JPS589692A - 発酵法によるｌ−アルギニンの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は発酵法によるＬ−アルギニンの製法に関する。

　　− Ｌ−アルギニンは医薬品あるいは食品添加物として有用
な天然アミノ酸のひとつである。

従来９発酵法によりＬ−アルギニンを製造する方法とし
ては、バチルス属、コリネバクテリウム属又はミクロバ
クテリウム属に属し、Ｌ−アルギニンアナログ耐性を有
する変異株を用いる方法〔＾ｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉａ
ｌ　　１２２　．９８７〜９９１（１９７］　　）；　
　Ａｇｒ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ＠ｗ　　・１３６　．１６７
５〜１６８４（’１９７２）；特公昭４９−２５３５９
号〕。

ブレビバクテリウム属に属し、グアニン要求性を有し、
かつアルギニンのフィードバック阻害詔よび／またはレ
プレッシーンに抵抗性の変異株を用いる方法（特開昭４
９−６１３８８号）、セラチア属に属しＬ−アルギニン
分解能欠損性でかつＬ−アルギニンによる代謝調節機構
の解除された変異株を用いる方法〔特開昭５２−８７２
９７号。

Ｊ、　１ｉｏｏｈｓＩＩ＋、　８４　、８８１　（１９
７８）　）等が知られている。しかしながら、これら公
知方法はいずれもＬ−アルギニンの生成蓄積量に詔いて
十分満足し得るものでなかうた。

かかる状況の下に本発明者らは種々研究を重ねた結果、
Ｊｋ５チア属に属し、コハク酸要求性を有するか、又は
核酸塩基アナログ脳性を有するある種の変異株が優れた
Ｌ−アルギニン生産能を有することを見い出し９本発明
を完成するに至った。

すなわち１本発明はセラチア属に属し、コハク駿特開昭
５８−９６９２（２） 要求性を有するか又は核酸塩基アナログ耐性を有するＬ
−アルギニン生産性変異株を培養して、培地中にＬ−ア
ルギニンを生成蓄積せしめ、培養物からＬ−アルギニン
を採取することからなる発酵法によるＬ−アルギニンの
製法である。

本発明方法で用いられる１株の代表的な例としては１例
えはセラチア・フルセラセンス（パージ−の７ニエアル
・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー、第８
版、第３２６頁参照）に属し、コハク酸要求性を有する
Ｌ−アルギニン生産性変異株、セラチア・フルセラセン
スに属し、核酸塩基アナログ（例えば、６−メチルプリ
ンの如きプリンアナグ０．６−アザウラシルの如きピリ
ミジンアナログ等）耐性を有するＬ−アルギニン生産性
変異株などがあげられる。

セ５ｆア・フルセラセンスに属し、コハク酸要求性を有
するＬ−アルギニン生産性変異株は９例えばセラチア・
フルセラセンスに属する公知のＬ−アルギニン生産性変
異株〔例えば寡セラチア・フルセラセンスＰＡ　８１７
９株（Ｊ、　！１ｉｏｏｈ＠ｍ、　ｇ　４５− ．８８１（１９７８））、セラチア・フルセラセンスＰ
Ａ８１４６株（昭和５４年日本醗酵工学大会講演要旨集
第８８〜８９頁）、セラチア・マルセッセンス＾テ４２
８株ｔよびａｔａ１９株（昭和５４年度日本醗酵工学大
会講演要旨集第８８〜８９）なとのＬ−アルギニン化ｌ
ｌｍ１〕を親株とし・、これに通常の変異誘導操作（例
えば、紫外線照射、変異誘起剤による処理）を施すこと
によりコハク酸要求性を付与するか、或いはセラチア・
フルセラセンスの野生株に上記と同様な方法でまず、コ
ハク酸要求性を付与し、該コハク酸要求性麦興株にセラ
チア・フルセラセンスに属する公知のＬ−アルギニン生
産性変異株の有する変異特性を形質導入するか、或いは
セラチア・フルセラセンスの野生株に通常の変異誘導操
作膠こより公知のＬ−アルギニン生産菌が有する変異特
性の１部とコハク酸要求性とを付与し、ついで上記Ｌ−
アルギニン生産菌が有する残りの変異特性を形質導入す
ることにより取得することができる。この様にして取得
した菌株の代表的な例としては１例えばセ　６− ラチア・マルセッセンスＳ＾２６８株（微工研鯛寄第　
θρ４Ａ８号）（本菌株はコノ１り酸要求性を有すると
同時にＬ−アルギニン分解能欠損性でかつＬ−アルギニ
ンによる代謝調節機構が解除されている。）があげられ
る。

