BR112017028181B1 - Micro-organismo modificado para produzir putrescina ou ornitina e método para produzir putrescina ou ornitina usando o dito micro-organismo - Google Patents
Micro-organismo modificado para produzir putrescina ou ornitina e método para produzir putrescina ou ornitina usando o dito micro-organismo Download PDFInfo
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Abstract
micro-organismos para produzir putrescina ou ornitina e processo para produzir putrescina ou ornitina usando os mesmos. a presente invenção refere-se a um micro-organismo recombinante para produzir putrescina ou ornitina, e um método para produzir putrescina ou ornitina usando os mesmos. especificamente, a presente invenção refere-se a um micro-organismo do gênero corynebacterium capaz de produzir putrescina ou ornitina, em que uma atividade do regulador transcricional de metabolismo de açúcar (sugr) é enfraquecida, uma atividade do citrato sintase (glta) é melhorada, ou ambas são aplicadas; e um método para produzir putrescina ou ornitina usando o mesmo.
Description
[001]KRA presente invenção refere-se a um micro-organismo recombinante para produzir putrescina ou ornitina, e um método para produzir putrescina ou ornitina usando os mesmos.
[002]A putrescina é encontrada em bactérias ou fungos gram negativos e presente em várias espécies em concentração alta. Assim, espera-se realizar papéis importantes no metabolismo de micro-organismos. Geralmente, a putrescina é uma material base muito importante para a síntese de poliamina náilon-4,6 e é principalmente produzida por um método de síntese química. O método de síntese química consiste de um processo de 3 etapas incluindo uma reação de oxidação catalítica, uma etapa de usar um composto de cianeto, e uma reação de hidrogenação usando hidrogênio de alta pressão. A este respeito, para a produção de putrescina, o desenvolvimento de um método mais respeitador do meio ambiente usando biomassa que pode reduzir consumo de energia é necessário.
[003]Sob estas circunstâncias, como métodos para produzir putrescina usando um micro-organismo, métodos para produção de alto rendimento de putrescina por transformação de E. coli e um micro-organismo do gênero Corynebacterium foram divulgados em Publicação de Patente Internacional No WO 2006/005603; Publicação de Patente Internacional No WO 2009/125924; Qian ZD et al., Biotechnol. Bioeng. 104 (4):651-662, 2009; Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 88 (4):859-868, 2010; Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 95: 169-178, 2012).
[004]A ornitina é um material amplamente encontrado em plantas, animais e micro-organismos, e é usada como um precursor na biossíntese de arginina, prolina e poliaminas. A ornitina desempenha um papel importante na via para excreção de ureia produzida de aminoácidos ou amônia pelo ciclo de ornitina no metabolismo in vivo de animais superiores. A ornitina também é usada como suplementos de nutrientes ou fármacos farmacêuticos na indústria para melhorar cirrose hepática e transtornos da função hepática. Os métodos conhecidos de produzir ornitina incluem tratamento de caseína de leite com enzimas digestivas e uso de E. coli transformada ou um micro-organismo do gênero Corynebacterium (Patente Coreana No 101372635; T. Gotoh et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 33:773-777, 2010).
[005]SugR, que é um regulador transcricional de metabolismo de açúcar (em seguida, SugR), é conhecido como um regulador transcricional em Corynebacterium, e houve um relatório prévio que SugR inibe o gene que codifica fosfotransferase da PEP-proteína do sistema PTS e os genes associados com glicólise de açúcares (VF Wendisch, et al., J. Bacteriol. 190:24, 8033-8044, 2008). Citrato sintase é uma enzima que primeiro age no ciclo TCA e pode regular a taxa deste. Houve um relatório que uma cepa modificada de Corynebacterium com atividade de GltA reduzida aumentou a produção de aspartato e lisina (Shiio et al., Agric Biol Chem. 46; 101-107, 1982).
[006]Os presentes inventores confirmaram que a manipulação de sugR, o gene que codifica SugR e gltA, o gene que codifica citrato sintase, aprimorar a produtividade de putrescina ou ornitina, desse modo completando a presente invenção.
[007]Um objetivo da presente invenção é fornecer um micro-organismo recombinante que pode produzir putrescina ou ornitina em alto rendimento.
[008]Um outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para produzir putrescina ou ornitina usando o micro-organismo acima.
[009]Os presentes inventores confirmaram que realçar simultaneamente a atividade de citrato sintase (em seguida, GltA) enquanto enfraquece a atividade de SugR em um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz putrescina ou ornitina aumenta a quantidade de produção de putrescina ou ornitina. Consequentemente, o micro-organismo da presente invenção pode ser amplamente usado para a produção industrial de putrescina ou ornitina, e o micro-organismo pode ser amplamente usado como um meio eficaz e desejável em termos do aspecto econômico e ambiental para fornecer material base para a produção de vários produtos de polímero, em que putrescina ou ornitina são usadas como matérias-primas.
[0010]Um aspecto da presente divulgação fornece um micro-organismo modificado do gênero Corynebacterium que produz putrescina ou ornitina, em que uma atividade de regulador transcricional de metabolismo de açúcar (SugR) é enfraquecida em comparação com a sua atividade endógena, ii) uma atividade de citrato sintase (GltA) é aprimorada em comparação com a sua atividade endógena, ou iii) a atividade de SugR é enfraquecida em comparação com a sua atividade endógena e uma atividade de GltA é aprimorada em comparação com a sua atividade endógena.
[0011]Uma modalidade exemplar da presente divulgação fornece o micro-organismo modificado do gênero Corynebacterium que produz putrescina ou ornitina, em que uma atividade de SugR é enfraquecida em comparação com a sua atividade endógena e uma atividade de GltA é aprimorada em comparação com a sua atividade endógena.
[0012]Uma outra modalidade exemplar da presente divulgação fornece o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz putrescina ou ornitina, em que o SugR consiste de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3.
[0013]Uma outra modalidade exemplar da presente divulgação fornece o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz putrescina ou ornitina, em que o GltA consiste de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7.
[0014]Uma outra modalidade exemplar da presente divulgação fornece o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz putrescina ou ornitina, em que o micro-organismo do gênero Corynebacterium é selecionado a partir do grupo consistindo em Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum e Brevibacterium lactofermentum.
[0015]Uma outra modalidade exemplar da presente divulgação fornece o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz putrescina ou ornitina, em que uma atividade de ornitina decarboxilase (ODC) é ainda introduzida.
[0016]Uma outra modalidade exemplar da presente divulgação fornece o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz putrescina ou ornitina, em que a ODC consiste de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.
[0017]Uma outra modalidade exemplar da presente divulgação fornece o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz putrescina ou ornitina, em que uma atividade de i) ornitina carbamoiltransferase (ArgF), ii) exportador de glutamato, ou iii) ornitina carbamoiltransferase e exportador de glutamato são ainda enfraquecidos em comparação com a sua atividade endógena.
[0018]Uma outra modalidade exemplar da presente divulgação ainda fornece o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz putrescina ou ornitina, em que a ornitina carbamoiltransferase consiste de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 11, e o exportador de glutamato consiste de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15.
[0019]Uma outra modalidade exemplar da presente divulgação fornece o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz putrescina ou ornitina, em que uma atividade de pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em acetil-gama-glutamil-fosfato redutase (ArgC), acetilglutamato sintase ou ornitina acetiltransferase (ArgJ), acetilglutamato cinase (ArgB), e acetilornitina aminotransferase (ArgD) é ainda aprimorada em comparação com a sua atividade endógena.
[0020]Uma outra modalidade exemplar da presente divulgação fornece o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz putrescina ou ornitina, em que o acetil-gama-glutamil fosfato redutase consiste de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 21, o acetilglutamato sintase ou ornitina acetiltransferase consiste de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 25, o acetilglutamato cinase consiste de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 29, e o acetilornitina aminotransferase consiste de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 33.
[0021]Uma outra modalidade exemplar da presente divulgação ainda fornece o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz putrescina ou ornitina, em que uma atividade de acetiltransferase é ainda enfraquecida em comparação com a sua atividade endógena.
[0022]Uma outra modalidade exemplar da presente divulgação fornece o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz putrescina ou ornitina, em que o acetiltransferase consiste de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 37.
[0023]Uma outra modalidade exemplar da presente divulgação fornece o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz putrescina ou ornitina, em que uma atividade de uma proteína consistindo em SEQ ID NO: 39 ou SEQ ID NO: 41 é ainda aprimorada em comparação com a sua atividade endógena.
[0024]Um outro aspecto da presente divulgação fornece um método para produzir putrescina ou ornitina, incluindo: (i) cultivar o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz putrescina ou ornitina em um meio; e (ii) recuperar putrescina ou ornitina a partir do micro-organismo cultivado ou o meio cultivado na etapa (i).
[0025]Uma modalidade exemplar da presente divulgação fornece o método para produzir putrescina ou ornitina, em que o micro-organismo do gênero Corynebacterium é Corynebacterium glutamicum.
[0026]Em seguida, a presente divulgação é descrita em detalhes.
[0027]Um aspecto da presente divulgação refere-se a um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz putrescina ou ornitina, em que uma atividade de regulador transcricional de metabolismo de açúcar (SugR) é enfraquecida em comparação com a sua atividade endógena, ii) uma atividade de citrato sintase (GltA) é aprimorada em comparação com a sua atividade endógena, ou iii) a atividade de SugR é enfraquecida em comparação com a sua atividade endógena e uma atividade de GltA é aprimorada em comparação com a sua atividade endógena. Especificamente, a presente divulgação refere-se a um microorganismo do gênero Corynebacterium que produz putrescina ou ornitina, em que uma atividade de regulador transcricional de metabolismo de açúcar é enfraquecida em comparação com a sua atividade endógena e uma atividade de citrato sintase é aprimorada em comparação com a sua atividade endógena.
