JP3046332B2 - 発酵法によるアミノ酸の製造法 - Google Patents
発酵法によるアミノ酸の製造法Info
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- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 Ｌ−スレオニンやＬ−リジンなどのアミノ酸は、医
薬、食品、飼料などに広く利用されている重要な物質で
ある。
薬、食品、飼料などに広く利用されている重要な物質で
ある。
従来の技術 従来、安価に大量に入手可能な発酵原料であるメタノ
ールからアミノ酸を製造する方法としては、アクロモバ
クター属およびシュードモナス属（特公昭45−25273号
公報）、プロタミノバクター属（特開昭49−125590号公
報）、プロタミノバクター属およびメタノモナス属（特
開昭50−25790号公報）、ミクロサイクラス属（特開昭5
2−18886号公報）などに属する微生物を用いる方法が知
られている。しかし、いずれの場合もアミノ酸の生産量
は少なく、満足すべきものではない。
ールからアミノ酸を製造する方法としては、アクロモバ
クター属およびシュードモナス属（特公昭45−25273号
公報）、プロタミノバクター属（特開昭49−125590号公
報）、プロタミノバクター属およびメタノモナス属（特
開昭50−25790号公報）、ミクロサイクラス属（特開昭5
2−18886号公報）などに属する微生物を用いる方法が知
られている。しかし、いずれの場合もアミノ酸の生産量
は少なく、満足すべきものではない。
発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、医薬、食品、飼料などに有用なＬ−
スレオニンやＬ−リジンなどのアミノ酸を工業的により
効率よく、安価に製造する方法を提供することにある。
スレオニンやＬ−リジンなどのアミノ酸を工業的により
効率よく、安価に製造する方法を提供することにある。
課題を解決するための手段 本発明によれば、メチロバチルス属に属し、抗生物質
およびアミノ酸代謝拮抗物質から選ばれる少なくとも１
つに対する感受性が向上した菌株を親株として変異処理
により得られ、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジンおよびアミ
ノ酸代謝拮抗物質から選ばれる少なくとも１つに耐性を
有し、かつアミノ酸生産能を微生物を、メタノールを主
たる炭素源として含有する培地に培養し、培養物中にア
ミノ酸を生成蓄積させ、該培養物からアミノ酸を採取す
ることを特徴とする発酵法によるアミノ酸の製造法を提
供することができる。
およびアミノ酸代謝拮抗物質から選ばれる少なくとも１
つに対する感受性が向上した菌株を親株として変異処理
により得られ、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジンおよびアミ
ノ酸代謝拮抗物質から選ばれる少なくとも１つに耐性を
有し、かつアミノ酸生産能を微生物を、メタノールを主
たる炭素源として含有する培地に培養し、培養物中にア
ミノ酸を生成蓄積させ、該培養物からアミノ酸を採取す
ることを特徴とする発酵法によるアミノ酸の製造法を提
供することができる。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明で用いられる微生物は、メチロバチルス属に属
し、抗生物質およびアミノ酸代謝拮抗物質から選ばれる
少なくとも１つに対する感受性が向上した菌株を親株と
して変異処理により得られ、Ｌ−スレオニン（以下、Ｌ
−Thrと略記する。）、Ｌ−リジン（以下、Ｌ−Lysと略
記する。）およびアミノ酸代謝拮抗物質から選ばれる少
なくとも１つに耐性を有し、メタノールを主たる炭素源
として含有する培地に生育でき、かつアミノ酸とくにＬ
−ThrやＬ−Lysの生産能を有する微生物であればよい。
このような性質を有する変異株は、親株に紫外線照射、
Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（NTG）処理なとによる通常の変異処理を施して得られ
る。
し、抗生物質およびアミノ酸代謝拮抗物質から選ばれる
少なくとも１つに対する感受性が向上した菌株を親株と
して変異処理により得られ、Ｌ−スレオニン（以下、Ｌ
−Thrと略記する。）、Ｌ−リジン（以下、Ｌ−Lysと略
記する。）およびアミノ酸代謝拮抗物質から選ばれる少
なくとも１つに耐性を有し、メタノールを主たる炭素源
として含有する培地に生育でき、かつアミノ酸とくにＬ
−ThrやＬ−Lysの生産能を有する微生物であればよい。
このような性質を有する変異株は、親株に紫外線照射、
Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（NTG）処理なとによる通常の変異処理を施して得られ
る。
抗生物質としては、カナマイシン、アンピシリン、ス
トレプトマイシンなどがあげられる。
トレプトマイシンなどがあげられる。
