JPH0638743B2 - Ｌ―リジンを生産する微生物およびこれを用いたｌ―リジンの製造方法 - Google Patents
Ｌ―リジンを生産する微生物およびこれを用いたｌ―リジンの製造方法Info
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- JPH0638743B2 JPH0638743B2 JP2082914A JP8291490A JPH0638743B2 JP H0638743 B2 JPH0638743 B2 JP H0638743B2 JP 2082914 A JP2082914 A JP 2082914A JP 8291490 A JP8291490 A JP 8291490A JP H0638743 B2 JPH0638743 B2 JP H0638743B2
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- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/15—Corynebacterium
Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はＬ−リジンを生産する微生物およびこれを用い
たＬ−リジンの製造方法に関するもので、より具体的に
は公知のＬ−リジン生産変異体であるコリネバクテリウ
ム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)ＹＪ−
１５０（ＫＦＣＣ−１００１４）を変異処理し、Ｌ−リ
ジン生産に必要なものとして公知になっている特性以外
にアルギニンアナログおよびその他のアミノ酸アナログ
耐性を有する菌株を得、その様なアルギニンアナログお
よびその他のアミノ酸アナログ耐性菌株を栄養培地で培
養し、その培養液からＬ−リジンを分離、精製すること
を特徴とするＬ−リジンの製造方法に関するものであ
る。
たＬ−リジンの製造方法に関するもので、より具体的に
は公知のＬ−リジン生産変異体であるコリネバクテリウ
ム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)ＹＪ−
１５０（ＫＦＣＣ−１００１４）を変異処理し、Ｌ−リ
ジン生産に必要なものとして公知になっている特性以外
にアルギニンアナログおよびその他のアミノ酸アナログ
耐性を有する菌株を得、その様なアルギニンアナログお
よびその他のアミノ酸アナログ耐性菌株を栄養培地で培
養し、その培養液からＬ−リジンを分離、精製すること
を特徴とするＬ−リジンの製造方法に関するものであ
る。
［従来の技術および発明が解決しようとする課題］ Ｌ−リジンは必須アミノ酸であり、これを飼料に添加す
ることによって他のアミノ酸の吸収率を増加させて飼料
の質を向上させ、飼料添加剤として使用されるだけでな
く、食品添加剤としても使用され、医薬用ではアミノ酸
製剤、アミノ酸添加ソルビット製剤、アミノ酸添加デキ
ストラン製剤などの栄養輸液の成分として使用される。
ることによって他のアミノ酸の吸収率を増加させて飼料
の質を向上させ、飼料添加剤として使用されるだけでな
く、食品添加剤としても使用され、医薬用ではアミノ酸
製剤、アミノ酸添加ソルビット製剤、アミノ酸添加デキ
ストラン製剤などの栄養輸液の成分として使用される。
Ｌ−リジンの生産方法としてはＤＬ−α−アミノ−ε−
カプロラクタム（ＤＬ−α−amino−ε−caprolactam：
以下ＡＣＬという）をＬ−ＡＣＬ−加水分解酵素（Ｌ−
ＡＣＬ−hydrolase）とＡＣＬ−ラセマーゼ（ＡＣＬ−r
acemase）で処理して生産する酵素的転換法と栄養要求
性菌株および／または代謝調節変異株を用いる発酵法に
よる生産方法があり、主として後者が用いられる。即
ち、ホモセリン（またはメチオニンとスレオニン）、ア
ラニン、ロイシン、バリン、イソロイシンなどの様なア
ミノ酸要求性菌株を基本としてビタミンＢ１、パントテ
ン酸、ビオチン要求性菌株、Ｌ−リジンおよびスレオニ
ン、イソロイシンのアナログに対する耐性菌株、バシト
ラシン、ペニシリンＧまたはポリミキシンの様な抗生物
質耐性菌株、上述した栄養要求性、アナログ耐性、薬剤
耐性などを組み合わせた菌株を使用する方法など（日本
特許公開昭５７−９７９７号、昭５７−１４８３９号、