[0028]Como usado aqui, o termo “regulador transcricional de metabolismo de açúcar (SugR)” refere-se a uma enzima que funciona amplamente como um inibidor com respeito aos genes associados com vários aspectos de metabolismo de açúcar, tais como absorção de açúcar e o sistema de fosfotransferase, glicólise, fermentação relacionada para lactar a desidrogenase, etc. Na presente divulgação, o SugR inclui tanto as proteínas endógenas quanto as proteínas externas dentro de um micro-organismo do gênero Corynebacterium, e especificamente, um SugR derivado de um micro-organismo do gênero Corynebacterium.
[0029]Na presente divulgação, o regulador transcricional de metabolismo de açúcar pode incluir, sem limitação, qualquer proteína incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, ou qualquer proteína incluindo uma sequência de aminoácidos tendo uma homologia de sequência de 70 % ou mais alta, especificamente 80 % ou mais alta, mais especificamente 90 % ou mais alta, mesmo mais especificamente 95 % ou mais alta, ainda mesmo mais especificamente 98 % ou mais alta, e mais especificamente 99 % ou mais alta para as sequências de aminoácido acima, contanto que a proteína tenha substancialmente a mesma atividade como o regulador transcricional de metabolismo de açúcar.
[0030]Adicionalmente, visto que a sequência de aminoácidos de uma proteína que codifica a atividade acima pode variar dependendo da espécie ou cepa do micro-organismo, o SugR não pode ser limitado com respeito a sua origem na presente divulgação, mas o SugR pode ser, por exemplo, derivado de um micro-organismo do gênero Corynebacterium, e especificamente, derivado de Corynebacterium glutamicum. É óbvio que qualquer sequência de aminoácidos que tem uma homologia às sequências acima e tem uma atividade biológica substancialmente idêntica ou correspondente à proteína de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 também pode pertencer ao escopo da presente divulgação, embora a sequência de aminoácidos pode ter uma deleção, modificação, substituição ou adição em parte da sequência.
[0031]O polinucleotídeo que codifica o regulador transcricional de metabolismo de açúcar da presente divulgação, contanto que tenha uma atividade similar àquela do regulador transcricional de metabolismo de açúcar, pode incluir qualquer polinucleotídeo que codifique a proteína tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, ou os polinucleotídeos que codifiquem proteínas tendo uma homologia de sequência de 70 % ou mais alta, especificamente 80 % ou mais alta, mais especificamente 90 % ou mais alta, mesmo mais especificamente 95 % ou mais alta, ainda mesmo mais especificamente 98 % ou mais alta, e mais especificamente 99 % ou mais alta para as sequências de aminoácido acima. Com respeito ao polinucleotídeo que codifica o regulador transcricional de metabolismo de açúcar, considerando os códons com base em degeneração do códon ou aqueles preferidos por organismos para expressar o regulador, várias modificações podem ser executadas na região de codificação dentro do escopo sem alterar a sequência de aminoácidos do polipeptídeo, e especificamente, o polinucleotídeo pode incluir a sequência de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, mas não é limitada a esta.
[0032]Como usado aqui, o termo “citrato sintase (GltA)” refere-se a uma enzima que está envolvida na produção de vários intermediários biossintéticos intracelulares e a produção de ácido nucleico de purina reduzido. GltA é conhecido agir para mediar a condensação hidrolítica entre acetil-CoA e oxaloacetato para a produção de citrato. Na presente divulgação, GltA inclui tanto as enzimas endógenas quanto as proteínas externas presentes em um micro-organismo do gênero Corynebacterium, e especificamente, GltA derivado de um micro-organismo do gênero Corynebacterium.
[0033]Na presente divulgação, GltA pode incluir, sem limitação, as proteínas tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7, ou qualquer proteína que inclui uma sequência de aminoácidos tendo uma homologia de sequência de 70 % ou mais alta, especificamente 80 % ou mais alta, mais especificamente 90 % ou mais alta, mesmo mais especificamente 95 % ou mais alta, ainda mesmo mais especificamente 98 % ou mais alta, e mais especificamente 99 % ou mais alta para as sequências de aminoácido acima, e tem a atividade substancial de mediar a condensação hidrolítica entre acetil-CoA e oxaloacetato para a produção de citrato.
[0034]Adicionalmente, visto que a sequência de aminoácidos da proteína que exibe a atividade pode variar de acordo com a espécie ou cepa do micro-organismo, GltA pode ser derivado de, por exemplo, Corynebacterium, e especificamente, Corynebacterium glutamicum, mas a origem de GltA não é limitada na presente divulgação. É óbvio que qualquer sequência de aminoácidos que tem uma homologia às sequências acima e tem uma atividade biológica substancialmente idêntica ou correspondente à proteína de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7 também pode pertencer ao escopo da presente divulgação, embora a sequência de aminoácidos pode ter uma deleção, modificação, substituição ou adição em parte da sequência.
[0035]O polinucleotídeo que codifica GltA da presente divulgação pode incluir os polinucleotídeos que codifiquem o aminoácido de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7, ou os polinucleotídeos que codifiquem proteínas tendo uma homologia de 70 % ou mais alta, especificamente 80 % ou mais alta, mais especificamente 90 % ou mais alta, mesmo mais especificamente 95 % ou mais alta, ainda mesmo mais especificamente 98 % ou mais alta, e mais especificamente 99 % ou mais alta para as sequências de aminoácido acima. Com respeito ao polinucleotídeo que codifica GltA, considerando os códons com base em degeneração do códon ou aqueles preferidos por organismos para expressar o GltA, várias modificações podem ser executadas na região de codificação dentro do escopo sem alterar a sequência de aminoácidos do polipeptídeo, e especificamente, o polinucleotídeo pode incluir a sequência de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8, mas não está limitado.
[0036]Como usado aqui, o termo “homologia” refere-se a um grau de identidade em comparação com uma dada sequência de aminoácidos ou uma sequência de polinucleotídeo e pode ser indicado como uma porcentagem. Na presente divulgação, sequências homólogas tendo a mesma atividade ou similar àquela da dada sequência de aminoácidos ou a sequência de polinucleotídeo são indicadas em termos de “% de homologia”. Por exemplo, a homologia pode ser confirmada usando software padrão para calcular parâmetros (por exemplo, parâmetros tais como pontuação, identidade, e similaridade), especificamente BLAST 2,0, ou comparando sequências por southern blot sob condições de hibridização severas definidas, e as condições de hibridização apropriadas a serem definidas podem ser determinadas por um método que está dentro do escopo da técnica e bem conhecido a uma pessoa de habilidade comum na técnica (por exemplo, J. Sambrook et al., Clonagem molecular, A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque).
[0037]Adicionalmente, os polinucleotídeos que codificam SugR e citrato sintase da presente divulgação podem ser hibridizados sob condições severas com as sequências de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 2 ou 4, ou SEQ ID NO: 6 ou 8, ou sondas derivadas das sequências de polinucleotídeo, respectivamente, e podem ser um tipo modificado que codifica SugR e citrato sintase que estão envolvidos em funções normais. Como usado aqui, o termo “condições severas” refere-se a uma condição que permite uma hibridização específica entre polinucleotídeos. Por exemplo, as condições severas são especificamente descritas nas referências (por exemplo, J. Sambrook et al., ibid).
[0038]Na presente divulgação, tentativas foram feitas para enfraquecer a atividade de SugR, ou realçar a atividade de GltA, ou aplicar tanto o enfraquecimento da atividade de SugR quanto realçar a da atividade de GltA simultaneamente a um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz putrescina ou ornitina, e como um resultado, foi confirmado que a quantidade de produção de putrescina ou ornitina foi aprimorada em todas as cepas modificadas.
[0039]Em particular, o micro-organismo da presente divulgação pode incluir tanto os micro-organismos de tipo selvagem quanto de tipo modificado contanto que eles possam produzir putrescina ou ornitina. Por exemplo, o micro-organismo pode pertencer ao gênero Escherichia, o gênero Shigella, o gênero Citrobacter, o gênero Salmonella, o gênero Enterobacter, o gênero Yersinia, o gênero Klebsiella, o gênero Erwinia, o gênero Corynebacterium, o gênero Brevibacterium, o gênero Lactobacilo, o gênero Selenomanas, o gênero Vibrio, o gênero Pseudomonas, o gênero Streptomyces, o gênero Arcanobacterium e o gênero Alcaligenes. Especificamente, o micro-organismo da presente divulgação pode pertencer ao gênero Corynebacterium, e mais especificamente, pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum e Brevibacterium lactofermentum, e mesmo mais especificamente, pode ser Corynebacterium glutamicum, mas não está limitado.
[0040]Especificamente, como usado aqui, o termo “que produz putrescina ou ornitina” refere-se a um micro-organismo fornecido com produtividade de putrescina ou ornitina em uma cepa precursora que tem a putrescina ou ornitina em um estado natural ou não tem produtividade de putrescina ou ornitina.
[0041]Adicionalmente, o micro-organismo que produz putrescina ou ornitina pode ser modificado para enfraquecer uma atividade de ornitina carbamoiltransferase (ArgF), que é envolvida na síntese de arginina, e/ou uma atividade de exportador de glutamato (NCgl1221), que é uma proteína envolvida na excreção de glutamato, em comparação com as suas atividades endógenas respectivas.
[0042]Além disso, o micro-organismo tendo produtividade de putrescina pode ser modificado para enfraquecer a atividade de acetiltransferase (NCgl1469), que é uma proteína que acetila putrescina, em comparação com a sua atividade endógena e/ou introduzir a atividade de ODC, que é uma proteína que converte ornitina em putrescina.