アミノ酸代謝拮抗物質としては、α−アミノ−β−ヒ
ドロキシ吉草酸（以下、AHVと略記する。）、Ｓ−２−
アミノエチル−Ｌ−システイン（以下、AECと略記す
る。）およびDL−4,5−トランスデヒドロリジン（以
下、DHLと略記する。）などがあげられる。
ドロキシ吉草酸（以下、AHVと略記する。）、Ｓ−２−
アミノエチル−Ｌ−システイン（以下、AECと略記す
る。）およびDL−4,5−トランスデヒドロリジン（以
下、DHLと略記する。）などがあげられる。
本発明で用いられる微生物の具体例を第１表に示す。
これらの菌株の取得方法を示す。
メチロバチルス属細菌の野生菌はアミノ酸代謝拮抗物
質に対する感受性が低く、野生株にアミノ酸代謝拮抗物
質に対する耐性を付与し、代謝制御変異株を分離するこ
とが難しい。アミノ酸代謝拮抗物質に対する感受性が低
いのは、種々の薬剤に対する膜透過性が悪いことが原因
として考えられる。そこで野生株からアミノ酸漏出型変
異株を誘導し、得られた変異株の中から種々の薬剤に対
する感受性が向上し、薬剤の透過性が向上したと考えら
れる株を親株として取得する。
質に対する感受性が低く、野生株にアミノ酸代謝拮抗物
質に対する耐性を付与し、代謝制御変異株を分離するこ
とが難しい。アミノ酸代謝拮抗物質に対する感受性が低
いのは、種々の薬剤に対する膜透過性が悪いことが原因
として考えられる。そこで野生株からアミノ酸漏出型変
異株を誘導し、得られた変異株の中から種々の薬剤に対
する感受性が向上し、薬剤の透過性が向上したと考えら
れる株を親株として取得する。
親株としては、メチロバチルス属に属し、カナマイシ
ン、アンピシリン、ストレプトマイシンなどの抗生物
質、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸、Ｓ−２−アミ
ノエチル−Ｌ−システインなどのアミノ酸代謝拮抗物質
から選ばれる少なくとも１つに対する感受性が向上した
ものが用いられる。具体的には既に公知の菌株やアクロ
モバクター・メタノーロフィラ（Achromobacter methan
olophila）ATCC 21452株、シュードモナス・インスエタ
（Pseudomonas insueta）ATCC 21276株、プロタミノバ
クター・チアミノファーガス（Protaminobacter thiami
nophagus）ATCC 21371株、メタノモナス・メチロボーラ
（Methanomonas methylovora）ATCC 21369株などの野生
株の、前記したような薬剤に対する感受性を向上させた
変異株が好ましい。既に公知の菌株としては、シュード
モナス・インスエタＫ−015（ATCC21966株）、シュード
モナス・インスエタＫ−038（ATCC 21967株）、プロタ
ミノバクター・チアミノファーガスＫ−224（ATCC 2196
9株）などがあげられる。
ン、アンピシリン、ストレプトマイシンなどの抗生物
質、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸、Ｓ−２−アミ
ノエチル−Ｌ−システインなどのアミノ酸代謝拮抗物質
から選ばれる少なくとも１つに対する感受性が向上した
ものが用いられる。具体的には既に公知の菌株やアクロ
モバクター・メタノーロフィラ（Achromobacter methan
olophila）ATCC 21452株、シュードモナス・インスエタ
（Pseudomonas insueta）ATCC 21276株、プロタミノバ
クター・チアミノファーガス（Protaminobacter thiami
nophagus）ATCC 21371株、メタノモナス・メチロボーラ
（Methanomonas methylovora）ATCC 21369株などの野生
株の、前記したような薬剤に対する感受性を向上させた
変異株が好ましい。既に公知の菌株としては、シュード
モナス・インスエタＫ−015（ATCC21966株）、シュード
モナス・インスエタＫ−038（ATCC 21967株）、プロタ
ミノバクター・チアミノファーガスＫ−224（ATCC 2196
9株）などがあげられる。
ATCC 21452株、ATCC 21276株、ATCC 21371株、ATCC 2
1369株、ATCC 21966株、ATCC21967株およびATCC 21969
株はいずれも、現在メチロバチルス（Methylobacillu
s）属に分類されていることがインターナショナル・ジ
ャーナル・システマティック・バクテリオロジー（Inte
rnational J.Systematic Bacteriology），27,p247−25
5,1977;34,p188−201,1984に記載されている。
1369株、ATCC 21966株、ATCC21967株およびATCC 21969
株はいずれも、現在メチロバチルス（Methylobacillu
s）属に分類されていることがインターナショナル・ジ
ャーナル・システマティック・バクテリオロジー（Inte
rnational J.Systematic Bacteriology），27,p247−25