昭６１−３５８４０号）を用いることが従来方法として
知られているが、近頃はＬ−リジンの需要の増加により
Ｌ−リジンの生産濃度および対糖収率を増加させるため
の菌株の開発が引続いて進行しているのが実情である。
カプロラクタム（ＤＬ−α−amino−ε−caprolactam：
以下ＡＣＬという）をＬ−ＡＣＬ−加水分解酵素（Ｌ−
ＡＣＬ−hydrolase）とＡＣＬ−ラセマーゼ（ＡＣＬ−r
acemase）で処理して生産する酵素的転換法と栄養要求
性菌株および／または代謝調節変異株を用いる発酵法に
よる生産方法があり、主として後者が用いられる。即
ち、ホモセリン（またはメチオニンとスレオニン）、ア
ラニン、ロイシン、バリン、イソロイシンなどの様なア
ミノ酸要求性菌株を基本としてビタミンＢ１、パントテ
ン酸、ビオチン要求性菌株、Ｌ−リジンおよびスレオニ
ン、イソロイシンのアナログに対する耐性菌株、バシト
ラシン、ペニシリンＧまたはポリミキシンの様な抗生物
質耐性菌株、上述した栄養要求性、アナログ耐性、薬剤
耐性などを組み合わせた菌株を使用する方法など（日本
特許公開昭５７−９７９７号、昭５７−１４８３９号、
昭６１−３５８４０号）を用いることが従来方法として
知られているが、近頃はＬ−リジンの需要の増加により
Ｌ−リジンの生産濃度および対糖収率を増加させるため
の菌株の開発が引続いて進行しているのが実情である。
［課題を解決するための手段］ 従って、本発明者らはコリネバクテリウム、グルタミク
ムＹＪ−１５０（１９８９年６月２１日付で社団法人・
韓国種菌協会に寄託番号ＫＦＣＣ−１００１４で寄託済
み）を利用して研究した結果、少なくとも１種のアルギ
ニンアナログに対して耐性を持つアルギニンアナログ耐
性菌株がＬ−リジンの生産性の向上させるという事実を
発見し、本発明を完成した。
ムＹＪ−１５０（１９８９年６月２１日付で社団法人・
韓国種菌協会に寄託番号ＫＦＣＣ−１００１４で寄託済
み）を利用して研究した結果、少なくとも１種のアルギ
ニンアナログに対して耐性を持つアルギニンアナログ耐
性菌株がＬ−リジンの生産性の向上させるという事実を
発見し、本発明を完成した。
本発明において、菌株はコリネバクテリウム・グルタミ
クムでＬ−リジン生産能力があり、また少なくとも１種
のアルギニンアナログに対して耐性を持つ菌株ならばい
ずれでも使用できる。即ち、栄養要求性（ホモセリン、
アラニン、ロイシン、バリン、ニコチン酸、パントテン
酸およびこれらの組み合せ）および各種アミノ酸誘導体
（リジン誘導体、スレオニン、メチオニン、イソロイシ
ン、バリン誘導体およびこれらの組み合せ）に対する耐
性を持つ公知のＬ−リジン生産菌株だけでなく、上述し
て特性とその他のアミノ酸アナログに対する耐性または
薬剤耐性を有するＬ−リジン生産菌株も使用できる。ア
ルギニンアナログとその他のアミノ酸アナログなどには
β−２−チアゾリル−ＤＬ−アラニン、カナバニン、カ
ダベリン、スペルミジン、スペルミン、フトレスシン、
５−ヒドロキシウリジン、アルギニンヒドロキサメー
ト、６−アザウラシル、６−フルオロトリプトファンな
どがある。
クムでＬ−リジン生産能力があり、また少なくとも１種
のアルギニンアナログに対して耐性を持つ菌株ならばい
ずれでも使用できる。即ち、栄養要求性（ホモセリン、
アラニン、ロイシン、バリン、ニコチン酸、パントテン
酸およびこれらの組み合せ）および各種アミノ酸誘導体
（リジン誘導体、スレオニン、メチオニン、イソロイシ
ン、バリン誘導体およびこれらの組み合せ）に対する耐
性を持つ公知のＬ−リジン生産菌株だけでなく、上述し
て特性とその他のアミノ酸アナログに対する耐性または
薬剤耐性を有するＬ−リジン生産菌株も使用できる。ア
ルギニンアナログとその他のアミノ酸アナログなどには
β−２−チアゾリル−ＤＬ−アラニン、カナバニン、カ
ダベリン、スペルミジン、スペルミン、フトレスシン、
５−ヒドロキシウリジン、アルギニンヒドロキサメー
ト、６−アザウラシル、６−フルオロトリプトファンな
どがある。
本発明をより具体的に説明すると、次の通りである。
コリネバクテリウム・グルタミクムＹＪ−１５０（ＫＦ
ＣＣ−１００１４）を0.1Ｍの硫酸マグネシウム溶液に
１０７−１０８細胞／mlで懸濁し、紫外線を３０秒ない
し１８０秒照射して変異処理するか、あるいは0.1Ｍ燐
酸緩衝液（pH7.0）または0.1Ｍクエン酸塩緩衝液（pH5.
