレオニンの製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6244193A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5919670A (en) * | 1997-06-23 | 1999-07-06 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing L-amino acids by fermentation |
-
1985
- 1985-08-23 JP JP18392585A patent/JPS6244193A/ja active Granted
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5919670A (en) * | 1997-06-23 | 1999-07-06 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing L-amino acids by fermentation |
US6143552A (en) * | 1997-06-23 | 2000-11-07 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing L-amino acids by fermentation |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0313875B2 (ja) | 1991-02-25 |
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