JPS6155958B2

JPS6155958B2 -

Info

Publication number: JPS6155958B2
Application number: JP56104746A
Authority: JP
Inventors: Ichiro Senhata; Masahiko Kizumi; Tsutomu Takagi
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1981-07-03
Filing date: 1981-07-03
Publication date: 1986-11-29
Also published as: JPS589692A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は発酵法によるＬ―アルギニンの製法に
関する。

Ｌ―アルギニンは医薬品あるいは食品添加物と
して有用な天然アミノ酸のひとつである。

従来、発酵法によりＬ―アルギニンを製造する
方法としては、バチルス属、コリネバクテリウム
属又はミクロバクテリウム属に属し、Ｌ―アルギ
ニンアナログ耐性を有する変異株を用いる方法
〔Appl，Microbial.，22，987〜991（1971）；
Agr.Biol.Chem.，36，1675〜1684（1972）；特
公昭49―25359号），ブレビバクテリウム属に属
し、グアニン要求性を有し、かつアルギニンのフ
イードバツク阻害および／またはプレツシヨンに
抵抗性の変異株を用いる方法（特開昭49―61388
号）、セラチア属に属しＬ―アルギニン分解能欠
損性でかつＬ―アルギニンによる代謝調節機構の
解除された変異株を用いる方法〔特開昭52―
87297号，J.Biochem.84，881（1978）〕等が知ら
れている。しかしながら、これら公知方法はいず
れもＬ―アルギニンの生成蓄積量において十分満
足し得るものでなかつた。

かかる状況の下に本発明者らは種々研究を重ね
た結果、セラチア属に属し、コハク酸要求性を有
するか、又は６―メチルプリン耐性を有するある
種の変異株が優れたＬ―アルギニン生産能を有す
ることを見い出し、本発明を完成するに至つた。

すなわち、本発明はセラチア属に属し、コハク
酸要求性を有するか又は６―メチルプリン耐性を
有するＬ―アルギニン生産性変異株を培養して、
培地中にＬ―アルギニンを生成蓄積せしめ、培養
物からＬ―アルギニンを採取することからなる発
酵法によるＬ―アルギニンの製法である。

本発明方法で用いられる菌株の代表的な例とし
ては、例えばセラチア・マルセツセンス（バージ
ーのマニユアル・オブ・デターミネイテイブ．バ
クテリオロジー、第８版、第326頁参照）に属
し、コハク酸要求性を有するＬ―アルギニン生産
性変異株、セラチア、マルセツセンスに属し、６
―メチルプリン耐性を有するＬ―アルギニン生産
性変異株などがあげられる。

セラチア．マルセツセンスに属し、コハク酸要
求性を有するＬ―アルギニン生産性変異株は、例
えばセラチア・マルセツセンスに属する公知のＬ
―アルギニン生産性変異株〔例えば；セラチア．
マルセツセンスPA3179株（J.Biochem.84、881
（1978））、セラチア．マルセツセンスPA8146株
（昭和54年日本醗酵工学大会講演要旨集第88〜89
頁）、セラチア．マルセツセンスAT428株および
AT419株（昭和54年度日本醗酵工学大会講演要
旨集第88〜89）などのＬ―アルギニン生産菌〕を
親株とし、これに通常の変異誘導操作（例えば、
紫外線照射、変異誘起剤による処理）を施すこと
によりコハク酸要求性を付与するか、或いはセラ
チア．マルセツセンスの野生株に上記と同様な方
法でまず、コハク酸要求性を付与し、該コハク酸
要求性変異株にセラチア・マルセツセンスに属す
る公知のＬ―アルギニン生産性変異株の有する変
異特性を形質導入するか、或いはセラチア・マル
セツセンスの野生株に通常の変異誘導操作により
公知のＬ―アルギニン生産菌が有する変異特性の
１部とコハク酸要求性とを付与し、ついで上記Ｌ
―アルギニン生産菌が有する残りの変異特性を形
質導入することにより取得することができる。こ
の様にして取得した菌株の代表的な例としては、
例えばセラチア・マルセツセンスSA268株（微工
研菌寄第6048号）（本菌株はコハク酸要求性を有
すると同時にＬ―アルギニン分解能欠損性でかつ
Ｌ―アルギニンによる代謝調節機構が解除されて
いる。）があげられる。