[0043]Em particular, a modificação de atividades de realce ou enfraquecimento pode ocorrer por um processo chamado transformação na presente divulgação. Como usado aqui, o termo “transformação” refere-se a um processo de introduzir um polinucleotídeo que codifica uma proteína particular ou um vetor incluindo uma sequência promotora com atividade forte ou fraca, etc., em uma célula hospedeira, desse modo permitindo a expressão da proteína codificada pelo polinucleotídeo na célula hospedeira ou induzindo a modificação do cromossomo da célula hospedeira.
[0044]Adicionalmente, o polinucleotídeo inclui DNA e RNA que codificam a proteína alvo. O polinucleotídeo pode ser inserido em qualquer forma contanto que possa ser introduzido em uma célula hospedeira e expressado nela. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula hospedeira na forma de um cassete de expressão, que é uma construção de gene incluindo todos os elementos essenciais necessários para a auto-expressão. O cassete de expressão pode convencionalmente incluir um promotor conectado de maneira operável ao polinucleotídeo, um sinal de terminação de transcrição, um domínio de ligação ao ribossomo e um sinal de terminação de tradução. O cassete de expressão pode ser na forma de um vetor de expressão capaz de auto-replicação. Adicionalmente, o polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula hospedeira como é e conectado de maneira operável a uma sequência necessária para sua expressão na célula hospedeira, mas não é limitada a esta.
[0045]Adicionalmente, como usado aqui, o termo “conectado de maneira operável” refere-se a uma conexão funcional entre uma sequência promotora, que inicia e medeia a transcrição do polinucleotídeo que codifica a proteína alvo da presente divulgação, e a sequência de gene acima.
[0046]Como usado aqui, o termo “vetor” refere-se a qualquer construção de DNA que inclui a sequência de polinucleotídeo que codifica a proteína alvo, que é de maneira operável conectada a uma sequência controle apropriada capaz de expressar a proteína alvo em uma célula hospedeira apropriada. A sequência controle inclui um promotor capaz de iniciar transcrição, qualquer sequência de operador capaz de controlar a transcrição, uma sequência que codifica um domínio de ligação ao ribossomo de mRNA apropriado, e sequências capazes de controlar a terminação de transcrição e tradução. O vetor, depois de ser transformado em uma célula hospedeira apropriada, pode ser replicado ou funcionar independentemente do genoma hospedeiro, ou pode ser integrado no próprio genoma hospedeiro.
[0047]O vetor a ser usado na presente divulgação não pode ser particularmente limitado contanto que o vetor seja replicável em uma célula hospedeira, e qualquer vetor conhecido na técnica pode ser usado. Exemplos do vetor convencionalmente usado podem incluir plasmídeos naturais ou recombinantes, cosmídeos, vírus e bacteriofagos. Por exemplo, como um vetor de fago ou vetor de cosmídeo, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A, etc., pode ser usado; e como um vetor de plasmídeo, aquele com base em pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL, pET, etc., pode ser usado. O vetor a ser usado na presente divulgação não pode ser particularmente limitado, mas qualquer vetor de expressão conhecido pode ser usado. Especificamente, os vetores pDZ, pDZTn, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, etc., podem ser usados.
[0048]Como tal, o polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo externa pode ser substituído com um polinucleotídeo modificado no cromossomo por um vetor para inserção em cromossomo bacteriano. A inserção do polinucleotídeo no cromossomo pode ser realizada usando qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por recombinação homóloga, mas não é limitada a esta. Visto que, o vetor da presente divulgação pode ser inserido no cromossomo por recombinação homóloga, um marcador de seleção para confirmação da inserção no cromossomo pode ser ainda incluído. O marcador de seleção é usado para a seleção de uma célula transformada, isto é, confirmar se o polinucleotídeo alvo foi inserido, e marcadores capazes de fornecer fenótipos selecionáveis tais como resistência ao fármaco, requisito de nutriente, resistência aos agentes citotóxicos, e expressão de proteínas de superfície pode ser usada. Sob as circunstâncias tratadas com agentes seletivos, apenas as células capazes de expressar os marcadores de seleção podem sobreviver ou expressar outros traços fenotípicos, e assim as células transformadas podem ser selecionadas.
[0049]Como usado aqui, o termo “aprimoramento de atividade” não inclui apenas o desenho de um efeito maior do que a função original devido à nova introdução de uma atividade ou um aumento na atividade de uma proteína própria, mas também inclui o aumento em sua atividade por um aumento na atividade de um gene endógeno, amplificação de um gene endógeno de fator(s) interno(s) ou external(s), deleção de fator(s) regulatório(s) para inibir a expressão de gene, um aumento em número de cópias de gene, introdução de um gene de fora, modificação da sequência de controle de expressão, e especificamente, um aumento em atividade de enzima devido a substituição ou modificação de um promotor e uma mutação dentro de um gene, etc.
[0050]Especificamente, na presente divulgação, a aprimoramento ou aumento de atividade pode ser realizado por: 1) aumentar o número de cópias de um polinucleotídeo que codifica a enzima, 2) modificar a sequência de controle de expressão para aumentar a expressão do polinucleotídeo, 3) modificar a sequência de polinucleotídeo no cromossomo para realçar a atividade da enzima, e 4) modificar por uma combinação deste, mas o método não está limitado.
[0051]O aumento de número de cópias de um polinucleotídeo (método 1) pode ser realizado em uma forma em que o polinucleotídeo está ligado de maneira operável a um vetor, ou inserindo-se o polinucleotídeo no cromossomo de uma célula hospedeira, embora o método não seja particularmente limitado. Especificamente, o aumento de número de cópias de um polinucleotídeo dentro do cromossomo da célula hospedeira pode ser realizado introduzindo-se um vetor que pode replicar e funcionar independentemente de uma célula hospedeira e a qual o polinucleotídeo que codifica a proteína da presente divulgação está ligado de maneira operável; ou pode ser realizado introduzindo-se um vetor que pode inserir o polinucleotídeo no cromossomo de uma célula hospedeira e ao qual o polinucleotídeo está ligado de maneira operável, em uma célula hospedeira.
[0052]Em seguida, a modificação da sequência de controle de expressão para aumentar a expressão de um polinucleotídeo (método 2) pode ser realizada induzindo-se uma modificação na sequência de polinucleotídeo através da deleção, inserção, substituição não conservativa ou conservativa da sequência de polinucleotídeo, ou uma combinação desta para realçar ainda a atividade da sequência de controle de expressão, ou substituindo-se a sequência de polinucleotídeo com uma sequência de polinucleotídeo tendo uma atividade mais forte, embora o método não seja particularmente limitado. A sequência de controle de expressão inclui um promotor, uma sequência de operador, uma sequência que codifica sítio de ligação ao ribossomo, e uma sequência que regula a terminação de transcrição e tradução.
[0053]Um promotor exógeno forte, em vez do promotor original, pode ser conectado à região a montante da expressão unidade do polinucleotídeo. Exemplos do promotor forte pode ser promotor CJ7, promotor lysCP1, promotor EF-Tu, promotor groEL, promotor aceA ou aceB, etc., e mais especificamente, a taxa de expressão pode ser aprimorada por ser de maneira operável conectada ao promotor lysCP1 derivado de Corynebacterium (WO 2009/096689) ou promotor CJ7 (Patente Coreana No 0620092 e WO 2006/065095), mas o promotor forte não está limitado a esta.
[0054]Além disso, a modificação de uma sequência de polinucleotídeo no cromossomo (método 3) pode ser realizada induzindo-se uma modificação na sequência de controle de expressão através de deleção, inserção, substituição não conservativa ou conservativa da sequência de polinucleotídeo, ou uma combinação desta para realçar ainda a atividade da sequência de polinucleotídeo, ou substituindo-se a sequência de polinucleotídeo com uma sequência de polinucleotídeo aprimorada tendo uma atividade mais forte, embora o método não é particularmente limitado a esta.
[0055]Como usado aqui, “enfraquecimento de atividade” pode ser obtido deletando-se uma parte ou a totalidade de um polinucleotídeo que codifica a proteína para enfraquecer a atividade da proteína, modificando-se a sequência de controle de expressão para reduzir a expressão do polinucleotídeo, modificando-se a sequência de polinucleotídeo nos cromossomos para enfraquecer a atividade da proteína, e por um método selecionado de uma combinação deste.
[0056]Especificamente, na presente divulgação, o enfraquecimento de atividade pode ser obtido por: 1) deletar uma parte ou a totalidade de um polinucleotídeo que codifica a proteína, 2) modificar a sequência de controle de expressão para reduzir a expressão do polinucleotídeo, 3) modificar a sequência de polinucleotídeo nos cromossomos para enfraquecer a atividade da proteína, e 4) um método selecionado de uma combinação deste,mas o método não está limitado.
[0057]Especificamente, o método de deletar uma parte ou a totalidade de um polinucleotídeo que codifica uma proteína pode ser realizado substituindo-se o polinucleotídeo que codifica a proteína alvo endógena dentro do cromossomo com um polinucleotídeo tendo uma deleção parcial na sequência de polinucleotídeo ou um gene marcador usando um vetor para inserção cromossômica dentro de bactérias. Como usado aqui, o termo “uma parte” pode variar dependendo dos tipos de polinucleotídeos, e pode especificamente referir-se a 1 a 300, mais especificamente 1 a 100, e mesmo mais especificamente 1 a 50.
[0058]Adicionalmente, o método de modificar a sequência de controle de expressão pode ser realizado induzindo-se uma modificação na sequência de controle de expressão através de deleção, inserção, substituição não conservativa ou conservativa de uma sequência de polinucleotídeo, ou uma combinação desta para enfraquecer ainda a atividade da sequência de controle de expressão, ou substituindo-se a sequência de polinucleotídeo com uma sequência de polinucleotídeo tendo uma atividade mais fraca. A sequência de controle de expressão inclui um promotor, uma sequência de operador, uma sequência que codifica um sítio de ligação ao ribossomo, e uma sequência que regula a terminação de transcrição e tradução.
