CN103328643B - 尸胺的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与利用传统的发酵法的制造方法相比，可以更有效且产率更高地制造尸胺的新型尸胺制造方法。所述尸胺的制造方法包括培养具有生产尸胺的能力、且对2,2'-硫代双(乙胺)具有抗性的棒状菌群。优选所述棒状菌群具有赖氨酸脱羧酶活性，另外，优选所述棒状菌群具有高丝氨酸营养缺陷性和/或S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸抗性。
Description
技术领域
本发明涉及使用具有尸胺生产能力的棒状菌群来制造尸胺的方法。
背景技术
尸胺具有二胺结构，别名称为1,5-戊二胺或戊二胺等。近来，尸胺作为聚酰胺的单体原料而受到关注，因此期待大量生产。作为尸胺的制造方法，已知利用棒状菌群的发酵法，具体而言，已知有：通过下述棒状菌群的发酵来制造尸胺的方法，所述棒状菌群具有尸胺生产能力、并且作为尸胺前体物质的赖氨酸的合成能力得到强化（参考专利文献1～4、非专利文献1）；或者通过下述棒状菌群的发酵来制造尸胺的方法，所述棒状菌群由于赖氨酸脱羧酶基因的拷贝数增加而使赖氨酸脱羧酶活性得到强化（参考专利文献5）。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2004-222569号公报
专利文献2：日本特开2002-223770号公报
专利文献3：WO2007/113127号
专利文献4：WO2008/101850号
专利文献5：WO2008/092720号
非专利文献
非专利文献1：Stefaine Kind,Metabolic engineering.(代谢工程)12,341-351,(2010)
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题为开发出比利用传统的发酵法制造尸胺的方法更有效且产率更高的尸胺制造工艺。
解决问题的手段
本发明人发现，具有生产尸胺的能力、且对2,2'-硫代双(乙胺)具有抗性的棒状菌群可用作尸胺生产菌，从而导致本发明的完成。
即，本发明提供了以下（1）～（5）。
（1）一种尸胺的制造方法，包括培养具有生产尸胺的能力、且对2,2'-硫代双(乙胺)具有抗性的棒状菌群。
（2）根据（1）所述的尸胺的制造方法，所述棒状菌群对250mM以上的2,2'-硫代双(乙胺)具有抗性。
（3）根据（1）或（2）所述的尸胺的制造方法，所述棒状菌群具有赖氨酸脱羧酶活性。
（4）根据（1）至（3）中任一项所述的尸胺的制造方法，所述棒状菌群选自由棒状杆菌属和短杆菌属构成的组。
（5）根据（1）至（4）中任一项所述的尸胺的制造方法，所述棒状菌群具有高丝氨酸营养缺陷性和/或S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸抗性。
发明的效果
根据本发明，与利用传统的发酵法制造尸胺的方法相比，能够更有效且更高产率地制造尸胺。
具体实施方式
如上所述，在本发明的方法中，使用了棒状菌群。棒状菌群为好氧性革兰氏阳性杆菌，传统上被分类为短杆菌属，但是现在也被包括在统一为棒状杆菌属的细菌中（Int.J.Syst.,Bacteriol.,(1981)41,p.225）。另外，包括与棒状杆菌属非常接近的短杆菌属细菌。
作为这样的棒状菌群的例子，可以列举出：嗜乙酰乙酸棒杆菌（Corynebacterium acetoacidophylum）、醋谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium acetoglutamicum）、解烷棒状杆菌（Corynebacterium alkanolyticum）、帚石南棒状杆菌（Corynebacterium callunae）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、百合花棒杆菌（Corynebacterium lilium）、栖糖蜜棒杆菌（Corynebacterium mellassecola）、热产氨棒状杆菌（Corynebacterium thermoaminogenes）、有效棒杆菌（Corynebacterium efficiens）、力士棒杆菌（Corynebacterium herculis）、叉开短杆菌（Brevivacterium divaricatum）、黄色短杆菌（Brevivacterium flavum）、ブレビバクテリウム·インマリオフィラム（Brevivacterium immariophilum）、乳糖发酵短杆菌（Brevivacterium lactofermentum）、玫瑰色短杆菌（Brevivacterium roseum）、解糖短杆菌（Brevivacterium saccharolyticum）、生硫短杆菌（Brevivacterium thiogenitalis）、产氨棒杆菌（Corynebacterium ammoniagenes）、白短杆菌（Brevivacterium album）、ブレビバクテリウム·セリヌム（Brevivacterium cerinum）、嗜氨微杆菌（Microbacterium ammoniaphilum）。
