BR112013014197B1 - método para produzir cadaverina - Google Patents
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Abstract
MÉTODO PARA PRODUZIR CADAVERINA. Trata-se de um método inovador para produzir cada verina, em que o método é capaz de produzir cadaverina de modo mais eficiente e a um rendimento mais alto que os métodos de produção pelos métodos de fermentação convencionais. O método para produzir cadaverina inclui cultivar bactéria/bactérias corineforme(s) que têm uma capacidade para produzir cadaverina e que têm uma resistência a 2,2'-tiobis(etilamina). Preferencialmente, a(s) bactéria/bactérias corineforme(s) tem/têm atividade de lisina descarboxilase e, preferencialmente, a(s) bactéria/bactérias corineforme(s) tem/têm auxotrofia de homosserina e/ou uma resistência a S-(2-aminoetil)-L-cisteína.
Description
[001] A presente invenção refere-se a um método para produzir cadaverina com o uso de uma bactéria/bactérias corineforme(s) que tem/têm uma capacidade para produzir cadaverina.
[002] A cadaverina tem estrutura de diamina e é também chamada de 1,5-pentanadiamina, pentametilenodiamina ou similares. Como o interesse recente tem focado na cadaverina como um monômero de material bruto para poliamida, a produção em massa de cadaverina é exigida. Os exemplos conhecidos do método para produzir cadaverina incluem um método de fermentação que usa bactérias corineformes, mais especificamente, um método de produção de cadaverina por fermentação de bactérias corineformes que têm uma capacidade para produzir cadaverina e que têm uma capacidade reforçada para sintetizar lisina que é um precursor da cadaverina (consulte as Literaturas de Patente 1 a 4 e a Literatura de Não Patente 1) e um método de produção de cadaverina por fermentação de bactérias corineformes em que a atividade de lisina descarboxilase é reforçada por aumento do número de cópias do gene de lisina descarboxilase gene (consulte a Literatura de Patente 5).
[003] Literatura de Patente 1: JP 2004-222569 A
[004] Literatura de Patente 2: JP 2002-223770 A
[005] Literatura de Patente 3: WO 2007/113127
[006] Literatura de Patente 4: WO 2008/101850
[007] Literatura de Patente 5: WO 2008/092720
[008] Literaturas de Não Patente
[009] Literatura de Não Patente 1: Stefaine Kind, Metabolic engineering. (2010), Volume 12, páginas 341 a 351.
[010] Um objetivo da presente invenção é criar um processo para produzir cadaverina de modo mais eficaz e a um rendimento mais alto que os métodos de produção de cadaverina por meio de métodos de fermentação convencionais.
[011] Os presentes inventores revelaram que a(s) bactéria/bactérias corineforme(s) que tem/têm uma capacidade para produzir cadaverina e que tem/têm uma resistência a 2,2'-tiobis(etilamina) é/são útil(eis) ωmo bactéria/bactérias de produção de cadaverina, completando assim a presente invenção.
[012] Ou seja, os seguintes (1) a (5) são fornecidos pela presente invenção: (1) Um método para produzir cadaverina, em que o método compreende cultivar bactéria/bactérias corineformes que tem/têm uma capacidade para produzir cadaverina e que tem/têm uma resistência a 2,2'- tiobis(etilamina). (2) O método para produzir cadaverina, de acordo com a (1), em que a(s) bactéria/bactérias corineforme(s) tem/têm uma resistência a 2,2'- tiobis(etilamina) que tem uma concentração de não menos que 250 mM. (3) Método para produzir cadaverina, de acordo com (1) ou (2), em que a(s) bactéria/bactérias corineforme(s) tem/têm atividade de lisina descarboxilase. (4) O método para produzir cadaverina, de acordo com qualquer um dentre (1) a (3), em que a(s) dita(s) bactéria/bactérias corineformes é/são selecionada(s) a partir do grupo que consiste no gênero Corynebacterium e no gênero Brevibacterium. (5) O método para produzir cadaverina, de acordo com qualquer um dentre (1) a (4), em que a(s) bactéria/bactérias corineformes tem/têm auxotrofia de homosserina e/ou uma resistência a S-(2-aminoetil)-L-cisteína.
[013] Pela presente invenção, a cadaverina pode ser produzida de modo mais eficaz e a um rendimento mais alto que os métodos de produção de cadaverina por meios de fermentação convencionais.
[014] Conforme mencionado acima, a(s) bactéria/bactérias corineforme(s) é/são usada(s) na presente invenção. As bactérias corineformes são bacilos gram-positivos aeróbicos e também incluem bactérias que foram previamente classificadas no gênero Brevibacterium, mas foram agora integradas no gênero Corynebacterium (Int. J. Syst., Bacteriol., (1981)41, página 225). As bactérias corineformes também incluem as bactérias que pertencem ao gênero Brevibacterium que é muito próximo ao gênero Corynebacterium.
[015] Os exemplos de tais bactérias corineformes incluem Corynebacterium acetoacidophylum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium alkanolyticum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium lilium, Corynebacterium mellassecola, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium effíciens, Corynebacterium herculis, Brevivacterium divaricatum, Brevivacterium flavum, Brevivacterium immariophiium, Brevivacterium lactofermentum, Brevivacterium roseum, Brevivacterium saccharolyticum, Brevivacterium thiogenitalis, Corynebacterium ammoniagenes, Brevivacterium album, Brevivacterium cerínum e Microbacterium ammoniaphilum.
[016] Os exemplos concretos de cepas das respectivas bactérias corineformes incluem Corynebacterium acetoacidophylum ATCC13870, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806, Corynebacteríum alkanolyticum ATCC21511, Corynebacterium callunae ATCC15991, Corynebacterium glutamicum ATCC13020, ATCC13020 e ATCC13060, Corynebacterium lilium ATCC15990, Corynebacterium mellassecola ATCC17965, Corynebacterium efficiens AJ12340 (n° de acesso FERM BP- 1539), Corynebacterium herculis ATCC13868, Brevivacterium divaricatum ATCC14020, Brevivacterium fiavum ATCC13826, ATCC14067 e AJ12418 (n° de acesso FERM BP-2205), Brevivacterium immariophilum ATCC14068, Brevivacterium lactofermentum ATCC13869, Brevivacterium roseum ATCC13825, Brevivacterium saccharolyticum ATCC14066, Brevivacterium thiogenitalis ATCC19240, Corynebacterium ammoniagenes ATCC6871 e ATCC6872, Brevivacterium album ATCC15111, Brevivacterium cerinum ATCC15112 e Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354.
