CN115197954A - 用于发酵生产1,5-戊二胺的重组dna、菌株及其用途 - Google Patents

用于发酵生产1,5-戊二胺的重组dna、菌株及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN115197954A
CN115197954A CN202110402224.5A CN202110402224A CN115197954A CN 115197954 A CN115197954 A CN 115197954A CN 202110402224 A CN202110402224 A CN 202110402224A CN 115197954 A CN115197954 A CN 115197954A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
sequence
gene
leu
ala
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110402224.5A
Other languages
English (en)
Inventor
雷云凤
徐敏
刘佳
刘修才
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cathay R&D Center Co Ltd
CIBT America Inc
Original Assignee
Cathay R&D Center Co Ltd
CIBT America Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cathay R&D Center Co Ltd, CIBT America Inc filed Critical Cathay R&D Center Co Ltd
Priority to CN202110402224.5A priority Critical patent/CN115197954A/zh
Publication of CN115197954A publication Critical patent/CN115197954A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07006—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01018—Lysine decarboxylase (4.1.1.18)

Abstract

本发明提供用于发酵生产1,5‑戊二胺的重组DNA、菌株及其用途。本发明通过使用稳定期特异性启动子调控T7RNA聚合酶基因表达，进一步调控T7启动子控制的L‑赖氨酸脱羧酶在稳定期的足量表达，降低对1,5‑戊二胺耐受过程中的能耗，促进L‑赖氨酸的生产，进而提高1,5‑戊二胺的产量。可选地，可以通过增加促进1,5‑戊二胺排出细胞外的基因表达量，降低胞内1,5‑戊二胺浓度及其对胞内赖氨酸脱羧酶活性的抑制，进而提高1,5‑戊二胺的产量。

Description

用于发酵生产1,5-戊二胺的重组DNA、菌株及其用途
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，具体地说，涉及用于发酵生产1,5-戊二胺的重组DNA、菌株及其用途。
背景技术
1,5-戊二胺的用途相当广泛且在工业生产中具有很高的经济价值，例如可以与二元酸进行聚合反应合成新型尼龙。目前，1,5-戊二胺的生物合成主要利用两种策略进行：发酵生产或体外酶催化。发酵生产1,5-戊二胺是通过赖氨酸脱羧酶(L-lysinedecarboxylase,简称LDC,EC 4.1.1.18)将L-赖氨酸脱去一个羧基而生成。具体的，可以将赖氨酸脱羧酶基因添加至产赖氨酸的微生物例如谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中，从而将赖氨酸生物合成途径延长至1,5-戊二胺生物合成途径。目前已有通过DNA重组技术改造的具有L-赖氨酸生产能力的棒杆菌属和埃希杆菌属的细菌，其效率的提高是通过过表达L-赖氨酸合成途径的相关基因和反馈抑制脱敏的相关基因，或者强化从葡萄糖代谢开始的能量供应途径而实现的。反馈抑制脱敏的相关基因，例如天冬氨酸激酶Ⅲ(LysC)是赖氨酸合成途径中的特异关键酶。然而，由于菌体本身耐受的1,5-戊二胺浓度有限，如果在发酵体系中前期表达了赖氨酸脱羧酶转化生成的1,5-戊二胺过多，就会对菌体造成毒害，从而抑制菌体生长及利用葡萄糖生产L-赖氨酸的过程(Qian,et al.,Biotechnol.Bioeng.2011；108:93–103)。
专利申请WO2019006723A1使用嗜热赖氨酸脱羧酶，通过高温控制酶活性，或中国专利CN201510767145.9通过使用温控型启动子表达赖氨酸脱羧酶，一定程度上改善了发酵前期1，5-戊二胺的产生所造成的细胞毒性问题，但使用高温进行催化又额外增加了能耗和生产成本。因此，需要开发更经济、稳定、高效的1,5-戊二胺生产工艺。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组DNA、包含所述重组DNA的基因工程菌，以实现1,5-戊二胺的稳定、高效、低成本生产。
本发明的作用机制是，通过将在稳定期特异性启动子控制之下的T7 RNA聚合酶基因和在T7启动子控制之下的赖氨酸脱羧酶基因重组插入到细菌染色体中，使用稳定期特异性启动子调控T7 RNA聚合酶基因表达，所表达的T7 RNA聚合酶进一步调控T7启动子，保证L-赖氨酸脱羧酶的足量、稳定表达，大大降低宿主细胞耐受1,5-戊二胺毒害而导致的能耗，从而促进1,5-戊二胺的生产，而整个过程无需使用抗生素、诱导物质等等。可选地，可以进一步结合促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因，例如透过酶(如yebQ、mdtD,cgl2893)，以进一步降低胞内1,5-戊二胺浓度，提高1,5-戊二胺的产量。
第一方面，提供了重组DNA，其包括：
A)在稳定期特异性启动子控制之下的T7 RNA聚合酶基因；和
B)在T7启动子控制之下的赖氨酸脱羧酶基因。
在一些实施方案中，所述重组DNA还包括：
C)促进1,5-戊二胺排出的基因，以促进1,5-戊二胺从细胞排出。任选地，所述促进1,5-戊二胺排出细胞的基因在组成型启动子控制之下。
在一些实施方案中，所述T7 RNA聚合酶基因可以是来源于大肠杆菌例如大肠杆菌(例如BL21(DE3)、JM109(DE3)菌株)的T7 RNA聚合酶基因，噬菌体的T7 RNA聚合酶基因或者合成的T7 RNA聚合酶基因。
在本文中，赖氨酸脱羧酶(简称LDC,EC 4.1.1.18)的基因可以来自微生物、动物或植物的细胞，包括但不局限于大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)或奥克西托克雷白杆菌(Klebsiella oxytoca)等。在一些实施方案中，赖氨酸脱羧酶基因是来自于大肠杆菌的cadA基因或ldcC基因。另外，赖氨酸脱羧酶也可以来自于上述菌株经过诱变或随机突变之后的菌株或基因工程菌。赖氨酸脱羧酶还可以是上述来源的赖氨酸脱羧酶的突变体(包括天然突变体和人工重组突变体)或者活性片段(保留了赖氨酸脱羧酶活性的截短形式的蛋白片段)。
在一些实施方案中，所述稳定期特异性启动子选自pcsiE、pbolA、posmY、pkatE、P21、P22、P23或P24中的任意一种；和/或
所述T7 RNA聚合酶基因可以是来源于大肠杆菌的T7 RNA聚合酶基因、噬菌体的T7RNA聚合酶基因或者合成的T7 RNA聚合酶基因；和/或
所述T7启动子是选自来源于噬菌体、pET30a质粒或者合成的T7启动子；和/或
所述赖氨酸脱羧酶基因可以选自大肠杆菌的cadA基因、ldcC基因、haldc基因、cadA基因的片段、ldcC基因的片段或haldc基因的片段。
在一些实施方案中，所述促进1,5-戊二胺排出的基因是透过酶基因，例如yebQ、mdtD,cgl2893。
在一些实施方案中，所述组成型启动子可以是plac、trp、tac或trc启动子。
在本文中，“在……启动子控制之下”意指，所述启动子序列和基因序列可操作地连接，从而确保所述基因的转录和表达受到该启动子的控制。
在一些实施方案中，pcsiE的序列可以是SEQ ID NO.1；pbolA的序列可以是SEQ IDNO.2；posmY的序列可以是SEQ ID NO.3；pkatE的序列可以是SEQ ID NO.4；P21的序列可以是SEQ ID NO.5；P22的序列可以是SEQ ID NO.6；P23的序列可以是SEQ ID NO.7；P24的序列可以是SEQ ID NO.8。
在一些实施方案中，T7 RNA聚合酶基因的序列可以是SEQ ID NO.28。
在一些实施方案中，赖氨酸脱羧酶基因的序列可以是cadA基因或ldcC基因的序列，例如cadA基因的序列可以是SEQ ID NO.9，cadA蛋白的序列可以是SEQ ID NO.10。
在一些实施方案中，T7启动子可以是选自来源于噬菌体或者合成的T7启动子，例如T7启动子的序列是SEQ ID NO.31。
在一些实施方案中，yebQ基因的序列可以是SEQ ID NO.55，mdtD基因的序列可以是SEQ ID NO.56，cgl2893基因的序列可以是SEQ ID NO.57或SEQ ID NO.13的编码序列。
在本文中所使用的组成型启动子是本领域技术人员所熟知的，其可以使促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因在宿主细胞中表达，例如可以使用plac、trp、tac或trc启动子。例如，plac的序列可以是SEQ ID NO.60。
在一个实例中，提供了重组DNA，其包括：
A)在稳定期特异性启动子控制之下的T7 RNA聚合酶基因，序列选自SEQ IDNOs.61、62、63、64、65、66、67或68；
B)在T7启动子控制之下的赖氨酸脱羧酶基因，序列是SEQ ID NO.36；和
C)在组成型启动子控制之下的促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因，序列选自SEQID NOs.69、70或71。
本领域技术人员理解，为了提高目的基因在宿主细胞中的表达，可以根据该宿主细胞的密码子偏好对目的基因的编码序列进行优化。例如，可以将目的基因的稀有密码子进行同义替换，使之更接近于宿主细胞的密码子使用方式。通过这种方法，提高外源基因在宿主细胞中表达量的报道已有很多。
在本文中，促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因是指，其表达产物促进微生物细胞将1,5-戊二胺排出到细胞外，从而降低胞内1,5-戊二胺浓度及其对胞内赖氨酸脱羧酶活性的抑制，促进1,5-戊二胺的生产。在一些实施方案中，所述促进戊二胺排出的基因包括透过酶的基因。透过酶包括yebQ及其同源蛋白，同源蛋白例如包括mdtD、cgl2893等。更具体地，所述促进戊二胺排出的蛋白还可以是上述蛋白的突变体(包括天然突变体和人工重组突变体)或者活性片段。在一些实施方案中，大肠杆菌透过酶yebQ、mdtD、cgl2893的氨基酸序列可以是SEQ ID NOs.11、12和13，其编码序列可以分别是SEQ ID NOs.55、56和57，其中SEQID NO.57针对大肠杆菌宿主细胞进行了密码子优化。
在本文所述的重组DNA中，稳定期特异性启动子(元件a)和T7 RNA聚合酶蛋白基因(元件b)可操作地连接(表示为a-b)，使得T7 RNA聚合酶基因的转录和表达在稳定期特异性启动子的控制之下；T7启动子(元件c)和赖氨酸脱羧酶基因(元件d)可操作地连接(表示为c-d)，使得赖氨酸脱羧酶的转录和表达在T7启动子的控制之下。优选地，所连接的a-b和c-d可以可操作地连接，实现在宿主细胞中表达的T7 RNA聚合酶对T7启动子进行调控，进一步通过T7启动子控制L-赖氨酸脱羧酶的生产，提高1,5-戊二胺的产量。
在本文所述的重组DNA中，组成型启动子(元件e)和促进戊二胺排出的基因(元件f)可操作的连接(表示为e-f)，使得促进戊二胺排出的基因的转录和表达在组成型启动子的控制之下。可选地，前述所连接的a-b、c-d和e-f可以进行可操作的连接或者独立存在。
第二方面，提供了含有第一方面所述重组DNA的质粒。
在本文中，T7 RNA聚合酶基因和赖氨酸脱羧酶基因可以包含在同一个质粒中。
在本文中，促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因可以包含在与T7 RNA聚合酶基因和赖氨酸脱羧酶基因相同的质粒中；或者，其也可以包含在不同的质粒中，独立于宿主染色体而在宿主细胞内表达。
第三方面，提供了生产1,5-戊二胺的基因工程菌，其包含第一方面所述的重组DNA或者使用第二方面所述的质粒而获得。
在本文中，所述基因工程菌的染色体中包含在所述在稳定期特异性启动子控制之下的T7 RNA聚合酶基因和在T7启动子控制之下的赖氨酸脱羧酶基因。由此，通过使用稳定期特异性启动子调控T7 RNA聚合酶基因表达，进一步调控T7启动子控制的L-赖氨酸脱羧酶在稳定期的表达，降低1,5-戊二胺耐受过程中的能耗，促进L-赖氨酸的生产，进而提高1,5-戊二胺的产量。进一步地，所述基因工程菌还可以通过重组在染色体中包含所述促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因或在所转化的表达质粒中包含所述促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因，由此通过表达促进1,5-戊二胺从细胞排出的蛋白而降低胞内1,5-戊二胺浓度及其对胞内赖氨酸脱羧酶活性的抑制，进而提高1,5-戊二胺的产量。本领域技术人员理解，所述重组DNA通过基因工程手段整合到所述生产1,5-戊二胺的基因工程菌的染色体上。重组DNA插入到出发菌的染色体中，插入位置是生产赖氨酸或1,5-戊二胺所非必须基因的位置，例如upp处。
所述基因工程菌的出发菌株可以选自埃希氏菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、哈夫尼菌属(Hafnia)的菌种，例如大肠杆菌、嗜热菌(Thermus.thermophilus)、蜂房哈夫尼菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌。作为出发菌株，可以使用可生产L-赖氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli)M11A3菌株，该菌株现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC No：M2018456，保藏日期2018年7月6日。
在一个实施方案中，生产1,5-戊二胺的基因工程菌在其染色体中包含：
A)在稳定期特异性启动子控制之下的T7 RNA聚合酶基因，序列选自SEQ IDNOs.61、62、63、64、65、66、67或68；
B)在T7启动子控制之下的赖氨酸脱羧酶基因，序列是SEQ ID NO.36；和