另外，作为各棒状菌群的具体菌株，可以举出：嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870，醋谷氨酸棒状菌群ATCC15806，解烷棒状杆菌ATCC21511，帚石南棒状杆菌ATCC15991，谷氨酸棒杆菌ATCC13020、ATCC13020、ATCC13060，百合花棒杆菌ATCC15990，栖糖蜜棒杆菌ATCC17965，有效棒杆菌AJ12340（保藏编号：FERMBP-1539），力士棒杆菌ATCC13868，叉开短杆菌ATCC14020，黄色短杆菌ATCC13826、ATCC14067、AJ12418（保藏编号：FERMBP-2205），ブレビバクテリウムインマリオフィラム（Brevivacterium immariophilum）ATCC14068，乳糖发酵短杆菌ATCC13869，玫瑰色短杆菌ATCC13825，解糖短杆菌ATCC14066，生硫短杆菌ATCC19240，产氨棒杆菌ATCC6871、ATCC6872，白短杆菌ATCC15111，ブレビバクテリウムセリヌム（Brevivacteriumcerinum）ATCC15112，嗜氨微杆菌ATCC15354。
上述棒状菌群可以从（例如）美国典型培养物保藏中心（ATCC）处购买获得。在ATCC中，每个菌株都附带有对应的登记号，该登记号记载在ATCC的目录中，可以参考该登记号购买获得各菌株。
在本发明中，作为具有生产尸胺的能力的棒状菌群，优选使用通过从外部导入编码赖氨酸脱羧酶的多核苷酸而具有赖氨酸脱羧酶 活性的棒状菌群。只要具有赖氨酸脱羧酶活性，即能够以赖氨酸为原料，通过对其进行脱羧而生产尸胺。
赖氨酸脱羧酶优选为L-赖氨酸脱羧酶。另外，关于赖氨酸脱羧酶的来源也没有特别限制，但是优选使用来源于（例如）耐盐芽孢杆菌（Bacillus halodurans）、枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli；大肠杆菌）、反刍月形单胞菌（Selenomonas ruminamtium）、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）、毛链霉菌（Streptomyces pilosus）、侵蚀艾肯菌（Eikenella corrodens）、噬氨基酸真杆菌（Eubacterium acidaminophilum）、鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium）、蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei）、脑膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitidis）、嗜酸热原体（Thermoplasma acidophilum）、或者深海热球菌（Pyrococcus abyssi）的赖氨酸脱羧酶，更优选使用来源于安全性得到确认的大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶。这些赖氨酸脱羧酶（有时被称为“LDC”）的氨基酸序列以及对其进行编码的碱基序列登记在数据库（GenBank）中。例如，在本发明中可优选使用的来源于大肠杆菌的LDC基因的碱基序列登记为GenBank Accession No.M76411。
本发明中使用的编码赖氨酸脱羧酶的基因可以根据所使用的棒状菌群的密码子使用频率对核酸序列进行再设计。需要说明的是，如上所述，来源于上述各生物的赖氨酸脱羧酶基因登记在数据库（GenBank）中，以生物名称和赖氨酸脱羧酶作为关键词进行检索即可以容易地得知各LDC基因的碱基序列。
