KR910002850B1 - L-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-라이신의 제조방법 - Google Patents

L-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-라이신의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

L-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 L-라이신의 제조방법
본 발명은 L-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 L-라이신의 제조방법에 관한 것으로, 좀더 구체적으로는 공지의 L-라이신 생산 변이주인 코리네박테리움 글리타미쿰 YJ-150(KFCC-10014)을 변이처리하여 알지닌 아나로그와 β-(2-티아졸일)-DL-알라닌, 카나바닌(Canavanine), 카다버린(Cadeverine), 스퍼민(Spermine), 스퍼미딘(Spermidine), 퓨트리신(Puterscine), 하이드록시우리딘(5-hydroxyuridine), 알지닌 하이드록사메이트(Arginine hydroxamate), 아자우라실 (6-Azauracil), 플루오로트립토판(6-Fluorotryptophan)과 같은 기타 아나로그 내성 및 로이신 영양요구성 균주(KFCC-10672)를 얻은 다음, 이 균주를 영양배지에서 배양하고, 그 배양액으로부터 L-라이신을 분리, 정제함을 특징으로 하는 L-라이신의 제조방법에 관한 것이다.
L-라이신의 필수아미노산으로서, 이를 사료에 첨가함으로써 다른 아미노산의 흡수율을 증가시켜 사료의 질을 향상시키기 때문에 사료첨가제로 사용될 뿐만아니라 식품첨가제로도 사용되며 의약용으로는 아미노산제제, 아미노산첨가솔비톨제제, 아미노산첨가 덱스트란제제 등으로 사용된다.
L-라이신의 생산방법으로는 DL-α-아미노-ε-카프로락탐(DL-α-amino-ε-caprolactam : 이하 ACL이라 한다)을 L-ACL-가수분해효소(S-ACL-hydrolase)와 ACL-라세마제(ACL-racemase)로 처리하여 생산하는 효소적 전환법과 영양요구성 균주 및 대사조절 변이주를 이용하여 발효법에 의한 생산방법이 있으나 후자가 주를 이루고 있다. 즉, 호모세린(혹은 메타오닌과 스레오닌), 알라닌, 루이신, 발린, 이소루이신 등과 같은 아미노산 요구성 균주를 기본으로 하여 비타민 B1, 판토텐산, 비오틴 요구성균주, L-라이신 및 스레오닌, 이소루이신의 아나로그에 대한 내성균주, 바시트라신, 페니실린 G 혹은 폴리믹신 같은 항생제 내성균주, 상술한 특성들을 조합한 영양요구성 균주, 아나로그 내성변이주, 약제 내성균주를 사용하는 방법 등(일본공개특허 제57-9797호, 제57-14839호, 제61-35840호)이 종래 방법으로 사용되는 것들로 알려지고 있으며, 현금에는 L-라이신의 수요가 증가됨에 따라 L-라인신의 생산농도 및 대당수율을 증가시키기 위한 균주의 개발이 계속 진행되고 있는 실정이다.
따라서, 본 발명자 등은 코리네박테리움 글루타미쿰 YJ-150(KFCC-10014)을 이용하여 연구한 결과 알지닌 아나로그 내성균주중에서 최소한 일종의 알지닌 아나로그에 대하여 내성을 갖는 균주가 L-라이신의 생산성을 향상시킨다는 사실을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명에 있어서 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰으로 L-라이신 생산능이 있으며 알지닌 아나로그중에서 최소한 한종에 대해 내성을 갖는 균주이면 어떤것이든 사용될 수 있다. 즉, 영양요구성(호모세린, 알라닌, 루이신, 발린, 니코틴산, 판토텐산 및 이들의 조합) 및 각종 아미노산 유도체(라이신 유도체, 스레오닌, 메티오닌, 이소루이신, 발린유도체 및 이들의 조합)에 대한 내성을 가는 공지의 l-라이신 생산균주뿐만 아니라, 상술한 특성과 기타 아미노산 아나로그에 대한 내성 혹은 약제내성을 갖는 L-라이신 생산균주도 사용할 수 있다. 알지닌 아나로그와 기타 아나로그들은 β-2-티아졸일-DL-알라닌, 카나바닌, 카다버린, 스퍼미딘, 스퍼민, 퓨트리신, 5-하이드록시우리딘, 알지닌, 하이드록사메이트, 6-아자우라실, 6-플로오로트립토판 등이 있다.