5,1977;34,p188−201,1984に記載されている。
そこで本明細書中ではATCC 21452株、ATCC 21276株、
ATCC 21371株、ATCC 21369株、ATCC 21966株、ATCC 219
67株およびATCC 21969株をそれぞれ、メチロバチルス・
エスピー1001、1011、1006、1003、Ｋ−015、Ｋ−038お
よびＫ−224株と呼称する。
ATCC 21371株、ATCC 21369株、ATCC 21966株、ATCC 219
67株およびATCC 21969株をそれぞれ、メチロバチルス・
エスピー1001、1011、1006、1003、Ｋ−015、Ｋ−038お
よびＫ−224株と呼称する。
メチロバチルス・エスピー1001株、1011株、1006株お
よび1003株などの野生株に、薬剤に対する感受性を向上
させるには、前記したような野生株にNTG処理などの通
常の変異処理を施す。具体的な菌株としては、メチロバ
チルス・エスピーiA111株などがあげられる。以下にiA1
11株の取得方法を示す。
よび1003株などの野生株に、薬剤に対する感受性を向上
させるには、前記したような野生株にNTG処理などの通
常の変異処理を施す。具体的な菌株としては、メチロバ
チルス・エスピーiA111株などがあげられる。以下にiA1
11株の取得方法を示す。
メチロバチルス・エスピー1011株を下記組成からなる
M1培地で30℃、24時間培養する。得られた菌体を常法に
よりNTG処理（500mg/、30℃で30分）し、カザミノ酸
（ディフコ社製）0.1％およびＬ−トリプトファン20mg/
含有するM1寒天培地（M1培地＋寒天1.5％）に塗布す
る。これを、30℃で３〜14日培養し、生じたコロニーを
釣菌分離する。このようにして得られた変異株を試験管
内の3mlの種培地へ植菌し、30℃で18時間培養する。得
られた種培養液1mlを、50ml容太型試験管中の、メタノ
ールを２％添加した発酵培地10mlに植え、培養24時間後
に２％量のメタノールをさらに添加し、30℃で合計48時
間培養する。培養はいずれも、振盪培養でおこなう。
M1培地で30℃、24時間培養する。得られた菌体を常法に
よりNTG処理（500mg/、30℃で30分）し、カザミノ酸
（ディフコ社製）0.1％およびＬ−トリプトファン20mg/
含有するM1寒天培地（M1培地＋寒天1.5％）に塗布す
る。これを、30℃で３〜14日培養し、生じたコロニーを
釣菌分離する。このようにして得られた変異株を試験管
内の3mlの種培地へ植菌し、30℃で18時間培養する。得
られた種培養液1mlを、50ml容太型試験管中の、メタノ
ールを２％添加した発酵培地10mlに植え、培養24時間後
に２％量のメタノールをさらに添加し、30℃で合計48時
間培養する。培養はいずれも、振盪培養でおこなう。
以下に、それぞれの培地組成を示す。
M1培地組成：メタノール0.5％、硫酸アンモニウム0.2
％、燐酸一カリウム0.1％、燐酸二カリウム0.7％、塩化
ナトリウム0.01％、チオウレア0.01％、硫酸マグネシウ
ム0.05％、硫酸第一鉄10mg/、硫酸マンガン8mg/、
チアミン1mg/、ビオチン0.01mg/、pH7.0 種培地（以下、種培値ａという）組成：粉末ブイヨン
（極東製薬社製）２％、酵母エキスＳ（大五製薬社製）
0.5％、メタノール１％、pH7.0 発酵培地（以下、発酵培地ｂという）組成：硫酸アンモ
ニウム0.8％、燐酸一カリウム0.1％、燐酸二カリウム0.
7％、塩化ナトリウム0.1％、硫酸マグネシウム0.04％、
硫酸第一鉄10mg/、硫酸マンガン10mg/、ビオチン0.
05mg/、チアミン0.2mg/、パントテン酸カルシウム
0.5mg/、ニコチン酸0.5mg/、コーン・スティーブ・
リカー0.3％、カザミノ酸0.05％、炭酸カルシウム２
％、pH7.0 〔pHは水酸化ナトリウムまたは塩酸を用いて調整する。
いずれの培地においても、メタノール以外の成分を溶解
し、120℃、15分間の蒸気滅菌をおこない、その後、メ
ンブレンフィルター（ミルポア社製、0.45μｍ）で除菌
したメタノールをそれぞれの量添加する。〕 培養終了後、菌体および炭酸カルシウムと培養液上清
を遠心分離する。培養液上清中に含まれるアミノ酸をア
ミノ酸分析計（日本分光社製、高速液体クロマトグラフ
ィー、アミノ酸分析システム）で分析する。グルタミン
酸、アスパラギン酸、バリン、アラニンなどのアミノ酸
が培養液上清に検出されている菌株をアミノ酸漏出型変
異株として取得する。
％、燐酸一カリウム0.1％、燐酸二カリウム0.7％、塩化
ナトリウム0.01％、チオウレア0.01％、硫酸マグネシウ
ム0.05％、硫酸第一鉄10mg/、硫酸マンガン8mg/、
チアミン1mg/、ビオチン0.01mg/、pH7.0 種培地（以下、種培値ａという）組成：粉末ブイヨン
（極東製薬社製）２％、酵母エキスＳ（大五製薬社製）
0.5％、メタノール１％、pH7.0 発酵培地（以下、発酵培地ｂという）組成：硫酸アンモ
ニウム0.8％、燐酸一カリウム0.1％、燐酸二カリウム0.