作为编码赖氨酸脱羧酶的基因，在具有其功能的范围内，除了上述各生物种类的天然LDC基因之外，还包括在这些LDC基因的各碱基序列中，发生1个或多个碱基的置换、缺失、插入或添加后的多核苷酸。这里，“多个”通常为1至40个的程度，优选1至30个，更优选1至20个，特别优选1至10个，最优选1至5个。另外，作为上述编码赖氨酸脱羧酶的基因，在具有其功能的范围内，可以列举出与构成该基因的多核苷酸或者其互补链的全体或一部分在严格条 件下杂交的多核苷酸。这里，“在严格条件下杂交的多核苷酸”是指（例如）将选自原来的碱基序列中任意至少20个、优选为25个、更优选为至少30个连续序列中的1个或多个核酸序列作为探针，使用公知的杂交技术（Current Protocols I Molecular Biology edit.Ausbel et at.，(1987)Publish.John Wily&Sons Section6.3-6.4）等进行杂交的核酸序列。此处作为严格条件，例如在50%甲酰胺的存在下，在杂交温度为37℃、作为更加严格的条件为42℃、作为进一步更严格的条件为65℃时，通过用0.1至2倍浓度的SSC溶液（1倍浓度的SSC溶液的组成：150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠）洗涤，由此可实现杂交。另外，作为上述编码赖氨酸脱羧酶的多核苷酸，在具有其功能的范围内，也可以为序列一致性通常在85%以上、优选为90%以上、更优选为95%以上、进一步优选为99%以上的多核苷酸。此处，“序列一致性”是指将进行序列比较的2个碱基序列排列以使两个序列的碱基尽可能多地一致（根据需要插入间隙），用一致的碱基数除以全部碱基数并以百分率表示的数值。当2个序列的碱基数不同时，除以序列长的一方的碱基数。计算序列一致性的软件是众所周知的，在互联网上免费公开。这样的编码赖氨酸脱羧酶的基因也可以从本来的宿主以外取得，还可以通过对从本来的宿主得到的基因进行本领域技术人员众所周知的体外突变处理、或者部位特异性突变处理而取得。
向棒状菌群导入编码赖氨酸脱羧酶的基因（下面有时也称为“赖氨酸脱羧酶基因”或“LDC基因”，然而如上所述，其并不限于天然的基因）时，赖氨酸脱羧酶基因可以在维持于棒状菌群染色体外的质粒等中得到保持，也可以整合到棒状菌群的染色体中而得到保持。
向棒状菌群的染色体中整合赖氨酸脱羧酶基因时，可以利用转座子，通过同源重组或其自身的转移能力而将赖氨酸脱羧酶基因导入棒状菌群的染色体中。需要说明的是，所导入的基因序列的构建或其确认方法可通过本领域技术人员所熟知的分子生物学技术完成，例如可以参考Sambrook等的Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York；DNA Cloning:A Practical Approach, Volumes I and II(D.N.Glovered.1985)；F.M.Ausubel等(eds),Current Protocols in Molecular Biology(1994)John Willey&Sons,Inc.；PCR Technology:Principles and Application for DNA Amplication,H.Erlich,ed.,Stockton Press，等。
对上述基因构建体向棒状菌群中的导入方法没有特别限定，例如，可以通过原生质体法（Gene,(1985),39,p.281-286）、电穿孔法（Bio/Technology,(1989),7,1067-1070）等导入。
需要说明的是，导入外来的LDC基因并具有尸胺产生能力的棒状菌群如（例如）专利文献1所述的那样是公知的（参照下述参考例）。
接下来，具体说明对2,2'-硫代双(乙胺)具有抗性的棒状菌群。
2,2'-硫代双(乙胺)为由结构式NH2-(CH2)2-S-(CH2)2-NH2表示的强碱性化学物质。在本发明中，对2,2'-硫代双(乙胺)具有抗性是指在含有2,2'-硫代双(乙胺)的培养基中比野生型菌株生长更快的性质。具体而言，在含有200mM以上的2,2'-硫代双(乙胺)的平板培养基上，野生型菌株无法形成菌落，但对于在第2～3天形成菌落的菌株，可以判断其具有2,2'-硫代双(乙胺)抗性。需要说明的是，对于棒状菌群在平板培养基上显示出抗性的硫代双(乙胺)的浓度没有特别的限制，但是优选250mM以上，更优选300mM以上，进一步优选400mM以上。
对用于评价棒状菌群的2,2'-硫代双(乙胺)抗性的含有2,2'-硫代双(乙胺)的培养基没有特别的限制，只要是可以培养棒状菌群的培养基即可，但是优选没有添加氨基酸等的基本培养基，更优选表1所示的基本培养基。
[表1]
作为向棒状菌群赋予2,2'-硫代双(乙胺)抗性的方法，没有特别的限制，例如，只要使母株的染色体产生某种突变即可。向染色体中导入突变的技术有：通过UV、激光等的照射而产生突变的方法；以及使用乙磺酸甲酯（EMS）、亚硝基胍（NTG）、4-二甲氨基苯重氮磺酸钠（DAPA）等诱变剂的方法等。另外，也可以利用在培养棒状菌群时产生的自然突变。需要说明的是，作为提供具有生产尸胺的能力、且对2,2'-硫代双(乙胺)具有抗性的棒状菌群的方法，可以向具有生产尸胺的能力的棒状菌群赋予所述抗性，另外，也可以向已赋予了此抗性的棒状菌群以上述方式赋予生产尸胺的能力。需要说明的是，上述突变诱发处理在微生物的突变诱发处理中采用的公知条件下进行即可，例如，在UV照射时，照射量取决于与光源的距离，然而通常进行10秒～30分钟的照射。另外，在用上述NTG等各种诱变剂进行处理时，处理浓度为（例如）100μg/ml～2μg/ml，优选为300μg/ml～1.3μg/ml，可以通过（例如）在此浓度的培养液中培养12小时～48小时来进行处理。