[017] As bactérias corineformes descritas acima estão disponíveis, por exemplo, Coleção de Cultura do Tipo Americano (ATCC). Ou seja, um número de acesso correspondente é dado a cada cepa em ATCC e descrito no catálogo de ATCC e cada cepa pode ser fornecida por referência a esse número.
[018] Como a(s) bactéria/bactérias corineforme(s) que tem/têm uma capacidade para produzir cadaverina na presente invenção, a(s) bactéria/bactérias corineforme(s) que adquiriu(am) atividade de lisina descarboxilase por introdução externa de um polinucleotídeo que encodifica lisina descarboxilase é/são preferencialmente usada(s). As bactérias corineformes podem produzir cadaverina com o uso de lisina como um material bruto e por descarboxilação da lisina, contanto que as bactérias corineformes tenham atividade de lisina descarboxilase.
[019] A lisina descarboxilase é preferencialmente L-lisina descarboxilase. A origem da lisina descarboxilase não é restrita e os exemplos preferenciais da lisina descarboxilase incluem aquelas derivadas de Bacillus halodurans, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Selenomonas ruminamtium, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Streptomyces coelicolor, Streptomyces pilosus, Eikenella corrodens, Eubacterium acidaminophilum, Salmonella typhimurium, Hafnia alvei, Neisseria meningitidis, Thermoplasma acidophilum e Pyrococcus abyssi. A lisina descarboxilase é mais preferencialmente aquela derivada de E. coli cuja segurança foi confirmada. As sequências de aminoácido e as sequências de bases que codificam as mesmas dessas lisinas descarboxilases (doravante também referidas como "LDC") são registradas em uma base de dados (GenBank). Por exemplo, a sequência de bases do gene de LDC derivado de E. coli que pode ser preferencialmente empregada na presente invenção é registrada sob o n° de Acesso do GenBank M76411.
[020] As sequências de ácidos nucleicos do gene que encodifica a lisina descarboxilase usadas na presente invenção podem ser projetadas novamente em consideração ao uso de códon da(s) bactéria/bactérias corineforme(s) usada(s). Conforme mencionado acima, o gene da lisina descarboxilase derivado de cada organismo descrito acima é registrado em uma base de dados (GenBank) e a sequência de bases de cada gene de LDC pode ser facilmente encontrada por execução de uma pesquisa com o uso do nome do organismo e a lisina descarboxilase como as palavras-chave.
[021] Adicionalmente ao gene de LDC de ocorrência natural de cada espécie de organismo mencionada acima, o gene que encodifica lisina descarboxilase também inclui polinucleotídeos cujas sequências de bases são as mesmas que as sequências de bases respectivas do gene de LDC de ocorrência natural exceto aquela em que diversas bases são substituídas, deletadas, inseridas e/ou adicionadas, contanto que suas funções sejam mantidas. O termo “diversos” no presente documento normalmente 1 a 40, preferencialmente cerca de 1 a 30, mais preferencialmente cerca de 1 a 20, de modo preferencialmente especial cerca de 1 a 10, de preferência máxima cerca de 1 a 5. Ademais, os exemplos do gene que encodifica a lisina descarboxilase incluem o polinucleotideo que inteira ou parcialmente se hibridiza com o polinucleotideo que constitui o gene ou com filamentos complementares do mesmo sob condições rigorosas, contanto suas funções sejam mantidas. O termo “polinucleotideo que se hibridiza sob condições rigorosas” no presente documento significa uma sequência de ácidos nucleicos que se hibridiza com uma sonda (s) que tem uma ou mais sequências de ácidos nucleicos, cada um tendo pelo menos 20, preferencialmente 25, mais preferencialmente pelo menos 30 sequências contínuas arbitrariamente selecionadas da sequência de bases original, quando uma técnica de hibridização conhecida (Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausbel et al., (1987) Publish. John Wily & Sons Seção 6.3 a 6.4) ou similar é aplicada. As condições rigorosas no presente documento podem ser atingidas, por exemplo, por realização de hibridização na presença de 50% de formamida a uma temperatura de 37 °C, a 42 °C para condição mais rigorosa ou a 65 °C para condições ainda mais rigorosas, seguidas por lavagem com 0,1 x a 2 x de solução de SSC (composição de 1 x solução de SSC: cloreto de sódio de 150 mM, citrato de sódio de 15 mM). O polinucleotideo que encodifica a lisina descarboxilase pode ser um polinucleotideo que tem uma identidade de sequência de normalmente não menos que 85%, preferencialmente não menos que 90%, mais preferencial mente não menos que 95%, ainda mais preferencialmente não menos que 99% à sequência original, contanto que as funções sejam mantidas. O termo "identidade de sequência" no presente documento significa o valor calculado por alinhamento das duas sequências de modo que o número de bases correlacionadas entre as duas sequências de bases é o máximo (um vão(s) é(são) inserido conforme necessário) e por divisão do número de bases correlacionadas pelo número de bases total. Nos casos em que os números de bases entre as duas sequências são diferentes, o número de bases correlacionadas é dividido pelo número de bases da sequência mais longa. Um software que calcula a identidade de sequência é bem conhecido e livremente disponível na Internet. O gene que encodifica lisina descarboxilase pode ser obtido ou de um organismo outro que o hospedeiro original ou submetendo um gene obtido do hospedeiro original para mutagênese in vitroou mutagênese direcionada por sítio, que é bem conhecida por aqueles versados na técnica.
[022] Nos casos em que o gene que encodifica uma lisina descarboxilase (doravante também referida como “gene de lisina descarboxilase” ou “gene de LDC”, mas o gene não é restrito a um gene de ocorrência natural conforme descrito acima) é introduzido na(s) bactéria/bactérias corineforme(s), o gene de lisina descarboxilase pode ser detido em um plasmídeo mantido fora do cromossomo da(s) bactéria/bactérias corineforme(s) ou pode ser incorporado e detido no cromossomo da(s) bactéria/bactérias corineforme(s).