5）に１０７−１０８細胞／mlで懸濁し、Ｎ−メチル−
Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを最終濃度が２
００−５００μｇ／mlとなる様に添加し、室温または３
２℃で１０分ないし３０分間処理し、変異を誘発した。
ＣＣ−１００１４）を0.1Ｍの硫酸マグネシウム溶液に
１０７−１０８細胞／mlで懸濁し、紫外線を３０秒ない
し１８０秒照射して変異処理するか、あるいは0.1Ｍ燐
酸緩衝液（pH7.0）または0.1Ｍクエン酸塩緩衝液（pH5.
5）に１０７−１０８細胞／mlで懸濁し、Ｎ−メチル−
Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを最終濃度が２
００−５００μｇ／mlとなる様に添加し、室温または３
２℃で１０分ないし３０分間処理し、変異を誘発した。
その後、アルギニンアナログおよびその他のアミノ酸ア
ナログを１−１０ｇ／の濃度で添加した最小平板寒天
培地で変異処理した菌株懸濁液を0.1−0.3ml（必要な場
合には濃縮後）塗抹し、３２℃で４−７日間培養し、ホ
モセリンとロイシン要求性、アルギニンアナログおよび
その他のアミノ酸アナログ耐性菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−
２７６３、ＫＦＣＣ−１０６７２）を得た。
ナログを１−１０ｇ／の濃度で添加した最小平板寒天
培地で変異処理した菌株懸濁液を0.1−0.3ml（必要な場
合には濃縮後）塗抹し、３２℃で４−７日間培養し、ホ
モセリンとロイシン要求性、アルギニンアナログおよび
その他のアミノ酸アナログ耐性菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−
２７６３、ＫＦＣＣ−１０６７２）を得た。
場合によっては、変異処理後アミノ酸が適切に添加され
た最小培地で培養するか、またはペニシリンＧを２００
０単位／ml−１００００単位／mlになるように添加し、
0.1Ｍ硫酸マグネシウムおよび２０％スクロース溶液か
ら構成された高浸透圧(hypertonic)最小培地で強化(Enr
ichment)培養した後、希望する平板培地に塗抹して集落
を得た。得られた集落を最小寒天培地または特異的栄養
要求変異株を得るために必要なアミノ酸を含む最小寒天
培地に塗沫した。
た最小培地で培養するか、またはペニシリンＧを２００
０単位／ml−１００００単位／mlになるように添加し、
0.1Ｍ硫酸マグネシウムおよび２０％スクロース溶液か
ら構成された高浸透圧(hypertonic)最小培地で強化(Enr
ichment)培養した後、希望する平板培地に塗抹して集落
を得た。得られた集落を最小寒天培地または特異的栄養
要求変異株を得るために必要なアミノ酸を含む最小寒天
培地に塗沫した。
最小培地の組成は次の通りであり、アミノ酸は５０−１
００mg／（ＤＬ型の場合には２倍）づつ添加して使用
した。
００mg／（ＤＬ型の場合には２倍）づつ添加して使用
した。
最小培地の組成（ｇ／）； グルコース１０ｇ、硫酸アンモニウム２ｇ、尿素２ｇ、
KH2PO40.2ｇ、K2HPO40.2ｇ、MgSO4・7H2O0.1ｇ、CaCl2
・2H2O0.1ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１
００μｇ、Na2B4O7・10H2O８０μｇ、(NH4)6Mo7O27・4H
2O４０μｇ、ZnSO4・7H2O１０μｇ、CuSO4・5H2O３００
μｇ、MnCl2・4H2O１０μｇ、FeCl3・6H2O１mg。
KH2PO40.2ｇ、K2HPO40.2ｇ、MgSO4・7H2O0.1ｇ、CaCl2
・2H2O0.1ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１
００μｇ、Na2B4O7・10H2O８０μｇ、(NH4)6Mo7O27・4H
2O４０μｇ、ZnSO4・7H2O１０μｇ、CuSO4・5H2O３００
μｇ、MnCl2・4H2O１０μｇ、FeCl3・6H2O１mg。
得られた菌株の栄養要求性およびアナログ耐性は公知の
レプリカ法によって確認、または適当な寒天培地に塗抹
して確認し、なおフラスコ培養で親株と得られた変異株
の相対的成長速度を測定、および変異株の酵素活性を検
定した。
レプリカ法によって確認、または適当な寒天培地に塗抹
して確認し、なおフラスコ培養で親株と得られた変異株
の相対的成長速度を測定、および変異株の酵素活性を検
定した。
かかる菌株などのうち、(a)α−アミノ−β−ヒドロキ
シ吉草酸、(b)Ｓ−（β−アミノエチル）−Ｌ−システ
イン、(c)メチルリジン(d)β−（２−チアゾリル）−Ｄ