7％、塩化ナトリウム0.1％、硫酸マグネシウム0.04％、
硫酸第一鉄10mg/、硫酸マンガン10mg/、ビオチン0.
05mg/、チアミン0.2mg/、パントテン酸カルシウム
0.5mg/、ニコチン酸0.5mg/、コーン・スティーブ・
リカー0.3％、カザミノ酸0.05％、炭酸カルシウム２
％、pH7.0 〔pHは水酸化ナトリウムまたは塩酸を用いて調整する。
いずれの培地においても、メタノール以外の成分を溶解
し、120℃、15分間の蒸気滅菌をおこない、その後、メ
ンブレンフィルター（ミルポア社製、0.45μｍ）で除菌
したメタノールをそれぞれの量添加する。〕 培養終了後、菌体および炭酸カルシウムと培養液上清
を遠心分離する。培養液上清中に含まれるアミノ酸をア
ミノ酸分析計（日本分光社製、高速液体クロマトグラフ
ィー、アミノ酸分析システム）で分析する。グルタミン
酸、アスパラギン酸、バリン、アラニンなどのアミノ酸
が培養液上清に検出されている菌株をアミノ酸漏出型変
異株として取得する。
つぎにこのようにして得られたアミノ酸漏出型変異株
の薬剤感受性の検定をおこなう。カナマイシン硫酸塩
〔Km〕（明治製菓社製）、アンピシリン〔Ap〕（シグマ
社製）、ストレプトマイシン硫酸塩〔Sm〕（半井製薬社
製）、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸〔AHV〕（シ
グマ社製）、Ｓ−２−アミノエチル−Ｌ−システイン
〔AEC〕（シグマ社製）を種々の濃度で添加したM1寒天
培地に上記で分離したアミノ酸漏出型変異株を塗布し、
30℃で２〜５日培養し生育の有無を調べ、親株より薬剤
感受性の向上した菌株を選ぶ。
の薬剤感受性の検定をおこなう。カナマイシン硫酸塩
〔Km〕（明治製菓社製）、アンピシリン〔Ap〕（シグマ
社製）、ストレプトマイシン硫酸塩〔Sm〕（半井製薬社
製）、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸〔AHV〕（シ
グマ社製）、Ｓ−２−アミノエチル−Ｌ−システイン
〔AEC〕（シグマ社製）を種々の濃度で添加したM1寒天
培地に上記で分離したアミノ酸漏出型変異株を塗布し、
30℃で２〜５日培養し生育の有無を調べ、親株より薬剤
感受性の向上した菌株を選ぶ。
メチロバチルス・エスピー1011株を親株とし、該親株
より薬剤感受性の向上した菌株をメチロバチルス・エス
ピーiA111株と命名する。
より薬剤感受性の向上した菌株をメチロバチルス・エス
ピーiA111株と命名する。
第２表に代表的な菌株の生育が阻害される最少の薬剤
濃度（最少素子濃度）を示す（正し、Ｋ−224株の場合
は、フェニルアラニン50mg/を含むM1寒天培地を用
い、薬剤に対する最少阻止濃度を測定した。）。
濃度（最少素子濃度）を示す（正し、Ｋ−224株の場合
は、フェニルアラニン50mg/を含むM1寒天培地を用
い、薬剤に対する最少阻止濃度を測定した。）。
つぎに本発明で用いられる微生物の具体的取得方法を
示す。
示す。
本発明で用いられる微生物は、前記したようなメチロ
バチルス属に属する菌株に、Ｌ−Thr、Ｌ−Lysおよびア
ミノ酸代謝拮抗物質から選ばれる少なくとも１つに耐性
を付与させた変異株である。このような変異株は、NTG
処理などの通常の変異処理により得られる。変異処理
後、その親株が生育できないような濃度のＬ−Thr、Ｌ
−Lysおよびアミノ酸代謝拮抗物質から選ばれる少なく
とも１つを含有する培地中または培地上に生育できるよ
うな変異株を分離すればよい。
バチルス属に属する菌株に、Ｌ−Thr、Ｌ−Lysおよびア
ミノ酸代謝拮抗物質から選ばれる少なくとも１つに耐性
を付与させた変異株である。このような変異株は、NTG
処理などの通常の変異処理により得られる。変異処理
後、その親株が生育できないような濃度のＬ−Thr、Ｌ
−Lysおよびアミノ酸代謝拮抗物質から選ばれる少なく
とも１つを含有する培地中または培地上に生育できるよ
うな変異株を分離すればよい。
以下に本発明の変異株の取得方法を具体的に示す。
（１） メチロバチルス・エスピーTA−47株の取得方法
メチロバチルス・エスピーiA111株をカザミノ酸0.1％お
よびＬ−トリプトファン20mg/を含むM1培地で30℃、2
4時間培養する。得られた菌体を、常法によりNTG処理
（500mg/、30℃で30分）し、Ｌ−Thr5000mg/を添加
したMM1寒天培地に塗布する。これを、30℃で３〜14日
培養し、生じたコロニーを釣菌分離して、Ｌ−Thr耐性
株を取得し、Ｌ−ThrおよびＬ−Lys生産試験にかける。
親株よりＬ−ThrおよびＬ−Lys生産能が向上した菌株を
