JPS6227798B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属する微生物を培地に培養してＬ
−グルタミン酸を培地中に蓄積させ、これを採取
する方法において、リゾチームに感受性を有し、
培地中に存在する過剰のビオチンによつてＬ−グ
ルタミン酸の生産が抑制されない菌株を用いるこ
とを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法に関す
る。 生育にビオチンを要求するＬ−グルタミン酸生
産菌のＬ−グルタミン酸生産性は培地中のビオチ
ン濃度と極めて密接な関係があり、生育に対して
制限量のビオチン濃度のときはじめてＬ−グルタ
ミン酸を生産できる。一方安価な培地の粗原料と
して利用される廃糖蜜、殿粉加水分解物などはビ
オチンを多量に含有している。これら粗原料を含
有する培地にＬ−グルタミン酸生産菌を培養する
方法としては特公昭37−1695号公報、特公昭38−
25288号公報などに記載されている方法が知られ
ているが、工業的にはさらに優れた方法が望まれ
ている。 本発明者らは、安価な粗原料を用い、過剰量の
ビオチンの作用を回避してＬ−グルタミン酸を製
造する方法につき研究した結果、従来のＬ−グル
タミン酸生産菌を親株として変異誘導したリゾチ
ームに感受性を有する変異株を用いれば、過剰の
ビオチン含有培地を用いても、ビオチンによる抑
制を受けることなく高い収率でＬ−グルタミン酸
を生産できることを見出した。 以下本発明をさらに詳細に説明する。 本発明によればコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属し、リゾチームに感受性
を有し、培地中に存在する過剰のビオチンによつ
てＬ−グルタミン酸の生産が抑制されない性質を
有する微生物を培地に培養すれば培地中にＬ−グ
ルタミン酸が蓄積するので、これを採取すること
により高収率にＬ−グルタミン酸が得られる。 本発明に用いる微生物はコリネバクテリウム属
またはブレビバクテリウム属に属し、リゾチーム
に感受性を有し、培地中に存在する過剰のビオチ
ンによつてＬ−グルタミン酸の生産が抑制されな
い性質を有する微生物であればいかなる菌株をも
用いることができる。一般にはコリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属に属し、Ｌ−グ
ルタミン酸生産能を有する菌株を親株とし、これ
を変異誘導処理して得られた変異株からリゾチー
ムに感受性を有するものを選択し、これを用い
る。変異誘導の方法としては、紫外線照射、放射
線照射、変異誘起剤処理等の通常の方法が用いら
れる。変異誘導された変異株からリゾチームに感
受性を有する菌株を選択するには、親株が生育可
能な濃度のリゾチームを含有する培地で生育でき
なくて、リゾチーム無添加培地では親株と同様に
生育できるものを選べばよい。従つて、ここでリ
ゾチームに感受性であるとは、リゾチームに対す
る最小阻止濃度が親株よりも低いことを意味す
る。また培地中に存在する過剰のビオチンによつ
てＬ−グルタミン酸の生産が抑制されないとは、
培地中に存在する過剰のビオチンによるＬ−グル
タミン酸生産の抑制が実質的に無視できる程度の
ものであることを意味する。具体的には前記のご
とき粗原料を用いた場合でも過剰のビオチンによ
る影響をうけることなくＬ−グルタミン酸の生産
ができることを意味する。 本発明に用いる具体的に好適な菌株の一例とし
ては、コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032を親株として得られたコリネバクテ
リウム・グルタミクムKY9703（微工研菌寄第
4412号、NRRL11271）、コリネバクテリウム・グ
ルタミクムKY9705（微工研菌寄第4413号、
NRRL11272）およびブレビバクテリウム・フラ
ブムATCC14067を親株として得られたブレビバ
クテリウム・フラブムKY9733（微工研菌寄第
4414号、NRRL11273）があげられる。 コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032を親株としてリゾチーム感受性変異
株を取得する方法について以下具体的に説明す
る。該親株を粉末ブイヨン（極東製薬社製）20
ｇ／および酵母エキス５ｇ／の組成を有する
培地（殺菌前PH7.2、以下Ｃ培地という）に植菌
し30℃で振盪培養する。中期対数期で培養を中止
し、集菌し、生理食塩水で洗浄後、Ｍ／20トリ
ス・マレート緩衝液（PH6.0）に５×10⁸細胞／ml
になるように懸濁する。この懸濁液に最終濃度
500μｇ／mlになるようにニトロソグアニジンを
加え、25℃で30分間放置し、遠心分離により菌体
を集め、同一緩衝液で菌体を洗浄後、生理食塩水
に懸濁し、適宜生理食塩水で希釈してＣ培地にさ
らに２ｇ／dlの寒天を含む固体培地（以下CA培
地という）に塗りつける。これを30℃で２日間培
養し、生じたコロニー（約6000）を次の３種類の
固体培地にレプリカ法により塗りつける。 CA培地 CLA培地：CA培地を加熱殺菌後、冷却して
培地の温度が45℃まで下がつてから200mg／
になるようにリゾチームを添加した培地。 MA培地：グルコース10ｇ／、NH₄Cl4
ｇ／、尿素２ｇ／、KH₂PO₄1ｇ／、
K₂HPO₄3ｇ／、FeSO₄・7H₂O10mg／、
MgSO₄・7H₂O400mg／、MnCl₂・4H₂O2mg／
、ZnSO₄・7H₂O0.9mg／、CuSO₄・
5H₂O0.4mg／、Na₂B₄O₇・10H₂O0.09mg／
、（NH₄）₆Mo₇O₂₄・4H₂O0.04mg／、ビオチ
ン30μｇ／、サイアミン塩酸塩１mg／、シ
ステイン塩酸塩20mg／および寒天20ｇ／の
組成を有する培地（殺菌前PH7.0）。 30℃で２日間培養後、CA培地で生育し、CLA
培地で生育しない菌をリゾチーム感受性変異株と
して得る。MA培地で親株と同様に生育する自己
栄養性でリゾチームに対して感受性の変異株は試
験した6000コロニーの中に110株得られた。この
110株中17株がビオチン過剰培地でも多量のＬ−
グルタミン酸を生産する能力を有していた。コリ
ネバクテリウム・グルタミクムKY9703および
KY9705はかくして得られた変異株の一例であ
る。 ブレビバクテリウム・フラブムATCC14067を
親株とする変異誘導も上記と同様に行つて、ブレ
ビバクテリウム・フラブムKY9733を得た。 上記例示の変異株のMA培地、CA培地、CLA
培地での生育およびリゾチーム感受性度について
親株と比較した結果を第１表に示す。３種類の固
体培地上での生育はレプリカ法で塗りつけ、30℃
で２日間培養後判定した。表中生育欄の＋は菌の
生育が観察されたものを、−は生育が観察されな
かつたものを示す。また表中リゾチーム感受性は
次のように試験した。すなわちＣ培地にて24時間
30℃液体振盪培養した菌を集菌後、生理食塩水に
て適当に希釈して菌体の懸濁液をつくる。 この懸濁液10⁴細胞相当を倍々系列の濃度のリ
ゾチームを含有するCA培地に滴下接種し、30℃
で２日間培養する。菌の生育がまつたく認められ
ない最小のリゾチーム濃度を菌のリゾチーム感受
性値（最小生育阻止濃度）とした。