[023] Nos casos em que o gene de lisina descarboxilase é incorporado no cromossomo da(s) bactéria/bactérias corineforme(s), o gene de lisina descarboxilase pode ser introduzido no cromossomo da(s) bactéria/bactérias corineforme(s) com o uso de transposon e por recombinação homóloga ou pela capacidade de transposição do próprio transposon. A construção e a conformação da sequência de gene a ser introduzida são executadas de acordo com técnicas biológicas moleculares bem conhecidas por aqueles versados na técnica e um pode se referir a, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Clonig: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I e II (D. N. Glovered. 1985); F. M. Ausubel et al. (eds), Current Protocols in Molecular Biology (1994) John Wiley & Sons, Inc.; e PCR Technology: Principles and Application for DNA Amplication, H. Erlich, ed., Stockton Press, ou similares.
[024] O método de introdução do construto de gene na(s) bactéria/bactérias corineforme(s) não é restrito e o construto de gene pode ser introduzido pelo método de protoplasto (Gene, (1985), 39, páginas 281 a 286), método de eletroporação (Bio/Technology, (1989), 7,1.067 a 1.070) ou similares.
[025] A(s) bactéria/bactérias corineforme(s) em que um gene de LDC estranho é introduzido e que tem/têm uma capacidade para produzir cadaverina é/são conhecida(s) conforme descrito em, por exemplo, Literatura de Patente 1 (consulte o Exemplo de Referência abaixo).
[026] Em seguida, a(s) bactéria/bactérias corineforme(s) que tem/têm uma resistência a 2,2'-tiobisetilamina será(ão) agora descrita(s) concretamente.
[027] A 2,2'-tiobisetilamina é um composto químico alcalino forte representado pela fórmula estrutural: NH2-(CH2)2-S-(CH2)2-NH2. Na presente invenção, que tem uma resistência a 2,2'-tiobisetilamina significa que a(s) bactéria/bactérias tem/têm uma propriedade de proliferação mais rápida que a cepa do tipo selvagem em um meio que contém 2,2'-tiobisetilamina. Especificamente, embora a cepa do tipo selvagem não possa formar colônias em um meio de placa que contém 2,2'-tiobisetilamina que tem uma concentração de não menos que 200 mM, sendo que a cepa forma uma colônia duas ou três dias após pode ser julgada como tendo uma resistência a 2,2'-tiobisetilamina. A concentração de tiobisetilamina na qual a(s) bactéria/bactérias corineforme(s) tem/têm uma resistência em um meio de placa não é restrita e a concentração da mesma é preferencialmente não menor que 250 mM, mais preferencialmente não menor que 300 mM, ainda mais preferencialmente não menor que 400 mM.
[028] O meio que contém 2,2'-tiobisetilamina, para avaliar uma resistência de bactéria/bactérias corineforme(s), a 2,2'-tiobisetilamina não é restrita contanto o mesmo seja um meio em que a(s) bactéria/bactérias corineforme(s) pode(m) ser cultivada(s) e o meio é preferencialmente um meio mínimo ao qual um aminoácido ou similar não θ adicionado e mais preferencialmente um meio mínimo mostrado na Tabela 1-
[029] O método para gerar uma resistência a 2,2'-tiobisetilamina em bactéria/bactérias corineforme(s) não é restrito e, Por exemplo, o método pode ser um que cause alguma mutação no cromossomo da cepa progenitora. Os exemplos da técnica que introduz uma mutação no cromossomo incluem um método para introduzir uma mutação por irradiação de UV, laser ou similares e um método que usa um agente mutagênico tal como etanossulfonato de metila (EMS), nitrosoguanidina (NTG), 4-dimetilaminobenzenodiazossulfonato de sódio (DAPA). Uma mutação natural ocorrida na cultura de bactéria/bactérias corineforme(s) pode ser também usada. Como o método para fornecer bactéria/bactérias corineforme(s) que tem/têm uma capacidade para produzir cadaverina e que tem/têm uma resistência a 2,2'-tiobisetilamina, a resistência pode ser gerada na bactéria/bactérias corineforme(s) que tem/têm uma capacidade para produzir cadaverina, ou conforme mencionado acima, a capacidade de produzir cadaverina pode ser gerada na bactéria/bactérias corineforme(s) a qual a resistência foi gerada. O tratamento por mutagênese descrito acima pode ser executado sob condições bem conhecidas usadas em tratamentos por mutagênese de micro-organismo. Por exemplo, no caso de irradiação de UV, a dose de radiação depende da distância da fonte de luz e a irradiação é usualmente executada por 10 segundos a 30 minutos. No caso do tratamento com o agente de mutação descrito acima tal como NTG, a concentração do agente de mutação durante o tratamento é, por exemplo, 100 pg/ml a 2 pg/ml, preferencialmente 300 pg/ml a 1,3 pg/ml, e o tratamento pode ser executado em um meio de cultura que tem essa concentração, por exemplo, por 12 horas a 48 horas.
[030] Após tal tratamento por mutagênese, a(s) bactéria/bactérias corineforme(s) que tem/têm uma resistência a 2,2'-tiobisetilamina pode(m) ser obtida(s) por cultivo da(s) bactéria/bactérias corineforme(s) tratada(s) no meio descrito acima para avaliar uma resistência a 2,2-tiobisetilamina, e por triagem de uma cepa(s) que adquiriu(am) a resistência a 2,2'-tiobisetilamina. Conforme descrito concretamente nos Exemplos abaixo, uma pluralidade de cepas que adquiriram uma resistência a 2,2-tiobisetilamina é obtida pelo tratamento com NTG, que claramente mostra que as cepas que têm uma resistência a 2,2'- tiobisetilamina podem ser produzidas de modo reprodutivo pelo tratamento por mutagênese.
[031] Além disso, a(s) bactéria/bactérias corineforme(s) usada(s) na presente invenção é/são preferencialmente mutante(s) que tem/têm uma capacidade aprimorada para produzir lisina. Como o mutante que tem uma capacidade aprimorada para produzir lisina, por exemplo, o mutante cuja inibição de retroalimentação é realçada por L-lisina ou L-treonina pode ser usado. Os exemplos do método para obter tais mutantes incluem, por exemplo, um método para obter o mutante dentre mutantes que são selecionados com o uso de uma resistência a S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC) como indícios após a execução do mesmo procedimento de mutagênese para cepa do tipo selvagem como a modalidade acima e que adquiriu uma capacidade para produzir L-lisina (consulte a Literatura de Patente 1). Se a bactéria/bactérias tem/têm uma resistência a AEC ou não pode ser julgado por se a bactéria/bactérias se prolifera(s) ou não após o cultivo da bactéria/bactérias em um meio de ágar mínimo que contém 50 pg/ml de AEC a 30 °C por 24 horas conforme descrito na Literatura de Patente 1.