在这种突变诱发处理后，在上述用于评价2,2'-硫代双(乙胺)抗性 的培养基上进行培养，并通过对已获得了2,2'-硫代双(乙胺)抗性的菌株进行筛选，由此能够获得具有2,2'-硫代双(乙胺)抗性的棒状菌群。需要说明的是，如以下实施中具体描述的那样，由通过NTG处理可以得到多个获得了2,2'-硫代双(乙胺)抗性的菌株得知，通过突变诱发处理，可以再现性地制作出2,2'-硫代双(乙胺)抗性菌株。
另外，本发明中使用的棒状菌群优选为赖氨酸合成能力得到提高的突变株。作为赖氨酸合成能力得到提高的突变株，例如，可以利用解除了因L-赖氨酸或L-苏氨酸引起的反馈抑制的突变株。作为这些突变株的获得方法，例如，可以列举如下方法：对野生型菌株实施与上述例子相同的突变操作后，以S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸（AEC）抗性为指标进行选择，由成为具有L-赖氨酸生产性的突变株而获得的方法（参考专利文献1）。需要说明的是，如专利文献1所述，是否具有AEC抗性可以通过在含有50μg/ml AEC的基本琼脂培养基上于30℃培养24小时后是否发生增殖来进行判断。
或者，作为向野生型菌株赋予AEC抗性的更优选方法，有使用了基因工程技术的方法。对使用了基因工程技术的方法没有特别的限制，有（例如）使用了在棒状菌群中可以复制的重组DNA的方法，或者通过同源重组使染色体中的靶基因重组的方法。例如，可以通过具有突变型天冬氨酸激酶基因（有时被称为“脱敏型AK基因”）而获得S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸抗性，该突变型天冬氨酸激酶是序列号14中所记载的氨基酸序列中的第311位的氨基酸残基被Thr以外的氨基酸置换而得到的。更优选的基因工程技术为通过将棒状菌群的染色体中的AK基因同源重组为脱敏型AK基因而重组的方法。另外，关于脱敏型AK基因，可以利用向AK基因中导入所需突变的众所周知的技术方法（例如定点突变），相应的试剂盒也在市场上有售。
另外，作为赖氨酸合成能力得到提高的突变株，除了AEC抗性突变株之外，还可列举高丝氨酸营养缺陷型突变株。野生型菌株不具有高丝氨酸营养缺陷性，但作为获得高丝氨酸营养缺陷型菌株的方法，可以列举以下方法：与上述例子相同，例如，对野生型菌株实施突变操作后，以高丝氨酸营养缺陷性为指标进行选择，由成为具有 L-赖氨酸生产性的突变株而获得的方法；或者通过基因工程技术使棒状菌群的高丝氨酸脱氢酶活性丧失的方法（专利文献1）。
另外，作为向野生型菌株赋予高丝氨酸营养缺陷性的更优选方法，可以列举通过同源重组向染色体中的高丝氨酸脱氢酶基因（以下简称为HOM）中插入其它基因的方法等，由此使高丝氨酸脱氢酶活性丧失的方法。对所述其它基因没有特别的限制。优选为LDC基因，更优选在野生型菌株中LDC基因能够组成性表达的启动子和基因盒。
在本发明中，通过对所述具有尸胺生产能力、且对2,2'-硫代双(乙胺)具有抗性的棒状菌群进行培养来制造尸胺。作为培养方法，可以使用分批培养、流加培养或连续培养。在连续培养时，优选通过（例如）日本特开2008-104453号公报中所记载的公知方法进行连续培养。
作为用于制造尸胺的培养用培养基，可以使用含有可同化的碳源和氮源及无机盐类等的普通的营养培养基。作为碳源，可以使用例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉水解产物等糖类，乙醇等醇类，醋酸、乳酸、琥珀酸等有机酸类。作为氮源，可以使用氨，氯化铵、硫酸铵、碳酸铵、醋酸铵等各种无机和有机铵盐类，尿素，其它含氮化合物，以及肉类提取物、酵母提取物、玉米浆、大豆水解产物等含氮有机物。作为无机盐，可以使用磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、硫酸铵、氯化钠、硫酸镁、碳酸钙等。此外，根据需要，可以添加生物素、硫胺素、维生素B6等微量营养源。这些微量营养源也可以用肉类提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白氨基酸等培养基添加物来替代。
另外，也可以向培养用培养基中预先添加作为尸胺前体的赖氨酸。若向培养用培养基中预先添加赖氨酸，则棒状菌群将赖氨酸摄入菌体内，赖氨酸脱羧酶以赖氨酸为基质将其转变为尸胺，因此能够提高尸胺的制造效率。向培养用培养基中预先添加赖氨酸时，作为培养用培养基中的赖氨酸浓度，并没有特别的限制，但是优选不会对棒状菌群的增殖造成恶劣影响、且不会对赖氨酸脱羧酶造成阻碍的浓度，具体而言优选为0.01M至2M。
