JPS6244171A - L−グルタミン酸生産性新規微生物 - Google Patents

L−グルタミン酸生産性新規微生物

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JPS6244171A
JPS6244171A JP18606186A JP18606186A JPS6244171A JP S6244171 A JPS6244171 A JP S6244171A JP 18606186 A JP18606186 A JP 18606186A JP 18606186 A JP18606186 A JP 18606186A JP S6244171 A JPS6244171 A JP S6244171A
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JP
Japan
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glutamic acid
lysozyme
culture
producing
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JP18606186A
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Ryoichi Katsumata
勝亦 瞭一
Kenichiro Takayama
高山 健一郎
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KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属に属し、リゾチームに感受性を有し、培地中に存在
する過剰のビオチンによってL−グルタミン酸の生産が
抑制されないし一グルタミン酸生産性新規微生物に関す
る。
生育にビオチンを要求するし一グルタミン酸生産菌のし
一グルタミン酸生産性は培地中のビオチン濃度と極めて
密接な関係があり、生育に対して制限潰のビオチン濃度
のときはじめてL−グルタミン酸を生産できる。一方安
価な培地の粗原料として利用される廃糖蜜、殿粉加水分
解物などはビオチンを多量に含有している。これら粗原
料を含有する培地にL−グルタミン酸生産菌を培養する
方法としては特公昭37−1695号公報、特公昭38
−25288号公報などに記載されている方法が知られ
ているが、工業的にはさらに優れた方法が望まれている
本発明者らは、安価な粗原料を用い、過剰量のビオチン
の作用を回避してL−グルタミン酸を製造する方法につ
き研究した結果、従来のし一グルタミン酸生産菌を親株
として変異誘導したりゾチームに感受性を有する変異株
を用いれば、過剰のビオチン含有培地を用いても、ビオ
チンによる抑制を受けることなく高い収率でL−グルタ
ミン酸を生産できることを見出した。
以下本発明をさらに詳細に説明する。
本発明によればコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属に属し、リゾチームに感受性を有し、培地中
に存在する過剰のビオチンによってL−グルタミン酸の
生産が抑制されない性質を有する微生物を培地に培養す
れば培地中にL−グルタミン酸が蓄積するので、これを
採取することにより高収率にL−グルタミン酸が得られ
る。
本発明に用いる微生物はコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属し、リゾチームに感受性を有し
、培地中に存在する過剰のビオチンによってL−グルタ
ミン酸の生産が抑制されない性質を有する微生物であれ
ばいかなる菌株をも用いることができる。一般にはコリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属し、
L−グルタミン酸生産能を有する菌株を親株とし、これ
を変異誘導処理して得られた変異株からリゾチームに感
受性を有するものを選択し、これを用いる。
変異誘導の方法としては、紫外線照射、放射線照射、変
異誘起剤処理等の通常の方法が用いられる。
変異誘導された変異株からリゾチームに感受性を有する
菌株を選択するには、親株が生育可能な濃度のりゾチー
ムを含有する培地で生育できなくて、リゾチーム無添加
培地では親株と同様に生育できるものを選べばよい。従
って、ここでリゾチームに感受性であるとは、リゾチー
ムに対する最小阻止濃度が親株より低いことを意味する
。また培地中に存在する過剰のビオチンによってL−グ
ルタミン酸の生産が抑制されないとは、培地中に存在す
る過剰のビオチンによるし一グルタミン酸生産の抑制が
実質的に無視できる程度のものであることを意味する。
具体的には前記のごとき粗原料を用いた場合でも過剰の
ビオチンによる影響をうけることなくし一グルタミン酸
の生産ができることを意味する。
本発明に用いる具体的に好適な菌株の一例としては、コ
リネバクテリウム・グルタミクムATCC13032を
親株として得られたコリネバクテリウム・グルタミクム
KY9703(微工研菌寄第4412号、NRRLI 
1271)、コリネバクテリウム・グルタミクムKY9
705(微工研菌寄第4413号、NRRL11272
)およびブレビバクテリウム・フラブムΔTCC140
67を親株として得られたブレビバクテリウム・フラブ
ムKY9733(微工研菌寄第4414号、NRRL1
1273)があげられる。
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032
を親株としてリゾチーム感受性変異株を取得する方法に
ついて以下具体的に説明する。
該親株を粉末ブイヨン(極東製薬社製)20g/lおよ
び酵母エキス5g/j2の組成を有する培地(殺菌前p
H7,2、以下C培地という)に植菌し30℃で振盪培
養する。中期対数期で培養を中止し、集菌し、生理食塩
水で洗浄後、M /20 ) IJ、ス・マレート緩衝
液<pH6,0’) l;l: 5 XIO’細胞/細
胞7汀lニうに懸濁する。この懸濁液に最終濃度500
Jig/mlになるようにニトロソグアニジンを加え、
25℃で30分間放置し、遠心分離により菌体を集め、
同一緩衝液で菌体を洗浄後、生理食塩水に懸濁し、適宜
生理食塩水で希釈してC培地にさらに2g/aの寒天を
含む固体培地(以下CA培地という)に塗りつける。こ
れを30℃で2日間培養し、生じたコルニー(約6. 