[032] Alternativamente, o método mais preferencial para gerar a cepa do tipo selvagem com uma resistência a AEC é um método que usa um método de modificação genética. O método que usa um método de modificação genética não é restrito e os exemplos do mesmo incluem, por exemplo, um método que usa um DNA recombinante que é replicável em bactérias corineformes ou um método pelo qual o gene desejado no cromossomo é recombinado por recombinação homóloga. Por exemplo, uma resistência a S-(2- aminoetil)-L-cisteína pode ser adquirida tendo-se um gene aspartoquinase mutante em que o 311o resíduo de aminoácido é substituído por um aminoácido outro que Ter na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 14 (o gene pode ser doravante referido como “gene de AK do tipo dessensibilizado”). O método de modificação genética mais preferencial é um método pelo qual o gene de AK no cromossomo da bactéria corineforme é recombinado com o gene de AK do tipo dessensibilizado por recombinação homóloga. Além disso, as técnicas bem conhecidas para introduzir a mutação desejada ao gene de AK (por exemplo, mutagênese direcionada por sítio) podem ser usadas para o gene de AK do tipo dessensibilizado e um kit para o mesmo comercialmente disponível.
[033] Os exemplos do mutante que tem uma capacidade aprimorada para produzir lisina incluem um mutante auxotrófico por homosserina adicionalmente ao mutante resistente a AEC. Embora a cepa do tipo selvagem não tenha auxotrofia de homosserina, os exemplos do método para obter a cepa auxotrófica por homosserina incluem um método para obter a cepa a partir de mutantes que são selecionados pelo uso de auxotrofia de homosserina como índices, por exemplo, após a execução do mesmo procedimento de mutagênese para a cepa do tipo selvagem conforme a modalidade acima e que adquiriu uma capacidade para produzir L-lisina; e um método para fazer a atividade de homosserina desidrogenase de bactérias corineformes ser deficiente por um método de modificação genética (Literatura de Patente 1).
[034] Os Exemplos do método mais preferencial para gerar auxotrofia de homosserina de cepa do tipo selvagem incluem um método para fazer a atividade de homosserina desidrogenase ser deficiente por inserção de outro gene no gene de homosserina desidrogenase no cromossomo (doravante referido como “gene de HOM” para abreviação) por recombinação homóloga. O outro gene não é restrito e preferencialmente um gene de LDC e um cassete que compreende o gene de LDC e um promotor que pode expressar o gene constitutivamente na cepa do tipo selvagem é mais preferencial.
[035] Na presente invenção, a cadaverina é produzida por cultura de bactéria/bactérias corineforme(s) que tem/têm uma capacidade para produzir a cadaverina e que tem/têm uma resistência a 2,2'- tiobisetilamina. Os exemplos do método de cultura incluem cultura a batelada, cultura de batelada alimentada e cultura contínua. Nos casos de cultura contínua, a cultura contínua é preferencialmente executada por um método conhecido conforme descrito em JP 2008-104453 A.
[036] Como um meio de cultura para produzir cadaverina, um meio de nutriente normal que compreende uma fonte de carbono assimilável, fonte de nitrogênio, sal inorgânico e/ou similar pode ser usado. Os exemplos da fonte de carbono que podem ser usados incluem sacarídeos tais como glicose, frutose, sacarose, maltose e hidrolisados de amido; álcoois tais como etanol; e ácidos orgânicos tais como ácido acético, ácido láctico e ácido succínico. Os exemplos da fonte de nitrogênio que podem ser usados incluem amónia; sais de amónio inorgânicos e orgânicos tais como cloreto de amónio, sulfato de amónio, carboneto de amónio e acetato de amónio; compostos que contêm nitrogênio tais como ureia; e substâncias orgânicas que contêm nitrogênio tais como extratos de carne, extratos de levedura, licor de milhocina e hidrolisados de feijâo-soja. Os exemplos do sal inorgânico que podem ser usados incluem fosfato diidrogenado de potássio, fosfato hidrogenado de dipotássio, sulfato de amónio, cloreto de sódio, sulfato de magnésio e carbonato de cálcio. Ademais, conforme necessário, micronutrientes tais como biotina, tiamina, vitamina B6 e similares podem ser adicionados. Aditivos de meio tais como extratos de carne, extratos de levedura, licor de milhocina, casaminoácidos e similares podem ser usados como alternativas a esses micronutrientes.
[037] A lisina que é um precursor da cadaverina pode ser preliminarmente adicionada ao meio de cultura. Nos casos em que a lisina é preliminarmente adicionada ao meio de cultura, a lisina é incorporada em bactéria/bactérias corineforme(s) e a lisina é usada como um substrato e convertida em cadaverina pela lisina descarboxilase, de modo que a eficácia de produção de cadaverina possa ser acentuada. Nos casos em que a lisina é preliminarmente adicionada ao meio de cultura, a concentração de lisina no meio de cultura não é restrita e a concentração de lisina é preferencialmente uma em que a proliferação da(s) bactéria/bactérias corineforme(s) não é adversamente afetada e a lisina descarboxilase não é inibida. Mais concretamente, a concentração é preferencialmente 0,01 a 2 M.
[038] A lisina a ser adicionada é preferencialmente L-lisina. A lisina a ser adicionada pode estar ou na forma livre ou ser um sal de lisina e preferencialmente um sal de lisina. O sal de lisina é preferencialmente cloridrato de lisina ou um dicarboxilato de lisina derivado do ácido dicarboxílico descrito adiante. Os exemplos concretos preferenciais de dicarboxilato de lisina incluem adipato de lisina, sebacato de lisina, 1,12- dodecanodicarboxilato de lisina, succinato de lisina, isoftalato de lisina e tereftalato de lisina e os exemplos concretos mais preferenciais de dicarboxilato de lisina incluem adipato de lisina.
[039] As condições de cultura não são restritas e a cultura é executada sob condições aeróbicas, por exemplo, com tremulação ou por cultura com agitação por aeração profunda. A temperatura da cultura é em geral 25 °C a 42 °C, preferencialmente 28 °C a 38 °C. O período de cultura é normalmente de 1 a 6 dias.