所添加的赖氨酸优选为L-赖氨酸。另外，所添加的赖氨酸可以为游离体，也可以为赖氨酸盐，但优选赖氨酸盐，作为赖氨酸盐，优选赖氨酸盐酸盐或来源于下述二羧酸的赖氨酸·二羧酸盐，作为更优选的具体例子，可以举出赖氨酸·己二酸盐、赖氨酸·癸二酸盐、赖氨酸·1,12-十二烷二羧酸盐、赖氨酸·琥珀酸盐、赖氨酸·间苯二甲酸盐、赖氨酸·对苯二甲酸盐，作为更优选的具体例子，可以举出赖氨酸·己二酸盐。
对培养条件没有特别的限制，在振荡培养、深部通气搅拌培养等好氧条件下进行培养。培养温度一般为25℃至42℃，优选为28℃至38℃。培养时间通常为1天至6天。
对于培养pH的调节，调节为碱性时优选使用氨，调节为酸性时优选使用盐酸或二羧酸，更优选使用二羧酸。使用这些中和剂将培养pH调节到5至8，优选最好控制在pH6.5至7.5。此外，对中和剂的状态并没有限制，以气体、液体、固体或水溶液形式使用。特别优选水溶液。
对优选用作中和剂的二羧酸没有特别限定，但是优选的是，除了上述2个羧基以外，实质上不存在其它官能团的二羧酸。这里所说的官能团为在聚酰胺聚合反应（作为反应条件，例如，反应温度250至270℃，压力10至20kg/cm2，反应时间1至5小时）时，与氨基或羧基等反应，造成聚合物的分支、或使聚合物的结晶度下降（结晶度80%以下）的反应基团，例如，氨基或羧基就符合该官能团，除此以外，酸性基团（磺酸基、磷酸基、酚羟基等）、碱性基团（肼基等）、质子极性基（羟基等）、具有断裂性的基团（环氧基、过氧化基等）或者其它反应性高的基团（异氰酸根基）也符合该官能团。另一方面，卤素取代基、芳香性取代基、醚基、酯基、酰胺基等反应性低，不符合这里所说的官能团。
作为二羧酸，更优选的是由下列通式（1）、（2）或（3）所表示的二羧酸。
HOOC-(CH2)m-COOH（1）
（通式（1）中，m=0至16）。
[化学式1]
（通式（2）中，n、o=0至16）。
[化学式2]
（通式（3）中，p、q=0至16）。
另外，作为二羧酸，进一步优选己二酸、癸二酸、1,12-十二烷二羧酸、琥珀酸、间苯二甲酸、对苯二甲酸。
培养液中的尸胺以尸胺的游离体或尸胺盐的形式存在（需要说明的是，在本发明中将它们统称为“尸胺”）。为了回收培养液中的尸胺，首先从培养液中除去棒状菌群。此时，棒状菌群增殖，发酵充分进行从而生成尸胺，之后可以将菌体和培养上清液分离（作为分离方法，将菌体沉淀除去、离心分离、膜过滤分离），或者可以从最初就利用保持材料等将菌体分离、保持或者固定化。从除去了菌体的含有尸胺的培养液中回收尸胺的方法本身是众所周知的，例如，可以如日本特开2009-207495号公报中所记载的那样，以尸胺·二羧酸盐的形式结晶析出并收集。另外，也可以如日本特开2009-29872号公报中所记载的那样，利用NF膜来精制并收集尸胺的游离体。另外，还可以如日本特开2009-28045号公报中所记载的那样，通过用极性有机溶剂提取、并蒸馏，从而收集尸胺的游离体（参见以下参考例）。
实施例
下面列举实施例和对比例对本发明进行详细说明。
参考例1尸胺和赖氨酸浓度的HPLC分析方法
在25μl分析样品中添加25μl的1,4-丁二胺（0.03M）作为内标物，添加150μl碳酸氢钠（0.075M）以及2,4-二硝基氟苯（0.2M）的乙醇溶液加以混合，在37℃下保温1小时，将50μl反应溶液溶解在1ml乙腈中，然后在以下条件下对以10,000rpm的转速离心5分钟后得到的上清液10μl进行HPLC分析。
使用柱子：CAPCELL PAK C18（資生堂）
流动相：0.1%(w/w)磷酸水溶液:乙腈=4.5:5.5
检测：UV360nm
参考例2具有L-赖氨酸脱羧酶活性、且丧失高丝氨酸脱氢酶活性的谷氨酸棒杆菌（TR-CAD1菌株）的制作（专利文献1）
（1）HOM基因的克隆
为了使HOM活性丧失，对对应于从N末端开始的300个氨基酸区域的基因进行了克隆。
参照数据库（GenBank）中登记的HOM基因（登记号BA000036）的碱基序列，合成了寡核苷酸引物5′-gaagaattctaaacctcagcatctgcccc-3′（序列号1）和5′-gaaggatccaaaggacttgtttaccgacgc-3′（序列号2）。将来自谷氨酸棒杆菌ATCC13032的、根据常规方法配制的基因组DNA溶液作为扩增模板，各取0.2μl装入0.2ml的微量离心管中，添加各种试剂：各引物20pmol、pH8.0的Tris盐酸缓冲液（20mM）、氯化钾（2.5mM）、明胶（100μg/ml）、各dNTP（50μM）、LATaqDNA聚合酶（2单位）（宝酒造制），使总量为50μl。在DNA变性条件为94℃、30秒，引物的退火条件为55℃、30秒，DNA引物的伸长反应条件为72℃、3分钟的各条件下，使用BioRad公司的热循环仪，进行30个循环的聚合酶链式反应（下面简称为PCR法）。此外，在本参考例中，除非特别指明，PCR法都在此条件下进行。通过该PCR法所得到的产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，从凝胶中切割出含有HOM基因的大约0.9kb的DNA片段，并且利用Gene Clean Kit （BIO101公司制）进行精制。将该片段用限制酶EcoRI和BamHI消化，并将所得到的0.9kb的EcoRI-BamHI片段利用连接试剂盒ver.1（宝酒造公司制）插入到预先被EcoRI和BamHI消化过的pHSG298（宝酒造制）的EcoRI/BamHI间隙中，将所得质粒命名为pHOM1。