[0059]Adicionalmente, o método de modificar uma sequência de polinucleotídeo no cromossomo pode ser realizada induzindo-se uma modificação na sequência de polinucleotídeo através da deleção, inserção, substituição não conservativa ou conservativa da sequência de polinucleotídeo, ou uma combinação destas para enfraquecer ainda a atividade da proteína, ou substituindo-se a sequência de polinucleotídeo com uma sequência de polinucleotídeo aprimorada tendo uma atividade mais forte.
[0060]Adicionalmente, o método de deletar o fator regulatório que inibe a expressão do polinucleotídeo da proteína pode ser realizado substituindo-se o polinucleotídeo para a expressão inibindo o fator com um polinucleotídeo tendo uma deleção parcial na sequência de polinucleotídeo ou um gene marcador. Como usado aqui, o termo “uma parte” pode variar dependendo dos tipos de polinucleotídeos, e pode especificamente referir-se a 1 a 300, mais especificamente 1 a 100, e mesmo mais especificamente 1 a 50.
[0061]Como usado aqui, o termo “atividade endógena” refere-se a um estado ativo de uma enzima em um estado não modificado, por exemplo, em um estado natural, originalmente possuído por um micro-organismo, e o termo “aprimoramento em comparação com a sua atividade endógena” refere-se a um estado aumentado da atividade da proteína possuída pelo micro-organismo depois da manipulação, tal como a introdução de um gene que exibe uma atividade ou um aumento do número de cópias do gene correspondente, deleção do fator de controle de inibição da expressão do gene, ou uma modificação da sequência de controle da expressão, por exemplo, o uso de um promotor aprimorado, em comparação com atividade possuída pelo micro-organismo antes da manipulação.
[0062]O micro-organismo do gênero Corynebacterium da presente divulgação pode ser um micro-organismo do gênero Corynebacterium tendo produtividade de putrescina, em que a atividade de ornitina decarboxilase (ODC) é ainda introduzida.
[0063]Como usado aqui, o termo “ornitina decarboxilase (ODC)” refere-se a uma enzima tendo produtividade de putrescina mediando-se a descarbolização de ornitina. Embora o micro-organismo do gênero Corynebacterium não tenha uma via de biossíntese de putrescina, quando ODC é introduzido a partir do exterior, putrescina é sintetizada e liberada extracelularmente. Na presente divulgação, a ODC pode consistir de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, ou pode incluir, sem limitação, qualquer proteína que tenha uma homologia de 70 % ou mais alta, especificamente 80 % ou mais alta, mais especificamente 90 % ou mais alta, mesmo mais especificamente 95 % ou mais alta, ainda mesmo mais especificamente 98 % ou mais alta, e mais especificamente 99 % ou mais alta à sequência de aminoácidos acima, contanto que a proteína tenha substancialmente a mesma atividade de ODC.
[0064]Adicionalmente, visto que a sequência de aminoácidos da proteína que exibe a atividade pode variar de acordo com a espécie ou cepa do micro-organismo, a origem de ODC não é limitada na presente divulgação, e especificamente, pode ser um ODC derivado de E. coli. É óbvio que qualquer sequência de aminoácidos que tem uma homologia às sequências acima e tem uma atividade biológica substancialmente idêntica ou correspondente à proteína de SEQ ID NO: 17 também pode pertencer ao escopo da presente divulgação, embora a sequência de aminoácidos possa ter uma deleção, modificação, substituição ou adição em parte da sequência.
[0065]O polinucleotídeo que codifica ODC da presente divulgação pode incluir os polinucleotídeos que codificam o aminoácido de SEQ ID NO: 17 ou os polinucleotídeos que codificam proteínas tendo uma homologia de 70 % ou mais alta, especificamente 80 % ou mais alta, mais especificamente 90 % ou mais alta, mesmo mais especificamente 95 % ou mais alta, ainda mesmo mais especificamente 98 % ou mais alta, e mais especificamente 99 % ou mais alta à sequência de aminoácidos acima. Com respeito ao polinucleotídeo que codifica ODC, considerando os códons com base em degeneração do códon ou aqueles preferidos por organismos para expressar a proteína, várias modificações podem ser executadas na região de codificação dentro do escopo sem alterar a sequência de aminoácidos do polipeptídeo.
[0066]O micro-organismo do gênero Corynebacterium pode ser um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz putrescina ou ornitina, em que a atividades de i) ornitina carbamoiltransferase (ArgF), ii) exportador de glutamato (NCgl1221), ou iii) ornitina carbamoiltransferase e exportador de glutamato são ainda enfraquecidos em comparação com as suas atividades endógenas.
[0067]Na presente divulgação, a ornitina carbamoiltransferase pode incluir, sem limitação, qualquer proteína consistindo em sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 11, ou qualquer proteína consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo uma homologia de sequência de 70 % ou mais alta, especificamente 80 % ou mais alta, mais especificamente 90 % ou mais alta, mesmo mais especificamente 95 % ou mais alta, ainda mesmo mais especificamente 98 % ou mais alta, e mais especificamente 99 % ou mais alta para as sequências de aminoácido acima, contanto que a proteína tenha substancialmente a mesma atividade como ornitina carbamoiltransferase.
[0068]Adicionalmente, o exportador de glutamato na presente divulgação pode incluir, sem limitação, qualquer proteína consistindo em sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15, ou qualquer proteína incluindo uma sequência de aminoácidos tendo uma homologia de sequência de 70 % ou mais alta, especificamente 80 % ou mais alta, mais especificamente 90 % ou mais alta, mesmo mais especificamente 95 % ou mais alta, ainda mesmo mais especificamente 98 % ou mais alta, e mais especificamente 99 % ou mais alta para as sequências de aminoácido acima, contanto que a proteína tenha substancialmente a mesma atividade como o exportador de glutamato.
[0069]Adicionalmente, o micro-organismo do gênero Corynebacterium da presente divulgação pode ser um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz putrescina ou ornitina, em que pelo menos uma atividade selecionada a partir do grupo consistindo em acetil-gama-glutamil fosfato redutase (ArgC), acetilglutamato sintase ou ornitina acetiltransferase (ArgJ), acetilglutamato cinase (ArgB), e acetilornitina aminotransferase (ArgD) é ainda aprimorada em comparação com as suas atividades endógenas.
[0070]Na presente divulgação, o acetil-gama-glutamil fosfato redutase pode incluir, sem limitação, qualquer proteína consistindo em sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 21, ou qualquer proteína consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo uma homologia de sequência de 70 % ou mais alta, especificamente 80 % ou mais alta, mais especificamente 90 % ou mais alta, mesmo mais especificamente 95 % ou mais alta, ainda mesmo mais especificamente 98 % ou mais alta, e mais especificamente 99 % ou mais alta para as sequências de aminoácido acima, contanto que a proteína tenha substancialmente a mesma atividade como acetil-gama-glutamil fosfato redutase.
[0071]Adicionalmente, o acetilglutamato sintase ou ornitina acetiltransferase pode incluir, sem limitação, qualquer proteína consistindo em sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 25, ou qualquer proteína consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo uma homologia de sequência de 70 % ou mais alta, especificamente 80 % ou mais alta, mais especificamente 90 % ou mais alta, mesmo mais especificamente 95 % ou mais alta, ainda mesmo mais especificamente 98 % ou mais alta, e mais especificamente 99 % ou mais alta para as sequências de aminoácido acima, contanto que a proteína tenha substancialmente a mesma atividade como acetilglutamato sintase ou ornitina acetiltransferase.
[0072]Na presente divulgação, o acetilglutamato cinase pode incluir, sem limitação, qualquer proteína consistindo em sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 29, ou qualquer proteína consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo uma homologia de sequência de 70 % ou mais alta, especificamente 80 % ou mais alta, mais especificamente 90 % ou mais alta, mesmo mais especificamente 95 % ou mais alta, ainda mesmo mais especificamente 98 % ou mais alta, e mais especificamente 99 % ou mais alta para as sequências de aminoácido acima, contanto que a proteína tenha substancialmente a mesma atividade como acetilglutamato cinase.
[0073]Adicionalmente, na presente divulgação, o acetilornitina aminotransferase pode incluir, sem limitação, qualquer proteína que consiste da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 33, ou qualquer proteína consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo uma homologia de sequência de 70 % ou mais alta, especificamente 80 % ou mais alta, mais especificamente 90 % ou mais alta, mesmo mais especificamente 95 % ou mais alta, ainda mesmo mais especificamente 98 % ou mais alta, e mais especificamente 99 % ou mais alta para as sequências de aminoácido acima, contanto que a proteína tenha substancialmente a mesma atividade como acetilornitina aminotransferase.
[0074]Além disso, o micro-organismo do gênero Corynebacterium da presente divulgação pode ser um micro-organismo do gênero Corynebacterium tendo produtividade de putrescina, em que a atividade de acetiltransferase (NCgl1469) é ainda enfraquecida em comparação com a sua atividade endógena.
[0075]Na presente divulgação, o acetiltransferase pode incluir qualquer proteína que pode transferir um grupo acetila à putrescina. O acetiltransferase pode incluir, sem limitação, qualquer proteína consistindo em sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 37, ou qualquer proteína consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo uma homologia de sequência de 70 % ou mais alta, especificamente 80 % ou mais alta, mais especificamente 90 % ou mais alta, mesmo mais especificamente 95 % ou mais alta, ainda mesmo mais especificamente 98 % ou mais alta, e mais especificamente 99 % ou mais alta para as sequências de aminoácido acima, contanto que a proteína tenha substancialmente a mesma atividade como acetiltransferase.