C)通过重组引入的在组成型启动子控制之下的促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因，序列选自SEQ ID NOs.69、70或71。
第四方面，提供了生产1,5-戊二胺的方法，包括培养第三方面所述的基因工程菌。
在一些实施方案中，培养温度为20-50℃。
在本文中，将所述重组DNA构建到具有生产L-赖氨酸能力的工程菌中，发酵培养重组菌并进行赖氨酸积累，发酵培养温度控制在20-50℃，进行菌体的快速生长以及赖氨酸积累，进入发酵稳定期后使赖氨酸脱羧酶大量表达，转化生产1,5-戊二胺。
如本文所用，术语“约”在用于修改温度范围内的数值时表示该数值与该值的合理偏差，例如，在该范围内所述的值之下或之上1℃或2℃以内，是在所述值或范围的预期含义内。
在一些实施方案中，培养在约25℃至约45℃的温度下进行。在其他实施方案中，培养在约30℃至约40℃的温度下进行。在进一步的实施方案中，培养在约35℃至约39℃的温度下进行。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明使用了稳定期的启动子，当菌体生长到稳定期后才会启动T7 RNA聚合酶基因的表达，进而调控T7启动子下游的赖氨酸脱羧酶基因的表达。与表达嗜热赖氨酸脱羧酶或温控启动子表达赖氨酸脱羧酶相比，本发明可以通过在染色体上插入稳定期特异性启动子-T7 RNA聚合酶和T7启动子-赖氨酸脱羧酶，实现赖氨酸脱羧酶稳定和足量的表达，另外，该菌株去除了抗生素、特殊环境条件或其他诱导剂的使用，整个发酵培养过程自调控。
将其应用于1,5-戊二胺生产，可以显著降低细胞生长及L-赖氨酸生产阶段产生的1,5-戊二胺的细胞毒性，提高L-赖氨酸产量；发酵结束后，可以将L-赖氨酸几乎全部转化为1,5-戊二胺，从而实现了1,5-戊二胺产量的增加。同时使用了促进戊二胺排出的蛋白，转化的同时将1,5-戊二胺输出胞外，综合显著地提高重组菌株发酵生产1,5-戊二胺的产量，实现了1,5-戊二胺的稳定、高效、低成本生产。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。应当理解，尽管本文示例了实施本发明的一些实施方案，根据本公开，本领域技术人员会认识到，可以进行众多修改而不脱离本发明的精神和预期范围。还应当理解，本文所用的术语用于仅描述具体实施方案并且不意在是限制性的，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求及其等同物限定。
若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中涉及到的PCR扩增、纯化、质粒提取、酶切、酶切产物连接、转化等的具体步骤、条件参数等均按所购相关酶和试剂的说明书进行。其中PCR扩增所用的DNA聚合酶、酶切所用的限制性内切酶、酶切产物连接所用的连接酶均购自宝生物工程(大连)有限公司。质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒均购自康宁生命科学(吴江)有限公司
Figure BDA0003020837090000071
引物均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司(INVITROGEN)。
以下实施例中涉及到的质粒转化方法如下：将连接产物加至100μl的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30min后，42℃热激90s。冰上孵育5min后加入1ml的LB。涂布至相对应的抗性平板上。
本发明中，培养基中L-赖氨酸和1,5-戊二胺的量可以通过核磁共振方法检测。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
实施例1 T7 RNA聚合酶基因的克隆
以大肠杆菌K12 MG1655的基因组为模板，引物对UPP-UF(SEQ ID NO：14)和Upp-UR(SEQ ID NO：15)扩增出Upp-U片段(SEQ ID NO：16)，引物对UPP-DF(SEQ ID NO：17)和Upp-DR(SEQ ID NO：18)扩增出Upp-500bp-D(SEQ ID NO：19)片段，引物对UPP-F(SEQ ID NO：20)和Upp-R(SEQ ID NO：21)扩增出Pupp-Upp-D片段(SEQ ID NO：22)。以质粒pBR322为模板，引物对P1P2-tetA-F(SEQ ID NO：23)和P1P2-tetA-R(SEQ ID NO：24)扩增出质粒上包含P1P2启动子和tetA序列的片段P1P2-tetA(SEQ ID NO：25)。将Upp-U、Upp-500bp-D、P1P2-tetA和Pupp-Upp-D片段PCR产物切胶回收后，与EcoRI和NaeI双酶切后的pBR322载体进行连接，使用多片段一步法克隆试剂盒将基因片段和载体进行重组连接。重组连接后的混合物转化至E.coli JM109(购自宝生物工程(大连)有限公司)感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，获得多个单菌落。通过菌落PCR和测序验证正确后，抽提质粒即得到包含Upp-U、Upp-500bp-D、P1P2-tetA和Pupp-Upp-D四个片段的质粒，命名为pBU。
以大肠杆菌BL21(DE3)的基因组为模板，引物对T7 RNA-F/R(序列如SEQ ID NO：26和27所示)，通过PCR扩增获得T7 RNA聚合酶基因片段(SEQ ID NO：28)。将所扩增的T7 RNA聚合酶基因片段和EcoRI单酶切后的pBU载体进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将其两者进行重组连接。重组连接后的混合物转化至E.coli JM109(购自宝生物工程(大连)有限公司)感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，获得多个单菌落。通过菌落PCR和测序验证正确后，抽提质粒即得到pBU-eT7R质粒，该质粒包含了T7 RNA聚合酶序列。
实施例2赖氨酸脱羧酶CadA基因的克隆
以大肠杆菌K12 MG1655的基因组为模板，引物对cadA-F(序列如SEQ ID NO：29所示)和cadA-R(序列如SEQ ID NO：30所示)扩增出CadA基因片段(序列如SEQ ID NO：9所示)，将cadA基因片段和EcoRI单酶切后的pBU载体进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将基因片段和载体进行重组，产生的质粒名为pBU-cadA。
以大肠杆菌K12 MG1655的基因组为模板，引物对cadA-NdeI-F(序列如SEQ ID NO：32所示)和cadA-HindIII-R(序列如SEQ ID NO：33所示)扩增出CadA基因，将PCR产物纯化后用NdeI和HindIII酶切回收，用同样的酶酶切质粒pET30a(购自北京天恩泽基因科技有限公司)并回收，将PCR产物和质粒酶切回收片段连接，产生的质粒名为pET30a-cadA。
以质粒pET30a-cadA为模板，引物对T7-cadA-F(序列如SEQ ID NO：34所示)和T7-cadA-R(序列如SEQ ID NO：35所示)扩增出质粒上包含T7启动子(SEQ ID NO.31)和CadA片段的序列T7-cadA(序列如SEQ ID NO：36所示)。将T7-cadA片段和EcoRI单酶切后的pBU-eT7R载体进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将基因片段和载体进行重组连接。重组连接后的混合物转化至E.coli JM109(购自宝生物工程(大连)有限公司)感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，获得多个单菌落。通过菌落PCR和测序验证正确后，抽提质粒即得到pBU-eT7R-T7-cadA质粒，该质粒包含了T7 RNA聚合酶基因和T7启动子控制下的cadA基因。
实施例3构建pBU-稳定期特异性启动子-eT7R-T7-cadA和pBU-稳定期特异性启动子-cadA质粒
以大肠杆菌K12 MG1655的基因组为模板，分别利用引物pcsiE-F(SEQ ID No：37)/pcsiE-R(SEQ ID No：38),pbolA-F(SEQ ID No：39)/pbolA-R(SEQ ID No：40),posmY-F(SEQID No：41)/posmY-R(SEQ ID No：42),pkatE-F(SEQ ID No：43)/pkatE-R(SEQ ID No：44),pcsiE-F(SEQ ID No：37)/pcsiE-R2(SEQ ID No：45),pbolA-F(SEQ ID No：39)/pbolA-R2(SEQ ID No：46),posmY-F(SEQ ID No：41)/posmY-R2(SEQ ID No：47),pkatE-F(SEQ IDNo：43)/pkatE-R2(SEQ ID No：48)；扩增稳定期特异性启动子pcsiE(SEQ ID No：1)，pbolA(SEQ ID No：2)，posmY(SEQ ID No：3)，pkatE(SEQ ID No：4)，将PCR产物进行切胶回收后，分别与SacI酶切的pBU-eT7R-T7-cadA和pBU-cadA质粒连接，得到pBU-pcsiE-eT7R-T7-cadA，pBU-pbolA-eT7R-T7-cadA，pBU-posmY-eT7R-T7-cadA，pBU-pkatE-eT7R-T7-cadA，pBU-pcsiE-cadA，pBU-pbolA-cadA，pBU-posmY-cadA，和pBU-pkatE-cadA。
使用本领域常用基因序列合成方法分别合成p21、p22、p23和p24 4条启动子的双链DNA序列，然后分别连接至SacI酶切的pBU-eT7R-T7-cadA和pBU-cadA质粒中。得到含有这4个启动子的质粒pBU-p21-eT7R-T7-cadA，pBU-p22-eT7R-T7-cadA，pBU-p23-eT7R-T7-cadA，pBU-p24-eT7R-T7-cadA，pBU-p21-cadA，pBU-p22-cadA，pBU-p23-cadA，pBU-p24-T7-cadA。
实施例4构建1,5-戊二胺生产菌株并检测1,5-戊二胺产量
本发明中出发菌株采用可生产L-赖氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli)M11-A3菌株，该菌株现已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC No：M2018456，保藏日期2018年7月6日。
首先，制备电转感受态，通过热激法转化pKD46质粒至M11-A3感受态，含有100μg/ml氨苄青霉素的LB抗性平板中筛选培养后，挑取单菌落于5mL的LB液体培养基中，30℃，200rpm，培养8h；以1％的接种量转接到50mL含的LB液体培养基中培养至OD600约为0.15，加入1mL 2mM的L-阿拉伯糖溶液，继续培养至OD600为0.4～0.5；随即转入50mL离心管中冰浴20min，使其停止生长；4℃，4000rpm，离心10min，收集菌体；再用40mL预冷的无菌水洗涤菌体，离心收集细胞；重复上述步骤；用20mL预冷的10％甘油洗涤菌体，离心收集细胞；最后用500μL预冷的10％甘油重悬菌体，将得到的M11-A3/pKD46感受态进行分装备用。
以实施例3构建得到的16个质粒(如下表1所示)作为模板，使用引物对upp-UF/upp-R分别扩增获得可用于染色体上同源重组的片段，并进行切胶回收。每个片段分别转入受体菌M11-A3/pKD46菌株中。涂布在含有10μg/ml四环素的LB抗性平板中进行筛选。针对每个质粒转化挑取3个单菌落至添加有氨苄青霉素的600μl LB培养基中，37℃培养8h后，取1μl菌体作为模板进行PCR验证筛选出正确的重组菌株，并甘油保种。
将甘油保种的16株菌株接种至含有0.1ug/mL 5-FU(5-氟尿嘧啶)的LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养8h；取菌液分别划线至含有和不含有5-氟尿嘧啶的LB培养基平板，过夜培养。平板分析显示在含有5-氟尿嘧啶的平板上不能生长的菌株，从对应的不含5-氟尿嘧啶的平板上选取6个单克隆，取1μl菌体作为模板再次进行PCR验证，获得正确的重组株，并甘油保种。
上述重组株各选取3个转化子，与和出发株M11-A3一同分别涂布不含抗生素的种子培养基((含有4％葡萄糖,0.1％KH2PO4,0.1％MgSO4,1.6％(NH4)2SO4,0.001％FeSO4,0.001％MnSO4,0.2％酵母提取物)，于37℃培养过夜。然后，分别各挑取3个单克隆，利用5ml种子培养基(含有4％葡萄糖,0.1％KH2PO4,0.1％MgSO4,1.6％(NH4)2SO4,0.001％FeSO4,0.001％MnSO4,0.2％酵母提取物)进行培养，37℃、225rpm过夜。然后将每个菌株再分别转接至50ml新鲜的发酵培养基(30g/L葡萄糖,0.7％Ca(HCO3)2，0.1％KH2PO4，0.1％MgSO4,1.6％(NH4)2SO4,0.001％FeSO4,0.001％MnSO4,0.2％酵母提取物的培养基)于37℃、170rpm继续培养48h，利用核磁检测并计算各培养基中的1,5-戊二胺的含量(表1)。
表1核磁检测重组株与出发菌株相比的1,5-戊二胺产量及OD600
Figure BDA0003020837090000111
从表1可以看出，使用稳定期特异性启动子直接表达CadA的重组菌株pcsiE-cadA/M11-A3，pbolA-cadA/M11-A3，posmY-cadA/M11-A3，pkatE-cadA/M11-A3，P21-cadA/M11-A3，P22-cadA/M11-A3，P23-cadA/M11-A3，P24-cadA/M11-A3，发酵48h后，检测到0.8～2.3g/kg的L-赖氨酸和1.07～2.06g/kg的1,5-戊二胺，说明赖氨酸脱羧酶表达量偏少，仅将部分L-赖氨酸转化为1,5-戊二胺。
相比之下，使用稳定期的启动子表达T7 RNA聚合酶并使用T7启动子表达cadA的重组菌株pcsiE-eT7R-T7-cadA/M11-A3，pbolA-eT7R-T7-cadA/M11-A3，posmY-eT7R-T7-cadA/M11-A3，pkatE-eT7R-T7-cadA/M11-A3，P21-eT7R-T7-cadA/M11-A3，P22-eT7R-T7-cadA/M11-A3，P23-eT7R-T7-cadA/M11-A3，P24-eT7R-T7-cadA/M11-A3，通过测试发现在发酵48h的时候，使用了T7 RNA聚合酶并使用T7启动子表达cadA的各重组菌株与使用稳定期特异性启动子直接表达cadA的8个重组菌株相比，生成的1,5-戊二胺的产量有进一步的提高，同时L-赖氨酸近乎全部转化为1,5-戊二胺，其中p21-eT7R-T7-cadA/M11-A3菌株1,5戊二胺产量最高，最后积累了2.95g/kg以上的1,5-戊二胺，且几乎没有L-赖氨酸残留。