[040] Nos casos em que o pH da cultura é ajustada para alcalino, a amónia é preferencialmente usada e nos casos em que o pH da cultura é ajustado para ácido, ácido clorídrico ou ácido dicarboxílico é preferencialmente usado e o ácido dicarboxílico é mais preferencialmente usado. É preferencial usar o neutralizador para controlar o pH da cultura em 5 a 8, mais preferencialmente 6,5 a 7,5. O estado do neutralizador não é restrito e o neutralizador pode ser usado como um gás, líquido, sólido ou uma solução aquosa. O neutralizador é de modo preferencialmente especial uma solução aquosa.
[041] O ácido dicarboxílico a ser preferencialmente usado como o neutralizador não é restrito e o ácido dicarboxílico é preferencialmente um ácido dicarboxílico que não tem substancialmente nenhum grupo funcional outro que os dois grupos de carboxila descritos acima. O grupo funcional no presente documento significa um grupo reativo que reage, durante a reação de polimerização de poliamida (sob condições de reação em que, por exemplo, a temperatura de reação é 250 °C a 270 °C, a pressão é 10 a 20 kg/cm2 e o tempo de reação é 1 a 5 hora(s)), com um grupo de amino ou grupo de carboxila para causar a ramificação do polímero ou redução no grau de cristalinidade do polímero (a um grau de cristalinidade de não mais que 80%). Os exemplos do grupo funcional incluem o de amino e grupo de carboxila e outros exemplos do grupo funcional incluem grupos ácidos (por exemplo, o grupo de ácido sulfônico, grupo de fosfato e grupo de hidroxila fenólica), grupos básicos (por exemplo, o grupo de hidrazino), grupos polares protônicos (por exemplo, o grupo de hidroxila), grupos cliváveis (por exemplo, o grupo de epóxi e grupo de peróxido) e outros grupos altamente reativos (por exemplo, grupo de isocianato). Por outro lado, substituintes de halogênio, substituintes aromáticos, grupos de éter, grupos de éster, grupos de amida e similares não estão incluídos no grupo funcional na presente descrição já que sua reatividade é baixa.
[042] O ácido dicarboxílico é mais preferencialmente um ácido dicarboxílico representado pela Fórmula Geral (1), (2) ou (3) abaixo.
(em que na Fórmula Geral (1), m = 0 a 16).
(em que na Fórmula Geral (2), n, o = 0 a 16). 
(em que na Fórmula Geral (3), p, q = 0 a 16).
[043] O ácido dicarboxílico é ainda mais preferencialmente ácido adípico, ácido sebácico, ácido 1,12-dodecanodicarboxílico, ácido succínico, ácido isoftálico ou ácido tereftálico.
[044] A cadaverina no meio de cultura sai no estado livre ou como um sal de cadaverina (esses são coletivamente referidos como “cadaverina” na presente invenção). A fim de coletar cadaverina no meio de cultura, a(s) bactéria/bactérias corineforme(s) é/são primeiramente removida(s) do meio de cultura. Nesse caso, a(s) bactéria/bactérias corineforme(s) e sobrenadante de cultura podem ser separados (o método para separar a(s) bactéria/bactérias é precipitação, centrifugação ou separação por filtração de membrana) após a(s) bactéria/bactérias proliferar(em) e a fermentação prossegue bem ou a bactéria/bactérias pode(m) ser separada(s), detida(s) ou imobilizada(s) com o uso de suporte ou similar a partir do começo. O método para coletar cadaverina do meio de cultura do qual a(s) bactéria/bactérias foi/foram removida(s) e que contém cadaverina é bem conhecido por si e a cadaverina pode ser coletada como dicarboxilato de cadaverina por cristalização conforme descrito em JP 2009- 207495 A. Alternativamente, a cadaverina na forma livre pode ser purificada e coletada com o uso de uma membrana NF conforme descrita em JP 2009- 29872 A. Alternativamente, a cadaverina na forma livre pode ser coletada por extração com um solvente orgânico polar e por destilação conforme descrito em JP 2009-28045 A.
[045] A presente invenção será agora descrita em detalhes por meio de Exemplos e Exemplos Comparativos.
[046] Método de Análise de Concentrações de Cadaverina e Lisina por HPLC.
[047] A 25 pl da amostra a ser analisada, 25 pl de 1,4- diaminobutano (0,03 M), 150 pl de hidrocarbonato de sódio (0,075 M) e uma solução de 2,4-dinitrofluorobenzeno (0,2 M) em etanol foram adicionados e a mistura resultante foi misturada e incubada a 37 °C por 1 hora. Uma alíquota de 50 pl da solução de reação acima foi dissolvida em 1 ml de acetonitrila e a solução resultante foi centrifugada a 10.000 rpm por 5 minutos, seguida por submissão de 10 pl do sobrenadante à análise de HPLC.
[048] Coluna usada: CAPCELL PAK C18 (Shiseido)
[049] Fase móvel: 0,1% (p/p) de solução de fosfato aquoso: acetonitrila = 4,5:5,5
[050] Detecção: UV 360 nm
[051] Preparação de Corynebacterium glutamicumque tem Atividade de Descarboxilação de L-lisina e que é deficiente em Atividade de Homosserina Desidrogenase (cepa TR-CAD1) (Literatura de Patente 1).
[052] O gene correspondente à região de 300 aminoácidos do N- terminal foi clonado para fazer a atividade de HOM ser deficiente.
[053] Por referência à sequência de bases do gene HOM gene (n° de Acesso BA000036) registrada na base de dados (GenBank), os iniciadores de oligonucleotídeo 5'-gaagaattctaaacctcagcatctgcccc-3' (SEQ ID NO:1) e 5'- gaaggatccaaaggacttgtttaccgacgc-3' (SEQ ID NO:2) foram sintetizados. Em um tubo de microcentrífuga de 0,2 ml, 0,2 pl de uma solução de DNA genômico preparada de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 de acordo com um método convencional como um modelo de amplificação foi colocado e cada reagente foi adicionado ao tubo de modo que a mistura resultante, em um volume total de 50 pl, contivesse cada iniciador 20 pmol, tampão de Tris-HCI pH 8,0 (20 mM), cloreto de potássio (2,5 mM), gelatina (100 pg/ml), cada dNTP (50 pM) e LA Taq DNA polimerase (2 unidades) (fabricada pela Takara Shuzo Co., Ltd.). A reação de cadeia de polimerase (doravante referida como PCR) foi executada com o uso de um ciclador térmico fabricado pela BioRad sob a condição de 30 ciclos de: desnaturação de DNA a 94 °C por 30 segundos, anelação dos iniciadores a 55 °C por 30 segundos e reação de extensão dos iniciadores de DNA a 72 °C por 3 minutos. A PCR no presente Exemplo de Referência foi executada sob as condições acima a não ser que especificado de outro modo. O produto obtido por essa PCR foi submetido à eletroforese em 1% de agarose e um fragmento de DNA de cerca de 0,9 kb contendo o gene HOM foi excisado do gel, seguido por ser purificado com o uso do kit Geneclean (fabricado pela BIO 101 Inc.). Esse fragmento foi digerido com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI e o fragmento EcoRI-BamHI de 0,9 kb obtido foi inserido no vão EcoRI/BamHI de pHSG298 (fabricado pela Takara Shuzo Co., Ltd.) que foi preliminarmente digerido com EcoRI e BamHI, com o uso do kit Ligation Ver. 1 (fabricado pela Takara Shuzo Co., Ltd.). O plasmídeo obtido foi designado pHOM1.