[0076]Por fim, o micro-organismo do gênero Corynebacterium da presente divulgação pode ser um micro-organismo do gênero Corynebacterium tendo produtividade de putrescina, em que a atividade de NCgl2522 é ainda aprimorada em comparação com a sua atividade endógena.
[0077]Na presente divulgação, NCgl2522 é uma proteína que desempenha o papel de liberar putrescina, e pode incluir qualquer proteína que pode transferir um grupo acetila à putrescina. A acetiltransferase pode incluir, sem limitação, qualquer proteína consistindo em sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 ou SEQ ID NO: 41, ou qualquer proteína consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo uma homologia de sequência de 70 % ou mais alta, especificamente 80 % ou mais alta, mais especificamente 90 % ou mais alta, mesmo mais especificamente 95 % ou mais alta, ainda mesmo mais especificamente 98 % ou mais alta, e mais especificamente 99 % ou mais alta para as sequências de aminoácido acima, contanto que a proteína tenha substancialmente a mesma atividade como NCgl2522.
[0078]Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece um método para produzir putrescina ou ornitina, incluindo: (i) cultivar o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz putrescina ou ornitina em um meio; e (ii) recuperar putrescina ou ornitina a partir do micro-organismo cultivado ou o cultivo na etapa (i).
[0079]Na presente divulgação, o micro-organismo do gênero Corynebacterium pode ser Corynebacterium glutamicum.
[0080]O micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz putrescina ou ornitina da presente divulgação é o mesmo como descrito acima.
[0081]No método acima, o micro-organismo pode ser cultivado por cultura em lote, cultura contínua e cultura alimentada por lotes conhecida na técnica, embora não estejam particularmente limitadas a estas. Em particular, com respeito à condição de cultivo, pH apropriado (isto é, um pH ótimo de 5 a 9, especificamente pH 6 a 8, e mais especificamente pH 6,8) pode ser mantido usando uma química básica (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amônia) ou uma química ácida (por exemplo, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico), embora não estejam particularmente limitadas a estas. Adicionalmente, uma condição aeróbica pode ser mantida adicionando-se oxigênio ou uma mistura de gás contendo oxigênio à uma cultura celular. A temperatura da cultura pode ser mantida a 20 °C a 45 °C, e especificamente a 25 °C a 40 °C, e o micro-organismo pode ser cultivado por cerca de 10 horas a 160 horas. A putrescina ou ornitina produzida pela cultura acima pode ser secretada a um meio de cultura ou permanecer dentro das células.
[0082]Adicionalmente, no meio de cultura, fontes de carbono, tais como açúcares e carboidratos (por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaços, amido e celulose), óleos e gorduras (por exemplo, óleo de soja, óleo de semente de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco), ácidos graxos (por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico), álcoois (por exemplo, glicerol e etanol) e ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético), podem ser usados individualmente ou em combinação, mas não são limitados a estes; fontes de nitrogênio, tais como compostos orgânicos contendo nitrogênio (por exemplo, peptona, extrato de levedura, suco de carne, extrato malte, licor íngreme de milho, farinha de soja e uréia) ou compostos inorgânicos (por exemplo, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio), podem ser usados individualmente ou em combinação, mas são não limitados a estes; e fontes de potássio, tais como di-hidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato de dipotássio, ou sais contendo sódio correspondentes a estes, podem ser usados individualmente ou em combinação, mas não são limitados a estes. Adicionalmente, outras substâncias essenciais estimulantes do crescimento incluindo sais metálicos (por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro), aminoácidos e vitaminas podem ser contidas no meio.
[0083]O método de recuperar a putrescina ou ornitina produzido durante a cultura da presente divulgação pode ser realizada por um método de cultura apropriado conhecido na técnica, por exemplo, cultura em lote, cultura contínua ou cultura alimentada por lotes, e e deste modo o material alvo pode ser recuperado a partir da cultura.
[0084]Aqui abaixo, a presente invenção será descrita em detalhes com modalidades exemplares que acompanham. Entretanto, as modalidades exemplares divulgadas aqui são apenas para propósitos ilustrativos e não devem ser interpretadas como limitativas do escopo da presente invenção.
[0085]Os presentes inventores confirmaram o efeito de enfraquecimento de sugR, que é o gene que codifica SugR, em uma cepa tendo produtividade de putrescina.
[0086]De modo a confirmar se o enfraquecimento de gene sugR é relacionado à produtividade de putrescina em uma cepa Corynebacterium glutamicum à base de ATCC13032 tendo produtividade de putrescina (Publicação de Pedido de Patente Coreana No 10-2013-0082478), uma cepa enfraquecida por sugR foi preparada. Especificamente, a cepa enfraquecida por sugR foi preparada alterando-se o códon de iniciação do gene sugR e substituindo o promotor com promotor enfraquecido com B6 (Patek M (2005) Regulação de expressão de gene. Em: Eggeling L, Bott M (eds) Handbook of Corynebacterium glutamicum. CRC, BocaRaton).
[0087]Primeiro, um vetor para alterar a códon de iniciação do gene sugR foi preparado. Com respeito à vizinhança da sequência de polinucleotídeo do gene que codifica o SugR descrito por SEQ ID NO: 2, os pares de iniciadores de SEQ ID NOS: 43 e 44 para obter o fragmento recombinante homólogo a montante do códon de iniciação do gene sugR e os pares de iniciadores de SEQ ID NOS: 45, 46 e 47 para obter o fragmento recombinante homólogo a jusante do códon de iniciação do gene sugR foram preparados. Os iniciadores usados para a mudança dos códons de iniciação estão resumidos na Tabela 1 abaixo. [Tabela 1]
[0088]PCR foi realizada usando o DNA genômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 como um modelo junto com 2 pares de iniciadores, respectivamente, para ampliar a região a montante e a região a jusante do códon de iniciação de gene sugR, respectivamente, e os resultados foram submetidos à eletroforese para obter fragmentos desejados. Em particular, PCR foi realizada por 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, recozimento a 55 °C por 30 segundos, e extensão a 72 °C por 30 segundos. Os fragmentos assim obtidos foram submetidos à eletroforese em um gel de agarose a 0,8 %, e as bandas de tamanhos desejados foram eluídas e purificadas.
[0089]O vetor pDZ (Patente Coreana No 10-0924065) foi tratado com BamHI e SalI e depois, os produtos PCR da cepa ATCC13032 foram submetidos à clonagem por fusão. A clonagem por fusão foi realizada usando o Kit de Clonagem HD In-Fusion® (Clontech). Como tal, os plasmídeos pDZ-1’sugR(GTG) e pDZ- 1’sugR(TTG) foram preparados.
[0090]No caso do vetor para a substituição em um promotor enfraquecido com B6, SEQ ID NO: 48 para a preparação de vetor foi preparado como mostrado na Tabela 2 abaixo. [Tabela 2]
[0091]PCR foi realizada usando os pares de iniciadores de SEQ ID NOS: 43 e 44 para obter o fragmento recombinante homólogo a montante do códon de iniciação do gene sugR e os pares de iniciadores de SEQ ID NOS: 48 e 47 para obter o fragmento recombinante homólogo a jusante do códon de iniciação do gene sugR, que foram preparados com respeito à vizinhança da sequência de polinucleotídeo do gene que codifica o SugR descrito por SEQ ID NO: 2, e a região a montante e a região a jusante do códon de iniciação de gene sugR foram amplificadas, respectivamente, e os resultados foram submetidos à eletroforese para obter fragmentos desejados. Os fragmentos assim obtidos foram submetidos à eletroforese em um gel de agarose a 0,8 %, e as bandas de tamanhos desejados foram eluídas e purificadas. O vetor pDZ foi tratado com BamHI e SalI e depois, os produtos PCR da cepa ATCC13032 foram submetidos à clonagem por fusão. A clonagem por fusão foi realizada usando o Kit de Clonagem HD In-Fusion® (Clontech). Como tal, o plasmídeo pDZ-1’sugR(B6) foi preparado.
[0092]Os plasmídeos pDZ-1’sugR(GTG), pDZ-1’sugR(TTG), e pDZ- 1’sugR(B6) foram introduzidos em um micro-organismo do gênero Corynebacterium KCCM11240P (Publicação de Pedido de Patente Coreana No 10-2013-0082478) por eletroporação para obter transformantes, e os transformantes foram plaqueados em meios de placa BHIS (infusão de coração Braine 37 g/L, sorbitol 91 g/L, e ágar 2 %) contendo canamicina (25 μg/mL) e X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolin-D-galactosídeo) e cultivado para obter colônias. Entre as colônias, colônias azuis foram selecionadas e desse modo cepas introduzidas com os plasmídeos pDZ-1’sugR(GTG), pDZ- 1’sugR(TTG) e pDZ-1’sugR(B6) foram selecionadas.
[0093]As cepas selecionadas foram cultivadas com agitação (30 °C, 8 horas) em meio CM (glicose 10 g/L, polipeptona 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L, extrato de carne 5 g/L, NaCl 2,5 g/L, ureia 2 g/L, pH 6,8) e sequencialmente diluídas de10-4 a 10-10, plaqueados em um meio sólido contendo X-gal, e cultivadas para formar colônias.
[0094]Entre as colônias assim formadas, colônias brancas que apareceram em uma taxa relativamente baixa foram selecionadas e as cepas em que o códon de iniciação de sugR foi alterado em GTG ou TTG por um cruzamento secundário ou as cepas em que o promotor foi alterado em B6 foram finalmente selecionadas. Com respeito às cepas selecionadas finalmente, PCR foi realizada usando um par de iniciador de SEQ ID NOS: 43 e 47 e confirmou que o códon de iniciação de sugR foi alterado em GTG ou TTG, ou o promotor foi convertido a um promotor enfraquecido com B6, e as cepas modificadas de Corynebacterium glutamicum foram nomeadas como sugR KCCM11240P (GTG), sugR KCCM11240P (TTG), sugR KCCM11240P (B6).