（2）LDC表达盒的制作
首先，对于作为在谷氨酸棒杆菌中组成性表达LDC的启动子的卡那霉素抗性基因的启动子进行了克隆。
参照数据库（GenBank）中登记的pHSG299（登记号M19415）的碱基序列，合成寡核苷酸引物5′-gaaccgcggcctgaatcgccccatcatcc-3′（序列号3）和5′-gaaccatggccccttgtattactg-3′（序列号4）。将通过以质粒pHSG299为扩增模板并以寡核苷酸（序列号3）、（序列号4）为引物组的PCR法所得到的产物用1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳，从凝胶中切割出含有卡那霉素抗性基因的启动子区域的0.3kb的DNA片段，并利用Gene Clean Kit进行精制。利用连接试剂盒ver.1将该片段插入到在质粒载体pT7blue（Novagen公司制）的EcoRV切断部位的3′末端添加有T碱基的间隙中，在所得到的质粒中，在用限制酶HindIII和SacII进行消化时，将成为3.2kb的单一片断的质粒命名为pKMP1。
接下来，进行LDC基因的克隆。参照数据库（GenBank）中登记的LDC基因（登记号M76411）的碱基序列，合成寡核苷酸引物5′-gaaccatggacgttattgcaa-3′（序列号5）和5′-gaaccgcggttattttttgctttcttcttt-3′（序列号6）。将通过PCR法（该PCR法以来源于大肠埃希氏菌ATCC10798的、用常规方法配制的基因组DNA溶液为扩增模板、以寡核苷酸（序列号5）、（序列号6）为引物组）所得到的产物用1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳，从凝胶中切割出含有LDC基因的2.1kb的DNA片段，并利用Gene Clean Kit进行精制。利用连接试剂盒ver.1将该片段插入到在质粒载体pT7blue的EcoRV切断部位的3′末端添加有T碱基的间隙中，在所得到的质粒中，在用HindIII和NcoI进行消化时，将成为4.0kb的单一片断的质粒命名为pCADA。
最后，用HindIII和NcoI消化pKMP1，将其产物用1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳，从凝胶中切割出含有卡那霉素抗性基因的启动子区域的0.3kb的DNA片段，并利用Gene Clean Kit进行精制。利用连接试剂盒ver.1将如此得到的HindIII-NcoI片段插入到预先被HindIII和NcoI消化过的pCADA的HindIII/NcoI间隙中，将所得质粒命名为pTM100。
（3）HOM基因破坏及LDC基因表达载体的制作
用SacII消化pTM100，将其产物用1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳，从凝胶中切割出含有LDC表达盒的2.4kb的DNA片段，并利用Gene Clean Kit进行精制。利用连接试剂盒ver.1将如此获得的SacII片段插入到预先被SacII消化过的pHOM1的SacII间隙中，将所得质粒命名为pTM101。
（4）pTM101向染色体的整合
通过电穿孔法［FEMS Microbiology Letters,65,p.299(1989)］向谷氨酸棒杆菌ATCC13032（以下简称ATCC13032菌株）中导入质粒pTM101，在添加有卡那霉素（25μg/ml）的LB（胰蛋白胨（10g/l）（Bacto公司制）、酵母提取物（5g/l）（Bacto公司制）、氯化钠（10g/l））琼脂培养基上进行选取。
从这样选取的转化株中以常规方法配制基因组DNA溶液。以该基因组DNA为模板，以寡核苷酸（序列号5）（序列号6）为引物组进行PCR，将所得产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，此时观察到2.1kb的单一的带。由此能够确认，对于所选取的转化株，LDC基因被插入到HOM基因座中。将该转化株命名为谷氨酸棒杆菌TR-CAD1（以下简称为TR-CAD1菌株）。
确认了13032菌株不具有LDC活性，而TR-CAD1菌株具有LDC活性。另外，13032菌株具有HOM活性，而TR-CAD1菌株丧失了HOM活性。13032菌株不缺乏高丝氨酸，而TR-CAD1菌株缺乏高丝氨酸。由此能够制得具有LDC活性、且丧失HOM活性（高丝氨酸营养缺陷性）的谷氨酸棒杆菌TR-CAD1菌株。