본 발명을 좀더 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 코리네박테리움 글루타미쿰 YJ-150(KFCC-10014)을 0.1몰 마그네슘 설페이트 용액에 107-108cells/㎖로 현탁시키고 자외선을 30초 내지 180초간 조사하여 변이처리하거나, 포스페이트 완충액(pH 7.0)혹은 시이트레이트 완충액(pH 5.5)에 107-108cell/㎖로 현탁시키고 N-메틸-N'-니트로-N-니트로-N-니트로소구아니딘을 최종농도가 200-500㎍/㎖가 되도록 첨가하고 실온 혹은 32℃에서 10분 내지 30분간 처리하여 변이를 유발시켰다. 그 다음에 알지닌 아나로그 및 기타 아나로그를 1-10g/l의 농도로 첨가한 최소평판 한천배지에서 변이처리한 균체 현탁액을 0.1-0.3㎖(필요한 경우에는 농축 후) 도말하고 32℃에서 4-7일간 배양하여 알지닌 아나로그 및 기타 아나로그 내성균주들을 얻었다.
경우에 따라서는 변이처리 후 아미노산이 적절히 첨가된 최소배지에서 발현시키거나 페니실린 G를 2000 units/㎖-10000units/㎖되게 처리하여 0.1M 마그네슘 설페이트 및 20% 슈크로오즈 용액으로 구성된 하이퍼토닉(hypertonic) 최소배지에서 집적(Enrichment)배향한 다음, 원하는 평판배지에 도달하여 군락을 얻었다.
최소배지의 조성은 다음과 같으며 아미노산 50-100㎎/㎖ (DL형의 경우에는 2배)씩 첨가하여 사용하였다.
최소배지 조성(1ℓ); 포도당 10g, 황산암모니움 2g, 요소 2g, KH2PO40.2g, K2HPO40.2g, MgSO4·7H2O 0.1g, CaCl2·2H2O 0.1g, 비오틴 100㎍, 치아민 염산염 100㎍, Na2B4O7·10H2O 80㎍, (NH4)6Mo7O27·4H2O 40㎍, ZnSO4·7H2O 10㎍, CuSO4·5H2O 300㎍, MnCl2·4H2O 10㎍, FeCl3·6H2O 1㎎.
얻은 균주의 영양요구성 및 아나로그 내성은 공지의 레프리카법에 의해 확인하거나 적당한 한천배지에 도말하여 확안하였으며 액체배양에서 상대적으로 성장정도 및 효소의 역가를 측정하여 정량하였다.
변이처리하여 얻은 균주들을 호기적 조건(진탕배양; 250-300rpm, 발효조의 경우는 0.5-1.5VVM의 통기) 및 pH 5-8, 25-35℃의 온도 조건하에서 배양하여 L-라이신을 제조하였다. 플라스크에서 배양하는 경우에는 48-72시간 후에 L-라이신이 배양액에 축적되었다. 또한 발효조에서 배양하는 경우에는 추가당을 공급하는 유가식 발효법으로 L-라이신을 제조하였으며, 본 발명에 있어서 균주의 발효능은 유가식 발효법으로 측정하였다.
발효배지의 조성(1ℓ); 포도당 75g, 황산암모니움 40g, CaCO340g, 콘스팁리쿼(Corn steep liguor) 100g, KH2PO41g, MgSO4·7H2O 0.4g, FeSO4·7H2O 0.01g, MnSO4·4H2O 6㎎, 비오틴 300㎍, 티아민 염산염 500㎍, 판토텐산 0.01g, pH 7.6-8.0. 배양후 L-라이신은 염산염을 기준으로 공지의 산성 닌히드린법(acidic ninhydrin)이나 HPLC로 분석했으며, 배양액의 아미노산 농도는 아미노산 자동분석기로 정량 분석하였다.
다음의 실시예는 본 발명을 좀더 구체적으로 설명하는 것이다.
[실시예 1]
코리네박테리움 글루타미쿰 YJ-150(KFCC-10014)를 30L발효조에서 배양온도 32℃, 배양 pH 6.8-7.0, 통기량 0.5-1.0VVM으로 유지하면서 유가식으로 배양한 다음, 최종 배양액을 아미노산 자동분석기를 사용하여 아미노산 조성을 분석하였으며, 각종 아미노산 첨가에 따른 L-라이신 생산성의 변화를 관찰하기 위해 각각의 아미노산 1g/l, 3g/l첨가하여 플라스크에서 48시간동안 발효시켜 그 영향을 검토하여 표 1과 표 2에 기재하였다.