[0095]DAB12-a ΔNCgl1469 (Publicação de Pedido de Patente Coreana No 10-2014-0115244), que é uma cepa à base de ATCC13869 Corynebacterium glutamicum tendo produtividade de putrescina, foi nomeada como DAB12-b, e uma cepa enfraquecida por sugR foi preparada com base na cepa DAB12-b.
[0096]Especificamente, de modo a confirmar as sequências do gene que codificam SugR derivado de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 e a proteína expressada a partir da mesma, PCR foi realizada usando o DNA genômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 como um modelo junto com um par de iniciador de SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 49. [Tabela 3]
[0097]Em particular, PCR foi realizada por 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, recozimento a 55 °C por 30 segundos, e extensão a 72 °C por 1 minuto e 30 segundos.
[0098]Os produtos PCR assim obtidos foram separados por eletroforese e submetidos à análise de sequência, e como um resultado, foi confirmado que o gene que codifica SugR derivado de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 inclui uma sequência de polinucleotídeo descrita por SEQ ID NO: 4. A comparação da sequência de proteína sendo codificada a partir da mesma e a sequência de aminoácidos do SugR derivado de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (SEQ ID NO: 1) revelou que sua homologia foi 99 %.
[0099]De modo a alterar o códon de iniciação de sugR derivado de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 e substituir o promotor enfraquecido com B6, PCR foi realizada como no Exemplo 1-1 usando o DNA genômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 como um modelo junto com os iniciadores descritos nas Tabelas 1 e 2 acima, e os fragmentos de PCR da região a montante e da região a jusante do códon de iniciação de sugR foram amplificados, respectivamente, e depois submetidos à eletroforese para obter os fragmentos desejados. Em particular, PCR foi realizada por 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, recozimento a 55 °C por 30 segundos, e extensão a 72 °C por 30 segundos. Os fragmentos assim obtidos foram submetidos à eletroforese em um gel de agarose a 0,8 %, e as bandas de tamanhos desejados foram eluídas e purificadas.
[00100]O vetor pDZ foi tratado com BamHI e SalI e depois, os produtos PCR da cepa ATCC13032 foram submetidos à clonagem por fusão. A clonagem por fusão foi realizada usando o Kit de Clonagem HD In-Fusion® (Clontech). Como tal, os plasmídeos pDZ-2’sugR(GTG), pDZ-2’sugR(TTG) e pDZ-2’sugR(B6) foram preparados.
[00101]Os plasmídeos pDZ-2’sugR(GTG), pDZ-2’sugR(TTG) e pDZ- 2’sugR(B6) foram transformados em Corynebacterium glutamicum DAB12-b na mesma maneira como no Exemplo 1-1, e as cepas em que o códon de iniciação de sugR foi alterado e/ou o promotor foi convertido a um promotor enfraquecido com B6 foram selecionadas. As cepas modificadas assim selecionadas de Corynebacterium glutamicum foram nomeadas como DAB12-b sugR(GTG), DAB12-b sugR(TTG) e DAB12-b sugR(B6), respectivamente.
[00102]De modo a confirmar o efeito de realçar a atividade de gltA, que é citrato sintase, em uma cepa tendo produtividade de putrescina, uma cepa modificada foi preparada em que gene gltA foi introduzido em um gene de transposão dentro do cromossomo da cepa tendo produtividade de putrescina. O vetor pDZTn (WO 2009/125992) para transformação, que pode introduzir um gene no cromossomo, e a região do gene de transposão do micro-organismo do gênero Corynebacterium foi usada.
[00103]Os fragmentos de gene gltA foram amplificados usando o DNA genômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 como um modelo junto com os iniciadores de SEQ ID NOS: 50 e 51 (Tabela 4). Em particular, PCR foi realizada por 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, recozimento a 55 °C por 30 segundos, e extensão a 72 °C por 30 segundos ou 1 minuto e 30 segundos. Os fragmentos assim obtidos foram submetidos à eletroforese em um gel de agarose a 0,8 %, e as bandas de tamanhos desejados foram eluídas e purificadas.
[00104]O vetor pDZTn foi tratado com SpeI e depois, os produtos PCR foram submetidos à clonagem por fusão, respectivamente. A clonagem por fusão foi realizada usando o Kit de Clonagem HD In-Fusion® (Clontech). O plasmídeo assim obtido foi nomeado como pDZTn1’-gltA.
[00105]O plasmídeo assim preparado foi introduzido na cepa KCCM11240P por eletroporação para obter um transformante, e o transformante foi cultivado com agitação (30 °C, 8 horas) em meio CM (glicose 10 g/L, polipeptona 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L, extrato de carne 5 g/L, NaCl 2,5 g/L, ureia 2 g/L, pH 6,8), sequencialmente diluído de 10-4 a 10-10, plaqueado em um meio sólido contendo X- gal e cultivado para formar colônias.
[00106]Entre as colônias assim formadas, colônias brancas que apareceram em uma taxa relativamente baixa foram selecionadas e a cepa em que o gene que codifica gltA foi introduzido por um cruzamento secundário foi finalmente selecionada. Com respeito à cepa selecionada finalmente, foi confirmado que PCR foi realizada usando um par de iniciador de SEQ ID NOS: 50 e 51 e que o gene que codifica gltA foi introduzido nele, e a cepa modificada de Corynebacterium glutamicum foi nomeada como KCCM11240P Tn::gltA.
[00107]Com respeito à cepa DAB12-b usada no Exemplo 1-2, uma cepa aprimorada com gltA foi preparada.
[00108]Especificamente, de modo a confirmar as sequências do gene que codificam gltA derivado de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 e a proteína expressada a partir da mesma, PCR foi realizada usando o DNA genômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 como um modelo junto com um par de iniciador de SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 51.
[00109]Em particular, PCR foi realizada por 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, recozimento a 55 °C por 30 segundos, e extensão a 72 °C por 1 minuto e 30 segundos. Os produtos PCR assim obtidos foram separados por eletroforese e submetidos à análise de sequência, e como um resultado, foi confirmado que o gene que codifica gltA derivado de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 inclui uma sequência de polinucleotídeo descrita por SEQ ID NO: 8. A comparação da sequência de proteína sendo codificada a partir da mesma e a sequência de aminoácidos do GltA derivado de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (SEQ ID NO: 5) revelou que sua homologia foi 99 %.
[00110]De modo a realçar o GltA derivado de Corynebacterium glutamicum ATCC13869, PCR foi realizada como no Exemplo 2-1 usando o DNA genômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 como um modelo junto com os iniciadores de SEQ ID NOS: 50 e 51 para ampliar fragmentos do gene. Em particular, PCR foi realizada por 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, recozimento a 55 °C por 30 segundos, e extensão a 72 °C por 30 segundos ou 1 minuto e 30 segundos. Os fragmentos de PCR assim obtidos foram submetidos à eletroforese em um gel de agarose a 0,8 %, e as bandas de tamanhos desejados foram eluídas e purificadas.
[00111]O vetor pDZTn foi tratado com SpeI e depois, os produtos PCR foram submetidos à clonagem por fusão, respectivamente. A clonagem por fusão foi realizada usando O Kit de Clonagem HD In-Fusion® (Clontech). O plasmídeo assim obtido foi nomeado como pDZTn2’-gltA. O plasmídeo pDZTn2’-gltA foi transformado na cepa DAB12-b Corynebacterium glutamicum na mesma maneira como no Exemplo 2-1 e desse modo, a cepa em que gltA foi aprimorado foi selecionada. A cepa modificada assim selecionada de Corynebacterium glutamicum foi nomeada como DAB12-b Tn:gltA.
[00112]De modo a confirmar a aprimoramento de produtividade de putrescina das cepas enfraquecidas por sugR preparadas nos Exemplos 1-1 e 1-2 pela inserção do gene gltA, o gene gltA foi introduzido no gene de transposão. Em particular, os vetores pDZTn1’-gltA e pDZTn2’-gltA preparados nos Exemplos 2-1 e 2-2 foram usados.
[00113]Especificamente, o plasmídeo pDZTn1’-gltA foi transformado em Corynebacterium glutamicum KCCM11240P sugR(GTG), -KCCM11240P sugR(TTG), e -KCCM11240P sugR(B6) na mesma maneira como no Exemplo 2-1 para preparar cepas aprimoradas com gltA. As cepas modificadas assim preparadas de Corynebacterium glutamicum foram nomeadas como KCCM11240P sugR(GTG) Tn::gltA, KCCM11240P sugR(TTG) Tn::gltA, e KCCM11240P sugR(B6) Tn::gltA, respectivamente, e dentre elas, KCCM11240P sugR(TTG) Tn::gltA (Corynebacterium glutamicum CC01-1147) foi depositado com o Centro de Cultura dos Micro-organismos Coreano (KCCM) em 28 de novembro de 2014, sob o número de acesso KCCM11615P.
[00114]Adicionalmente, o plasmídeo pDZTn2’-gltA foi transformado em Corynebacterium glutamicum DAB12-b sugR(GTG), -DAB12-b sugR(TTG), e - DAB12-b sugR(B6) na mesma maneira como no Exemplo 2-2 para preparar as cepas aprimoradas com gltA. As cepas modificadas assim preparadas de Corynebacterium glutamicum foram nomeadas como DAB12-b sugR(GTG) Tn::gltA, DAB12-b sugR(TTG) Tn::gltA, e DAB12-b sugR(B6) Tn::gltA, respectivamente.