参考例3具有L-赖氨酸脱羧酶活性、具有高丝氨酸缺陷性、且具有S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸抗性的谷氨酸棒杆菌（TR-CAD2）菌株的制作（专利文献1）
（1）脱敏型AK基因的制作
为了向AK基因中导入突变而制作脱敏型AK基因，对AK基因进行了克隆。
参考数据库（GenBank）中登记的AK基因（登记号：BA000036）的碱基序列，合成寡核苷酸引物5′-acagaattcgtggccctggtcgtacagaa-3′（序列号7）和5′-catctcgagttagcgtccggtgcctgcat-3′（序列号8）。将通过PCR法（该PCR法以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13032的、根据常规方法配制的基因组DNA溶液为扩增模板、以寡核苷酸（序列号7）、（序列号8）为引物组）所得到的产物用1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳，从凝胶中切割出含有AK基因的大约1.3kb的DNA片段，并且利用Gene Clean Kit进行精制。将该片段用EcoRI和XhoI消化，利用连接试剂盒ver.1将所得到的1.3kb的EcoRI-XhoI片段插入到预先被EcoRI和XhoI消化过的pHSG396（宝酒造制）的EcoRI/XhoI间隙中，将所得质粒命名为pAK1。
接下来，为了使克隆的AK基因的第931位至第933位的acc（Thr）突变为atg（Ile），合成了寡核苷酸引物5′-cgacatcatcttcacctgcc-3′（序列号9）和5′-ggcaggtgaagatgatgtcg-3′（序列号10）。将以pAK1为扩增模板、以寡核苷酸（序列号9）、（序列号10）为引物组、并使用QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン株式会社制）得到的质粒命名为pTM102。通过常规方法对该pTM102中的AK基因进行筛选，此时可以确认：按照目的，从第931位到第933位的acc（Thr）突变为atg（Ile），从而制成了脱敏型AK基因。
（2）pTM102向染色体的整合
参考数据库（GenBank）中登记的pFK398（登记号D29826）的碱基序列，合成氯霉素抗性基因的寡核苷酸引物5′-acggtcgactcgcagaataaataaatcctggtg-3′（序列号11）和5′- atgaggcctgagaggcggtttgcgtattgga-3′（序列号12）。
通过电穿孔法向TR-CAD1菌株中导入质粒pTM102，并在添加有卡那霉素（25μg/ml）和氯霉素（10μg/ml）的LB琼脂培养基上进行选取。
从这样选取的转化株中以常规方法配制基因组DNA溶液。以该基因组DNA为模板，以寡核苷酸（序列号11）（序列号12）为引物组进行PCR，将所得产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，此时观察到1.0kb的单一的带。由此能够确认，对于所选取的转化株，氯霉素抗性基因被插入到AK基因座中。将该转化株命名为谷氨酸棒杆菌TR-CAD2（以下简称为TR-CAD2菌株）。
（3）向TR-CAD2菌株的染色体上导入脱敏型AK基因的确认
参考数据库（GenBank）中登记的AK基因（登记号BA000036）的碱基序列，合成较AK的N末端处于上游的0.1kb的寡核苷酸引物5′-ttggaacgcgtcccagtggc-3′（序列号13）。
从TR-CAD2菌株中以常规方法配制基因组DNA溶液。以该基因组DNA为模板，以寡核苷酸（序列号12）（序列号13）为引物组进行PCR法，将所得产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，从凝胶中切割出含有AK基因和氯霉素抗性基因的3.1kb的DNA片段，并且利用Gene Clean Kit进行精制。利用连接试剂盒ver.1将该片段插入到在质粒载体pT7blue的EcoRV切断部位的3′末端添加有T碱基的间隙中，将所得质粒命名为pAK2。通过常规方法对此pAK2中的AK基因进行筛选，此时能够确认含有所期望的突变，因而能够确认可以向TR-CAD2菌株的染色体上导入可以表达的脱敏型AK基因。由此能够制得具有LDC活性、丧失HOM活性（高丝氨酸营养缺陷性）、并且为AEC抗性的谷氨酸棒杆菌（TR-CAD2菌株）。
实施例1具有生产尸胺的能力、且对2,2'-硫代双(乙胺)具有抗性的棒状菌群的获取