Ｌ−アラニン、カナバニン（Canavanine）、カダベリン
（Cadaverine）、スペルミン（Spermine）、スペルミジ
ン（Spermidine）、フトレスシン（Putrescine）、ヒド
ロキシウリジン（５−hydroxyuridine）、アルギニンヒ
ドロキサメート（Arginine hydroxamate）、アザウラ
シル（６−Azauracil）、フルオロトリプトファン（６
−Fluorotryptophan）の様なアルギニンアナログおよび
その他のアミノ酸アナログに耐性を有し、(e)ロイシン
とホモセリンに栄養要求性を持つ菌株を分離し、これを
コリネバクテリウム・グルタミクムＣＳ−７５５と命名
した。
シ吉草酸、(b)Ｓ−（β−アミノエチル）−Ｌ−システ
イン、(c)メチルリジン(d)β−（２−チアゾリル）−Ｄ
Ｌ−アラニン、カナバニン（Canavanine）、カダベリン
（Cadaverine）、スペルミン（Spermine）、スペルミジ
ン（Spermidine）、フトレスシン（Putrescine）、ヒド
ロキシウリジン（５−hydroxyuridine）、アルギニンヒ
ドロキサメート（Arginine hydroxamate）、アザウラ
シル（６−Azauracil）、フルオロトリプトファン（６
−Fluorotryptophan）の様なアルギニンアナログおよび
その他のアミノ酸アナログに耐性を有し、(e)ロイシン
とホモセリンに栄養要求性を持つ菌株を分離し、これを
コリネバクテリウム・グルタミクムＣＳ−７５５と命名
した。
本発明者はこのコリネバクテリウム・グルタミクムＣＳ
−７５５を１９８９年３月２９日付で社団法人・韓国種
菌協会（Korean Federation of Culture Collectio
n）に受託番号：ＫＦＣＣ−１０６７２として寄託を済
ませた。
−７５５を１９８９年３月２９日付で社団法人・韓国種
菌協会（Korean Federation of Culture Collectio
n）に受託番号：ＫＦＣＣ−１０６７２として寄託を済
ませた。
変異処理して菌株（ＫＦＣＣ−１０６７２、ＦＥＲＭ
ＢＰ−２７６３）を好気的条件（振盪培養；２５０−３
００rpm、発酵槽の場合は0.5−1.0ＶＶＭの通気）下でp
H５−８、２５−３５℃の温度で培養してＬ−リジンを
製造した。フラスコで培養する場合には４８−７２時間
後にＬ−リジンが培養液に蓄積された。また、発酵槽で
培養する場合には追加糖を供給する流加培養法でＬ−リ
ジンを製造した。
ＢＰ−２７６３）を好気的条件（振盪培養；２５０−３
００rpm、発酵槽の場合は0.5−1.0ＶＶＭの通気）下でp
H５−８、２５−３５℃の温度で培養してＬ−リジンを
製造した。フラスコで培養する場合には４８−７２時間
後にＬ−リジンが培養液に蓄積された。また、発酵槽で
培養する場合には追加糖を供給する流加培養法でＬ−リ
ジンを製造した。
発酵培地の組成（ｇ／）； グルコース７５ｇ、硫酸アンモニウム４０ｇ、CaCO3４
０ｇ、コーンスチープリカー（Corn steep liqor）１
００ｇ、KH2PO4１ｇ、MgSO4・7H2O0.4ｇ、FeSO2・7H2O
0.01ｇ、MnSO4・4H2O６mg、ビチオン３００μｇ、チア
ミン塩酸塩５００μｇ、パントテン酸0.01ｇ、pH7.6−
8.0 培養後、Ｌ−リジンは塩酸塩を基準として公知の酸性ニ
ンヒドリン法（acidic ninhydrin）やＨＰＬＣで分析
し、培養液のアミノ酸濃度はアミノ酸自動分析機で定量
分析した。
０ｇ、コーンスチープリカー（Corn steep liqor）１
００ｇ、KH2PO4１ｇ、MgSO4・7H2O0.4ｇ、FeSO2・7H2O
0.01ｇ、MnSO4・4H2O６mg、ビチオン３００μｇ、チア
ミン塩酸塩５００μｇ、パントテン酸0.01ｇ、pH7.6−
8.0 培養後、Ｌ−リジンは塩酸塩を基準として公知の酸性ニ
ンヒドリン法（acidic ninhydrin）やＨＰＬＣで分析
し、培養液のアミノ酸濃度はアミノ酸自動分析機で定量
分析した。
次の実施例により本発明をより具体的に説明する。
実施例１ コリネバクテリウム・グルタミクムＹＪ−１５０（ＫＦ
ＣＣ−１００１４）を３０発酵層で培養温度３２℃、
培養pH6.8−7.0、通気量0.5−1.0ＶＶＭで維持しながら
流加式で培養した後、最終培養液をアミノ酸自動分析機
を利用してそれぞれのアミノ酸組成を分析し、各種のア
ミノ酸添加によるＬ−リジン生産性の変化を観察するた
め、それぞれのアミノ酸を１ｇ／、３ｇ／添加し、
フラスコで４８時間発酵させ、その結果などを第１表お
よび第２表に記載した。
ＣＣ−１００１４）を３０発酵層で培養温度３２℃、
培養pH6.8−7.0、通気量0.5−1.0ＶＶＭで維持しながら