OOO)を次の3種類の固体培地にレプリカ法により塗
りつける。
■ CA培地 ■ CLΔ培地:CA培地を加熱殺菌後、冷却して培地
の温度が45℃まで下がってから200■/1になるよ
うにリゾチームを添加した培地。
■ MA培地ニゲルコース10g/1SNH,CA4g
7ft、尿素2g/1SK)(2PO41g/(1,に
2HPO43g/β、FaSOs・7H2010mg/
j!、Mg5O<・7H20400mg/jl!S M
nC62・4 H2O2mg/j!S ZnSO4’ 
78200.9mg/CCuS○*・5H200,4I
IIg/12゜Na2B<Ot・1OH200,09m
g#、(NH4)sMOt○24’4H200,04m
g/7!、ビオチン30犀/β、サイアミン塩酸塩1+
ng/J、システィン塩酸塩20mg/βおよび寒天2
0g/I2の組成を有する培地(殺菌前p H7,0)
30℃で2日間培養後、CA培地で生育し、CLA培地
で生育しない菌をリゾチーム感受性変異株として得る。
MA培地で親株と同様に生育する自己栄養性でリゾチー
ムに対して感受性の変異株は試験した6、000コロニ
ーの中に110株得られた。
この110株中1了株がビオチン過剰培地でも多量のL
−グルタミン酸を生育する能力を有していた。コリネバ
クテリウム・グルタミクムKY9703およびK Y9
705はかくして得られた変異株の一例である。
ブレビバクテリウム・フラブムATCC14067を親
株とする変異誘導も上記と同様に行って、ブレビバクテ
リウム・フラブムKY9733を得た。
上記例示の変異株のMA培地、CA培地、CLA培地で
の生育およびリゾチーム感受性度について親株と比較し
た結果を第1表に示す。3種類の固体培地上での生育は
レプリカ法で塗りつけ、30℃で2日間培養後判定した
。表中生育欄の+は菌の生育が観察されたものを、−は
生育が観察されなかったものを示す。また表中リゾチー
ム感受性は次のように試験した。すなわちC培地にて2
4時間30℃液体振盪培養した菌を集菌後、生理食塩水
にて適当に希釈して菌体の懸濁液をつくる。
この懸濁液10′細胞相当を倍々系列の濃度のリゾチー
ムを含有するCA培地に滴下接種し、30℃で2日間培
養する。菌の生育がまったくみとめられない最小のリゾ
チーム濃度を菌のりゾチーム感受性値(最小生育阻止濃
度)とした。
第   1   表 本発明の微生物を培養するための培地は、炭素源、窒素
源、無機化合物、その他の栄養素を適当に含む培地なら
ば、通常L−グルタミン酸生産に用いられる天然培地、
合成培地のいずれも使用できる。たとえば炭素源として
は蔗糖、ブドウ糖、糖蜜などの糖質および殿粉糖化液な
どが、窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、
塩酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、燐酸アンモニウ
ム、炭酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、クエン酸
アンモニウム、酒石酸アンモニウム、酢酸アンモニウム
、尿素などの有機無機窒素化合物、ペプトン、肉エキス
、コーンスチーブリカーなどの天然栄養源などが、無機
化合物としては燐酸第一カリ、燐酸第二カリ、硫酸カリ
、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸第一鉄、
塩化第二鉄、硫酸マンガン、塩化マンガンなどが、その
他の栄養源としてはビオチン、サイアミンなどが用いら
れる。
培養は振盪培養、通気攪拌培養などの好気的条件で行い
、培養温度は24〜37℃とくに28〜33℃が好適で
ある。培養中は適当な中和剤を用いてpHを6〜9に調
整するのが好ましい。培養は1〜3日間行えば培養液中
に著量のL−グルタミン酸が生成蓄積する。培養液から
のし一グルタミン酸の採取は、菌体を除去した上清液か
ら、イオン交換樹脂による吸脱着法、濃縮晶析法、等電
点晶析法など、従来のし一グルタミン酸の製造において