[00115]De modo a confirmar o efeito de enfraquecimento de sugR e aprimoramento de gltA em cepas tendo produtividade de putrescina na produção de putrescina, a produtividade de putrescina foi comparada entre as cepas modificadas de Corynebacterium glutamicum tendo produtividade de putrescina preparada nos Exemplos 1, 2 e 3.
[00116]Especificamente, 6 diferentes tipos de cepas modificadas de Corynebacterium glutamicum, isto é, (KCCM11240P sugR (GTG) Tn::gltA/KCCM11240P sugR (TTG) Tn::gltA/KCCM11240P sugR (B6) Tn::gltA/DAB12-b sugR (GTG) Tn::gltA/DAB12-b sugR (TTG) Tn::gltA, e DAB12-b sugR (B6) Tn::gltA)), e 2 diferentes tipos de cepa precursoras (isto é, KCCM11240P e DAB12-b) foram respectivamente plaqueados em meios de placa CM contendo arginina 1 mM (1 % de glicose, 1 % de polipeptona, 0,5 % de extrato de levedura, 0,5 % de extrato de carne, 0,25 % de NaCl, 0,2 % de ureia, 100 l de 50 % de NaOH, 2 % de ágar, pH 6,8, com base em 1 L), e cultivados a 30 °C por 24 horas.
[00117]Cada uma das cepas cultivadas a partir da mesma em uma quantidade de cerca de um loop de platina foi inoculada em 25 mL de meio de titulação (8 % de glicose, 0,25 % de proteína de soja, 0,50 % de sólidos íngremes de milho, 4 % de (NH4)2SO4, 0,1 % de KH2PO4, 0,05 % de MgSO4-7H2O, 0,15 % de ureia, biotina 100 g, tiamina HCl 3 mg, ácido pantotênico de cálcio 3 mg, nicotinamida 3 mg, 5 % de CaCO3, com base em 1 L), e cultivada com agitação a 30 °C em uma taxa de 200 rpm por 50 horas.
[00118]Em todas as culturas de cepas, arginina 1 mM foi adicionada aos meios. Após a conclusão da cultura, a concentração de putrescina produzida em cada cultura foi medida e osa resultados são mostrados na Tabela 5 abaixo. [Tabela 5]
[00119]Como mostrado na Tabela 5 acima, as cepas modificadas de Corynebacterium glutamicum com sugR enfraquecido ou gltA aprimorado mostraram um aumento na produtividade de putrescina em comparação com a cepa não modificada, KCCM11240P, por 3 % a 9 %, e também, as cepas modificadas de Corynebacterium glutamicum com sugR enfraquecido ou gltA aprimorado simultaneamente mostraram um aumento na produtividade de putrescina por 9 % a 17 %.
[00120]Adicionalmente, as cepas modificadas da cepa DAB12-b com sugR enfraquecido ou gltA aprimorado mostraram um aumento na produtividade de putrescina em comparação com a cepa não modificada, por 4 % a 9 % e também, as cepas modificadas da cepa DAB12-b com sugR enfraquecido ou gltA aprimorado simultaneamente mostraram um aumento na produtividade de putrescina por 10 % a 13 %.
[00121]De modo a confirmar se a cepa KCCM11401P com capacidade aumentada de secreção de putrescina (Publicação de Pedido de Patente Coreana No 10-2014-0115244) pode aprimorar a produtividade de putrescina pelo enfraquecimento da atividade de gene sugR e a aprimoramento da atividade de gene gltA, cepas modificadas foram preparadas.
[00122]Especificamente, primeiro, os plasmídeos pDZ-1’sugR(GTG), pDZ- 1’sugR(TTG), e pDZ-1’sugR(B6) preparados no Exemplo 1-1 foram transformados em Corynebacterium glutamicum KCCM 11401P, e as cepas em que o códon de iniciação de sugR foi convertido para TTG resultou assim em enfraquecimento de sugR foram selecionadas a partir das mesmas. A cepas modificadas assim selecionadas de Corynebacterium glutamicum foram nomeadas como KCCM11401P sugR(GTG), KCCM11401P sugR(TTG) e KCCM11401P sugR(B6), respectivamente.
[00123]Então, de modo a confirmar se a produtividade de putrescina pode ser aprimorada pela aprimoramento da atividade de gene gltA, o gene gltA foi introduzido em um gene de transposão das cepas com gene sugR enfraquecido preparado acima. Em particular, o vetor pDZTn1’-gltA preparado no Exemplo 2-1 foi usado.
[00124]Especificamente, o plasmídeo pDZTn1’-gltA preparado no Exemplo 2-1 foi transformado em KCCM11401P sugR(GTG), KCCM11401P sugR(TTG), e KCCM11401P sugR(B6), e as cepas aprimoradas com gltA foram selecionadas. A cepas modificadas assim selecionadas de Corynebacterium glutamicum foram nomeadas como KCCM11401P sugR(GTG) Tn::gltA, KCCM11401P sugR(TTG) Tn::gltA e KCCM11401P sugR(B6) Tn::gltA.
[00125]De modo a confirmar o efeito de enfraquecimento de sugR e aprimoramento de gltA em cepas tendo produtividade de putrescina com respeito à sua produção de putrescina, a produtividade de putrescina foi comparada entre as cepas modificadas de Corynebacterium glutamicum preparadas no Exemplo 5-1.
[00126]Especificamente, 7 diferentes tipos de cepas modificadas de Corynebacterium glutamicum (isto é, (KCCM11401P sugR(GTG), KCCM11401P sugR(TTG), KCCM11401P sugR(B6), KCCM11401P Tn::gltA, KCCM11401P sugR(GTG) Tn::gltA, KCCM11401P sugR(TTG) Tn::gltA, e KCCM11401P sugR(B6) Tn::gltA) e uma cepa precursora única (KCCM11401P) foram respectivamente plaqueados em meios de placa CM contendo arginina 1 mM (1 % de glicose, 1 % de polipeptona, 0,5 % de extrato de levedura, 0,5 % de extrato de carne, 0,25 % de NaCl, 0,2 % de ureia, 100 l de 50 % de NaOH, 2 % de ágar, pH 6,8, com base em 1 L), e cultivados a 30 °C por 24 horas.
[00127]Cada uma das cepas cultivadas a partir da mesma em uma quantidade de cerca de um loop de platina foi inoculada em 25 mL de meio de titulação (8 % de glicose, 0,25 % de proteína de soja, 0,50 % de sólidos íngremes de milho, 4 % de (NH4)2SO4, 0,1 % de KH2PO4, 0,05 % de MgSO4'7H2O, 0,15 % de ureia, biotina 100 g, tiamina HCl 3 mg, ácido pantotênico de cálcio 3 mg, nicotinamida 3 mg, 5 % de CaCO3 1 L, com base em 1 L), e cultivada com agitação a 30 °C em uma taxa de 200 rpm por 50 horas. [Tabela 6]
[00128]Como mostrado na Tabela 6 acima, as cepas modificadas de Corynebacterium glutamicum com sugR enfraquecido ou gltA aprimorado mostraram um aumento na produtividade de putrescina em comparação com a cepa não modificada, KCCM11401P, por 2 % a 6 %, e também, as cepas modificadas de Corynebacterium glutamicum com sugR enfraquecido ou gltA aprimorado simultaneamente mostraram um aumento na produtividade de putrescina por 9 % a 15 % na produtividade de putrescina. Foi confirmado que os resultados concordaram com a interpretação dos resultados da Tabela 5.
[00129]De modo a confirmar se o enfraquecimento de sugR derivado de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 tem um efeito na produtividade de ornitina, cepas modificadas foram preparadas usando os vetores preparados no Exemplo 1-1.
[00130]Os plasmídeos preparados no Exemplo 1-1, isto é, pDZ- 1’sugR(GTG), pDZ-1’sugR(TTG), e pDZ-1’sugR(B6), foram introduzidos na cepa KCCM11137P (Patente Coreana No 10-1372635), que foi preparada usando Corynebacterium glutamicum ATCC13032 como a cepa precursora, por eletroporação para obter transformantes, e os transformantes foram plaqueados em meios de placa BHIS (infusão de coração Braine 37 g/L, sorbitol 91 g/L, e ágar 2 %) contendo canamicina (25 μg/mL) e X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolin-D-galactosídeo) e cultivados para obter colônias. Entre as colônias, colônias azuis foram selecionadas e desse modo cepas introduzidas com os plasmídeos pDZ- 1’sugR(GTG), pDZ-1’sugR(TTG), e pDZ-1’sugR(B6) foram selecionadas.
[00131]As cepas selecionadas foram cultivadas com agitação (30 °C, 8 horas) em meio CM (glicose 10 g/L, polipeptona 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L, extrato de carne 5 g/L, NaCl 2,5 g/L, ureia 2 g/L, pH 6,8) e sequencialmente diluídas de 10-4 a 10-10, plaqueadas em um meio sólido contendo X-gal, e cultivadas para formar colônias. Entre as colônias assim formadas, colônias brancas que apareceram em uma taxa relativamente baixa foram selecionadas e as cepas, em que o códon de iniciação de sugR foi alterado em GTG ou TTG por um cruzamento secundário ou as cepas em que o promotor foi alterado em B6 foram finalmente selecionadas. Com respeito às cepas selecionadas finalmente, PCR foi realizada usando um par de iniciador de SEQ ID NO: 43 e 47 e depois, confirmou que o códon de iniciação de sugR foi alterado em GTG ou TTG. As cepas modificadas obtidas de Corynebacterium glutamicum foram nomeadas como KCCM11137P sugR(GTG), KCCM11137P sugR(TTG) e KCCM11137P sugR(B6), respectivamente.