实施例5构建pBU-p21-eT7R-T7-cadA-plac-yebQ、pBU-p21-cadA-plac-yebQ、pBU-p21-eT7R-T7-cadA-plac-mdtD、pBU-p21-cadA-plac-mdtD、pBU-p21-eT7R-T7-cadA-plac-mcgl2893(“mcgl2893”中的m表示cgl2893经过密码子优化)和pBU-p21-cadA-plac-mcgl2893质粒
以大肠杆菌K12 MG1655的基因组为模板，引物对yebQ-F(序列如SEQ ID NO：49所示)和yebQ-R(序列如SEQ ID NO：50所示)扩增出yebQ基因(SEQ ID NO：55)，引物对mdtD-F(序列如SEQ ID NO：51所示)和mdtD-R(序列如SEQ ID NO：52所示)扩增出mdtD基因(SEQ IDNO：56)。以合成的密码子优化的mcgl2893基因序列为模板，引物对mcgl2893-F(序列如SEQID NO：53所示)和mcgl2893-R(序列如SEQ ID NO：54所示)扩增出mcgl2893基因(SEQ IDNO：57)；以pUC18质粒DNA为模板，引物对plac-F(序列如SEQ ID NO：58示)和plac-R(序列如SEQ ID NO：59所示)扩增出plac启动子(SEQ ID NO：60)；将plac启动子片段、yebQ基因片段和SacI单酶切后的pBU-p21-eT7R-T7-cadA和pBU-p21-cadA质粒进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将基因片段和载体进行重组连接，产生的质粒名为pBU-p21-eT7R-T7-cadA-plac-yebQ和pBU-p21-cadA-plac-yebQ。
将plac启动子片段、mdtD基因片段以及SacI单酶切后的、pBU-p21-eT7R-T7-cadA和pBU-p21-cadA质粒进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将基因片段和载体进行重组连接，产生的质粒名为pBU-p21-eT7R-T7-cadA-plac-mdtD和pBU-p21-cadA-plac-mdtD。
将plac启动子片段、mcgl2893(序列为SEQ ID NO：57)基因片段以及SacI单酶切后的、pBU-p21-eT7R-T7-cadA和pBU-p21-cadA质粒进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将基因片段和载体进行重组连接，产生的质粒名为pBU-p21-eT7R-T7-cadA-plac-mcgl2893和pBU-p21-cadA-plac-mcgl2893。
实施例6构建1,5-戊二胺生产菌株并检测1,5-戊二胺产量
以实施例5构建得到的3对质粒作为模板，使用引物对upp-UF/upp-R分别扩增获得可用于染色体上同源重组的片段，并进行切胶回收。每个片段分别转入受体菌M11-A3/pKD46菌株中。涂布在含有10μg/ml四环素的LB抗性平板中进行筛选。挑取12个单菌落至添加有氨苄青霉素的600μl LB培养基中，37℃培养8h后，取1μl菌体作为模板进行PCR验证筛选正确的重组株，并甘油保种。
将甘油保种的菌株接种至含有0.1ug/mL 5-FU(5-氟尿嘧啶)的LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养8h；取菌液分别划线至含有和不含有5-氟尿嘧啶的LB培养基平板，过夜培养。平板分析显示在含有5-氟尿嘧啶的平板上不能生长的菌株，从对应的不含5-氟尿嘧啶的平板上选取6个单克隆，取1μl菌体作为模板再次进行PCR验证，获得正确的重组株，并甘油保种。
上述重组株各选取3个转化子，出发株M11-A3、P21-eT7R-T7-cadA/M11-A3和P21-cadA/M11-A3作为对照菌株，分别涂布不含抗生素的种子培养基(含有4％葡萄糖,0.1％KH2PO4,0.1％MgSO4,1.6％(NH4)2SO4,0.001％FeSO4,0.001％MnSO4,0.2％酵母提取物)，于37℃培养过夜。然后，分别各挑取3个单克隆，利用5ml种子培养基(含有4％葡萄糖,0.1％KH2PO4,0.1％MgSO4,1.6％(NH4)2SO4,0.001％FeSO4,0.001％MnSO4,0.2％酵母提取物)进行培养，37℃、225rpm过夜。然后将每个菌株再分别转接至50ml新鲜的发酵培养基(30g/L葡萄糖,0.7％Ca(HCO3)2，0.1％KH2PO4，0.1％MgSO4,1.6％(NH4)2SO4,0.001％FeSO4,0.001％MnSO4,0.2％酵母提取物的培养基)中于37℃、170rpm继续培养48h，利用核磁检测并计算各培养基中的戊二胺的含量(表2)。
如表2所示，表达促进1,5-戊二胺排出蛋白的菌株P21-eT7R-T7-cadA-plac-yebQ/M11-A3，P21-eT7R-T7-cadA-plac-mdtD/M11-A3，与P21-eT7R-T7-cadA/M11-A3重组菌株相比，生成的1,5-戊二胺的产量有进一步的提高，同时L-赖氨酸近乎全部转化为1,5-戊二胺，其中P21-eT7R-T7-cadA-plac-yebQ/M11-A3菌株1,5戊二胺产量最高，最后积累了3.58g/kg以上的1,5-戊二胺，且几乎没有L-赖氨酸残留。
表2核磁检测重组株与出发菌株相比的戊二胺产量及OD600
Figure BDA0003020837090000141
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
SEQ ID NO.1，稳定期启动子pcsiE序列，来源于大肠杆菌K12 MG1655
TGCTTTTTCCGATCGTCACGGCGATGTTTATCGCGAACAGATGGTGGACTTTATCCTTAGCGCGTTGAATCCGCAGAACTAACCCATGATCGCTAGCACGATAATCATTCACAAAACCACCTTAAGACATGCTAATCCACTGGTCAGAACAGTTTAAGATGAGAAAAATTCTGTGACGCTTGCCAACATTTCTGATGATTAGCATTCCCTTCGCCATTTCCTTGAGCAAACTTTA
SEQ ID NO.2，稳定期启动子pbolA序列，来源于大肠杆菌K12 MG1655
TGTTTGGTAAAAATTCCCGCCATCATAACATTGCCAACGGCGAGGGGAAGTGGGTAAGGCATGTAAATTCATCATGTTGACGAAATAATCGCCCCTGGTAAAAGAAACACTGATGCGAGGCCTGTGTTTCAATCTTTAAATCAGTAAACTTCATACGCTTGACGGAAAAACCAGGACGAAACCTAAATATTTGTTGTTAAGCTGCAATGGAAACGGTAAAAGCGGCTAGTATTTAAAG
SEQ ID NO.3，稳定期启动子posmY序列，来源于大肠杆菌K12 MG1655
CTCGCTTACATCGCTACCAGCATGGTCAACCTGCGCCTGGCACAGGAACGTTATCCGGACGTTCAGTTCCACCAGACCCGCGAGCATTAATTCTTGCCTCCAGGGCGCGGTAGCCGCTGCGCCCTGTCAATTTCCCTTCCTTATTAGCCGCTTACGGAATGTTCTTAAAACATTCACTTTTGCTTATGTTTTCGCTGATATCCCGAGCGGTTTCAAAATTGTGATCTATATTT
SEQ ID NO.4，稳定期启动子pkatE序列，来源于大肠杆菌K12 MG1655
GCAGAAATGACTCTCCCATCAGTACAAACGCAACATATTTGCCACGCAGCATCCAGACATCACGAAACGAATCCATCTTTATCGCATGTTCTGGCGGCGCGGGTTCCGTGCGTGGGACATAGCTAATAATCTGGCGGTTTTGCTGGCGGAGCGGTTTCTTCATTACTGGCTTCACTAAACGCATATTAAAAATCAGAAAAACTGTAGTTTAGCCGATTTAGCCCCTGTACGTCCCGC
SEQ ID NO.5，P21序列，人工合成的序列
CACTCCCGCC TTTAGGGGTC AAAATTGTTC TATACTGTAT TG
SEQ ID NO.6，p22序列，人工合成的序列
TCCCGCCAAATTCCCAATTT TGTTCTATAC TGTATTG
SEQ ID NO.7，p23序列，人工合成的序列
TCCCGCCTTT AGGGGTGAAT TGTTCTATAC TGAATTG
SEQ ID NO.8，p24序列，人工合成的序列
TCCCGCCTTT AGGGGCTAAT TGTTCTATAC TGAAATG
SEQ ID NO.9，cadA基因序列，来源于大肠杆菌
ATGAACGTTATTGCAATATTGAATCACATGGGGGTTTATTTTAAAGAAGAACCCATCCGTGAACTTCATCGCGCGCTTGAACGTCTGAACTTCCAGATTGTTTACCCGAACGACCGTGACGACTTATTAAAACTGATCGAAAACAATGCGCGTCTGTGCGGCGTTATTTTTGACTGGGATAAATATAATCTCGAGCTGTGCGAAGAAATTAGCAAAATGAACGAGAACCTGCCGTTGTACGCGTTCGCTAATACGTATTCCACTCTCGATGTAAGCCTGAATGACCTGCGTTTACAGATTAGCTTCTTTGAATATGCGCTGGGTGCTGCTGAAGATATTGCTAATAAGATCAAGCAGACCACTGACGAATATATCAACACTATTCTGCCTCCGCTGACTAAAGCACTGTTTAAATATGTTCGTGAAGGTAAATATACTTTCTGTACTCCTGGTCACATGGGCGGTACTGCATTCCAGAAAAGCCCGGTAGGTAGCCTGTTCTATGATTTCTTTGGTCCGAATACCATGAAATCTGATATTTCCATTTCAGTATCTGAACTGGGTTCTCTGCTGGATCACAGTGGTCCACACAAAGAAGCAGAACAGTATATCGCTCGCGTCTTTAACGCAGACCGCAGCTACATGGTGACCAACGGTACTTCCACTGCGAACAAAATTGTTGGTATGTACTCTGCTCCAGCAGGCAGCACCATTCTGATTGACCGTAACTGCCACAAATCGCTGACCCACCTGATGATGATGAGCGATGTTACGCCAATCTATTTCCGCCCGACCCGTAACGCTTACGGTATTCTTGGTGGTATCCCACAGAGTGAATTCCAGCACGCTACCATTGCTAAGCGCGTGAAAGAAACACCAAACGCAACCTGGCCGGTACATGCTGTAATTACCAACTCTACCTATGATGGTCTGCTGTACAACACCGACTTCATCAAGAAAACACTGGATGTGAAATCCATCCACTTTGACTCCGCGTGGGTGCCTTACACCAACTTCTCACCGATTTACGAAGGTAAATGCGGTATGAGCGGTGGCCGTGTAGAAGGGAAAGTGATTTACGAAACCCAGTCCACTCACAAACTGCTGGCGGCGTTCTCTCAGGCTTCCATGATCCACGTTAAAGGTGACGTAAACGAAGAAACCTTTAACGAAGCCTACATGATGCACACCACCACTTCTCCGCACTACGGTATCGTGGCGTCCACTGAAACCGCTGCGGCGATGATGAAAGGCAATGCAGGTAAGCGTCTGATCAACGGTTCTATTGAACGTGCGATCAAATTCCGTAAAGAGATCAAACGTCTGAGAACGGAATCTGATGGCTGGTTCTTTGATGTATGGCAGCCGGATCATATCGATACGACTGAATGCTGGCCGCTGCGTTCTGACAGCACCTGGCACGGCTTCAAAAACATCGATAACGAGCACATGTATCTTGACCCGATCAAAGTCACCCTGCTGACTCCGGGGATGGAAAAAGACGGCACCATGAGCGACTTTGGTATTCCGGCCAGCATCGTGGCGAAATACCTCGACGAACATGGCATCGTTGTTGAGAAAACCGGTCCGTATAACCTGCTGTTCCTGTTCAGCATCGGTATCGATAAGACCAAAGCACTGAGCCTGCTGCGTGCTCTGACTGACTTTAAACGTGCGTTCGACCTGAACCTGCGTGTGAAAAACATGCTGCCGTCTCTGTATCGTGAAGATCCTGAATTCTATGAAAACATGCGTATTCAGGAACTGGCTCAGAATATCCACAAACTGATTGTTCACCACAATCTGCCGGATCTGATGTATCGCGCATTTGAAGTGCTGCCGACGATGGTAATGACTCCGTATGCTGCATTCCAGAAAGAGCTGCACGGTATGACCGAAGAAGTTTACCTCGACGAAATGGTAGGTCGTATTAACGCCAATATGATCCTTCCGTACCCGCCGGGAGTTCCTCTGGTAATGCCGGGTGAAATGATCACCGAAGAAAGCCGTCCGGTTCTGGAGTTCCTGCAGATGCTGTGTGAAATCGGCGCTCACTATCCGGGCTTTGAAACCGATATTCACGGTGCATACCGTCAGGCTGATGGCCGCTATACCGTTAAGGTATTGAAAGAAGAAAGCAAAAAATAA
SEQ ID NO.10，cadA蛋白序列，来源于大肠杆菌
MNVIAILNHMGVYFKEEPIRELHRALERLNFQIVYPNDRDDLLKLIENNARLCGVIFDWDKYNLELCEEISKMNENLPLYAFANTYSTLDVSLNDLRLQISFFEYALGAAEDIANKIKQTTDEYINTILPPLTKALFKYVREGKYTFCTPGHMGGTAFQKSPVGSLFYDFFGPNTMKSDISISVSELGSLLDHSGPHKEAEQYIARVFNADRSYMVTNGTSTANKIVGMYSAPAGSTILIDRNCHKSLTHLMMMSDVTPIYFRPTRNAYGILGGIPQSEFQHATIAKRVKETPNATWPVHAVITNSTYDGLLYNTDFIKKTLDVKSIHFDSAWVPYTNFSPIYEGKCGMSGGRVEGKVIYETQSTHKLLAAFSQASMIHVKGDVNEETFNEAYMMHTTTSPHYGIVASTETAAAMMKGNAGKRLINGSIERAIKFRKEIKRLRTESDGWFFDVWQPDHIDTTECWPLRSDSTWHGFKNIDNEHMYLDPIKVTLLTPGMEKDGTMSDFGIPASIVAKYLDEHGIVVEKTGPYNLLFLFSIGIDKTKALSLLRALTDFKRAFDLNLRVKNMLPSLYREDPEFYENMRIQELAQNIHKLIVHHNLPDLMYRAFEVLPTMVMTPYAAFQKELHGMTEEVYLDEMVGRINANMILPYPPGVPLVMPGEMITEESRPVLEFLQMLCEIGAHYPGFETDIHGAYRQADGRYTVKVLKEESKK