【表】 本発明の微生物を培養するための培地は、炭素
源、窒素源、無機化合物、その他の栄養素を適当
に含む培地ならば、通常Ｌ−グルタミン酸生産に
用いられる天然培地、合成培地のいずれも使用で
きる。たとえば炭素源としては蔗糖、ブドウ糖、
糖蜜などの糖質および殿粉糖化液などが、窒素源
としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、塩酸ア
ンモニウム、硝酸アンモニウム、燐酸アンモニウ
ム、炭酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、ク
エン酸アンモニウム、酒石酸アンモニウム、酢酸
アンモニウム、尿素などの有機無機窒素化合物、
ペプトン、肉エキス、コーンスチーブリカーなど
の天然栄養源などが、無機化合物としては燐酸第
一カリ、燐酸第二カリ、硫酸カリ、硫酸マグネシ
ウム、塩化マグネシウム、硫酸第一鉄、塩化第二
鉄、硫酸マンガン、塩化マンガンなどが、その他
の栄養源としてはビオチン、サイアミンなどが用
いられる。 培養は振盪培養、通気撹拌培養などの好気的条
件で行い、培養温度は24〜37℃とくに28〜33℃が
好適である。培養中は適当な中和剤を用いてPHを
６〜９に調整するのが好ましい。培養は１〜３日
間行えば培養液中に著量のＬ−グルタミン酸が生
成蓄積する。培養液からのＬ−グルタミン酸の採
取は、菌体を除去した上清液から、イオン交換樹
脂による吸脱着法、濃縮晶析法、等電点晶析法な
ど、従来のＬ−グルタミン酸の製造において常用
される諸方法を適宜使用して行うことができる。 以下に本発明の実施例を示す。 実施例 １ グルコース40ｇ／、（NH₄）₂SO₄2ｇ／、
MgSO₄・7H₂O0.5ｇ／、KH₂PO₄0.5ｇ／、
K₂HPO₄1ｇ／、FeSO₄・7H₂O2mg／、
MnSO₄・4H₂O2mg／、サイアミン塩酸塩１
mg／、フエノールレツド10mg／およびビオチ
ン２μｇ／あるいは100μｇ／の組成を有す
る培地を調製し、PHを7.0に調整した後、30mlず
つ300ml容の枝付フラスコに入れ、115℃で15分間
加熱殺菌した。冷却後、別に加熱殺菌した尿素液
を２ｇ／になるように添加した。この培地に第
２表に示した菌を接種し30℃で振盪培養を行つ
た。培養中培養液をPH6.5〜8.0に保つため12時間
目と20時間目の２回尿素液を４ｇ／になるよう
に添加し、32時間で培養を終了した。かくして培
養液中に蓄積したＬグルタミン酸量は、第２表に
示す通りである。培養液１から菌体を除去し、
濃縮し、塩酸でPH3.2に調整し、冷却してＬ−グ
ルタミン酸の粗結晶を得た。粗結晶の量（ｇ）を
括弧内に示す。

【表】 実施例 ２ 実施例１で用いた培地中グルコースを甘蔗廃糖
蜜（グルコースとして40ｇ／相当量）に換え、
加熱殺菌後の培地をPH7.0に再調整する以外は実
施例１と同様に行つた。培養液中に蓄積したＬ−
グルタミン酸量を第３表に示す。

【表】

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ コリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
   ウム属に属する微生物を培地に培養してＬ−グル
   タミン酸を培地中に蓄積させ、これを採取する方
   法において、リゾチームに感受性を有し、培地中
   に存在する過剰のビオチンによつてＬ−グルタミ
   ン酸の生産が抑制されない菌株を用いることを特
   徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。