一方、セラチア・フルセラセンスに属し、　［［基アナ
ログ耐性を有するＬ−ア／Ｌ、ギニン生産性変異株は１
例えばセラチア・フルセラセンスに属する公知のＬ−ア
ルギニン生産性変異株を親株とし、これに通常の変異誘
導操作（例えば、紫外線照射、変異誘起剤による処理）
を施すことによって核酸塩基アナログ（例えは、６−メ
チルプリンの如きプリンアナログ、６−アザウラシルの
如きピリミジンアナログ等）耐性を付与するか、或し）
はセラチア・フルセラセンスの野生株に上記と同じ方法
でまず核酸塩層アナログ耐性を付与し、該核酸塩基アナ
ログ耐性株にセラチア・フルセラセンスに属する公知の
Ｌ−アルギニン生産性変異株の有する変異特性を形質導
入するか、或いはセラチ、ア・フルセラセンスの野生株
に通常のａｓｓ導ｓ作により公知のＬ−アルギニン生ｔ
ｊ、ｌＩが有する変異特性の１部と核酸塩基アナログ耐
性とを付与し、ついで−ヒ記し−アルギニン生産園が有
する残りめ変異特性を形質導入することにより取得する
ことができる。

この様にして取得した菌株の代表例としては、セラチア
・マルセッセンス＾Ｕ’−１１６株（微工研菌寄第　６
０ぐ９号）（本１株は６−アザウラシル耐性を有すると
同時にＬ−アルギニン分解能欠損ＡＴ−５３１株（微１
研菌第１＞ｏｈ号）（本菌株は６−メチルプリン耐性を
有すると同時にＬ−アルギニン分解能欠損性かつＬ−ア
ルギニンによる代謝調節機構が解除されている。）があ
げられる。

かくして慢られる本発明に係る変異株のＬ−アルギニン
生産用培地としては、炭素源としてブドウ糖、シ■糖、
糖密の如き糖類、コハク酸、フマール酸の如き有機峻、
グリセロールの如きアルコ−４１ｍを１０〜２０％、１
１素源としてフマール駿アンモニウム、コへり酸アンモ
ニウムの如き有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウムの如き無機アンモニウム塩、尿素等を
１〜１０％、有機栄養物としてコーン・ステイープ、リ
カー、ペプトン、＃母エキス、魚肉エキス等を０〜１嘔
の範囲でそれぞれ適当量含有し、他にリン酸カリウム、
硫酸マグネシウム等の無機物を少量加えた培地が好適に
使用できる。これらの他に培地のｐＨを６〜８に保つた
め炭酸カルシウムあるいはアンモニア水を必要に応じて
添加してもよい。

尚１本発明方法で使用する微生物がコハク酸要求性変異
株である場合には、上記の如き培地に”更にコハク酸を
ソーダ塩、アンモニウム塩等の塩類として１〜１０岬／
−添加した培地、或いはコハク酸のかわりにＬ−リジン
とＬ−’メチオニンをそれぞれ０．１〜１０ｗｇ／−添
加した培地が好適に使用できる。