SEQ ID NO.11,YebQ蛋白，来源于大肠杆菌
MPKVQADGLPLPQRYGAILTIVIGISMAVLDGAIANVALPTIATDLHATPASSIWVVNAYQIAIVISLLSFSFLGDMFGYRRIYKCGLVVFLLSSLFCALSDSLQMLTLARVIQGFGGAALMSVNTALIRLIYPQRFLGRGMGINSFIVAVSSAAGPTIAAAILSIASWKWLFLINVPLGIIALLLAMRFLPPNGSRASKPRFDLPSAVMNALTFGLLITALSGFAQGQSLTLIAAELVVMVVVGIFFIRRQLSLPVPLLPVDLLRIPLFSLSICTSVCSFCAQMLAMVSLPFYLQTVLGRSEVETGLLLTPWPLATMVMAPLAGYLIERVHAGLLGALGLFIMAAGLFSLVLLPASPADINIIWPMILCGAGFGLFQSPNNHTIITSAPRERSGGASGMLGTARLLGQSSGAALVALMLNQFGDNGTHVSLMAAAILAVIAACVSGLRITQPRSRA
SEQ ID NO.12，MdtD蛋白，来源于大肠杆菌
MTDLPDSTRWQLWIVAFGFFMQSLDTTIVNTALPSMAQSLGESPLHMHMVIVSYVLTVAVMLPASGWLADKVGVRNIFFTAIVLFTLGSLFCALSGTLNELLLARALQGVGGAMMVPVGRLTVMKIVPREQYMAAMTFVTLPGQVGPLLGPALGGLLVEYASWHWIFLINIPVGIIGAIATLLLMPNYTMQTRRFDLSGFLLLAVGMAVLTLALDGSKGTGLSPLTIAGLVAVGVVALVLYLLHARNNNRALFSLKLFRTRTFSLGLAGSFAGRIGSGMLPFMTPVFLQIGLGFSPFHAGLMMIPMVLGSMGMKRIVVQVVNRFGYRRVLVATTLGLSLVTLLFMTTALLGWYYVLPFVLFLQGMVNSTRFSSMNTLTLKDLPDNLASSGNSLLSMIMQLSMSIGVTIAGLLLGLFGSQHVSVDSGTTQTVFMYTWLSMALIIALPAFIFARVPNDTHQNVAISRRKRSAQ
SEQ ID NO.13，cgl2893的蛋白序列，来源于谷氨酸棒状杆菌
MTSETLQAQAPTKTQRWAFLAVISGGLFLIGVDNSILYTALPLLREQLAATETQALWIINAYPLLMAGLLLGTGTLGDKIGHRRMFLMGLSIFGIASLGAAFAPTAWALVAARAFLGIGAATMMPATLALIRITFEDERERNTAIGIWGSVAILGAAAGPIIGGALLEFFWWGSVFLINVPVAVIALIATLFVAPANIANPSKHWDFLSSFYALLTLAGLIITIKESVNTARHMPLLLGAVIMLIIGAVLFSSRQKKIEEPLLDLSLFRNRLFLGGVVAAGMAMFTVSGLEMTTSQRFQLSVGFTPLEAGLLMIPAALGSFPMSIIGGANLHRWGFKPLISGGFAATAVGIALCIWGATHTDGLPFFIAGLFFMGAGAGSVMSVSSTAIIGSAPVRKAGMASSIEEVSYEFGTLLSVAILGSLFPFFYSLHAPAEVADNFSAGVHHAIDGDAARASLDTAYINVLIIALVCAVAAALISSYLFRGNPKGANNAH
SEQ ID NO.14：upp-UF，引物序列
AGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAAAACCCGCGACATCGTAATC
SEQ ID NO.15：upp-UR，引物序列
GGATTATACCTCCTTTCTTCAAGGCG
SEQ ID NO.16：Upp-U，人工序列
AGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAAAACCCGCGACATCGTAATCCTCACCGTGATACATCCCCGGCATTTCTGCCGTTTCGCCACCCACCAGTGAACAGCCTGATTGCAGACAACCTTCCGCAATGCCGCTGATCACCGCTGAAGCGGTATCAACATCCAGTTTTCCGGTTGCGTAATAGTCGAGGAAAAACAGCGGCTCTGCACCTTGCACCACCAGGTCATTAACGCACATGGCGACCAGATCAATACCAATGGTGTCGTGACGTTTTAAGTCCATTGCCAGACGCAGCTTGGTACCTACGCCGTCAGTGCCAGAAACCAGCACGGGTTCACGATATTTTTGCGGCAATGCACACAGCGCACCGAAGCCGCCCAGACCGCCCATCACTTCCGGACGACGCGTTTTCTTCACTACGCCTTTGATTCTTCCAACCAGAGCATTACCCGCGTCAATATCAACACCGGCATCTTTGTAGCTAAGAGAGGTTTTATCGGTCACTGCTTGGGTCCCCACGCGTTACTTGCGGTAGAAAAATAAAATTCGGCGCAATTCTAACAGGGAAAGCAAACGTTTGCGAGACTGCTTTACACAACCTTTTTGCACGTCTTTTCCCCAGGCGCGCGGCGAAAGAAGACTTGTGCCAGGGTAAAGGTTAGTTTTCGGATGGAATAATCTTCTTTCATAACCATCTGAATATAAAATAACTTTATCTCAAACCGTTATCATTTTGACTAAAGTCAACGAAAAGAATATTGCCGCCTTGAAGAAAGGAGGTATAATCC
SEQ ID NO.17：upp-DF，引物序列
TGCCGCCTTGAAGAAAGGAGGTATAATCCGAATTCAGTCGGCTTTTTTTTGAGTAAAGCG
SEQ ID NO.18：upp-DR，引物序列
CCGCATTAAAGCTTATCGATGATAAGCTGTCAAACATGACCGGGAGTAAACCCGCCATA
SEQ ID NO.19：Upp-500bp-D，人工序列
TGCCGCCTTGAAGAAAGGAGGTATAATCCGAATTCAGTCGGCTTTTTTTTGAGTAAAGCGCCTATAACACATAATACAGAGGATAATACTATGACGCGCCGTGCTATCGGGGTGAGTGAAAGACCGCCACTTTTACAGACAATCCCGCTTAGTTTGCAACATTTGTTCGCCATGTTTGGTGCAACCGTCCTGGTGCCCGTCTTATTTCATATTAACCCGGCGACTGTACTGTTATTTAACGGTATTGGAACGCTGCTGTATCTCTTCATCTGTAAAGGGAAAATTCCGGCTTATCTTGGTTCCAGCTTTGCCTTTATTTCACCGGTATTGTTACTGTTGCCGTTAGGGTATGAAGTCGCGCTGGGCGGCTTTATTATGTGCGGCGTGCTGTTCTGCCTGGTTTCTTTTATCGTGAAGAAAGCGGGGACCGGCTGGCTGGACGTGCTGTTTCCACCTGCGGCAATGGGCGCAATCGTTGCCGTCATCGGTCTGGAGCTGGCGGGCGTAGCTGCCGGTATGGCGGGTTTACTCCCGGTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGG
SEQ ID NO.20：upp-F，引物序列
TGGAGCCGGGCCACCTCGACCTGAATGGAAGCCGGCGTCGATTTTTTTTGTGGCTGCCC
SEQ ID NO.21：upp-R，引物序列
TGGAGTGGTGAATCCGTTAGCGAGGTGCCGCTTTGTTGTAATCCACTTTCG
SEQ ID NO.22：Pupp-UPP-D，人工序列
TGGAGCCGGGCCACCTCGACCTGAATGGAAGCCGGCGTCGATTTTTTTTGTGGCTGCCCCTCAAAGGAGAAAGAGTATGAAGATCGTGGAAGTCAAACACCCACTCGTCAAACACAAGCTGGGACTGATGCGTGAGCAAGATATCAGCACCAAGCGCTTTCGCGAACTCGCTTCCGAAGTGGGTAGCCTGCTGACTTACGAAGCGACCGCCGACCTCGAAACGGAAAAAGTAACTATCGAAGGCTGGAACGGCCCGGTAGAAATCGACCAGATCAAAGGTAAGAAAATTACCGTTGTGCCAATTCTGCGTGCGGGTCTTGGTATGATGGACGGTGTGCTGGAAAACGTTCCGAGCGCGCGCATCAGCGTTGTCGGTATGTACCGTAATGAAGAAACGCTGGAGCCGGTACCGTACTTCCAGAAACTGGTTTCTAACATCGATGAGCGTATGGCGCTGATCGTTGACCCAATGCTGGCAACCGGTGGTTCCGTTATCGCGACCATCGACCTGCTGAAAAAAGCGGGCTGCAGCAGCATCAAAGTTCTGGTGCTGGTAGCTGCGCCAGAAGGTATCGCTGCGCTGGAAAAAGCGCACCCGGACGTCGAACTGTATACCGCATCGATTGATCAGGGACTGAACGAGCACGGATACATTATTCCGGGCCTCGGCGATGCCGGTGACAAAATCTTTGGTACGAAATAAAGAATAAAAATAATTAAAGCCGACTTTAAGAGTCGGCTTTTTTTTGAGTAAAGCGCCTATAACACATAATACAGAGGATAATACTATGACGCGCCGTGCTATCGGGGTGAGTGAAAGACCGCCACTTTTACAGACAATCCCGCTTAGTTTGCAACATTTGTTCGCCATGTTTGGTGCAACCGTCCTGGTGCCCGTCTTATTTCATATTAACCCGGCGACTGTACTGTTATTTAACGGTATTGGAACGCTGCTGTATCTCTTCATCTGTAAAGGGAAAATTCCGGCTTATCTTGGTTCCAGCTTTGCCTTTATTTCACCGGTATTGTTACTGTTGCCGTTAGGGTATGAAGTCGCGCTGGGCGGCTTTATTATGTGCGGCGTGCTGTTCTGCCTGGTTTCTTTTATCGTGAAGAAAGCGGGGACCGGCTGGCTGGACGTGCTGTTTCCACCTGCGGCAATGGGCGCAATCGTTGCCGTCATCGGTCTGGAGCTGGCGGGCGTAGCTGCCGGTATGGCGGGTTTACTCCCGGCTGAAGGGCAAACGCCAGACTCCAAAACCATCATCATCTCTATTACCACCCTGGCGGTCACGGTTTTAGGTTCCGTGCTGTTTCGTGGTTTCCTGGCAATTATCCCGATTTTAATTGGCGTGCTGGTGGGGTACGCGCTCTCTTTCGCAATGGGAATTGTCGATACCACGCCGATTATTAATGCTCACTGGTTTGCGCTGCCAACCCTCTATACGCCGCGCTTCGAGTGGTTTGCCATTCTGACTATTCTGCCAGCGGCGTTAGTGGTTATTGCCGAACACGTAGGGCACCTGGTAGTAACGGCTAATATCGTCAAAAAAGATCTGCTGCGCGATCCAGGTCTGCACCGTTCGATGTTTGCTAATGGCTTGTCGACCGTGATTTCCGGCTTCTTTGGCTCTACGCCAAATACTACTTACGGAGAAAACATTGGCGTGATGGCGATCACCCGTGTTTACAGTACCTGGGTTATCGGCGGGGCGGCGATTTTCGCTATCCTGCTTTCCTGCGTCGGTAAACTGGCTGCCGCTATCCAGATGATCCCATTGCCGGTGATGGGCGGCGTTTCGCTGCTGCTTTATGGTGTCATCGGTGCTTCCGGTATTCGTGTTTTGATCGAATCGAAAGTGGATTACAACAAAGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCACTCCA
SEQ ID NO.23：P1P2-tetA-F，引物序列
TCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGC
SEQ ID NO.24：P1P2-tetA-R，引物序列
GCCGGCTTCCATTCAGGTCG
SEQ ID NO.25：P1P2-tetA，人工序列
TCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCTGTGGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTTGCTGGCGTTCGCGACGCGAGGCTGGATGGCCTTCCCCATTATGATTCTTCTCGCTTCCGGCGGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAGGTAGATGACGACCATCAGGGACAGCTTCAAGGATCGCTCGCGGCTCTTACCAGCCTAACTTCGATCACTGGACCGCTGATCGTCACGGCGATTTATGCCGCCTCGGCGAGCACATGGAACGGGTTGGCATGGATTGTAGGCGCCGCCCTATACCTTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCCACCTCGACCTGAATGGAAGCCGGC
SEQ ID NO.26：T7-RNA-F，引物序列
CGCCTTGAAGAAAGGAGGTATAATCCGAGCTCATGAACACGATTAACATCGCTAAGAAC
SEQ ID NO.27：T7-RNA-R，引物序列
GGCGCTTTACTCAAAAAAAAGCCGACTGAATTCTGCGCGCACGAAAAGCATCA
SEQ ID NO.28：T7 RNA聚合酶，来自大肠杆菌