一方、セラチア・マルセツセンスに属し、６―
メチルプリン耐性を有するＬ―アルギニン生産性
変異株は、例えばセラチア・マルセツセンスに属
する公知のＬ―アルギニン生産性変異株を親株と
し、これに通常の変異誘導操作（例えば、紫外線
照射、変異誘起剤による処理）を施すことによつ
て６―メチルプリン耐性を付与するか、或いはセ
ラチア・マルセツセンスの野性株に上記と同じ方
法でまず６―メチルプリン耐性を付与し、該６―
メチルプリン耐性株にセラチア・マルセツセンス
に属する公知のＬ―アルギニン生産性変異株の有
する変異特性を形質導入するか、或いはセラチ
ア・マルセツセンスの野生株に通常の変異誘導操
作により公知のＬ―アルギニン生産菌が有する変
異特性の１部と６―メチルプリン耐性とを付与
し、ついで上記Ｌ―アルギニン生産菌が有する残
りの変異特性を形質導入することにより取得する
ことができる。

この様にして取得した菌株の代表例としては、
セラチア・マルセツセンスAT―531株（微工研
菌第6051号）（本菌株は６―メチルプリン耐性を
有すると同時にＬ―アルギニン分解能欠損性かつ
Ｌ―アルギニンによる代謝調節機構が解除されて
いる。）があげられる。

かくして得られる本発明に係る変異株のＬ―ア
ルギニン生産用培地としては、炭素源としてブド
ウ糖、シヨ糖、糖密の如き糖類、コハク酸、フマ
ール酸の如き有機酸、グリセロールの如きアルコ
ール類を10〜20％、窒素源としてフマール酸アン
モニウム、コハク酸アンモニウムの如き有機アン
モニウム塩、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ムの如き無機アンモニウム塩、尿素等を１〜10
％、有機栄養物としてコーン・ステイープ、リカ
ー、ペプトン、酵母エキス、魚肉エキス等を０〜
１％の範囲でそれぞれ適当量含有し、他にリン酸
カリウム、硫酸マグネシウム等の無機物を少量加
えた培地が好適に使用できる。これらの他に培地
のPHを６〜８に保つため炭酸カルシウムあるいは
アンモア水を必要に応じて添加してもよい。尚、
本発明方法で使用する微生物がコハク酸要求性変
異株である場合には、上記の如き培地に更にコハ
ク酸をソーダ塩、アンモニウム塩等の塩類として
１〜10mg／ml添加した培地、或いはコハク酸のか
わりにＬ―リンジとＬ―メチオニンをそれぞれ
0.1〜10mg／ml添加した培地が好適に使用でき
る。本発明によれば、これらの培地に本発明に係
る変異株を接種し、20〜40℃にて振とう培養ある
いは通気撹拌培養の如き好気的条件下で３〜10日
間培養することによつて培地中にＬ―アルギニン
を蓄量蓄積せしめることができる。生成したＬ―
アルギニンの採取は培養終了後菌体その他の不溶
物を除去し、ついでイオン交換樹脂を用いる通常
の分離精製操作によつて容易に採取することがで
きる。以下、実施例をあげて本発明方法を説明す
るが、実施例中Ｌ―アルギニンの確認はペーパー
クロマトグラム上のニンヒドリン反応および坂口
反応により、その定量はロイコノストツク・メツ
センテロイデスＰ―60株によるバイオアツセイに
よつて行なつた。