選び、メチロバチルス・エスピーTA−47株と命名する。
メチロバチルス・エスピーiA111株をカザミノ酸0.1％お
よびＬ−トリプトファン20mg/を含むM1培地で30℃、2
4時間培養する。得られた菌体を、常法によりNTG処理
（500mg/、30℃で30分）し、Ｌ−Thr5000mg/を添加
したMM1寒天培地に塗布する。これを、30℃で３〜14日
培養し、生じたコロニーを釣菌分離して、Ｌ−Thr耐性
株を取得し、Ｌ−ThrおよびＬ−Lys生産試験にかける。
親株よりＬ−ThrおよびＬ−Lys生産能が向上した菌株を
選び、メチロバチルス・エスピーTA−47株と命名する。
（２） メチロバチルス・エスピーDA−19株の取得方法 Ｌ−Thr 5000mg/のかわりにＬ−Lys1000mg/およ
びAHV 1000mg/をM1寒天培地に添加する以外は、前記
（１）と同様にしておこない、Ｌ−LysおよびAHVに耐性
な変異株を取得した。親株よりＬ−Thr生産能の向上し
た菌株を選び、メチロバチルス・エスピーDA−19株と命
名する。
びAHV 1000mg/をM1寒天培地に添加する以外は、前記
（１）と同様にしておこない、Ｌ−LysおよびAHVに耐性
な変異株を取得した。親株よりＬ−Thr生産能の向上し
た菌株を選び、メチロバチルス・エスピーDA−19株と命
名する。
（３） メチロバチルス・エスピーDA−35株の取得方法 Ｌ−Thr 5000mg/のかわりにDHL 5000mg/をM1寒
天培地に添加する以外は、前記（１）と同様にしておこ
ない、DHL耐性株を取得した。親株よりＬ−Lys生産能の
向上した菌株を選び、メチロバチルス・エスピーDA−35
株と命名する。
天培地に添加する以外は、前記（１）と同様にしておこ
ない、DHL耐性株を取得した。親株よりＬ−Lys生産能の
向上した菌株を選び、メチロバチルス・エスピーDA−35
株と命名する。
DHLはジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journ
al of Biochemistry,1986年）、100巻、21〜25頁に記載
された方法により、ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン
ケミカル・ソサイエティー（Journal of the American
Chemical Society,1961年）、83巻、2279〜2281頁の記
載を参考に合成し97％以上純度の標品を精製して用い
た。
al of Biochemistry,1986年）、100巻、21〜25頁に記載
された方法により、ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン
ケミカル・ソサイエティー（Journal of the American
Chemical Society,1961年）、83巻、2279〜2281頁の記
載を参考に合成し97％以上純度の標品を精製して用い
た。
（４） メチロバチルス・エスピーAT−76株の取得方法 Ｌ−Thr 5000mg/のかわりにAHV 2000mg/および
Ｌ−Lys 5000mg/をM1寒天培地に添加する以外は、前
記（１）と同様にしておこない、AHVおよびＬ−Lysに耐
性な変異株を取得した。親株よりＬ−Lys生産能の向上
した菌株を選び、メチロバチルス・エスピーAL−76株と
命名する。
Ｌ−Lys 5000mg/をM1寒天培地に添加する以外は、前
記（１）と同様にしておこない、AHVおよびＬ−Lysに耐
性な変異株を取得した。親株よりＬ−Lys生産能の向上
した菌株を選び、メチロバチルス・エスピーAL−76株と
命名する。
（５） メチロバチルス・エスピーTR−26株の取得方法 iA111株のかわりにＫ−224株を親株として用い、Ｌ−
Thr 5000mg/のかわりにＬ−Thr 1000mg/を、フェ
ニルアラニン50mg/を含むM1寒天培地に添加する以外
は、前記（１）と同様にしておこない、Ｌ−Thrに耐性
株を取得した。親株よりＬ−Thr生産能の向上した菌株
を選び、メチロバチルス・エスピーTR−26株と命名す
る。
Thr 5000mg/のかわりにＬ−Thr 1000mg/を、フェ
ニルアラニン50mg/を含むM1寒天培地に添加する以外
は、前記（１）と同様にしておこない、Ｌ−Thrに耐性
株を取得した。親株よりＬ−Thr生産能の向上した菌株
を選び、メチロバチルス・エスピーTR−26株と命名す
る。
（６） メチロバチルス・エスピーATR−89株の取得方
法 iA111株のかわりにＫ−224株を親株として用い、Ｌ−
Thr 5000mg/のかわりにＬ−Thr 1000mg/およびAE
C 1000mg/を、フェニルアラニン50mg/を含むM1寒
天培地に添加する以外は、前記（１）と同様にしておこ
ない、Ｌ−ThrおよびAECに耐性な変異株を取得した。親
株よりＬ−Thr生産能およびＬ−Lys生産能の向上した菌
株を選び、メチロバチルス・エスピーATR−89株と命名
する。
法 iA111株のかわりにＫ−224株を親株として用い、Ｌ−
Thr 5000mg/のかわりにＬ−Thr 1000mg/およびAE
C 1000mg/を、フェニルアラニン50mg/を含むM1寒
天培地に添加する以外は、前記（１）と同様にしておこ
ない、Ｌ−ThrおよびAECに耐性な変異株を取得した。親
株よりＬ−Thr生産能およびＬ−Lys生産能の向上した菌
株を選び、メチロバチルス・エスピーATR−89株と命名
する。
得られた変異株は、各々ブタペスト条約に基づいて平
成２年６月22日付で工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託されている。各々の菌株の寄託番号を第３表に示
す。
成２年６月22日付で工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託されている。各々の菌株の寄託番号を第３表に示
す。
得られた変異株と親株を、前記した薬剤を含むM1寒天
培地上で30℃、48時間培養したときの生育度の程度を比
較した結果を第４表に示す。
培地上で30℃、48時間培養したときの生育度の程度を比
較した結果を第４表に示す。
本発明で用いられる微生物は、通常メタノール資化性
微生物の培養に用いられる方法で培養される。
微生物の培養に用いられる方法で培養される。
本発明におけるアミノ酸生産用の培地は、炭素源、窒
素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量
成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれ
でも用いられる。
素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量
成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれ
でも用いられる。
炭素源としてはメタノールを主に用い、培地中に0.05
〜30％添加する。菌の生育、Ｌ−ThrやＬ−Lysの生産性
が向上する場合には、ピルピン酸、２−ケトグルタル酸
などの有機酸、酵母エキス、ペプトン、コーン・スティ
ーブ・リカーなどの天然有機成分などを0.01〜４％程度
培地に添加してもよい。窒素源としては、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸アン
モニウム、燐酸アンモニウム、アンモニアガス、アンモ
ニア水、尿素などを0.1〜８％培地に添加して用いる。
これらのほかに、通常、リン酸カリウム、リン酸ナトリ
ウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンな
どの微量成分が少量添加される。
〜30％添加する。菌の生育、Ｌ−ThrやＬ−Lysの生産性
が向上する場合には、ピルピン酸、２−ケトグルタル酸
などの有機酸、酵母エキス、ペプトン、コーン・スティ
ーブ・リカーなどの天然有機成分などを0.01〜４％程度
培地に添加してもよい。窒素源としては、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸アン
モニウム、燐酸アンモニウム、アンモニアガス、アンモ
ニア水、尿素などを0.1〜８％培地に添加して用いる。
これらのほかに、通常、リン酸カリウム、リン酸ナトリ
ウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンな
どの微量成分が少量添加される。
培養は振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件
下、pH5〜９、温度24〜37℃に保持しておこなわれ、通
常24〜120時間で終了する。
下、pH5〜９、温度24〜37℃に保持しておこなわれ、通
常24〜120時間で終了する。
培養物よりＬ−ThrやＬ−Lysなどのアミノ酸を採取す
るには、培養物から菌体などの沈澱物を除去し、得られ
た培養液を通常の方法たとえば、イオン交換処理法、濃
縮法、塩析法などに付すことによりアミノ酸を採取する
ことができる。たとえば、Ｌ−Lhrを採取するには菌体
を除去した培養液上清を塩酸でpH2に調整した後、強酸
性カチオン交換樹脂に通液後、希アンモニア水で吸着成