[054] Primeiramente, o promotor do gene resistente a canamicina foi clonado como um promotor para expressão constitucional de LDC em Corynebacterium glutamicum.
[055] Por referência à sequência de bases de pHSG299 (n° de Acesso M19415) registrada na base de dados (GenBank), os iniciadores de oligonucleotídeo 5'-gaaccgcggcctgaatcgccccatcatcc-3' (SEQ ID NO:3) e and5'- gaaccatggccccttgtattactg-3' (SEQ ID NO:4) foram sintetizados. Com o uso do plasmídeo pHSG299 como um modelo de amplificação e os oligonucleotídeos (SEQ ID NO:3) (SEQ ID NO:4) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi executada para obter um produto, que foi então submetido à eletroforese em 1,0% de gel de agarose. Um fragmento de DNA de 0,3 kb contento a região promotora do gene resistente a canamicina foi excisado do gel e foi purificado com o uso o kit Geneclean. Esse fragmento foi inserido no vão no vetor de plasmídeo pT7blue (fabricado pela Novagen) com o uso de kit Ligation Ver. 1, cujo vão foi preparado por digestão do vetor com EcoRV e adição da base T à extremidade 3'. Entre os plasmídeos obtidos, o plasmídeo que se tornou um único fragmento de 3,2 kb após a digestão com enzimas de restrição Hind\\\ e Sacll foi designado pKMP1.
[056] Sendo assim, o gene LDC foi clonado. Por referência à sequência de bases do gene LDC (n° de Acesso M19415) registrada na base de dados (GenBank), os iniciadores de oligonucleotídeo 5’-gaaccatggacgttattgcaa- 3' (SEQ ID NO:5) e 5'-gaaccgcggttattttttgctttcttcttt-3' (SEQ ID NO:6) foram sintetizados. Com o uso de uma solução de DNA genômico de Escherichia coli ATCC10798 de acordo com um método convencional como um modelo de amplificação e os oligonucleotídeos (SEQ ID NOs:5) (SEQ ID NOs:6) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi executada para obter um produto, que foi então submetido à eletroforese em 1,0% de gel de agarose. Um fragmento de DNA de 2,1 kb contendo o gene LDC foi excisado do gel e foi purificado com o uso de kit Geneclean. Esse fragmento foi inserido no vão no vetor de plasmídeo pT7blue com o uso de kit Ligation Ver. 1, cujo vão foi preparado por digestão do vetor com EcoRV e adição da base T à extremidade 3'. Entre os plasmídeos obtidos, o plasmídeo que se tornou um único fragmento de 4,0 kb após a digestão com Hind\\\ e Nco\ foi designado pCADA.
[057] Finalmente, pKMP1 foi digerido com /-//ndlll e Nco\ e o produto obtido foi submetido a eletroforese em 1,2%de gel agarose. Um fragmento de DNA de 0,3 kb contento a região promotora do gene resistente a canamicina foi excisado do gel e foi purificado com o uso o kit Geneclean. O fragmento Hind\\\-Nco\ assim obtido foi inserido no vão Hind\\\INco\ de pCADA que foi preliminarmente digerido com /-//ndlll e A/col, com o uso do kit Ligation Ver. 1. O plasmídeo obtido foi designado pTM100.
[058] pTM100 foi digerido com Sacll e o produto obtido foi submetido a eletroforese em 1,0% de gel agarose. Um fragmento de DNA de 2,4 kb contendo o cassete de expressão de LDC foi excisado do gel e foi purificado com o uso de kit Geneclean. O fragmento Sacll assim obtido foi inserido no vão Sacll de pHOM1 que foi preliminarmente digerido com Sacll, com o uso do kit Ligation Ver. 1. O plasmídeo obtido foi designado pTM101.
[059] O plasmídeo pTM101 foi introduzido no Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (doravante referido como cepa ATCC13032 para abreviação) por eletroporação [FEMS Microbiology Letters, 65, página 299 (1989)] e submetido à seleção em meio de ágar LB (triptona (10 g/l) (fabricado por Bacto), extrato de levedura (5 g/l) (fabricado por Bacto), cloreto de sódio (10 g/l)) suplementado com canamicina (25 pg/ml).
[060] A partir do transformante assim selecionado, uma solução de DNA genômico foi preparada de acordo com um método convencional. Com o uso desse DNA genômico como um modelo e os oligonucleotídeos (SEQ ID NO:5) (SEQ ID NO:6) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi executada para obter um produto, que foi então submetido à eletroforese em 1,0% de gel de agarose. Como resultado, uma única banda de 2,1 kb foi observada. Por isso, pode ser confirmado que o transformante selecionado tem o gene LDC inserido no local de HOM. Esse transformante foi designado Corynebacterium glutamicum TR-CAD1 (doravante referido como cepa TR-CAD1 para abreviação).
[061] Foi confirmado que a cepa 13032 não tinha atividade de LDC, enquanto a cepa TR-CAD1 teve atividade de LDC. A cepa 13032 teve atividade de HOM, enquanto a cepa TR-CAD1 foi deficiente em atividade de HOM. A cepa 13032 não mostrou auxotrofia de homosserina, enquanto a cepa TR-CAD1 mostrou auxotrofia de homosserina. Assim, a cepa de Corynebacterium glutamicum TR-CAD1 que tem atividade de LDC e que é deficiente em atividade de HOM (auxotrofia de homosserina) foi preparada.