実施例１シヨ糖15％、フマール酸アンモニウム４％、コ
ハク酸２ナトリウム0.5％、尿素４％、リン酸第
２カリウム0.1％、硫酸マグネシウム・７水和物
0.035％、コーン・ステイープ・リカー0.3％、酵
母エキス0.3％および炭酸カルシウム0.5％を含む
発酵培地（PH7.0）15mlを500ml容振とうコルベン
に注入し、加熱滅菌した。但し、シヨ糖は別滅菌
後添加した。別に、シヨ糖３％、塩化アンモニウ
ム0.3％、コハク酸２ナトリウム0.5％、リン酸第
２カリウム0.1％、硫酸マグネシウム・７水和物
0.05％、ペプトン0.5％、酵母エキス0.1％、魚肉
エキス0.1％および炭酸カルシウム３％を含む種
培地（PH7.0）を調製し、この種培地で30℃、20
時間振とう培養したセラチア・マルセツセンス
SA268株（微工研菌寄第6048号）の培養液0.5ml
を上記発酵培地に植菌した。30℃、140回転／
分、振幅７cmの条件下で120時間培養した。培養
液中のＬ―アルギニン生成量は59.5mg／ml（塩酸
塩として72.0mg／ml）であつた。上記菌株の培養
液１を集め、熱処理した後、ロ過により菌体そ
の他の不溶物を除去した。アンバーライトIR―
120B（NH₄型）を充填したカラムにロ液を導通
し、水洗後吸着したＬ―アルギニンを５％アンモ
ニア水で溶出した。Ｌ―アルギニンを含む区分を
集め、減圧濃縮し、メタノールを加えて冷却し
た。生じた粗結晶を分離して水に懸濁し、塩酸を
加えてPHを5.0に調整した。このＬ―アルギニン
塩酸塩溶液を炭末脱色し、ロ過した。ロ液にメタ
ノールを加えて冷却した後、生じた結晶を分離
し、乾燥することによりＬ―アルギニン塩酸塩の
結晶51.8ｇを得た。

実施例２シヨ糖15％、フマール酸アンモニウム４％、尿
素５％、リン酸第２カリウム0.1％、硫酸マグネ
シウム・７水和物0.035％、コーン・ステイー
プ・リカー0.3％、酵母エキス0.3％および炭酸カ
ルシウム0.5％を含む発酵培地（PH7.0）1.5を３
容ジヤーフアメンターに注入し、加熱滅菌し
た。但し、シヨ糖は別途滅菌後添加した。これと
は別に種培地としてシヨ糖３％、塩化アンモニウ
ム0.3％、リン酸第２カリウム0.1％、硫酸マグネ
シウム・７水和物0.05％、ペプトン0.5％、酵母
エキス0.1％、魚肉エキス0.1％および炭酸カルシ
ウム３％を含む培地（PH7.0）を調製し、この種
培地で培養したセラチア・マルセツセンスAT―
531株（微工研菌寄第6051号）の培養液45mlを上
記発酵培地に植菌して、通気量750ml／分、回転
数800rpm、温度30℃で通気撹拌培養した。シヨ
糖を培養開始後72時間目及び96時間目に５％づつ
添加した。168時間目に培養液中のＬ―アルギニ
ン生成量は96ｇ／（塩酸塩として116ｇ／）
に達した。