[00132]De modo a confirmar o efeito de realçar o gene gltA em uma cepa tendo produtividade de ornitina na sua produção de ornitina, uma cepa modificada foi preparada inserindo-se o Gene gltA no cromossomo da cepa tendo produtividade de ornitina usando os vetores preparados no Exemplo 2-1.
[00133]Especificamente, os vetores preparados no Exemplo 2-1 foram introduzidos na cepa KCCM11137P (Patente Coreana No 10-1372635) por eletroporação para obter transformantes, e os transformantes foram cultivados com agitação (30 °C, 8 horas) em meio CM (glicose 10 g/L, polipeptona 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L, extrato de carne 5 g/L, NaCl 2,5 g/L, ureia 2 g/L, pH 6,8), sequencialmente diluído de 10-4 a 10-10, plaqueados em um meio sólido contendo X- gal e cultivado para formar colônias.
[00134]Entre as colônias assim formadas, colônias brancas que apareceram em uma taxa relativamente baixa foram selecionadas e a cepa em que o gene que codifica gltA foi introduzido por um cruzamento secundário foi finalmente selecionado. Com respeito à cepa selecionada finalmente, PCR foi realizada usando um par de iniciador de SEQ ID NOS: 50 e 51 e confirmou que o gene que codifica gltA foi introduzido nele, e a cepa modificada de Corynebacterium glutamicum foi nomeada como KCCM11137P Tn::gltA.
[00135]De modo a confirmar o efeito de realçar a atividade de produtividade de ornitina enfraquecido por sugR KCCM11137P sugR(GTG), KCCM11137P sugR(TTG) e KCCM11137P sugR(B6) preparado no Exemplo 6 pela inserção do Gene gltA no cromossomo, o gene gltA foi introduzido em um gene de transposão. Em particular, o vetor pDZTn1’-gltA preparado no Exemplo 2-1 foi usado. O plasmídeo pDZTn1’-gltA foi transformado no Corynebacterium glutamicum KCCM11137P sugR TTG) na mesma maneira como no Exemplo 2-1 e cepas aprimoradas com gltA foram selecionadas. A cepas modificadas assim selecionadas de Corynebacterium glutamicum foram nomeadas como KCCM11137P sugR(GTG) Tn::gltA, KCCM11137P sugR(TTG) Tn::gltA, e KCCM11137P sugR(B6) Tn::gltA, respectivamente.
[00136]De modo a confirmar o efeito de enfraquecimento de sugR e aprimoramento de gltA em cepas tendo produtividade de ornitina com respeito a sua produção de ornitina, a produtividade de ornitina foi comparada entre as cepas modificadas de Corynebacterium glutamicum preparadas no Exemplo 8-1.
[00137]Especificamente, 7 diferentes tipos de cepas modificadas de Corynebacterium glutamicum (isto é, (KCCM11137P sugR(GTG), KCCM11137P sugR(TTG), KCCM11137P sugR(B6), KCCM11137P Tn::gltA, KCCM11137P sugR(GTG) Tn::gltA, KCCM11137P sugR(TTG) Tn::gltA, e KCCM11137P sugR(B6) Tn::gltA) e uma cepa precursora única (KCCM11137P) foram respectivamente plaqueados em meios de placa CM contendo arginina 1 mM (1 % de glicose, 1 % de polipeptona, 0,5 % de extrato de levedura, 0,5 % de extrato de carne, 0,25 % de NaCl, 0,2 % de ureia, 100 l de 50 % de NaOH, 2 % de ágar, pH 6,8, com base em 1 L), e cultivados a 30 °C por 24 horas.
[00138]Cada uma das cepas cultivadas a partir da mesma em uma quantidade de cerca de um loop de platina foi inoculada em 25 mL de meio de titulação (8 % de glicose, 0,25 % de proteína de soja, 0,50 % de sólidos íngremes de milho, 4 % de (NH4)2SO4, 0,1 % de KH2PO4, 0,05 % de MgSO4-7H2O, 0,15 % de ureia, biotina 100 g, tiamina HCl 3 mg, ácido pantotênico de cálcio 3 mg, nicotinamida 3 mg, 5 % de CaCO3 com base em 1 L), e cultivada com agitação at 30 °C em uma taxa de 200 rpm por 50 horas. Em todas as culturas de cepas, arginina 1 mM foi adicionada aos meios. Após a conclusão da cultura, a concentração de ornitina produzida em cada cultura foi medida e os resultados são mostrados na Tabela 7 abaixo. [Tabela 7]
[00139]Como mostrado na Tabela 7 acima, as cepas modificadas de Corynebacterium glutamicum com sugR enfraquecido ou gltA aprimorado mostraram um aumento na produtividade de ornitina em comparação com a cepa não modificada, KCCM11137P, por 7 % a 10 %, e também, as cepas modificadas de Corynebacterium glutamicum com sugR enfraquecido ou gltA aprimorado simultaneamente mostraram um aumento na produtividade de ornitina por 12 % a 17 % na produtividade de ornitina.
[00140]Conclusivamente, em uma cepa Corynebacteriuma que produz putrescina ou ornitina, foi confirmada que a produção de putrescina e ornitina pode ser aumentada por enfraquecimento sugR ou realce gltA, e quando gltA foi aprimorado enquanto sugR enfraquece, a produção de putrescina e ornitina foi aumentada mais significantemente.
[00141]Do que precede, uma pessoa habilitada na técnica a qual a presente invenção pertence será capaz de compreender que a presente invenção pode ser incorporada em outras formas específicas sem modificar os conceitos técnicos ou características essenciais da presente invenção. A este respeito, as modalidades exemplares divulgadas aqui são apenas para propósitos ilustrativos e não devem ser interpretadas como limitativas do escopo da presente invenção. Pelo contrário, a presente invenção é intencionada a cobrir não apenas as modalidades exemplares, mas também várias alternativas, modificações, equivalentes, e outras modalidades que podem ser incluídas dentro do espírito e escopo da presente invenção como definidas pelas reivindicações anexas.
Claims (13)
1. Micro-organismo modificado do gênero Corynebacterium que produz putrescina ou ornitina CARACTERIZADO pelo fato de que uma atividade de regulador transcricional de metabolismo de açúcar (SugR) é enfraquecida em comparação com a sua atividade endógena e uma atividade de citrato sintase (GltA) é aprimorada em comparação com a sua atividade endógena, em que o micro-organismo do gênero Corynebacterium é selecionado dentre o grupo consistindo em Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum e Brevibacterium lactofermentum, em que a atividade de SugR é enfraquecida por: 2) deletar uma parte ou a totalidade de um polinucleotídeo que codifica a proteína; 3) modificar a sequência de controle de expressão para reduzir a expressão do polinucleotídeo; 4) modificar a sequência de polinucleotídeo nos cromossomos para enfraquecer a atividade da proteína; ou 5) um método selecionado de uma combinação do mesmo; e a atividade de GltA é aprimorada por: 1) aumentar o número de cópias de um polinucleotídeo que codifica a enzima; 2) modificar a sequência de controle de expressão para aumentar a expressão do polinucleotídeo; 3) modificar a sequência de polinucleotídeo no cromossomo para realçar a atividade da enzima; ou 4) modificar por uma combinação do mesmo, em que o SugR e o GltA são codificados pelo gene sugR e gltA, respectivamente.
2. Micro-organismo modificado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o regulador transcricional de metabolismo de açúcar consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3.
3. Micro-organismo modificado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a citrato sintase consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7.
4. Micro-organismo modificado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o micro-organismo do gênero Corynebacterium é Corynebacterium glutamicum.
5. Micro-organismo modificado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que uma atividade de ornitina decarboxilase (ODC) é ainda introduzida, em que a ornitina decarboxilase consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.
6. Micro-organismo modificado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que uma atividade de i) ornitina carbamoiltransferase (ArgF), ii) exportador de glutamato, ou iii) ornitina carbamoiltransferase e exportador de glutamato são ainda enfraquecidas em comparação com a sua atividade endógena, em que a ornitina carbamoiltransferase é codificada pelo gene argF, e o exportador de glutamato consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15.
7. Micro-organismo modificado, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a ornitina carbamoiltransferase consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 11.
8. Micro-organismo modificado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que uma atividade de pelo menos um selecionado dentre o grupo consistindo em acetil-gama-glutamil-fosfato redutase (ArgC), acetilglutamato sintase ou ornitina acetiltransferase (ArgJ), acetilglutamato cinase (ArgB) e acetilornitina aminotransferase (ArgD) é ainda aprimorada em comparação com a sua atividade endógena, em que a acetil-gama-glutamil-fosfato redutase é codificada pelo gene argC, a acetilglutamato sintase ou ornitina acetiltransferase é codificada pelo gene argJ, a acetilglutamato cinase é codificado pelo gene argB e a acetilornitina aminotransferase é codificada pelo gene argD.
9. Micro-organismo modificado, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a acetil-gama-glutamil-fosfato redutase consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 21, a acetilglutamato sintase ou ornitina acetiltransferase consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 25, o acetilglutamato cinase consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 29, e o acetilornitina aminotransferase consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 33.
10. Micro-organismo modificado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que uma atividade de acetiltransferase é ainda enfraquecida em comparação com a sua atividade endógena, em que a acetiltransferase consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 37.
11. Micro-organismo modificado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que uma atividade de uma proteína consistindo em SEQ ID NO: 39 ou SEQ ID NO: 41 é ainda aprimorada em comparação com a sua atividade endógena.
12. Método para produzir putrescina ou ornitina CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (i) cultivar o micro-organismo do gênero Corynebacterium, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em um meio; e (ii) recuperar putrescina ou ornitina do micro-organismo cultivado ou do meio cultivado.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o micro-organismo do gênero Corynebacterium é Corynebacterium glutamicum.
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