[062] Preparação de Corynebacterium glutamicum que tem Atividade de Descarboxilação de L-lisina, Auxotrofia de Homosserina e Resistência a S-(2-aminoetil)-L-Cisteína (cepa TR-CAD2) (Literatura de Patente 1)-
[063] O gene de AK foi clonado para preparar gene de AK do tipo dessensibilizado por introdução de uma mutação no gene de AK.
[064] Por referência à sequência de bases do gene de AK (n° de Acesso BA000036) registrada na base de dados (GenBank), os iniciadores de oligonucleotídeo 5'-acagaattcgtggccctggtcgtacagaa-3' (SEQ ID NO:7) e 5'- catctcgagttagcgtccggtgcctgcat-3' (SEQ ID NO:8) foram sintetizados. Com o uso de uma solução de DNA genômico de Corynebacterium glutamicumATCC13032 de acordo com um método convencional como um modelo de amplificação e os oligonucleotídeos (SEQ ID NO:7) (SEQ ID NOs:8) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi executada para obter um produto, que foi então submetido à eletroforese em 1,0% de gel de agarose. Um fragmento de DNA de 1,3 kb contendo o gene de AK foi excisado do gel e foi purificado com o uso de kit Geneclean. Esse fragmento foi digerido com EcoRI e Xho\e o fragmento EcoRI- Xho\ de 1,3 kb obtido foi inserido no vão EcoR\/Xho\ de pHSG396 (fabricado pela Takara Shuzo Co., Ltd.) que foi preliminarmente digerido com EcoRI e Xho\, com o uso do kit Ligation Ver. 1. O plasmídeo obtido foi designado pAK1.
[065] Os iniciadores de oliconucleotídeo 5'-cgacatcatcttcacctgcc- 3' (SEQ ID NO:9) e 5'-ggcaggtgaagatgatgtcg-3' (SEQ ID NQ:10) foram sintetizados para mutação do 931° ao 933° (Tre) do gene de AK clonado em atg (lie). O plasmídeo obtido com o uso do Kit de Mutagênese Direcionada por Sítio QuikChange (fabricado pela Stratagene Corporation), pAK1 como um modelo de amplificação e os oliconucleotídeos (SEQ ID NO:9) (SEQ ID NQ:10) como um conjunto de iniciadores foi designado pTM102. O gene de AK no pTM102 foi sequenciado de acordo com um método convencional para confirmar que o 931° ao 933° acc (Tre) sofreu mutação em atg (He) conforme pretendido e o gene de AK do tipo dessensibilizado foi preparado.
[066] Por referência à sequência de bases de pFK398 (n° de Acesso D29826) registrada na base de dados (GenBank), os iniciadores de oligonucleotídeo 5'-acggtcgactcgcagaataaataaatcctggtg-3' (SEQ ID NO:11) e 5'- atgaggcctgagaggcggtttgcgtattgga-3' (SEQ ID NO: 12) foram sintetizados.
[067] O plasmídeo pTM102 foi introduzido na cepa TR-CAD1 por eletroporação e submetido à seleção em meio de ágar LB suplementado com canamicina (25 pg/ml) e cloramfenicol (10 pg/ml).
[068] A partir do transformante assim selecionado, uma solução de DNA genômico foi preparada de acordo com um método convencional. Com o uso desse DNA genômico como um modelo e os oligonucleotídeos (SEQ ID NO:11) (SEQ ID NO: 12) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi executada para obter um produto, que foi então submetido à eletroforese em 1,0% de gel de agarose. Como resultado, uma única banda de 1,0 kb foi observada. Por isso, pode ser confirmado que o transformante selecionado tem o gene resistente a cloramfenicol inserido no local de AK. Esse transformante foi designado Corynebacterium glutamicum TR-CAD2 (doravante referido como cepa TR- CAD2 para abreviação).
[069] Por referência à sequência de bases do gene de AK (n° de Acesso BA000036) registrada na base de dados (GenBank), o iniciador de oligonucleotídeo 5'-ttggaacgcgtcccagtggc-3' (SEQ ID NO: 13) em uma região de 0,1 kb a montante do N-terminal do AK foi sintetizado.
[070] Uma solução de DNA genômico foi preparada a partir da cepa TR-CAD2 de acordo com um método convencional. Com o uso desse DNA genômico como um modelo e os oligonucleotídeos (SEQ ID NO:12) (SEQ ID NO: 13) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi executada para obter um produto, que foi então submetido à eletroforese em 1,0% de gel de agarose. Um fragmento de DNA de 3,1 kb contento o gene de AK e o gene resistente a cloramfenicol foram excisados do gel e foram purificados com o uso o kit Geneclean. Esse fragmento foi inserido no vão no vetor de plasmídeo pT7blue com o uso de kit Ligation Ver. 1, cujo vão foi preparado por digestão do vetor com EcoRV e adição da base T à extremidade 3'. O plasmídeo obtido foi designado pAK2. O gene de AK no pAK2 foi sequenciado de acordo com um método convencional para confirmar que a mutação pretendida foi incluída. Sendo assim, podería ser confirmado que o gene de AK do tipo dessensibilizado capaz de ser expresso no cromossomo foi introduzido na cepa TR-CAD2. Assim, a cepa de Corynebacterium glutamicum(cepa TR-CAD2) que tem atividade de LDC, que é deficiente em atividade de HOM (auxotrofia de homosserina) e que tem resistência a AEC foi preparada.