[표 1. 코리네박테리움 글루타미쿰 YJ-150 배양액의 아미노산 조성]
Figure kpo00001
[표 2. 아미노산 첨가가 라이신 생산에 미치는 영향]
Figure kpo00002
무첨가 : 17g/l, * : 첨가된 라이신의 양은 제외 표 2의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이 알지닌, 아스파틱산, 이소루이신, 발린 등의 아미노산을 첨가시에는 L-라이신의 생산이 촉진되는 반면에, 루이신의 첨가는 L-라이신의 생산을 감소시킴을 알 수 있었다. 또한 코리네박테리움 글리타미쿰 YJ-150의 성장에 대한 L-라이신 아나로그인 AEC의 저해정도와 알지닌 첨가에 의한 AEC저해 완화 정도를 조사하여 표 3에 기재하였다. 즉, L-라이신의 생산을 촉진시키는 알지닌이 AEC의 코리네박테리움 글루타미쿰 YJ-150의 성장저해에 대한 완화정도를 측정하였다.
[표 3. 코리네박테리움 글루타미쿰 YJ-150에 대한 AEC 내성]
(단위 : 상대성장속도,%)
Figure kpo00003
표 3의 기재로부터 알 수 있는 바와 같이, 알지닌을 1g/l로 첨가한 결과, AEC에 의한 성장저해가 완화되었다.
이 결과로부터 알지닌 아나로그 내성균주를 이용할 경우에 L-라이신의 생산량이 증가될 것이라고 판단되었으며, 실시예 2와 같은 방법으로 변이주를 얻어 L-라이신의 생산량을 측정하였다.
[실시예 2]
코리네박테리움 글루타미쿰 YJ-150(KFCC-10014)를 0.1몰 마그네슘설페이트 용액에 107-108cells/㎖로 현탁시켜 자외선을 30초 내지 180초간 조사하여 변이처리하거나 포스페이트 완충액(pH 7.0) 혹은 시이트레이트 완충액(pH 5.5)에 107-108cells/㎖로 현탁시킨 다음, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘을 최종농도가 200-500㎍/㎖이 되도록 첨가하고 실온 혹은 32℃에서 10분 내지 35분간 처리하는 방법으로 변이처리하여 여러종류의 영양요구성, 대사조절 변이주군을 얻었다. 이들의 특성을 다음의 표 4에 기재하였다.
[표 4, L-라이신 생산균주 및 특성]
Figure kpo00004
Hes : 호모세린 AEC : S-(β-아미노에틸)-L-시스테인
Leu : 루이신 AHV : α-아미노-β-하이드록시 발레릭산
ML : 메틸라이신 Arg아나로그 및 기타아나로그 :
β-(2-티아졸릴)-DL-알라닌, 카나바닌, 카다버린, 스퍼민, 스퍼미딘, 퓨트리신, 5-하이드록시우리딘, 알지닌 하이드록사메이트, 6-아자우라질, 6-플루오로트립토판
250㎖플라스크에 영양배지 20㎖와 필요한 아미노산을 200㎎/l 첨가한 뒤 표 4에 기재된 균주들을 1백금이 접종하여 48-72시간 배양한 다음, 축적된 L-라이신을 분석비교하여 코리네박테리움 글루타미쿰 CS-7 군중 Hse-, Leu-, AEDr, AHVr, MLr, -(2-티아졸릴)-DL-알라닌r, 카다바닌r, 카다버린r, 스퍼민r, 스퍼미딘r, 퓨트리신r, 5-하이드록시우리딘r, 알지닌 하이드록-사메이트r의 특성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 CS-755를 선별하여 1989.3.29.자로 사단법인 한국종균협회에 기탁하였다(KFCC-10672).
코리네박테리움 글루타미쿰 YJ-150과 CS-755를 플라스크에서 배양하여 L-라이신 염산염 생산농도와 수율을 비교하여 다음의 표 5에 기재하였다.
[표 5. 코리네박테리움 글루타미쿰 YJ-150과 CS-755의 플라스크 발효 결과]
Figure kpo00005
[실시예 3]
선별된 코리네박테리움 글루타미쿰 CS-755 및 모균주인 YJ-150을 30L 발효조에서 유가식으로 발효시켜 그 결과와 CS-755 최종배양액의 아미노산 조성을 분석하여 각각 표 6 및 표 7에 기재하였다.