本発明によれば、これにの培地に本発明に係る変　９− 間培養することによって培地中にＬ−アルギニンを蓄量
蓄積せしめることができる。生成したＬ−アルギニンの
採取は培養終了後画体その他の不溶物を除去し、ついで
イオン交換樹脂を用いる通常の分離精製操作によって容
易に採取することができる。以ド、実施例をあげて本発
明方法を説明するか、実施例中Ｌ−アルギニンの確認は
ペーパークロマトグラム上のニンヒドリン反応および坂
口反応ｌこより、その定量はロイコノストック・メツセ
ンチロイデス？−６０株によるバイオアッセイによって
行なった。

実施例　１ シ目糖’１５％、フマール酸アンモニウム４％。

コハク酸２ナトリウム０．５％、尿素４％、リン酸第２
カリウム０．１％、硫酸マグネシウム・７永和物０．０
３５％、コーン・ステイープ・リカー０．３囁、酵母エ
キス０．３％および炭酸カルシウム０．５囁゛を含む発
酵培地（ｐ）１７．０）１５ｊを５００ｄ容振とう−コ
ルベンに注入し、加熱域１した。但し。

シー糖は別滅菌後添加した。別に、シ四糖３％。

１０− 塩化アンモニウム０．３％、コハク酸２ナトリウム０．
５％、リン酸第２カリ・ラム０．１％、硫酸マグネシウ
ム・７水和物０．０５％、ペプトン０，５％、酵母エキ
ス０．１％、魚肉エキス０．１％および炭酸カルシウム
３％を含む種椿地（ｐＨ７，０）を調製し。

この種培地で３０℃、２０時間擬とう培養したセラチア
・マルセッセンス５ａ２６８株（微工研菌寄第　６０４
３号）の培養液０．５−を上記発酵培地に植１した。３
０℃、１４０回転／分、振幅・７５の条件Ｆで１２０峙
間培養した。培養液中のＬ−アルギニン生成量は５９．
５　”Ｉ／Ｍｔ（塩酸塩として７２．０　Ｗ／ｄ　）で
あった。上記菌株の培養液１１を集め、熱処理した後９
口過６Ｃより菌体その他の不溶物゛を除去した。アンバ
ーライトｒｉ　、＋　１２．０．８　（ＮＨ４型）を充
填したカラムに０液を導通し、水洗後吸着したＬ−アル
ギニンを５％アンモニア水５で溶出した。＝Ｌ−ア・ル
ギニンを含−む区分を集め、減圧勇縮し、メタノール番
加えて冷却した。生じた粗結晶を分離して水＃Ｃ＠・濁
し、塩酸を加えて、−を、ｇ、ｏｆｃ調整した。このＬ
−ア・ルギニン塩酸塩溶液を炭末脱色し９口過した。０
液にメタノールを加えて冷却した後、生じた結晶を分離
し、乾燥することによりＬ−アルギニン塩酸塩の結晶５
１．８Ｆを得た。

実施例２ シ日糖１ｓ％、フマール酸アンモニウム４囁。

尿素５％、リン酸第２カリウム０．１％、硫酸マグネシ
ウム・７水和物０．０３５％、コーン・ステイブ・リカ
ー０．３％、酵母エキス０．３５および炭酸カルシウム
０．５％を含む発酵培地−（ｐＨ７，０）１５ｍを５０
〇−容重とうコルベンに注入し、加熱滅菌した。但し、
シ１糖は別滅菌後添加した。これとは別に種培地として
シ■糖３％、塩化アンモニウム０．３％、リン酸第２カ
リウム０．１％、硫酸マグネシウム・７水和物ｏ、ｏｓ
ｓ、ペプトン０．５％。

酵母エキス０．１％、魚肉エキス０．１％詔よび炭酸カ
ルシウム３囁を含む培地（ｐＨ７，０）　１５−を同様
に調製した。この種培地で３０℃、２０時間振とう培養
したセラチア０マルセツセンス＾υｒ　＋　ｓ１６株（
微工研１寄第　６０女Ｑ号）の培養液ｌ−を上記の発酵
培地に植菌した。３０℃、１４０回転／分、振幅７ｃＩ
Ｒの条件下で９６時間培養した時点でシ田糖を１２添加
した。培養開始後１４４時間時間項養液中のＬ−アルギ
ニン生成量は８２．８Ｐ／ｍ／（塩酸塩として１００．
２　Ｖｒｎｌ　）に達した。