参考例１（セラチア・マルセツセンスSA268株の取得方
法）セラチア・マルセツセンスSr41株から変異誘
導したＬ―アルギニン分解能欠損株PA1012〔J.
Brochem.84，881（1978）〕をブイヨン培地に少
量接種して30℃で培養した。培養液中の細菌数が
およそ10⁹細胞／mlに達した時に、Ｎ―メチル―
N′―ニトロ―Ｎ―ニトロソグアニジンの１mg／
ml水溶液を0.2mg／mlになるように加え、30℃に
て20分間培養した。この培養液を遠心分離し、上
清を捨て、生理食塩水（NaCl0.9％）を加えて細
胞を懸濁した。５×10⁸細胞／mlになるように調
整したこの細胞懸濁液0.1mlをＬ―カナバニン２
mg／mlを添加した寒天平板培地（Ｌ―グルタミン
酸ソーゾ1.0％、硫酸アンモニウム0.1％、リン酸
第２カリウム0.7％、リン酸第１カリウム0.3％、
硫酸マグネシウム、７水和物0.01％、寒天1.5
％）に塗布した。これを30℃にて４日間培養し、
生じたコロニーを釣菌・分離することによりセラ
チア・マルセツセンスPA8146株（昭和54年度日
本醗酵工学会大会講演旨集第88〜89頁）を取得し
た。PA8146株を上記と同様にしてＮ―メチル―
N′―ニトロ―Ｎ―ニトロソグアニジンで処理
し、得られた細胞懸濁液を生理食塩水でおよそ
10³細胞／mlになるように稀釈した。この稀釈液
0.1mlをブイヨン寒天平板培地に塗布して30℃に
て24時間培養した。生じたコロニーから通常のレ
プリカ法〔蛋白質・核酸・酵素別冊細菌・フアー
ジ遺伝実験法（1972）第25〜34頁〕によつてコハ
ク酸要求性変異株を選択した。なお、コハク酸要
求性を調べる培地としてはコハク酸２ナトリウム
0.2％添加または無添加の最小平板培地（ブドウ
糖0.5％、硫酸アンモニウム0.1％、リン酸第２カ
リウム0.7％、リン酸第１カリウム0.3％、硫酸マ
グネシウム・７水和物0.01％、寒天1.5％）を用
い、生育の有無で調べた。上記のようにして得た
コハク酸要求性変異株にトリメトプリムを用いて
チミン要求性を付与して（上同、第147〜153頁）
コハク酸要求性かつチミン要求性変異株を得た。
次に、セラチア・マルセツセンスRA8432株（本
菌株はJ.Biochem.84．881（1978）に記載されて
いるセラチア・マルセツセンスRA4240株と同じ
変異特性を有し、これと同様にして取得した。）
を供与菌として、上記のコハク酸要求性かつチミ
ン要求性変異株を受容菌として形質導入〔J.
Biochem.84、881（1978）〕を行つた。コハク酸
２ナトリウム0.2％を添加した上記最小平板培地
上で30℃にて３日間培養しチミン非要求性の形質
導入株を選択することによつてセラチア・マルセ
ツセンスSA268株を取得した。

参考例２（セラチア・マルセツセンスAT―531株の取得
法）セラチア・マルセツセンスSr41株から誘導し
たＬ―アルギニン分解能欠損性かつＬ―アルギニ
ンによる代謝調節機構の解除された変異株
AT419株を参考例１と同様にしてＮ―メチル―
N′―ニトロ―Ｎ―ニトロソグアニジンで変異誘
起処理したのち、５×10⁸細胞／mlの細胞懸濁液
を調製した。この細胞懸濁液0.1mlを６―メチル
プリン0.2mg／mlを添加した寒天平板培地（ブド
ウ糖0.5％、リン酸第２カリウム0.7％、リン酸第
１カリウム0.3％、硫酸アンモニウム0.1％、硫酸
マグネシウム・７水和物0.01％、通常のＬ―アル
ギニンバイオアツセイ用培地からプリン、ピリミ
ジン類を除いた溶液10％、寒天1.5％）に塗布し
た。これを30℃にて３日間培養し、生じたコロニ
ーを釣菌・分離することによつてセラチア・マル
セツセンスAT―531株を取得した。

Claims

【特許請求の範囲】１セラチア属に属し、コハク酸要求性を有する
か、又は６―メチルプリン耐性を有するＬ―アル
ギニン生産株を培養し、培養物からＬ―アルギニ
ンを採取することを特徴とする発酵法によるＬ―
アルギニンの製法。２使用菌株がセラチア・マルセツセンスのコハ
ク酸要求性を有するＬ―アルギニン生産株である
特許請求の範囲第１項記載の製法。３使用菌株がセラチア・マルセツセンスの６―
メチルプリン耐性を有するＬ―アルギニン生産株
である特許請求の範囲第１項記載の製法。