流加式で培養した後、最終培養液をアミノ酸自動分析機
を利用してそれぞれのアミノ酸組成を分析し、各種のア
ミノ酸添加によるＬ−リジン生産性の変化を観察するた
め、それぞれのアミノ酸を１ｇ／、３ｇ／添加し、
フラスコで４８時間発酵させ、その結果などを第１表お
よび第２表に記載した。
第２表の記載より判明する様にアルギニン、アスパラギ
ン酸、イソロイシン、バリンなどのアミノ酸の添加時に
はＬ−リジンの生産が促進される反面、ロイシンの添加
はＬ−リジンの生産を減少させているという事実が判明
した。
ン酸、イソロイシン、バリンなどのアミノ酸の添加時に
はＬ−リジンの生産が促進される反面、ロイシンの添加
はＬ−リジンの生産を減少させているという事実が判明
した。
また、コリネバクテリウム・グルタミクムＹＪ−１５０
の成長に対するＬ−リジンアナログであるＡＥＣ（Ｓ−
（β−アミノエチル）−Ｌ−システイン）の阻害程度お
よびアルギニン添加によるＡＥＣ阻害緩和程度を調査
し、第３表に記載した。即ち、−リジンの生産を促進す
るアルギニンがＡＥＣのコリネバクテリウム・グルタミ
クムＹＪ−１５０の成長阻害に対する緩和程度を測定し
た。
の成長に対するＬ−リジンアナログであるＡＥＣ（Ｓ−
（β−アミノエチル）−Ｌ−システイン）の阻害程度お
よびアルギニン添加によるＡＥＣ阻害緩和程度を調査
し、第３表に記載した。即ち、−リジンの生産を促進す
るアルギニンがＡＥＣのコリネバクテリウム・グルタミ
クムＹＪ−１５０の成長阻害に対する緩和程度を測定し
た。
第３表の記載より判明するように、アルギニンを１ｇ／
添加した結果、ＡＥＣによる成長阻害が緩和された。
添加した結果、ＡＥＣによる成長阻害が緩和された。
この結果よりアルギニンアナログ耐性菌株を利用する場
合、Ｌ−リジンの生産量が増加することと判明し、実施
例２の様な方法により変異体を得てＬ−リジンの生産量
を測定した。
合、Ｌ−リジンの生産量が増加することと判明し、実施
例２の様な方法により変異体を得てＬ−リジンの生産量
を測定した。
実施例２ コリネバクテリウム・グルタミクムＹＪ−１５０（ＫＦ
ＣＣ−１００１４）を0.1モルの硫酸マグネシウム溶液
に１０７−１０８細胞／mlで懸濁して紫外線を３０秒な
いし１８０秒間照射し、変異処理するかあるいは0.1Ｍ
燐酸緩衝液（pH7.0）または0.1Ｍクエン酸塩緩衝液（pH
5.5）に１０７−１０８細胞／mlで懸濁した後、Ｎ−メ
チル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ′−ニトロソグアニジンを最終
濃度が２００−５００μｇ／mlになる様に添加し、室温
あるいは３２℃で１０分ないし３０分間処理する方法で
１−３回変異し、アルギニンアナログおよびアルギニン
生合成経路に含まれる特異的酵素の活性を阻害する化学
物質を含む最小寒天培地上に、変異原処理細胞を0.5−
５ｇ／の範囲で塗抹した。種々の栄養要求性、代謝調
節変異株群を得た。
ＣＣ−１００１４）を0.1モルの硫酸マグネシウム溶液
に１０７−１０８細胞／mlで懸濁して紫外線を３０秒な
いし１８０秒間照射し、変異処理するかあるいは0.1Ｍ
燐酸緩衝液（pH7.0）または0.1Ｍクエン酸塩緩衝液（pH
5.5）に１０７−１０８細胞／mlで懸濁した後、Ｎ−メ
チル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ′−ニトロソグアニジンを最終
濃度が２００−５００μｇ／mlになる様に添加し、室温
あるいは３２℃で１０分ないし３０分間処理する方法で
１−３回変異し、アルギニンアナログおよびアルギニン
生合成経路に含まれる特異的酵素の活性を阻害する化学
物質を含む最小寒天培地上に、変異原処理細胞を0.5−
５ｇ／の範囲で塗抹した。種々の栄養要求性、代謝調
節変異株群を得た。
これらの特性を次の第４表に記載した。
変異リジン過剰生産株を選別するために、ロイシンおよ
びホモセリン（またはメチオニンおよびスレオニン）な
どの必要なアミノ酸を２００mg／で補足した発酵培地
２０mlを含有する２５０mlのフラスコで発酵させた。栄
養培地で培養した第４表に記載された各菌株を培地に１
白金耳接種し、４８−７２時間培養した。これらの変異
株群から、より具体的には、コリネバクテリウム・グル
タミクムＣＳ−７群から、 Hse-、Leu-、AECr、AHVr、MLr、β−（２−チアゾリ
ル）−ＤＬ−アラニンｒ、カナバニンｒ、カダベリンｒ
スペルミンｒ、スペルミジンｒ、プトレスシンｒ、５−
ヒドロキシウリジンｒ、アルギニンヒドロキサメー
トｒ、６−アザウラシルｒ、６−フルオロトリプトファ
ンｒの特性を有するコリネバクテリウム・グルタミクム