実施例　３ 実施例２と同じ組織の発酵培地１５−を３１容ジヤーフ
アメンターに注入した。別に９種培地を実施例２と同様
憂こ調製し、この種培地で培養したセラチア・マルセッ
センスへ〒−５３１株（微工研菌寄第　６ρぐ１号）の
培養液４５−を上記発酵培地に植菌しで、？ｉｉ３Ｎ４
７５０　ｍｌ１分９回転数８０Ｑ　ｒｐｍ　、温度３０
℃で通気攪拌培養した。ショ糖を培養開始後７２時間目
及び９６時時間区５％づつ添加した。１６８時間目に培
養液中のＬ−アルギニン生成量は９６Ｆ／／（塩酸塩と
して１１６Ｐ／ｌ）に達した。

参考例　１ （セラチア・マルセッセンス５Ａ２６Ｓ株の取得、方法
） １３− セラチア・マルセッセンス５ｒ４１株から変異誘導した
し一アルギニン分解能欠損株ＰＡ１０１２［Ｊ、Ｂｒｏ
ｃｈｏｍ、８４．８８１（１９７８））をブイヨン培地
に少量接種して３０℃で培養した。培養液中の細菌数が
およそ１０９細１−に達した時に。

Ｎ−１＋ルーＮ′−二トローＮ−ニド０ソクアニジンの
１１水溶液を０．２η鷹になるように加え。

３０℃にて２０分間培養した。この培養液を遠心分離し
、１消を捨て、生理食塩水（Ｍａｉｌ　０．９　％　）
を加えて細胞を懸濁した。５Ｘ１Ｇ’細Ｉになるように
調整したこの細胞懸濁液０．１−をＬ−カナパニン２呪
−を添加した寒天板培地（Ｌ−グルタミン酸ソーダ１．
０％、硫酸アンモニウム０．１％。

リン酸第２カリウム０．７％、リン酸第１カリウム０．
３％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０１％。

寒天ｌｓ％）に塗布した。これを３０℃にて４日間培養
し、生じたコロニーを釣菌・分離Ｔること１（Ｊｔ）セ
ラチア・マルセツセンスＰ＾８１４６株（昭和５４年度
日本醗酵工学会大会講演旨集第８８〜８９頁）を取得し
た。ＰＡ８１４６株を上記１４− と同様にしてＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソ
グアニジンで処理し、得られた細胞懸濁液を生理食塩水
でおよそ１０”細胞層になるように稀釈した。この稀釈
液０，１−をブイヨン寒天平板培地に塗布して３０℃に
て２４時間培養した。生じたコロニーから通常のレプリ
カ法〔蛋白質・核゛酸・酵素別Ｗ＆ｌ１ｌｉｌｌＩ・フ
ァージ遺伝実験法（１９７２）第２５〜３４頁〕によっ
てコ／％り酸要求性変異株を選択した。なお、コ／Ｎり
酸要求性を調べる培地モス９４０．１％。リン酸第２カ
リウム０．７′％、リン酸第１カリウム０．３％、硫酸
マグネシウム・７水和物０．０１％、寒天１．５％）を
用い、生育の有無で調べた。上記のようにして碍たコノ
−り酸要求性変異株にトリメトプリムを用いてチミン要
求性を付与し、て（上向、第１４７〜１５３頁）コ／Ｘ
り酸要求性かつチミン要求性変異株を得た。次・こ。

セ５　チア・マルセツセンスｎＡ３４３２株Ｃ本１１株
はコ、　Ｂｉｏｃｈｓｍ　、　８４　、８８１　（１９
７８）に記載されているセラチア・マルセッセンスＲＡ
４２４０株と同じ変異特性を有し、これと同様にして取
得した。）を供与菌として、上記のコハク酸要求性かつ
チミン要求性変異株を受容菌として形質導入［Ｊ、Ｂｌ
ｏｃｈａｍ、８４．８８１（１９７８ン〕を行った。コ
ハク酸２ナトリウム０．２％を添加した上記最小平板培
地上で３０℃にて３日間培養しチミン非要求性の形質導
入株を選択することによってセラチア・マルセッセンス
５Ａ２６８株を取得した。