[표 6. 코리네박테리움 글루타미쿰 CS-755 및 YJ-150의 30L 발효조에서의 발효결과]
Figure kpo00006
[표 7. 코리네박테리움 글루타미쿰 CS-755 배양액의 아미노산 조성]
Figure kpo00007
표 6과 표 7의 기재로부터 알 수 있듯이 코리네박테리움 글루타미쿰 CS-755 균주는 120g/l 이상의 라이신 염산염을 생산했으며 대당수율은 45% 이상이며, 발효액중에 1.6-2.5g/l의 알지닌을 축적하였다.
[실시예 4]
코리네박테리움 글루타미쿰 CS-755(KFCC-10672)를 배양하여 얻은 발효액 10L의 황산을 가하여 pH를 조정한 후, NH4 +형으로 재생된 강산성 양이온 교환수지 Duolite C-20N가충진된 수지탑에 공각속도(SV) 5로 상류식으로 흡착시켰다. 이 상류식 흡착법을 이용하므로써 균체분리에 따른 설비가 필요 없으며 균체분리에 인해 생기는 라이신 손실을 줄일 수 있었다.
흡착이 완료된 수지는 물로 충분히 세척하여 균체, 색소 등을 제거하고 2N-NH4OH를 이용하여 용리를 행하여 수지량의 0.6배인 고농도부분의 용리액(농도 : 129g/l, 발효액으로부터 회수율 97%)을 얻고 저농도 부분은 다음 탑 용리시 재사용하였다.
얻어진 고농도액은 농축하여 암모니아를 제거하고, 염산을 사용하여 pH 5.0으로 조종한 후 활성탄 처리를 거친 뒤 농축, 분리 등을 하여 결정(1차 결정)과 모액(1차 모액)을 얻은 다음, 1차 모액을 재차 농축하여 결정(2차 결정)과 모액(2차 모액)을 다시 얻고 2차 모액은 발효액 저장탱크로 재순환시키고 2차 결정은 수지탑에서 얻은 고농도액의 처리시에 합하여 제품화하는데 사용하였다.
상술한 방법에 의해 얻어진 결정을 열풍건조하여 L-라이신염산염 993g(회수율 : 94%, 함량 99.5% 이상)을 얻었다. 얻어진 제품은 적외선 분광 광도계 등에 의해 라이신 염산염임이 판명되었다.
[실시예 5]
실시예 4와 같은 균주를 배양하여 얻은 발효액 10L를 Ultrafiltration Method(X-Flo System, 미국 Bio-recovery사, MRC-Membrane M.W. Cut off 30,000)로 균체로 분리하였다. 회수율을 높이기 위해 Diafiltration을 실시하여 얻어진 여과액은 35L였다. 이액을 염산으로 pH 5.0으로 조정하고 카본 탈색여과 후 농축, 결정화공정을 거쳐 결정과 모액으로 분리한 다음, 결정은 건조하여 제품화하고 모액은 따로 실시예 4의 수지공정과 같은 방법으로 처리하였으며, 여기서 얻은 고농도 부분은 암모니아를 제거한 후, 발효액 처리공정의 막여액에 합하여 재차 pH조정, 탈색 및 농축 후 결정화한 결과, 993g의 제품(회수율 : 94%, 함량 : 99%이상)을 얻었다.

Claims (2)

  1. α-아미노-β-하이드록시 발레릭산, S-(β-아미노에틸)-L-시스테인, 메틸라이신, 알지닌 아나로그 및 기타아나로그[β-(2-티아졸일)-DL-알라닌, 카나바닌, 카다바린, 스퍼민, 스퍼미딘, 퓨트리신, 5-하이드록시우리딘, 알지닌하이드록사메이트, 6-아자우라실, 6-플루오로트립토판]에 대한 내성 및 루이신과 호모세린 요구성을 갖는 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CS-755(KFCC-10672).
  2. 제1항의 미생물을 배양하여 배양액으로부터 L-라이신 염산염을 분리, 회수함을 특징으로 하는 발효법에 의한 L-라이신의 제조방법.
KR1019890004136A 1989-03-30 1989-03-30 L-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-라이신의 제조방법 KR910002850B1 (ko)

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