ＣＳ−７５５（ＫＦＣＣ−１０６７２、ＦＥＲＭ ＢＰ
−２７６３）を最終的に選別した。
びホモセリン（またはメチオニンおよびスレオニン）な
どの必要なアミノ酸を２００mg／で補足した発酵培地
２０mlを含有する２５０mlのフラスコで発酵させた。栄
養培地で培養した第４表に記載された各菌株を培地に１
白金耳接種し、４８−７２時間培養した。これらの変異
株群から、より具体的には、コリネバクテリウム・グル
タミクムＣＳ−７群から、 Hse-、Leu-、AECr、AHVr、MLr、β−（２−チアゾリ
ル）−ＤＬ−アラニンｒ、カナバニンｒ、カダベリンｒ
スペルミンｒ、スペルミジンｒ、プトレスシンｒ、５−
ヒドロキシウリジンｒ、アルギニンヒドロキサメー
トｒ、６−アザウラシルｒ、６−フルオロトリプトファ
ンｒの特性を有するコリネバクテリウム・グルタミクム
ＣＳ−７５５（ＫＦＣＣ−１０６７２、ＦＥＲＭ ＢＰ
−２７６３）を最終的に選別した。
コリネバクテリウム・グルタミクムＹＪ−１５０および
ＣＳ−７５５をフラスコで培養し、Ｌ−リジンの塩酸塩
の生産濃度と収率とを比較し、次の第５表に記載した。
ＣＳ−７５５をフラスコで培養し、Ｌ−リジンの塩酸塩
の生産濃度と収率とを比較し、次の第５表に記載した。
実施例３ 選別されたコリネバクテリウム・グルタミクムＣＳ−７
５５および母菌株であるＹＪ−１５０を３０の発酵層
で上記培養培地を用いて流加培養させた。３０の発酵
槽中には、CaCO3は添加せず、ロイシンおよびホモセリ
ン（メチオニンおよびスレオニン）を１００−２００mg
／の範囲でそれぞれ添加した。その結果および最終培
養液のアミノ酸組成を第６表および第７表に記載した。
５５および母菌株であるＹＪ−１５０を３０の発酵層
で上記培養培地を用いて流加培養させた。３０の発酵
槽中には、CaCO3は添加せず、ロイシンおよびホモセリ
ン（メチオニンおよびスレオニン）を１００−２００mg
／の範囲でそれぞれ添加した。その結果および最終培
養液のアミノ酸組成を第６表および第７表に記載した。
第６表および第７表の記載から判明する様にコリネバク
テリウム・グルタミクムＣＳ−７５５菌株は１２０ｇ／
以上のリジン塩酸塩を生産し、対糖収率は４５％以上
で、また発酵液中に1.6−2.5ｇ／のアルギニンを蓄積
した。
テリウム・グルタミクムＣＳ−７５５菌株は１２０ｇ／
以上のリジン塩酸塩を生産し、対糖収率は４５％以上
で、また発酵液中に1.6−2.5ｇ／のアルギニンを蓄積
した。
実施例４ コリネバクテリウム・グルタミクムＣＳ−７５５（ＫＦ
ＣＣ−１０６７２、ＦＥＲＭ ＢＰ−２７６３）を培養
して得た発酵液１０に硫酸を加えてpHを調整した後、
NH4型に再生した強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト
（Duolite）Ｃ−２０Ｎを使用して空間速度(SV)５で樹
脂カラム下部から逆流式で吸着させた。この逆流式吸着
法の利用により、菌体分離に伴う設備が要らず、さらに
菌体分離によって生ずるリジンの損失を減らすことがで
きた。吸着終了後の樹脂を水で十分洗浄し、菌体、色素
などを除去し、２Ｎ−NH4OHを利用して溶離を行って樹
脂量の0.6倍である高濃度部分の溶離液（濃度：１２９
ｇ／、発酵液より回収率９７％）を得て、リジンの低
濃度部分は次のカラムの溶離時、再使用した。吸着され
たリジンは濃NH4OHで溶離した。
ＣＣ−１０６７２、ＦＥＲＭ ＢＰ−２７６３）を培養
して得た発酵液１０に硫酸を加えてpHを調整した後、
NH4型に再生した強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト
（Duolite）Ｃ−２０Ｎを使用して空間速度(SV)５で樹
脂カラム下部から逆流式で吸着させた。この逆流式吸着
法の利用により、菌体分離に伴う設備が要らず、さらに
菌体分離によって生ずるリジンの損失を減らすことがで
きた。吸着終了後の樹脂を水で十分洗浄し、菌体、色素
などを除去し、２Ｎ−NH4OHを利用して溶離を行って樹
脂量の0.6倍である高濃度部分の溶離液（濃度：１２９
ｇ／、発酵液より回収率９７％）を得て、リジンの低
濃度部分は次のカラムの溶離時、再使用した。吸着され
たリジンは濃NH4OHで溶離した。
得られた高濃度液は濃縮してアワモニアを除去し、塩酸
を使用してpH5.0に調整した後、活性炭処理を経た後濃
縮、分離などを行い、結晶（１次結晶）と母液（１次母
液）を得た後、１次母液を再度濃縮し、結晶（２次結
晶）と母液（２次母液）を再び得て、２次母液は発酵液
貯蔵タンクに再循環し、２次結晶は樹脂塔で得られた高
濃度液の処理時に合わせて製品化に使用した。
を使用してpH5.0に調整した後、活性炭処理を経た後濃
縮、分離などを行い、結晶（１次結晶）と母液（１次母