参考例２ （セラチア・マルセッセンスＡＵｒ−１１８株ｆ）取得
法） セラチア・マルセッセンスＳｒ　４１株から誘導したＬ
−アルギニン分解能欠損性かつＬ−アルギニンによる代
謝調節機構の解除された（異株Ａ〒４１９株（昭和５４
年度日本醗酵工学大会講演要旨集第８８〜８９頁］を参
考例１と同様にしてＮ−メチル−Ｎ′−二トロングアニ
ジンで変異誘導処理したのち、５Ｘ１０”細胞／−の細
胞懸濁液を調製した。この細胞！Ｉ！濁液を０．１ｍｌ
を６−アザウラシル０．１１Ｆ／−を添加した寒天平板
培地（ブドウ糖０．５鴫、リンや第２カリウム０．７％
、リン酸第１カリウム０３チ、硫酸アンモニウム０．１
％、硫酸マグネシウム・７水和？？Ｊ０．０１％９通常
のＬ−アルギニンバイオアッセイ用培地からプリン、ピ
リジン類を除いた溶ｗ１１０チ、寒天１．５４　）に塗
布した。これを３０℃にて３日間培養し、生じたコロニ
ーを釣菌・分離することによりセラチア・マルセッセン
ス＾［１ｒ−１１６株を碍た。

参考例３ （セラチア・マルセッセンスＡｙ−５３１株の取得法） セラチア・マルセッセンス５ｒ４１株から誘導したＬ−
アルギニン分解能欠損性かつＬ−アルギニンによる代謝
調節機構の解除された変異株Ａ〒４１９株を参考例１と
同様にしてＮ−メチル−Ｎ／−ニトロ−Ｎ−ニトロソ°
グアニジンで変異誘起処理したのち、５ｘｌＯ”細胞鷹
の細胞懸濁液を調製しり、この細胞懸濁液０．１４を６
−メチルプリン０゜１７− ２　ｖ９／Ｒ１を添加した寒天平板培地（参考例２と同
じ）に塗布した。これを３０℃にて３日間培養し。

生じたコロニーを約１・分離することによってセラチア
・マルセッセンスＡＴ−５３１株を取得した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　セラチア属に属し、コハク酸要求性を有する
   か、又は核酸塩基アナログ耐性を有するＬ−アルギニン
   生産菌株を培養し、培養物からＬ−アルギニンを採材る
   ことを特徴とする発酵法によるＬ−アルギニンの製法。 （２）使用菌株がセラチア属に属し、コハク酸要求性を
   有するＬ−アルギニン生産菌株である特許請求の範囲第
   １項記載の製法。 （３１使用株がセラチア属に属し、核酸塩基アナログ耐
   性を有するＬ−アルギニン生産菌株である特許請求の範
   囲第１項記載の製法。 （４）　　使用菌株がセラチア属に属し、ピリミジンア
   ナログ耐性もしくはプリンアナログ耐性を有するＬ−ア
   ルギニン生産菌株である特許請求の範囲第３項記載の製
   法 〜　２− （５１使用菌株がセラチア・マルセッセンスに属し、コ
   ハク酸要求性を有するＬ−アルギニン生産菌株である特
   許請求の範囲第２項記載の製法。 （６）使用菌株がセラチア・マルセッセンスに属し、６
   −アザウラシル耐性を有するＬ−アルギニン生ｗＬ蒙株
   である特許請求の範囲第４項記載の製法。 （７１使用菌株がセラチア・マルセッセンスに属し、６
   −メチルプリン耐性を有するＬ−アルギニン生産菌株で
   ある特許請求の範囲第４項記載の製法。