将以上述方式得到的谷氨酸棒杆菌（TR-CAD1菌株）和谷氨酸棒杆菌（TR-CAD2菌株）分别在5ml的BHI（脑心浸液，Brain Heart Infusion）液体培养基中进行一晚上的前培养，将所得前培养液中的2.5ml接种到新的BHI液体培养基中，培养至浊度（A600）达到1～2，其中所述谷氨酸棒杆菌（TR-CAD1菌株）由于具有L-赖氨酸脱羧酶活性、且丧失高丝氨酸脱氢酶活性而成为高丝氨酸营养缺陷型突变株；所述谷氨酸棒杆菌（TR-CAD2菌株）由于具有L-赖氨酸脱羧酶活性、且丧失高丝氨酸脱氢酶活性而成为高丝氨酸营养缺陷型突变株，并且其具有S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸抗性（AEC抗性）。培养后，用Tris-马来酸缓冲液清洗菌体2次，使清洗过的菌体悬浊于12ml的Tris-马来酸缓冲液中，将悬浊液以每试管900μl的方式分装，并分别添加640μg/ml的NTG溶液。将混合溶液在30℃下剧烈振荡40分钟，然后悬浊于2ml的BHI培养基中，并用冰冷却。将悬浊液用Tris-马来酸缓冲液清洗2次后，添加50ml的BHI培养基，在28℃下培养一晚上。将培养液用Tris-马来酸缓冲液清洗2次，用添加了180mM、220mM、250mM、300mM或400mM的2,2'-硫代双(乙胺)的表1所示培养基培养2～3天后，获得形成了菌落的菌体作为2,2'-硫代双(乙胺)抗性株，分别是TR-CADA1-C、TR-CADA1-0～6菌株、TR-CADA2-C、TR-CADA2-0～6菌株（表2）。进一步将所获得的抗性株用获取该抗性株的培养基培养3天，确认形成了菌群，即，确认赋予了2,2'-硫代双(乙胺)抗性。
需要说明的是，TR-CADA1-6菌株、TR-CADA2-5菌株分别以受理编号NITE BP-1002、NITE BP-1003被国际保藏在日本国家技术评价研究所（独立行政法人製品評価技術基盤機構，NITE）中。
[表2]
实施例2、3和对比例1、2
利用TR-CADA1-1～6菌株（实施例2）、TR-CADA2-1～6菌株 （实施例3）、TR-CADA1菌株（对比例1）、TR-CADA1-0菌株（对比例2）、TR-CADA2（对比例3）、TR-CADA2-0（对比例4）进行尸胺发酵。向灭菌后的5mL BHI培养基中接种1白金环的各菌株，在30℃下振荡24小时，进行初步预培养。将此初步预培养液全部接种到50ml的与初步预培养相同的培养基中，在30℃、振幅30cm、120rpm的条件下培养24小时以进行预培养。接下来，将预培养液全部接种到950ml的表3所示MMP培养基中，将灭菌后的空气以0.07vvm的流速进行通气，同时在30℃、搅拌桨转速800rpm、pH被调节为6.7的条件下进行50小时的培养。中和剂使用硫酸水溶液（3M）和氨水（3M）。
[表3]
培养结束后，在4℃、8,000rpm下离心分离10分钟，由此除去菌体，并回收培养上清液。利用HPLC对该培养上清液中的尸胺和赖氨酸进行分析。另外，葡萄糖浓度测定使用了“Glucose Test Wako C”(注册商标)（和光純薬社制）。计算尸胺对糖收率（产生的尸胺重 量/消耗的葡萄糖重量）×100(%)），结果如表4所示。
[表4]
结果表明，当将实施例2与对比例1、对比例2分别比较、以及将实施例3与对比例3、对比例4分别比较时，通过对母株赋予2,2'-硫代双(乙胺)抗性，提高了尸胺的蓄积浓度和对糖收率。
由所得培养上清液回收尸胺可以通过各种公知方法来进行。下面列举优选的公知回收方法。
参考例4从培养上清液中回收尸胺
向通过上述方法得到的尸胺发酵液的培养上清液中添加5N的氢氧化钠，将pH调节为13。接着，使其通过纳滤膜以除去无机盐成分和微量的残余菌体，回收纳滤膜透过液。接着，使回收的纳滤膜透过液通过反渗透膜，浓缩至尸胺浓度成为18重量%左右，并回收。然后，将回收的浓缩液进一步通过旋转蒸发器等进行减压浓缩，由此除去水，从而得到50重量%左右的尸胺水溶液。接下来，加入等量的氯仿，使尸胺提取至氯仿相中。最后，对此氯仿相进行减压蒸馏（30mmHg、80℃），由此分离出游离的尸胺。
工业实用性
通过本发明，能够在工业上制造尸胺。
[保藏号]
NITE BP-1002
NITE BP-1003
Claims (3)
1.一种尸胺的制造方法，包括培养具有生产尸胺的能力、且对2,2'-硫代双(乙胺)具有抗性的棒状菌群，
所述棒状菌群具有赖氨酸脱羧酶活性，
所述棒状菌群选自由棒状杆菌属和短杆菌属构成的组。
2.根据权利要求1所述的尸胺的制造方法，所述棒状菌群对250mM以上的2,2'-硫代双(乙胺)具有抗性。
3.根据权利要求1或2所述的尸胺的制造方法，所述棒状菌群具有高丝氨酸营养缺陷性和/或S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸抗性。
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