液）を得た後、１次母液を再度濃縮し、結晶（２次結
晶）と母液（２次母液）を再び得て、２次母液は発酵液
貯蔵タンクに再循環し、２次結晶は樹脂塔で得られた高
濃度液の処理時に合わせて製品化に使用した。
上述した方法により得られた１次結晶を熱風乾燥し、Ｌ
−リジン塩酸塩９９３ｇ（回収率：９４％、含量99.5％
以上）を得た。
−リジン塩酸塩９９３ｇ（回収率：９４％、含量99.5％
以上）を得た。
得られた製品は赤外線分光光度計などによりリジン塩酸
塩であることが判明した。
塩であることが判明した。
実施例５ 実施例４の様な菌株は培養して得た発酵液１０を限外
濾過法（Ｘ−Floシステム、米国、バイオリカバリー
社、ＭＲＣ−膜Ｍ．Ｗ．カットオフ30,000）で菌体を分
離した。回収率を高めるため限外濾過を実施して得た濾
過液は３５であった。
濾過法（Ｘ−Floシステム、米国、バイオリカバリー
社、ＭＲＣ−膜Ｍ．Ｗ．カットオフ30,000）で菌体を分
離した。回収率を高めるため限外濾過を実施して得た濾
過液は３５であった。
この液を塩酸でpH5.0に調整し、活性炭脱色濾過の後、
濃縮、結晶化工程を経て結晶および母液に分離したの
ち、結晶は乾燥して製品化し、母液は別に実施例４の樹
脂処理工程と同様な方法で処理し、これで得た高濃度部
分はアンモニアを除去した後、限外濾過工程の膜濾液に
合わせて再度pHを調整し、脱色および濃縮後、結晶化し
た結果、９９３ｇの製品（回収率：９４％、含量：９９
％以上）を得た。
濃縮、結晶化工程を経て結晶および母液に分離したの
ち、結晶は乾燥して製品化し、母液は別に実施例４の樹
脂処理工程と同様な方法で処理し、これで得た高濃度部
分はアンモニアを除去した後、限外濾過工程の膜濾液に
合わせて再度pHを調整し、脱色および濃縮後、結晶化し
た結果、９９３ｇの製品（回収率：９４％、含量：９９
％以上）を得た。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者 曹 永済 大韓民国キョンギドー、アンヤングシ、ア ンヤング・１トン 97‐３、ジンフン・ア パート 12‐203 (72)発明者 朴 來憲 大韓民国ソウル特別市、カンナムク、バン ポー・２トン（番地の表示なし）、ジュコ ン・アパート 212‐208 (72)発明者 李 在興 大韓民国ソウル特別市、ヨントンポク ヨ イトトン（番地の表示なし）、ジンジュ・ アパート エイ‐102
Claims (2)
- 【請求項１】(a)α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸、 (b)Ｓ−（β−アミノエチル）−Ｌ−システイン、 (c)メチルリジン、 (d)アルギニンアナログおよびその他のアルギニンおよ
びポリアミン類の生合成に関連する特異的酵素活性を阻
害するアミノ酸アナログ［β−（２−チアゾリル）−Ｄ
Ｌ−アラニン、カナバニン、カダベリン、スペルミン、
スペルミジン、フトレスシン、５−ヒドロキシウリジ
ン、アルギニンヒドロキサメート、６−アザウラシル、
または６−フルオロトリプトファン］ 耐性、および (e)ロイシン要求性およびホモセリン要求性 を有するＬ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウム
・グルタミクムＣＳ−７５５（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７６
３）。 - 【請求項２】請求項１記載の微生物を培養し、培養液か
らＬ−リジン塩酸塩を分離、採取することを特徴とする
発酵法によるＬ−リジンの製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| KR89-4136 | 1989-03-30 | ||
| KR1019890004136A KR910002850B1 (ko) | 1989-03-30 | 1989-03-30 | L-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-라이신의 제조방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03201978A JPH03201978A (ja) | 1991-09-03 |
| JPH0638743B2 true JPH0638743B2 (ja) | 1994-05-25 |
Family
ID=19284926