[071] Obter Bactérias Corineformes que têm Capacidade para produzir Cadaverina e Resistência a 2,2'-Tiobis(etilamina)
[072] O Corynebacterium glutamicum (cepa TR-CAD1) obtido que tem atividade de L-lisina descarboxilase e que se tornou um mutante auxotrófico por homosserina fazendo a atividade de homosserina desidrogenase ser deficiente e Corynebacterium glutamicum (cepa TR-CAD2) que tem atividade de L-lisina descarboxilase, que se tornou um mutante auxotrófico por homosserina fazendo a atividade de homosserina desidrogenase ser deficiente e que te resistência a S-(2-aminoetil)-L-cisteína (resistência a AEC) conforme descrito acima foram, cada um, pré-cuItivados em 5 ml de meio líquido BHI (Brain Heart Infusion) da noite para o dia. Em um novo meio líquido BHI, 2,5 ml do meio de pré-cultura obtido foi inoculado e as cepas foram cultivadas até a turvação (A600) alcançar 1 a 2. Após a cultura, as bactérias foram lavadas com tampão de Tris- maleato duas vezes e as bactérias lavadas foram suspensas em 12 ml de tampão de Tris-maleato. Foram retiradas alíquotas da suspensão obtida em volumes de 900 pl para tubos de teste e 640 pg/ml de soluções NTG são adicionados a cada tubo de teste. A mistura obtida foi agitada vigorosamente a 30 °C por 40 minutos e suspensa em 2 ml de meio BHI e resfriada em gelo. A suspensão obtida foi lavada com tampão de Tris-maleato duas vezes, 50 ml de meio BHI foram adicionados a mesma e o resultante foi cultivado a 28 °C da noite para o dia. O meio de cultura foi lavado com tampão de Tris-maleato duas vezes e após a cultura em meios mostrados na Tabela 1 por 2 a 3 dias, a tais meios 2,2-tiobisetilamina em uma concentração de 180 mM, 220 mM, 250 mM, 300 mM e 400 mM foram adicionados, as bactérias que formaram as colônias foram obtidas como cepas resistentes a 2,2'-tiobisetilamina e cada cepa foram designadas cepas TR-CADA1-C, TR-CADA1-0 a 6, cepas TR-CADA2-C, TR- CADA2-0 a 6 (Tabela 2). Além disso, foi confirmado que as cepas resistentes obtidas foram cultivadas por 3 dias no meio do qual as cepas resistentes descritas acima foram obtidas e colônias foram formadas, ou seja, resistência a 2,2'-tiobisetilamina foi gerada nas cepas.
[073] Cepa TR-CADA1-6 e cepa TR-CADA2-5 foram depositadas no instituto Nacional de Tecnologia e Avaliação (NITE) sob o n° de acesso NITE BP-1002 e NITE BP-1003, respectivamente.
[074] As fermentações de cadaverina foram executadas com o uso das cepas TR-CADA1-1 a 6 (Exemplo 2), TR-CADA2-1 a 6 (Exemplo 3), cepa TR-CADA1 (Exemplo Comparativol), cepa TR-CADA1-0 (Exemplo Comparativo 2), TR-CADA2 (Exemplo Comparativo 3), TR-CADA2-0 (Exemplo Comparativo 4). Em 5 ml de meio BHI esterilizado, um laço de platina de cada cepa foi inoculado e a pré-precultura foi executada a 30 °C por 24 horas com agitação. O volume inteiro da pré-precultura obtida foi inoculado em 50 ml do mesmo meio como na pré-precultura e a pré-cultura foi executada a 30 °C com uma amplitude de agitação de 30 cm a 120 rpm por 24 horas. Sendo assim, o volume inteiro da pré-cultura obtida foi inoculada em 950 ml de meio MMP mostrado na Tabela 3 e a cultura foi executada sob aeração com ar esterilizado a 0,07 vvm a 30 °C a uma velocidade de rotação de lâmina de agitação de 800 rpm a um pH controlado de 6,7 por 50 horas. Como neutralizadores, uma solução de ácido sulfúrico aquoso (3 M) e amónia aquosa (3M) foram usadas.
[075] Após a conclusão da cultura, as bactérias foram removidas por centrifugação a 4 °C a 8.000 rpm por 10 minutos, seguida por recuperação do sobrenadante de cultura. Cadaverina e lisina nesse sobrenadante de cultura foram analisadas por HPLC. Para medir a concentração de glicose, “Glucose Test Wako C” (marca registrada) (fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) foi usado. O rendimento de cadaverina com relação ao consumo de glicose (peso de cadaverina produzida / peso de glicose consumida) x 100 (%)) foi calculado. Os resultados são mostrados na Tabela 4.
[076] Como resultado, por comparação entre o Exemplo 2 e os Exemplos Comparativos 1 e 2 e entre o Exemplo 3 e os Exemplos Comparativos 3 e 4, foi revelado que a concentração de cadaverina acumulada e o rendimento de cadaverina com relação ao consumo de glicose foram aumentados por geração de resistência a 2,2'-tiobisetilamina na cepa progenitora.
[077] A coleta de cadaverina do sobrenadante de cultura obtido pode ser executada por vários métodos conhecidos. Os métodos conhecidos preferenciais de coleta serão agora exemplificados.
[078] Ao sobrenadante de cultura do líquido de fermentação de cadaverina obtido no método mencionado acima, 5 N de hidróxido de sódio são adicionados para ajustar o pH em 13. Então, a mistura resultante é passada através de uma membrana de nanofiltração para remover componentes de sal inorgânico e as bactérias residuais em transe e o permeato através da membrana de nanofiltração é coletado. Sendo assim, o permeato coletado através da membrana de nanofiltração é passado através de uma membrana de osmose reversa e o permeato resultante é concentrado e coletado até a concentração de cadaverina alcançar cerca de 18% em peso. Em seguida, a solução concentrada coletada é ainda concentrada sob pressão reduzida por um evaporador giratório ou similar para remover água e cerca de 50% em peso de solução de cadaverina aquosa são obtidos. Então, uma quantidade igual de clorofórmio é adicionada à solução e cadaverina é extraída na camada de clorofórmio. Finalmente, a camada de clorofórmio é destilada sob pressão reduzida (30 mmHg, 80 °C) para isolar a cadaverina livre.
[079] Pela presente invenção, a cadaverina pode ser produzida industrialmente. Números de Acesso NITE BP-1002 NITE BP-1003
Claims (4)
1. MÉTODO PARA PRODUZIR CADAVERINA, caracterizado por compreender cultivar bactéria/bactérias corineforme(s) que tem/têm uma capacidade para produzir cadaverina e que tem/têm uma resistência a 2,2'- tiobis(etilamina), em que a produção de cadaverina é aumentada em relação a quantidade produzida pela cepa progenitora que não possui resistência a 2,2'- tiobis(etilamina), em que as ditas bactérias corineformes são Corynebacterium glutamicum.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela(s) dita(s) bactéria/bactérias corineforme(s) ter/terem uma resistência a 2,2'- tiobis(etilamina) que tem uma concentração de não menos que 250 mM.
3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela(s) dita(s) bactéria/bactérias corineforme(s) ter/terem atividade de lisina descarboxilase.
4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela(s) dita(s) bactéria/bactérias corineforme(s) ter/terem auxotrofia de homosserina e/ou uma resistência a S-(2-aminoetil)-L-cisteína.
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