分を溶出し、脱アンモニア後濃縮する。これにアルコー
ルを添加し、冷却保存下で生成した結晶を集めることに
よりＬ−Thrを得ることができる。
るには、培養物から菌体などの沈澱物を除去し、得られ
た培養液を通常の方法たとえば、イオン交換処理法、濃
縮法、塩析法などに付すことによりアミノ酸を採取する
ことができる。たとえば、Ｌ−Lhrを採取するには菌体
を除去した培養液上清を塩酸でpH2に調整した後、強酸
性カチオン交換樹脂に通液後、希アンモニア水で吸着成
分を溶出し、脱アンモニア後濃縮する。これにアルコー
ルを添加し、冷却保存下で生成した結晶を集めることに
よりＬ−Thrを得ることができる。
また、Ｌ−Lysを採取するには、菌体を除去した培養
液上清を水酸化ナトリウム水溶液でpH7.0に調整した
後、カチオン交換樹脂に通液後、希塩酸で吸着成分を溶
出し、Ｌ−Lysに相当する画分を集め、濃縮する。これ
にアルコールを添加し、冷却保存下で生成した結晶を集
めることによりＬ−Lysを得ることができる。
液上清を水酸化ナトリウム水溶液でpH7.0に調整した
後、カチオン交換樹脂に通液後、希塩酸で吸着成分を溶
出し、Ｌ−Lysに相当する画分を集め、濃縮する。これ
にアルコールを添加し、冷却保存下で生成した結晶を集
めることによりＬ−Lysを得ることができる。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例１ Ｌ−Thrの製造 メチロバチルス・エスピーTA−47株を試験管内の3ml
の種培地ａへ植菌へ、30℃で18時間培養した。得られた
培養液1mlを、50ml容太型試験管中のメタノールを２％
添加した発酵培地ｂ 10mlに加え、培養24時間後に２％
量のメタノールをさらに添加し、30℃で合計48時間培養
した。培養は、いずれも振盪培養でおこなった。
の種培地ａへ植菌へ、30℃で18時間培養した。得られた
培養液1mlを、50ml容太型試験管中のメタノールを２％
添加した発酵培地ｂ 10mlに加え、培養24時間後に２％
量のメタノールをさらに添加し、30℃で合計48時間培養
した。培養は、いずれも振盪培養でおこなった。
培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを遠心で除去し、
培養液上清中に含まれているＬ−Thr濃度をアミノ酸分
析計（日本分光社製、高速液体クロマトグラフィー、ア
ミノ酸分析システム）で定量した。
培養液上清中に含まれているＬ−Thr濃度をアミノ酸分
析計（日本分光社製、高速液体クロマトグラフィー、ア
ミノ酸分析システム）で定量した。
TA−47株のかわりに1011株、1006株、iA111株、Ｋ−2
24株、DA−19株、TR−26株およびATR−89株を各々用い
る以外は前記と同様にして培養し、培養液上清中に含ま
れるＬ−Thr濃度を定量した。
24株、DA−19株、TR−26株およびATR−89株を各々用い
る以外は前記と同様にして培養し、培養液上清中に含ま
れるＬ−Thr濃度を定量した。
結果を第５表に示す。
実施例２ Ｌ−Thrの採取 実施例１に示したと同様の方法でTA−47株を培養し
た。培養液上清800mlを集め、塩酸でpH2に調整した後、
強カチオン交換樹脂ダイヤイオンSK1B（Ｈ型）のカラム
に通塔した。カラムを水洗後、2Nアンモニア水でカラム
の吸着成分を溶出し、Ｌ−Thr画分を集め、減圧濃縮し
た。これにエタノールを加え、４℃に冷却し、生成した
結晶を集めて乾燥した結果、純度98％以上のＬ−Thrの
結晶が1.25g得られた。
た。培養液上清800mlを集め、塩酸でpH2に調整した後、
強カチオン交換樹脂ダイヤイオンSK1B（Ｈ型）のカラム
に通塔した。カラムを水洗後、2Nアンモニア水でカラム
の吸着成分を溶出し、Ｌ−Thr画分を集め、減圧濃縮し
た。これにエタノールを加え、４℃に冷却し、生成した
結晶を集めて乾燥した結果、純度98％以上のＬ−Thrの
結晶が1.25g得られた。
実施例３ Ｌ−Lysの製造 メチロバチルス・エスピー1011株、iA111株、TA−47
株、DA−35株、AL−76株、1006株、Ｋ−224株およびATR
−89株を用い、実施例１と同様に各々培養した。
株、DA−35株、AL−76株、1006株、Ｋ−224株およびATR
−89株を用い、実施例１と同様に各々培養した。
培養終了後、培養液上清中に含まれているＬ−Lys濃
度をアミノ酸分析計で定量した。結果を第６表に示す。
度をアミノ酸分析計で定量した。結果を第６表に示す。
実施例４ Ｌ−Lysの製造 メチロバチルス・エスピーAL−76株を種培養ａ 25ml
の入った300ml容三角フラスコに２白金耳量植菌し、30