常用される諸方法を適宜使用して行うことができる。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例1.− グルコース40g/l、(N)(4)2SO42g/l
!、MgSO3・7H200,5g#!5K82P0゜
0.5g/j!、K2HPO41g/j!、Fe50+
・7 H202mg/ j!、Mn5CL’4Hz0 
2mg/j!−サイアミン塩酸塩 1mg/β、フェノ
ールレッド10mg/j!およびビオチン2 Jig/
 lあるいは1100a/βの組成を有する培地を調製
し、p)lを7.0に調整した後、3Qmlずつ30 
Qml容の枝材フラスコに入れ、115℃で15分間加
熱殺菌した。冷却後、別に加熱殺菌した尿素液を2g/
βになるように添加した。この培地に第2表に示した菌
を接種し30℃で振盪培養を行った。培養中培養液をp
 H6,5〜8.0に保つため12時間目と20時間目
の2回尿素液を4g/(lになるように添加し、32時
間で培養を終了した。かくして培養液中に蓄積したし一
グルタミン酸量は、第2表に示す通りである。培養液1
βから菌体を除去し、a縮し、塩酸でp H3,2に調
整し、冷却してL−グルタミン酸の粗結晶を得た。粗結
晶の量(g)を括弧内に示す。
第   2   表 実施例2゜ 実施例1で用いた培地中グルコースを甘蔗廃糖蜜(グル
コースとして40 g/l相当量)に換え、加熱殺菌後
の培地をp H7,0に再調整する以外は実施例1と同
様に行った。培養液中に蓄積したし−グルタミン酸量を
第3表に示す。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
    属に属し、リゾチームに感受性を有し、培地中に存在す
    る過剰のビオチンによってL−グルタミン酸の生産が抑
    制されない性質を有する微生物。
  2. (2)該微生物がコリネバクテリウム・グルタミクムま
    たはブレビバクテリウム・フラブムに属する菌株から選
    ばれる特許請求の範囲1の微生物。
  3. (3)該微生物がコリネバクテリウム・グルタミクムK
    Y9703(微工研菌寄第4412、NRRL1127
    1)、コリネバクテリウム・グルタミクムKY9705
    (微工研菌寄第4413、NRRL11272)、およ
    びブレビバクテリウム・フラブムKY9733(微工研
    菌寄第4414、NRRL11273)から選ばれる特
    許請求の範囲2の微生物。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996006180A1 (fr) * 1994-08-19 1996-02-29 Ajinomoto Co., Inc. Procede de production de l-lysine et d'acide l-glutamique par fermentation
WO2000014241A1 (fr) * 1998-09-04 2000-03-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Nouveau gene
CN115135759A (zh) * 2021-01-27 2022-09-30 Cj第一制糖株式会社 新型葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶变体及使用其生产l-谷氨酸的方法

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CN115135759B (zh) * 2021-01-27 2023-01-31 Cj第一制糖株式会社 新型葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶变体及使用其生产l-谷氨酸的方法

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