CGCCTTGAAGAAAGGAGGTATAATCCGAGCTCATGAACACGATTAACATCGCTAAGAACGACTTCTCTGACATCGAACTGGCTGCTATCCCGTTCAACACTCTGGCTGACCATTACGGTGAGCGTTTAGCTCGCGAACAGTTGGCCCTTGAGCATGAGTCTTACGAGATGGGTGAAGCACGCTTCCGCAAGATGTTTGAGCGTCAACTTAAAGCTGGTGAGGTTGCGGATAACGCTGCCGCCAAGCCTCTCATCACTACCCTACTCCCTAAGATGATTGCACGCATCAACGACTGGTTTGAGGAAGTGAAAGCTAAGCGCGGCAAGCGCCCGACAGCCTTCCAGTTCCTGCAAGAAATCAAGCCGGAAGCCGTAGCGTACATCACCATTAAGACCACTCTGGCTTGCCTAACCAGTGCTGACAATACAACCGTTCAGGCTGTAGCAAGCGCAATCGGTCGGGCCATTGAGGACGAGGCTCGCTTCGGTCGTATCCGTGACCTTGAAGCTAAGCACTTCAAGAAAAACGTTGAGGAACAACTCAACAAGCGCGTAGGGCACGTCTACAAGAAAGCATTTATGCAAGTTGTCGAGGCTGACATGCTCTCTAAGGGTCTACTCGGTGGCGAGGCGTGGTCTTCGTGGCATAAGGAAGACTCTATTCATGTAGGAGTACGCTGCATCGAGATGCTCATTGAGTCAACCGGAATGGTTAGCTTACACCGCCAAAATGCTGGCGTAGTAGGTCAAGACTCTGAGACTATCGAACTCGCACCTGAATACGCTGAGGCTATCGCAACCCGTGCAGGTGCGCTGGCTGGCATCTCTCCGATGTTCCAACCTTGCGTAGTTCCTCCTAAGCCGTGGACTGGCATTACTGGTGGTGGCTATTGGGCTAACGGTCGTCGTCCTCTGGCGCTGGTGCGTACTCACAGTAAGAAAGCACTGATGCGCTACGAAGACGTTTACATGCCTGAGGTGTACAAAGCGATTAACATTGCGCAAAACACCGCATGGAAAATCAACAAGAAAGTCCTAGCGGTCGCCAACGTAATCACCAAGTGGAAGCATTGTCCGGTCGAGGACATCCCTGCGATTGAGCGTGAAGAACTCCCGATGAAACCGGAAGACATCGACATGAATCCTGAGGCTCTCACCGCGTGGAAACGTGCTGCCGCTGCTGTGTACCGCAAGGACAAGGCTCGCAAGTCTCGCCGTATCAGCCTTGAGTTCATGCTTGAGCAAGCCAATAAGTTTGCTAACCATAAGGCCATCTGGTTCCCTTACAACATGGACTGGCGCGGTCGTGTTTACGCTGTGTCAATGTTCAACCCGCAAGGTAACGATATGACCAAAGGACTGCTTACGCTGGCGAAAGGTAAACCAATCGGTAAGGAAGGTTACTACTGGCTGAAAATCCACGGTGCAAACTGTGCGGGTGTCGATAAGGTTCCGTTCCCTGAGCGCATCAAGTTCATTGAGGAAAACCACGAGAACATCATGGCTTGCGCTAAGTCTCCACTGGAGAACACTTGGTGGGCTGAGCAAGATTCTCCGTTCTGCTTCCTTGCGTTCTGCTTTGAGTACGCTGGGGTACAGCACCACGGCCTGAGCTATAACTGCTCCCTTCCGCTGGCGTTTGACGGGTCTTGCTCTGGCATCCAGCACTTCTCCGCGATGCTCCGAGATGAGGTAGGTGGTCGCGCGGTTAACTTGCTTCCTAGTGAAACCGTTCAGGACATCTACGGGATTGTTGCTAAGAAAGTCAACGAGATTCTACAAGCAGACGCAATCAATGGGACCGATAACGAAGTAGTTACCGTGACCGATGAGAACACTGGTGAAATCTCTGAGAAAGTCAAGCTGGGCACTAAGGCACTGGCTGGTCAATGGCTGGCTTACGGTGTTACTCGCAGTGTGACTAAGCGTTCAGTCATGACGCTGGCTTACGGGTCCAAAGAGTTCGGCTTCCGTCAACAAGTGCTGGAAGATACCATTCAGCCAGCTATTGATTCCGGCAAGGGTCTGATGTTCACTCAGCCGAATCAGGCTGCTGGATACATGGCTAAGCTGATTTGGGAATCTGTGAGCGTGACGGTGGTAGCTGCGGTTGAAGCAATGAACTGGCTTAAGTCTGCTGCTAAGCTGCTGGCTGCTGAGGTCAAAGATAAGAAGACTGGAGAGATTCTTCGCAAGCGTTGCGCTGTGCATTGGGTAACTCCTGATGGTTTCCCTGTGTGGCAGGAATACAAGAAGCCTATTCAGACGCGCTTGAACCTGATGTTCCTCGGTCAGTTCCGCTTACAGCCTACCATTAACACCAACAAAGATAGCGAGATTGATGCACACAAACAGGAGTCTGGTATCGCTCCTAACTTTGTACACAGCCAAGACGGTAGCCACCTTCGTAAGACTGTAGTGTGGGCACACGAGAAGTACGGAATCGAATCTTTTGCACTGATTCACGACTCCTTCGGTACCATTCCGGCTGACGCTGCGAACCTGTTCAAAGCAGTGCGCGAAACTATGGTTGACACATATGAGTCTTGTGATGTACTGGCTGATTTCTACGACCAGTTCGCTGACCAGTTGCACGAGTCTCAATTGGACAAAATGCCAGCACTTCCGGCTAAAGGTAACTTGAACCTCCGTGACATCTTAGAGTCGGACTTCGCGTTCGCGTAACGCCAAATCAATACGACTCCGGATCCCCTTCGAAGGAAAGACCTGATGCTTTTCGTGCGCGCAGAATTCAGTCGGCTTTTTTTTGAGTAAAGCGCC
SEQ ID NO.29：cadA-F，引物序列
CGCCTTGAAGAAAGGAGGTATAATCCGAGCTCATGAACGTTATTGCAATATTGAATCACATG
SEQ ID NO.30，cadA-R，引物序列
GGCGCTTTACTCAAAAAAAAGCCGACTGAATTCCCACTTCCCTTGTACGAGCTAA
SEQ ID NO.31，T7启动子序列，来自pET30a质粒
TAATACGACTCACTATAGGG
SEQ ID NO.32：cadA-NdeI-F，引物序列
AAGAAGGAGATATACATATG ATGAACGTTATTGCAATATTGAATCACATG
SEQ ID NO.33：cadA-HindIII-R，引物序列
TCGAGTGCGGCCGCAAGCTT CCACTTCCCTTGTACGAGCTAA
SEQ ID NO.34：T7-cadA-F，引物序列
AAGGAAAGACCTGATGCTTTTCGTGCGCGCAGAATTCGTCATTAGGAAGCAGCCCAGTA
SEQ ID NO.35：T7-cadA-R，引物序列
TATCCTCTGTATTATGTGTTATAGGCGCTTTACTCAAAAAAAAGCCGACTAGACCCGTTTAGAGGCCCCA
SEQ ID NO.36：T7-cadA，T7和cadA连接的序列，人工序列
AAGGAAAGACCTGATGCTTTTCGTGCGCGCAGAATTCGTCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGATGAACGTTATTGCAATATTGAATCACATGGGGGTTTATTTTAAAGAAGAACCCATCCGTGAACTTCATCGCGCGCTTGAACGTCTGAACTTCCAGATTGTTTACCCGAACGACCGTGACGACTTATTAAAACTGATCGAAAACAATGCGCGTCTGTGCGGCGTTATTTTTGACTGGGATAAATATAATCTCGAGCTGTGCGAAGAAATTAGCAAAATGAACGAGAACCTGCCGTTGTACGCGTTCGCTAATACGTATTCCACTCTCGATGTAAGCCTGAATGACCTGCGTTTACAGATTAGCTTCTTTGAATATGCGCTGGGTGCTGCTGAAGATATTGCTAATAAGATCAAGCAGACCACTGACGAATATATCAACACTATTCTGCCTCCGCTGACTAAAGCACTGTTTAAATATGTTCGTGAAGGTAAATATACTTTCTGTACTCCTGGTCACATGGGCGGTACTGCATTCCAGAAAAGCCCGGTAGGTAGCCTGTTCTATGATTTCTTTGGTCCGAATACCATGAAATCTGATATTTCCATTTCAGTATCTGAACTGGGTTCTCTGCTGGATCACAGTGGTCCACACAAAGAAGCAGAACAGTATATCGCTCGCGTCTTTAACGCAGACCGCAGCTACATGGTGACCAACGGTACTTCCACTGCGAACAAAATTGTTGGTATGTACTCTGCTCCAGCAGGCAGCACCATTCTGATTGACCGTAACTGCCACAAATCGCTGACCCACCTGATGATGATGAGCGATGTTACGCCAATCTATTTCCGCCCGACCCGTAACGCTTACGGTATTCTTGGTGGTATCCCACAGAGTGAATTCCAGCACGCTACCATTGCTAAGCGCGTGAAAGAAACACCAAACGCAACCTGGCCGGTACATGCTGTAATTACCAACTCTACCTATGATGGTCTGCTGTACAACACCGACTTCATCAAGAAAACACTGGATGTGAAATCCATCCACTTTGACTCCGCGTGGGTGCCTTACACCAACTTCTCACCGATTTACGAAGGTAAATGCGGTATGAGCGGTGGCCGTGTAGAAGGGAAAGTGATTTACGAAACCCAGTCCACTCACAAACTGCTGGCGGCGTTCTCTCAGGCTTCCATGATCCACGTTAAAGGTGACGTAAACGAAGAAACCTTTAACGAAGCCTACATGATGCACACCACCACTTCTCCGCACTACGGTATCGTGGCGTCCACTGAAACCGCTGCGGCGATGATGAAAGGCAATGCAGGTAAGCGTCTGATCAACGGTTCTATTGAACGTGCGATCAAATTCCGTAAAGAGATCAAACGTCTGAGAACGGAATCTGATGGCTGGTTCTTTGATGTATGGCAGCCGGATCATATCGATACGACTGAATGCTGGCCGCTGCGTTCTGACAGCACCTGGCACGGCTTCAAAAACATCGATAACGAGCACATGTATCTTGACCCGATCAAAGTCACCCTGCTGACTCCGGGGATGGAAAAAGACGGCACCATGAGCGACTTTGGTATTCCGGCCAGCATCGTGGCGAAATACCTCGACGAACATGGCATCGTTGTTGAGAAAACCGGTCCGTATAACCTGCTGTTCCTGTTCAGCATCGGTATCGATAAGACCAAAGCACTGAGCCTGCTGCGTGCTCTGACTGACTTTAAACGTGCGTTCGACCTGAACCTGCGTGTGAAAAACATGCTGCCGTCTCTGTATCGTGAAGATCCTGAATTCTATGAAAACATGCGTATTCAGGAACTGGCTCAGAATATCCACAAACTGATTGTTCACCACAATCTGCCGGATCTGATGTATCGCGCATTTGAAGTGCTGCCGACGATGGTAATGACTCCGTATGCTGCATTCCAGAAAGAGCTGCACGGTATGACCGAAGAAGTTTACCTCGACGAAATGGTAGGTCGTATTAACGCCAATATGATCCTTCCGTACCCGCCGGGAGTTCCTCTGGTAATGCCGGGTGAAATGATCACCGAAGAAAGCCGTCCGGTTCTGGAGTTCCTGCAGATGCTGTGTGAAATCGGCGCTCACTATCCGGGCTTTGAAACCGATATTCACGGTGCATACCGTCAGGCTGATGGCCGCTATACCGTTAAGGTATTGAAAGAAGAAAGCAAAAAATAATTAGCTCGTACAAGGGAAGTGGAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTAGTCGGCTTTTTTTTGAGTAAAGCGCCTATAACACATAATACAGAGGATA
SEQ ID NO.37：pcsiE-F；引物序列
CGCCTTGAAGAAAGGAGGTATAATCCGAGCTCTGCTTTTTCCGATCGTCACG
SEQ ID NO.38：pcsiE-R，引物序列
GTCGTTCTTAGCGATGTTAATCGTGTTCATTAAAGTTTGCTCAAGGAAATGGC
SEQ ID NO.39：pbolA-F，引物序列
CGCCTTGAAGAAAGGAGGTATAATCCGAGCTCTGTTTGGTAAAAATTCCCG
SEQ ID NO.40：pbolA-R，引物序列
GTCGTTCTTAGCGATGTTAATCGTGTTCATCTTTAAATACTAGCCGCTTTTAC
SEQ ID NO.41：posmY-F，引物序列
CGCCTTGAAGAAAGGAGGTATAATCCGAGCTCCTCGCTTACATCGCTACCAGC
SEQ ID NO.42：posmY-R，引物序列
GTCGTTCTTAGCGATGTTAATCGTGTTCATAAATATAGATCACAATTTTGAA
SEQ ID NO.43：pkatE-F，引物序列
CGCCTTGAAGAAAGGAGGTATAATCCGAGCTCGCAGAAATGACTCTCCCATC
SEQ ID NO.44：pkatE-R，引物序列
GTCGTTCTTAGCGATGTTAATCGTGTTCAT GCGGGACGTACAGGGGC
SEQ ID NO.45：pcsiE-R2，引物序列
CATGTGATTCAATATTGCAATAACGTTCATTAAAGTTTGCTCAAGGAAATGGC
SEQ ID NO.46：pbolA-R2，引物序列
CATGTGATTCAATATTGCAATAACGTTCATCTTTAAATACTAGCCGCTTTTAC
SEQ ID NO.47：posmY-R2，引物序列
CATGTGATTCAATATTGCAATAACGTTCATAAATATAGATCACAATTTTGAA
SEQ ID NO.48：pkatE-R2，引物序列
CATGTGATTCAATATTGCAATAACGTTCATGCGGGACGTACAGGGGC
SEQ ID NO.49：yebQ-F，引物序列
CGGATAACAATTTCACACAGGAGGAGCTCATGCCAAAAGTTCAGGCCGAC
SEQ ID NO.50：yebQ-R，引物序列
CGCCTTGAAGAAAGGAGGTATAATCCGAGCTCTCCTGATCGACGCGCTTTTTTTA