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2082914A Expired - Fee Related JPH0638743B2 (ja) | 1989-03-30 | 1990-03-29 | Ｌ―リジンを生産する微生物およびこれを用いたｌ―リジンの製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
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| KR (1) | KR910002850B1 (ja) |
| AU (1) | AU617937B2 (ja) |
| FR (1) | FR2645172B1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| JP3046332B2 (ja) * | 1990-08-02 | 2000-05-29 | 協和醗酵工業株式会社 | 発酵法によるアミノ酸の製造法 |
| DE4113471A1 (de) * | 1991-04-25 | 1992-10-29 | Degussa | Verfahren zur erhoehung der leistungsfaehigkeit l-lysin ausscheidender coryneformer mikroorganismen |
| DE4130867A1 (de) * | 1991-09-17 | 1993-03-18 | Degussa | Verfahren zur fermentativen herstellung von aminosaeuren |
| KR100733928B1 (ko) * | 2005-11-30 | 2007-07-02 | 씨제이 주식회사 | 카나마이신 내성을 갖고 ｌ-라이신 생산능이 향상된코리네형 미생물 및 그를 이용하여 ｌ-라이신을 생산하는방법 |
| CN103328643B (zh) | 2010-12-08 | 2015-08-19 | 东丽株式会社 | 尸胺的制造方法 |
| KR20190092951A (ko) * | 2018-01-31 | 2019-08-08 | 씨제이제일제당 (주) | 연속식 크로마토그래피 공정을 이용한 천연 l-시스테인 결정의 제조 방법 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3929571A (en) * | 1973-05-24 | 1975-12-30 | Ajinomoto Kk | Process for preparing L-lysine |
| JPS57115186A (en) * | 1980-12-29 | 1982-07-17 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-lysine by fermentation |
| GB2103617B (en) * | 1981-08-10 | 1986-05-21 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Production of l-lysine by fermentation and new micro-organisms obtained by protoplast fusion |
-
1989
- 1989-03-30 KR KR1019890004136A patent/KR910002850B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-03-26 AU AU52190/90A patent/AU617937B2/en not_active Ceased
- 1990-03-29 JP JP2082914A patent/JPH0638743B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-03-30 FR FR909004119A patent/FR2645172B1/fr not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU617937B2 (en) | 1991-12-05 |
| KR900014583A (ko) | 1990-10-24 |
| FR2645172B1 (fr) | 1994-09-09 |
| JPH03201978A (ja) | 1991-09-03 |
| KR910002850B1 (ko) | 1991-05-06 |
| FR2645172A1 (fr) | 1990-10-05 |
| AU5219090A (en) | 1990-10-04 |
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