℃、18時間振盪培養した。得られた種培養液金量を培地
ａ 225mlの入った２容三角フラスコに加え、さら
に、30℃、18時間振盪した。
の入った300ml容三角フラスコに２白金耳量植菌し、30
℃、18時間振盪培養した。得られた種培養液金量を培地
ａ 225mlの入った２容三角フラスコに加え、さら
に、30℃、18時間振盪した。
つぎに、５容培養槽（ミツワバイオシステム社製）
に発酵培地ｂ 2.25を調製し、上記250mlの種培養液
全量を植菌し30℃、2.5／分の通気量、600rpmの条件
で攪拌しながら培養した。また、培養中、培養液のpHを
６規定NH4OH液で6.8に自動調節した。メタノールは培養
開始時に0.5％添加し、その後0.5％を越えない量のメタ
ノールをペリスタポンプ（アトー社製）で連続的に添加
した。
に発酵培地ｂ 2.25を調製し、上記250mlの種培養液
全量を植菌し30℃、2.5／分の通気量、600rpmの条件
で攪拌しながら培養した。また、培養中、培養液のpHを
６規定NH4OH液で6.8に自動調節した。メタノールは培養
開始時に0.5％添加し、その後0.5％を越えない量のメタ
ノールをペリスタポンプ（アトー社製）で連続的に添加
した。
その結果、培養72時間でＬ−Lysが培地中に3.02g/
蓄積した。
蓄積した。
実施例５ Ｌ−Lysの採取 実施例１で示した方法でAL−76株を培養した。培養液
上清1200mlを遠心分離で集め、水酸化ナトリウムでpH7.
0に調整した後、強カチオン交換樹脂ダイヤイオンSK1B
（NH3型）のカラムに通した。カラムを水洗後、1N塩酸
でカラムの吸着成分を溶出し、Ｌ−Lysに相当する画分
を集め、減圧濃縮した。これにエタノールを加え、４℃
に冷却し、精製した結晶を集めて乾燥した結果、純度96
％以上のＬ−Lysの結晶を塩酸塩として1.88gを得た。
上清1200mlを遠心分離で集め、水酸化ナトリウムでpH7.
0に調整した後、強カチオン交換樹脂ダイヤイオンSK1B
（NH3型）のカラムに通した。カラムを水洗後、1N塩酸
でカラムの吸着成分を溶出し、Ｌ−Lysに相当する画分
を集め、減圧濃縮した。これにエタノールを加え、４℃
に冷却し、精製した結晶を集めて乾燥した結果、純度96
％以上のＬ−Lysの結晶を塩酸塩として1.88gを得た。
発明の効果 本発明の方法によれば、Ｌ−ThrやＬ−Lysなどのアミ
ノ酸を安価な原料から効率よく生産することができる。
ノ酸を安価な原料から効率よく生産することができる。
Claims (5)
- 【請求項１】メチロバチルス（Methylobacillus）属に
属し、抗生物質およびアミノ酸代謝拮抗物質から選ばれ
る少なくとも１つに対する感受性が向上した菌株を親株
として変異処理により得られ、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リ
ジンおよびアミノ酸代謝拮抗物質から選ばれる少なくと
も１つに耐性を有し、かつアミノ酸生産能を有する微生
物を、メタノールを主たる炭素源として含有する培地に
培養し、培養物中にアミノ酸を生成蓄積させ、該培養物
からアミノ酸を採取することを特徴とする発酵法による
アミノ酸の製造法。 - 【請求項２】抗生物質が、カナマイシン、アンピシリン
およびストレプトマイシンである請求項（１）記載の発
酵法によるアミノ酸の製造法。 - 【請求項３】アミノ酸代謝拮抗物質が、α−アミノ−β
−ヒドロキシ吉草酸、Ｓ−２−アミノエチル−Ｌ−シス
テインおよびDL−4,5−トランスデヒドロリジンから選
ばれる物質である請求項（１）記載の発酵法によるアミ
ノ酸の製造法。 - 【請求項４】アミノ酸がＬ−スレオニンである請求項
（１）記載の発酵法によるアミノ酸の製造法。 - 【請求項５】アミノ酸がＬ−リジンである請求項（１）
記載の発酵法によるアミノ酸の製造法。
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|---|---|---|---|
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| EP91112960A EP0472947B1 (en) | 1990-08-02 | 1991-08-01 | Process for producing amino acids |
| CA002048271A CA2048271C (en) | 1990-08-02 | 1991-08-01 | Process for producing amino acid |
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