SEQ ID NO.51：mdtD-F，引物序列
CGGATAACAATTTCACACAGGAGGAGCTCATGACAGATCTTCCCGACAGC
SEQ ID NO.52：mdtd-R，引物序列
CGCCTTGAAGAAAGGAGGTATAATCCGAGCTCAATACCGGGTCGCCAGAACTTCA
SEQ ID NO.53：mcgl2893-F，引物序列
CGGATAACAATTTCACACAGGAGGAGCTCATGACCAGCGAAACCTTACAGGC
SEQ ID NO.54：mcgl2893-R，引物序列
CGCCTTGAAGAAAGGAGGTATAATCCGAGCTCGCAGAATCATCTCTTTTTTACTA
SEQ ID NO.55：yebQ的基因序列，来自大肠杆菌
ATGCCAAAAGTTCAGGCCGACGGCCTGCCATTGCCCCAGCGATACGGTGCGATATTAACCATTGTGATTGGTATTTCGATGGCCGTCCTTGACGGCGCAATCGCCAACGTCGCCCTGCCAACAATCGCCACGGACCTTCATGCCACGCCAGCCAGTTCCATCTGGGTAGTGAACGCCTATCAAATCGCCATTGTCATCTCCCTGCTCTCGTTTTCGTTTCTGGGCGATATGTTTGGCTATCGACGTATTTATAAATGCGGTCTGGTCGTTTTTCTGTTGTCTTCACTGTTCTGCGCCCTTTCTGATTCGCTGCAAATGCTCACCCTTGCGCGTGTCATACAAGGTTTCGGCGGTGCAGCGTTGATGAGCGTTAATACCGCACTTATCCGCCTGATCTATCCACAACGTTTTCTGGGTAGAGGGATGGGCATAAACTCGTTTATTGTTGCCGTCTCTTCTGCTGCCGGGCCGACAATTGCTGCAGCAATCCTCTCCATCGCATCCTGGAAATGGTTATTTTTAATCAACGTACCGTTAGGTATTATCGCCCTGCTTCTGGCGATGCGTTTTCTGCCACCCAATGGTTCTCGCGCCAGTAAACCCCGTTTCGACCTGCCCAGCGCCGTGATGAACGCGTTAACCTTCGGCCTGCTTATCACTGCGTTGAGTGGTTTCGCTCAGGGGCAATCGCTGACGTTAATTGCTGCGGAACTGGTGGTAATGGTTGTTGTTGGTATTTTCTTTATTCGCCGCCAGCTTTCTCTTCCCGTACCGCTGCTACCGGTGGATTTACTGCGTATCCCGCTGTTTTCACTTTCTATTTGCACATCTGTTTGCTCTTTCTGCGCACAAATGCTGGCAATGGTTTCCCTGCCCTTTTACCTGCAAACCGTGCTCGGGCGTAGTGAAGTCGAAACAGGTTTACTTCTGACACCGTGGCCGTTAGCAACGATGGTGATGGCTCCGCTGGCAGGCTATTTGATTGAACGCGTACATGCAGGATTGCTGGGGGCTTTAGGGTTGTTCATCATGGCTGCGGGGCTTTTTTCCCTGGTTCTGCTGCCCGCGTCACCTGCGGATATCAATATTATCTGGCCGATGATCTTATGTGGTGCTGGATTTGGCTTATTCCAGTCACCCAATAACCACACCATTATTACCTCCGCGCCTCGCGAACGTAGCGGTGGAGCCAGTGGCATGTTAGGAACGGCTCGTCTACTGGGTCAGAGTAGCGGCGCGGCGCTGGTGGCGCTGATGCTAAATCAGTTTGGAGATAATGGTACACACGTCTCGCTGATGGCTGCGGCTATTCTGGCAGTGATTGCTGCCTGTGTCAGTGGTTTACGTATCACTCAGCCACGATCCAGGGCATAA
SEQ ID NO.56：mdtD的基因序列，来自大肠杆菌
ATGACAGATCTTCCCGACAGCACCCGTTGGCAATTGTGGATTGTGGCTTTCGGCTTCTTTATGCAGTCGCTGGACACCACCATCGTAAACACCGCCCTTCCCTCAATGGCGCAAAGCCTCGGGGAAAGTCCGTTGCATATGCACATGGTCATTGTCTCTTATGTGCTGACCGTGGCGGTGATGCTGCCCGCCAGCGGCTGGCTGGCGGACAAAGTCGGCGTGCGCAATATTTTCTTTACCGCCATCGTGCTGTTTACTCTCGGTTCACTGTTTTGCGCGCTTTCCGGCACGCTGAACGAACTGTTGCTGGCACGCGCGTTACAGGGCGTTGGCGGCGCGATGATGGTGCCGGTCGGCAGATTGACGGTGATGAAAATCGTACCGCGCGAGCAATATATGGCGGCGATGACCTTTGTCACGTTACCCGGTCAGGTCGGTCCGCTGCTCGGTCCGGCGCTCGGCGGTCTGCTGGTGGAGTACGCATCGTGGCACTGGATCTTTTTGATCAACATTCCGGTGGGGATTATCGGTGCGATCGCCACATTGCTGTTAATGCCGAACTACACCATGCAGACGCGGCGCTTTGATCTCTCCGGATTTTTATTGCTGGCGGTTGGCATGGCGGTATTAACCCTGGCGCTGGACGGCAGTAAAGGTACAGGTTTATCGCCGCTGACGATTGCAGGCCTGGTCGCAGTTGGCGTGGTGGCACTGGTGCTTTATCTGCTGCACGCCAGAAATAACAACCGTGCCCTGTTCAGTCTGAAACTGTTCCGTACTCGTACCTTTTCGCTGGGCCTGGCGGGGAGCTTTGCCGGACGTATTGGCAGTGGCATGTTGCCCTTTATGACACCGGTTTTCCTGCAAATTGGCCTCGGTTTCTCGCCGTTTCATGCCGGACTGATGATGATCCCGATGGTGCTTGGCAGCATGGGAATGAAGCGAATTGTGGTACAGGTGGTGAATCGCTTTGGTTATCGTCGGGTACTGGTAGCGACCACGCTGGGTCTGTCGCTGGTCACCCTGTTGTTTATGACTACCGCCCTGCTGGGCTGGTACTACGTTTTGCCGTTCGTCCTGTTTTTACAAGGGATGGTCAACTCGACGCGTTTCTCCTCCATGAACACCCTGACGCTGAAAGATCTCCCGGACAATCTGGCGAGCAGCGGCAACAGCCTGCTGTCGATGATTATGCAATTGTCGATGAGTATCGGCGTCACTATCGCCGGGCTGTTGCTGGGACTTTTTGGTTCACAGCATGTCAGCGTCGACAGCGGCACCACACAAACCGTCTTTATGTACACCTGGCTTAGCATGGCGTTGATCATCGCCCTTCCGGCGTTCATCTTTGCCAGAGTGCCGAACGATACGCATCAAAATGTAGCTATTTCGCGGCGAAAAAGGAGCGCGCAATGA
SEQ ID NO.57：密码子优化后的cgl2893的基因序列(mcgl2893)，人工序列
ATGACCAGCGAAACCTTACAGGCCCAAGCTCCAACTAAGACCCAGCGGTGGGCCTTCTTGGCCGTTATATCTGGCGGGTTATTCCTTATTGGTGTGGACAATAGCATCCTGTATACGGCGTTGCCATTGCTGCGCGAACAACTGGCGGCGACCGAAACGCAGGCCCTGTGGATTATCAATGCCTATCCACTGTTGATGGCTGGCCTGCTGCTTGGCACGGGTACTCTTGGTGACAAAATTGGCCATCGTCGTATGTTCTTGATGGGGCTGTCTATCTTTGGCATTGCGTCGTTGGGTGCGGCTTTCGCTCCGACCGCCTGGGCGCTGGTAGCTGCACGCGCCTTTCTTGGAATAGGTGCAGCGACAATGATGCCCGCCACACTGGCGTTAATCCGCATCACGTTTGAGGATGAACGTGAACGTAACACCGCGATCGGCATCTGGGGAAGCGTCGCTATACTGGGAGCGGCTGCGGGTCCAATAATCGGGGGTGCTCTGCTGGAGTTTTTTTGGTGGGGTAGCGTGTTTCTGATCAATGTGCCTGTGGCCGTGATTGCGCTTATCGCGACGTTATTTGTGGCTCCGGCAAATATCGCCAACCCGAGCAAACATTGGGACTTTTTGAGCAGCTTCTATGCGTTACTGACCTTAGCGGGCCTGATCATCACGATTAAGGAGAGCGTGAATACCGCCCGTCATATGCCACTGCTGTTAGGGGCGGTCATTATGTTGATTATCGGTGCCGTGCTGTTTAGCAGTCGTCAGAAGAAAATTGAGGAACCGCTTCTGGATCTGAGCTTATTTCGTAATCGTTTGTTCCTTGGGGGGGTGGTGGCAGCTGGCATGGCTATGTTTACCGTGAGCGGCCTGGAAATGACCACCAGTCAGCGTTTTCAACTGAGCGTGGGGTTTACCCCCCTGGAGGCGGGCTTGCTGATGATTCCTGCGGCACTGGGGTCTTTCCCTATGAGCATAATTGGAGGTGCAAATCTGCATCGGTGGGGCTTTAAGCCACTGATTAGCGGAGGCTTCGCCGCGACGGCGGTTGGAATTGCTTTATGCATTTGGGGTGCGACCCATACCGATGGTCTGCCGTTCTTTATAGCTGGCTTGTTCTTCATGGGCGCAGGTGCTGGTTCTGTGATGAGCGTATCAAGCACTGCCATCATCGGCAGCGCACCCGTTCGTAAAGCTGGGATGGCTTCGAGCATTGAAGAAGTTAGCTATGAATTTGGAACCCTGTTGTCGGTTGCTATCTTGGGAAGTCTGTTTCCGTTTTTCTACTCACTGCATGCCCCTGCAGAAGTGGCTGATAACTTTTCTGCCGGGGTGCATCATGCGATTGACGGGGATGCAGCTCGTGCAAGCCTTGACACAGCGTACATAAATGTACTGATAATTGCTCTGGTGTGCGCCGTTGCAGCGGCTCTGATATCGAGCTATCTGTTCCGTGGCAATCCGAAGGGCGCGAATAACGCGCATTAG
SEQ ID NO.58：plac-R，引物序列
GAGCTCCTCCTGTGTGAAATTGTTATC
SEQ ID NO.59：plac-F，引物序列
TTTTGACCCCTAAAGGCGGGAGTGGAGCTCGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAG
SEQ ID NO.60：plac启动子序列，来自pUC18质粒
GGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAGGAGCTC
SEQ ID NO.61：pcsiE启动子+T7R(连接有pcsiE启动子的T7R序列)，人工序列
TGCTTTTTCCGATCGTCACGGCGATGTTTATCGCGAACAGATGGTGGACTTTATCCTTAGCGCGTTGAATCCGCAGAACTAACCCATGATCGCTAGCACGATAATCATTCACAAAACCACCTTAAGACATGCTAATCCACTGGTCAGAACAGTTTAAGATGAGAAAAATTCTGTGACGCTTGCCAACATTTCTGATGATTAGCATTCCCTTCGCCATTTCCTTGAGCAAACTTTAATGAACACGATTAACATCGCTAAGAACGACTTCTCTGACATCGAACTGGCTGCTATCCCGTTCAACACTCTGGCTGACCATTACGGTGAGCGTTTAGCTCGCGAACAGTTGGCCCTTGAGCATGAGTCTTACGAGATGGGTGAAGCACGCTTCCGCAAGATGTTTGAGCGTCAACTTAAAGCTGGTGAGGTTGCGGATAACGCTGCCGCCAAGCCTCTCATCACTACCCTACTCCCTAAGATGATTGCACGCATCAACGACTGGTTTGAGGAAGTGAAAGCTAAGCGCGGCAAGCGCCCGACAGCCTTCCAGTTCCTGCAAGAAATCAAGCCGGAAGCCGTAGCGTACATCACCATTAAGACCACTCTGGCTTGCCTAACCAGTGCTGACAATACAACCGTTCAGGCTGTAGCAAGCGCAATCGGTCGGGCCATTGAGGACGAGGCTCGCTTCGGTCGTATCCGTGACCTTGAAGCTAAGCACTTCAAGAAAAACGTTGAGGAACAACTCAACAAGCGCGTAGGGCACGTCTACAAGAAAGCATTTATGCAAGTTGTCGAGGCTGACATGCTCTCTAAGGGTCTACTCGGTGGCGAGGCGTGGTCTTCGTGGCATAAGGAAGACTCTATTCATGTAGGAGTACGCTGCATCGAGATGCTCATTGAGTCAACCGGAATGGTTAGCTTACACCGCCAAAATGCTGGCGTAGTAGGTCAAGACTCTGAGACTATCGAACTCGCACCTGAATACGCTGAGGCTATCGCAACCCGTGCAGGTGCGCTGGCTGGCATCTCTCCGATGTTCCAACCTTGCGTAGTTCCTCCTAAGCCGTGGACTGGCATTACTGGTGGTGGCTATTGGGCTAACGGTCGTCGTCCTCTGGCGCTGGTGCGTACTCACAGTAAGAAAGCACTGATGCGCTACGAAGACGTTTACATGCCTGAGGTGTACAAAGCGATTAACATTGCGCAAAACACCGCATGGAAAATCAACAAGAAAGTCCTAGCGGTCGCCAACGTAATCACCAAGTGGAAGCATTGTCCGGTCGAGGACATCCCTGCGATTGAGCGTGAAGAACTCCCGATGAAACCGGAAGACATCGACATGAATCCTGAGGCTCTCACCGCGTGGAAACGTGCTGCCGCTGCTGTGTACCGCAAGGACAAGGCTCGCAAGTCTCGCCGTATCAGCCTTGAGTTCATGCTTGAGCAAGCCAATAAGTTTGCTAACCATAAGGCCATCTGGTTCCCTTACAACATGGACTGGCGCGGTCGTGTTTACGCTGTGTCAATGTTCAACCCGCAAGGTAACGATATGACCAAAGGACTGCTTACGCTGGCGAAAGGTAAACCAATCGGTAAGGAAGGTTACTACTGGCTGAAAATCCACGGTGCAAACTGTGCGGGTGTCGATAAGGTTCCGTTCCCTGAGCGCATCAAGTTCATTGAGGAAAACCACGAGAACATCATGGCTTGCGCTAAGTCTCCACTGGAGAACACTTGGTGGGCTGAGCAAGATTCTCCGTTCTGCTTCCTTGCGTTCTGCTTTGAGTACGCTGGGGTACAGCACCACGGCCTGAGCTATAACTGCTCCCTTCCGCTGGCGTTTGACGGGTCTTGCTCTGGCATCCAGCACTTCTCCGCGATGCTCCGAGATGAGGTAGGTGGTCGCGCGGTTAACTTGCTTCCTAGTGAAACCGTTCAGGACATCTACGGGATTGTTGCTAAGAAAGTCAACGAGATTCTACAAGCAGACGCAATCAATGGGACCGATAACGAAGTAGTTACCGTGACCGATGAGAACACTGGTGAAATCTCTGAGAAAGTCAAGCTGGGCACTAAGGCACTGGCTGGTCAATGGCTGGCTTACGGTGTTACTCGCAGTGTGACTAAGCGTTCAGTCATGACGCTGGCTTACGGGTCCAAAGAGTTCGGCTTCCGTCAACAAGTGCTGGAAGATACCATTCAGCCAGCTATTGATTCCGGCAAGGGTCTGATGTTCACTCAGCCGAATCAGGCTGCTGGATACATGGCTAAGCTGATTTGGGAATCTGTGAGCGTGACGGTGGTAGCTGCGGTTGAAGCAATGAACTGGCTTAAGTCTGCTGCTAAGCTGCTGGCTGCTGAGGTCAAAGATAAGAAGACTGGAGAGATTCTTCGCAAGCGTTGCGCTGTGCATTGGGTAACTCCTGATGGTTTCCCTGTGTGGCAGGAATACAAGAAGCCTATTCAGACGCGCTTGAACCTGATGTTCCTCGGTCAGTTCCGCTTACAGCCTACCATTAACACCAACAAAGATAGCGAGATTGATGCACACAAACAGGAGTCTGGTATCGCTCCTAACTTTGTACACAGCCAAGACGGTAGCCACCTTCGTAAGACTGTAGTGTGGGCACACGAGAAGTACGGAATCGAATCTTTTGCACTGATTCACGACTCCTTCGGTACCATTCCGGCTGACGCTGCGAACCTGTTCAAAGCAGTGCGCGAAACTATGGTTGACACATATGAGTCTTGTGATGTACTGGCTGATTTCTACGACCAGTTCGCTGACCAGTTGCACGAGTCTCAATTGGACAAAATGCCAGCACTTCCGGCTAAAGGTAACTTGAACCTCCGTGACATCTTAGAGTCGGACTTCGCGTTCGCGTAA
SEQ ID NO.62：pbolA+T7R(连接有pbolA启动子的T7R序列)，人工序列
TGTTTGGTAAAAATTCCCGCCATCATAACATTGCCAACGGCGAGGGGAAGTGGGTAAGGCATGTAAATTCATCATGTTGACGAAATAATCGCCCCTGGTAAAAGAAACACTGATGCGAGGCCTGTGTTTCAATCTTTAAATCAGTAAACTTCATACGCTTGACGGAAAAACCAGGACGAAACCTAAATATTTGTTGTTAAGCTGCAATGGAAACGGTAAAAGCGGCTAGTATTTAAAGATGAACACGATTAACATCGCTAAGAACGACTTCTCTGACATCGAACTGGCTGCTATCCCGTTCAACACTCTGGCTGACCATTACGGTGAGCGTTTAGCTCGCGAACAGTTGGCCCTTGAGCATGAGTCTTACGAGATGGGTGAAGCACGCTTCCGCAAGATGTTTGAGCGTCAACTTAAAGCTGGTGAGGTTGCGGATAACGCTGCCGCCAAGCCTCTCATCACTACCCTACTCCCTAAGATGATTGCACGCATCAACGACTGGTTTGAGGAAGTGAAAGCTAAGCGCGGCAAGCGCCCGACAGCCTTCCAGTTCCTGCAAGAAATCAAGCCGGAAGCCGTAGCGTACATCACCATTAAGACCACTCTGGCTTGCCTAACCAGTGCTGACAATACAACCGTTCAGGCTGTAGCAAGCGCAATCGGTCGGGCCATTGAGGACGAGGCTCGCTTCGGTCGTATCCGTGACCTTGAAGCTAAGCACTTCAAGAAAAACGTTGAGGAACAACTCAACAAGCGCGTAGGGCACGTCTACAAGAAAGCATTTATGCAAGTTGTCGAGGCTGACATGCTCTCTAAGGGTCTACTCGGTGGCGAGGCGTGGTCTTCGTGGCATAAGGAAGACTCTATTCATGTAGGAGTACGCTGCATCGAGATGCTCATTGAGTCAACCGGAATGGTTAGCTTACACCGCCAAAATGCTGGCGTAGTAGGTCAAGACTCTGAGACTATCGAACTCGCACCTGAATACGCTGAGGCTATCGCAACCCGTGCAGGTGCGCTGGCTGGCATCTCTCCGATGTTCCAACCTTGCGTAGTTCCTCCTAAGCCGTGGACTGGCATTACTGGTGGTGGCTATTGGGCTAACGGTCGTCGTCCTCTGGCGCTGGTGCGTACTCACAGTAAGAAAGCACTGATGCGCTACGAAGACGTTTACATGCCTGAGGTGTACAAAGCGATTAACATTGCGCAAAACACCGCATGGAAAATCAACAAGAAAGTCCTAGCGGTCGCCAACGTAATCACCAAGTGGAAGCATTGTCCGGTCGAGGACATCCCTGCGATTGAGCGTGAAGAACTCCCGATGAAACCGGAAGACATCGACATGAATCCTGAGGCTCTCACCGCGTGGAAACGTGCTGCCGCTGCTGTGTACCGCAAGGACAAGGCTCGCAAGTCTCGCCGTATCAGCCTTGAGTTCATGCTTGAGCAAGCCAATAAGTTTGCTAACCATAAGGCCATCTGGTTCCCTTACAACATGGACTGGCGCGGTCGTGTTTACGCTGTGTCAATGTTCAACCCGCAAGGTAACGATATGACCAAAGGACTGCTTACGCTGGCGAAAGGTAAACCAATCGGTAAGGAAGGTTACTACTGGCTGAAAATCCACGGTGCAAACTGTGCGGGTGTCGATAAGGTTCCGTTCCCTGAGCGCATCAAGTTCATTGAGGAAAACCACGAGAACATCATGGCTTGCGCTAAGTCTCCACTGGAGAACACTTGGTGGGCTGAGCAAGATTCTCCGTTCTGCTTCCTTGCGTTCTGCTTTGAGTACGCTGGGGTACAGCACCACGGCCTGAGCTATAACTGCTCCCTTCCGCTGGCGTTTGACGGGTCTTGCTCTGGCATCCAGCACTTCTCCGCGATGCTCCGAGATGAGGTAGGTGGTCGCGCGGTTAACTTGCTTCCTAGTGAAACCGTTCAGGACATCTACGGGATTGTTGCTAAGAAAGTCAACGAGATTCTACAAGCAGACGCAATCAATGGGACCGATAACGAAGTAGTTACCGTGACCGATGAGAACACTGGTGAAATCTCTGAGAAAGTCAAGCTGGGCACTAAGGCACTGGCTGGTCAATGGCTGGCTTACGGTGTTACTCGCAGTGTGACTAAGCGTTCAGTCATGACGCTGGCTTACGGGTCCAAAGAGTTCGGCTTCCGTCAACAAGTGCTGGAAGATACCATTCAGCCAGCTATTGATTCCGGCAAGGGTCTGATGTTCACTCAGCCGAATCAGGCTGCTGGATACATGGCTAAGCTGATTTGGGAATCTGTGAGCGTGACGGTGGTAGCTGCGGTTGAAGCAATGAACTGGCTTAAGTCTGCTGCTAAGCTGCTGGCTGCTGAGGTCAAAGATAAGAAGACTGGAGAGATTCTTCGCAAGCGTTGCGCTGTGCATTGGGTAACTCCTGATGGTTTCCCTGTGTGGCAGGAATACAAGAAGCCTATTCAGACGCGCTTGAACCTGATGTTCCTCGGTCAGTTCCGCTTACAGCCTACCATTAACACCAACAAAGATAGCGAGATTGATGCACACAAACAGGAGTCTGGTATCGCTCCTAACTTTGTACACAGCCAAGACGGTAGCCACCTTCGTAAGACTGTAGTGTGGGCACACGAGAAGTACGGAATCGAATCTTTTGCACTGATTCACGACTCCTTCGGTACCATTCCGGCTGACGCTGCGAACCTGTTCAAAGCAGTGCGCGAAACTATGGTTGACACATATGAGTCTTGTGATGTACTGGCTGATTTCTACGACCAGTTCGCTGACCAGTTGCACGAGTCTCAATTGGACAAAATGCCAGCACTTCCGGCTAAAGGTAACTTGAACCTCCGTGACATCTTAGAGTCGGACTTCGCGTTCGCGTAA
SEQ ID NO.63：posmY+T7R(连接有posmY启动子的T7R序列)，人工序列
CTCGCTTACATCGCTACCAGCATGGTCAACCTGCGCCTGGCACAGGAACGTTATCCGGACGTTCAGTTCCACCAGACCCGCGAGCATTAATTCTTGCCTCCAGGGCGCGGTAGCCGCTGCGCCCTGTCAATTTCCCTTCCTTATTAGCCGCTTACGGAATGTTCTTAAAACATTCACTTTTGCTTATGTTTTCGCTGATATCCCGAGCGGTTTCAAAATTGTGATCTATATTTATGAACACGATTAACATCGCTAAGAACGACTTCTCTGACATCGAACTGGCTGCTATCCCGTTCAACACTCTGGCTGACCATTACGGTGAGCGTTTAGCTCGCGAACAGTTGGCCCTTGAGCATGAGTCTTACGAGATGGGTGAAGCACGCTTCCGCAAGATGTTTGAGCGTCAACTTAAAGCTGGTGAGGTTGCGGATAACGCTGCCGCCAAGCCTCTCATCACTACCCTACTCCCTAAGATGATTGCACGCATCAACGACTGGTTTGAGGAAGTGAAAGCTAAGCGCGGCAAGCGCCCGACAGCCTTCCAGTTCCTGCAAGAAATCAAGCCGGAAGCCGTAGCGTACATCACCATTAAGACCACTCTGGCTTGCCTAACCAGTGCTGACAATACAACCGTTCAGGCTGTAGCAAGCGCAATCGGTCGGGCCATTGAGGACGAGGCTCGCTTCGGTCGTATCCGTGACCTTGAAGCTAAGCACTTCAAGAAAAACGTTGAGGAACAACTCAACAAGCGCGTAGGGCACGTCTACAAGAAAGCATTTATGCAAGTTGTCGAGGCTGACATGCTCTCTAAGGGTCTACTCGGTGGCGAGGCGTGGTCTTCGTGGCATAAGGAAGACTCTATTCATGTAGGAGTACGCTGCATCGAGATGCTCATTGAGTCAACCGGAATGGTTAGCTTACACCGCCAAAATGCTGGCGTAGTAGGTCAAGACTCTGAGACTATCGAACTCGCACCTGAATACGCTGAGGCTATCGCAACCCGTGCAGGTGCGCTGGCTGGCATCTCTCCGATGTTCCAACCTTGCGTAGTTCCTCCTAAGCCGTGGACTGGCATTACTGGTGGTGGCTATTGGGCTAACGGTCGTCGTCCTCTGGCGCTGGTGCGTACTCACAGTAAGAAAGCACTGATGCGCTACGAAGACGTTTACATGCCTGAGGTGTACAAAGCGATTAACATTGCGCAAAACACCGCATGGAAAATCAACAAGAAAGTCCTAGCGGTCGCCAACGTAATCACCAAGTGGAAGCATTGTCCGGTCGAGGACATCCCTGCGATTGAGCGTGAAGAACTCCCGATGAAACCGGAAGACATCGACATGAATCCTGAGGCTCTCACCGCGTGGAAACGTGCTGCCGCTGCTGTGTACCGCAAGGACAAGGCTCGCAAGTCTCGCCGTATCAGCCTTGAGTTCATGCTTGAGCAAGCCAATAAGTTTGCTAACCATAAGGCCATCTGGTTCCCTTACAACATGGACTGGCGCGGTCGTGTTTACGCTGTGTCAATGTTCAACCCGCAAGGTAACGATATGACCAAAGGACTGCTTACGCTGGCGAAAGGTAAACCAATCGGTAAGGAAGGTTACTACTGGCTGAAAATCCACGGTGCAAACTGTGCGGGTGTCGATAAGGTTCCGTTCCCTGAGCGCATCAAGTTCATTGAGGAAAACCACGAGAACATCATGGCTTGCGCTAAGTCTCCACTGGAGAACACTTGGTGGGCTGAGCAAGATTCTCCGTTCTGCTTCCTTGCGTTCTGCTTTGAGTACGCTGGGGTACAGCACCACGGCCTGAGCTATAACTGCTCCCTTCCGCTGGCGTTTGACGGGTCTTGCTCTGGCATCCAGCACTTCTCCGCGATGCTCCGAGATGAGGTAGGTGGTCGCGCGGTTAACTTGCTTCCTAGTGAAACCGTTCAGGACATCTACGGGATTGTTGCTAAGAAAGTCAACGAGATTCTACAAGCAGACGCAATCAATGGGACCGATAACGAAGTAGTTACCGTGACCGATGAGAACACTGGTGAAATCTCTGAGAAAGTCAAGCTGGGCACTAAGGCACTGGCTGGTCAATGGCTGGCTTACGGTGTTACTCGCAGTGTGACTAAGCGTTCAGTCATGACGCTGGCTTACGGGTCCAAAGAGTTCGGCTTCCGTCAACAAGTGCTGGAAGATACCATTCAGCCAGCTATTGATTCCGGCAAGGGTCTGATGTTCACTCAGCCGAATCAGGCTGCTGGATACATGGCTAAGCTGATTTGGGAATCTGTGAGCGTGACGGTGGTAGCTGCGGTTGAAGCAATGAACTGGCTTAAGTCTGCTGCTAAGCTGCTGGCTGCTGAGGTCAAAGATAAGAAGACTGGAGAGATTCTTCGCAAGCGTTGCGCTGTGCATTGGGTAACTCCTGATGGTTTCCCTGTGTGGCAGGAATACAAGAAGCCTATTCAGACGCGCTTGAACCTGATGTTCCTCGGTCAGTTCCGCTTACAGCCTACCATTAACACCAACAAAGATAGCGAGATTGATGCACACAAACAGGAGTCTGGTATCGCTCCTAACTTTGTACACAGCCAAGACGGTAGCCACCTTCGTAAGACTGTAGTGTGGGCACACGAGAAGTACGGAATCGAATCTTTTGCACTGATTCACGACTCCTTCGGTACCATTCCGGCTGACGCTGCGAACCTGTTCAAAGCAGTGCGCGAAACTATGGTTGACACATATGAGTCTTGTGATGTACTGGCTGATTTCTACGACCAGTTCGCTGACCAGTTGCACGAGTCTCAATTGGACAAAATGCCAGCACTTCCGGCTAAAGGTAACTTGAACCTCCGTGACATCTTAGAGTCGGACTTCGCGTTCGCGTAA
SEQ ID NO.64：pkatE+T7R(连接有pkatE启动子的T7R序列)，人工序列
GCAGAAATGACTCTCCCATCAGTACAAACGCAACATATTTGCCACGCAGCATCCAGACATCACGAAACGAATCCATCTTTATCGCATGTTCTGGCGGCGCGGGTTCCGTGCGTGGGACATAGCTAATAATCTGGCGGTTTTGCTGGCGGAGCGGTTTCTTCATTACTGGCTTCACTAAACGCATATTAAAAATCAGAAAAACTGTAGTTTAGCCGATTTAGCCCCTGTACGTCCCGCATGAACACGATTAACATCGCTAAGAACGACTTCTCTGACATCGAACTGGCTGCTATCCCGTTCAACACTCTGGCTGACCATTACGGTGAGCGTTTAGCTCGCGAACAGTTGGCCCTTGAGCATGAGTCTTACGAGATGGGTGAAGCACGCTTCCGCAAGATGTTTGAGCGTCAACTTAAAGCTGGTGAGGTTGCGGATAACGCTGCCGCCAAGCCTCTCATCACTACCCTACTCCCTAAGATGATTGCACGCATCAACGACTGGTTTGAGGAAGTGAAAGCTAAGCGCGGCAAGCGCCCGACAGCCTTCCAGTTCCTGCAAGAAATCAAGCCGGAAGCCGTAGCGTACATCACCATTAAGACCACTCTGGCTTGCCTAACCAGTGCTGACAATACAACCGTTCAGGCTGTAGCAAGCGCAATCGGTCGGGCCATTGAGGACGAGGCTCGCTTCGGTCGTATCCGTGACCTTGAAGCTAAGCACTTCAAGAAAAACGTTGAGGAACAACTCAACAAGCGCGTAGGGCACGTCTACAAGAAAGCATTTATGCAAGTTGTCGAGGCTGACATGCTCTCTAAGGGTCTACTCGGTGGCGAGGCGTGGTCTTCGTGGCATAAGGAAGACTCTATTCATGTAGGAGTACGCTGCATCGAGATGCTCATTGAGTCAACCGGAATGGTTAGCTTACACCGCCAAAATGCTGGCGTAGTAGGTCAAGACTCTGAGACTATCGAACTCGCACCTGAATACGCTGAGGCTATCGCAACCCGTGCAGGTGCGCTGGCTGGCATCTCTCCGATGTTCCAACCTTGCGTAGTTCCTCCTAAGCCGTGGACTGGCATTACTGGTGGTGGCTATTGGGCTAACGGTCGTCGTCCTCTGGCGCTGGTGCGTACTCACAGTAAGAAAGCACTGATGCGCTACGAAGACGTTTACATGCCTGAGGTGTACAAAGCGATTAACATTGCGCAAAACACCGCATGGAAAATCAACAAGAAAGTCCTAGCGGTCGCCAACGTAATCACCAAGTGGAAGCATTGTCCGGTCGAGGACATCCCTGCGATTGAGCGTGAAGAACTCCCGATGAAACCGGAAGACATCGACATGAATCCTGAGGCTCTCACCGCGTGGAAACGTGCTGCCGCTGCTGTGTACCGCAAGGACAAGGCTCGCAAGTCTCGCCGTATCAGCCTTGAGTTCATGCTTGAGCAAGCCAATAAGTTTGCTAACCATAAGGCCATCTGGTTCCCTTACAACATGGACTGGCGCGGTCGTGTTTACGCTGTGTCAATGTTCAACCCGCAAGGTAACGATATGACCAAAGGACTGCTTACGCTGGCGAAAGGTAAACCAATCGGTAAGGAAGGTTACTACTGGCTGAAAATCCACGGTGCAAACTGTGCGGGTGTCGATAAGGTTCCGTTCCCTGAGCGCATCAAGTTCATTGAGGAAAACCACGAGAACATCATGGCTTGCGCTAAGTCTCCACTGGAGAACACTTGGTGGGCTGAGCAAGATTCTCCGTTCTGCTTCCTTGCGTTCTGCTTTGAGTACGCTGGGGTACAGCACCACGGCCTGAGCTATAACTGCTCCCTTCCGCTGGCGTTTGACGGGTCTTGCTCTGGCATCCAGCACTTCTCCGCGATGCTCCGAGATGAGGTAGGTGGTCGCGCGGTTAACTTGCTTCCTAGTGAAACCGTTCAGGACATCTACGGGATTGTTGCTAAGAAAGTCAACGAGATTCTACAAGCAGACGCAATCAATGGGACCGATAACGAAGTAGTTACCGTGACCGATGAGAACACTGGTGAAATCTCTGAGAAAGTCAAGCTGGGCACTAAGGCACTGGCTGGTCAATGGCTGGCTTACGGTGTTACTCGCAGTGTGACTAAGCGTTCAGTCATGACGCTGGCTTACGGGTCCAAAGAGTTCGGCTTCCGTCAACAAGTGCTGGAAGATACCATTCAGCCAGCTATTGATTCCGGCAAGGGTCTGATGTTCACTCAGCCGAATCAGGCTGCTGGATACATGGCTAAGCTGATTTGGGAATCTGTGAGCGTGACGGTGGTAGCTGCGGTTGAAGCAATGAACTGGCTTAAGTCTGCTGCTAAGCTGCTGGCTGCTGAGGTCAAAGATAAGAAGACTGGAGAGATTCTTCGCAAGCGTTGCGCTGTGCATTGGGTAACTCCTGATGGTTTCCCTGTGTGGCAGGAATACAAGAAGCCTATTCAGACGCGCTTGAACCTGATGTTCCTCGGTCAGTTCCGCTTACAGCCTACCATTAACACCAACAAAGATAGCGAGATTGATGCACACAAACAGGAGTCTGGTATCGCTCCTAACTTTGTACACAGCCAAGACGGTAGCCACCTTCGTAAGACTGTAGTGTGGGCACACGAGAAGTACGGAATCGAATCTTTTGCACTGATTCACGACTCCTTCGGTACCATTCCGGCTGACGCTGCGAACCTGTTCAAAGCAGTGCGCGAAACTATGGTTGACACATATGAGTCTTGTGATGTACTGGCTGATTTCTACGACCAGTTCGCTGACCAGTTGCACGAGTCTCAATTGGACAAAATGCCAGCACTTCCGGCTAAAGGTAACTTGAACCTCCGTGACATCTTAGAGTCGGACTTCGCGTTCGCGTAA
SEQ ID NO.65：P21+T7R(连接有P21启动子的T7R序列)，人工序列
CACTCCCGCCTTTAGGGGTCAAAATTGTTCTATACTGTATTGATGAACACGATTAACATCGCTAAGAACGACTTCTCTGACATCGAACTGGCTGCTATCCCGTTCAACACTCTGGCTGACCATTACGGTGAGCGTTTAGCTCGCGAACAGTTGGCCCTTGAGCATGAGTCTTACGAGATGGGTGAAGCACGCTTCCGCAAGATGTTTGAGCGTCAACTTAAAGCTGGTGAGGTTGCGGATAACGCTGCCGCCAAGCCTCTCATCACTACCCTACTCCCTAAGATGATTGCACGCATCAACGACTGGTTTGAGGAAGTGAAAGCTAAGCGCGGCAAGCGCCCGACAGCCTTCCAGTTCCTGCAAGAAATCAAGCCGGAAGCCGTAGCGTACATCACCATTAAGACCACTCTGGCTTGCCTAACCAGTGCTGACAATACAACCGTTCAGGCTGTAGCAAGCGCAATCGGTCGGGCCATTGAGGACGAGGCTCGCTTCGGTCGTATCCGTGACCTTGAAGCTAAGCACTTCAAGAAAAACGTTGAGGAACAACTCAACAAGCGCGTAGGGCACGTCTACAAGAAAGCATTTATGCAAGTTGTCGAGGCTGACATGCTCTCTAAGGGTCTACTCGGTGGCGAGGCGTGGTCTTCGTGGCATAAGGAAGACTCTATTCATGTAGGAGTACGCTGCATCGAGATGCTCATTGAGTCAACCGGAATGGTTAGCTTACACCGCCAAAATGCTGGCGTAGTAGGTCAAGACTCTGAGACTATCGAACTCGCACCTGAATACGCTGAGGCTATCGCAACCCGTGCAGGTGCGCTGGCTGGCATCTCTCCGATGTTCCAACCTTGCGTAGTTCCTCCTAAGCCGTGGACTGGCATTACTGGTGGTGGCTATTGGGCTAACGGTCGTCGTCCTCTGGCGCTGGTGCGTACTCACAGTAAGAAAGCACTGATGCGCTACGAAGACGTTTACATGCCTGAGGTGTACAAAGCGATTAACATTGCGCAAAACACCGCATGGAAAATCAACAAGAAAGTCCTAGCGGTCGCCAACGTAATCACCAAGTGGAAGCATTGTCCGGTCGAGGACATCCCTGCGATTGAGCGTGAAGAACTCCCGATGAAACCGGAAGACATCGACATGAATCCTGAGGCTCTCACCGCGTGGAAACGTGCTGCCGCTGCTGTGTACCGCAAGGACAAGGCTCGCAAGTCTCGCCGTATCAGCCTTGAGTTCATGCTTGAGCAAGCCAATAAGTTTGCTAACCATAAGGCCATCTGGTTCCCTTACAACATGGACTGGCGCGGTCGTGTTTACGCTGTGTCAATGTTCAACCCGCAAGGTAACGATATGACCAAAGGACTGCTTACGCTGGCGAAAGGTAAACCAATCGGTAAGGAAGGTTACTACTGGCTGAAAATCCACGGTGCAAACTGTGCGGGTGTCGATAAGGTTCCGTTCCCTGAGCGCATCAAGTTCATTGAGGAAAACCACGAGAACATCATGGCTTGCGCTAAGTCTCCACTGGAGAACACTTGGTGGGCTGAGCAAGATTCTCCGTTCTGCTTCCTTGCGTTCTGCTTTGAGTACGCTGGGGTACAGCACCACGGCCTGAGCTATAACTGCTCCCTTCCGCTGGCGTTTGACGGGTCTTGCTCTGGCATCCAGCACTTCTCCGCGATGCTCCGAGATGAGGTAGGTGGTCGCGCGGTTAACTTGCTTCCTAGTGAAACCGTTCAGGACATCTACGGGATTGTTGCTAAGAAAGTCAACGAGATTCTACAAGCAGACGCAATCAATGGGACCGATAACGAAGTAGTTACCGTGACCGATGAGAACACTGGTGAAATCTCTGAGAAAGTCAAGCTGGGCACTAAGGCACTGGCTGGTCAATGGCTGGCTTACGGTGTTACTCGCAGTGTGACTAAGCGTTCAGTCATGACGCTGGCTTACGGGTCCAAAGAGTTCGGCTTCCGTCAACAAGTGCTGGAAGATACCATTCAGCCAGCTATTGATTCCGGCAAGGGTCTGATGTTCACTCAGCCGAATCAGGCTGCTGGATACATGGCTAAGCTGATTTGGGAATCTGTGAGCGTGACGGTGGTAGCTGCGGTTGAAGCAATGAACTGGCTTAAGTCTGCTGCTAAGCTGCTGGCTGCTGAGGTCAAAGATAAGAAGACTGGAGAGATTCTTCGCAAGCGTTGCGCTGTGCATTGGGTAACTCCTGATGGTTTCCCTGTGTGGCAGGAATACAAGAAGCCTATTCAGACGCGCTTGAACCTGATGTTCCTCGGTCAGTTCCGCTTACAGCCTACCATTAACACCAACAAAGATAGCGAGATTGATGCACACAAACAGGAGTCTGGTATCGCTCCTAACTTTGTACACAGCCAAGACGGTAGCCACCTTCGTAAGACTGTAGTGTGGGCACACGAGAAGTACGGAATCGAATCTTTTGCACTGATTCACGACTCCTTCGGTACCATTCCGGCTGACGCTGCGAACCTGTTCAAAGCAGTGCGCGAAACTATGGTTGACACATATGAGTCTTGTGATGTACTGGCTGATTTCTACGACCAGTTCGCTGACCAGTTGCACGAGTCTCAATTGGACAAAATGCCAGCACTTCCGGCTAAAGGTAACTTGAACCTCCGTGACATCTTAGAGTCGGACTTCGCGTTCGCGTAA
SEQ ID NO.66：P22+T7R(连接有P22启动子的T7R序列)，人工序列
TCCCGCCAAATTCCCAATTTTGTTCTATACTGTATTGATGAACACGATTAACATCGCTAAGAACGACTTCTCTGACATCGAACTGGCTGCTATCCCGTTCAACACTCTGGCTGACCATTACGGTGAGCGTTTAGCTCGCGAACAGTTGGCCCTTGAGCATGAGTCTTACGAGATGGGTGAAGCACGCTTCCGCAAGATGTTTGAGCGTCAACTTAAAGCTGGTGAGGTTGCGGATAACGCTGCCGCCAAGCCTCTCATCACTACCCTACTCCCTAAGATGATTGCACGCATCAACGACTGGTTTGAGGAAGTGAAAGCTAAGCGCGGCAAGCGCCCGACAGCCTTCCAGTTCCTGCAAGAAATCAAGCCGGAAGCCGTAGCGTACATCACCATTAAGACCACTCTGGCTTGCCTAACCAGTGCTGACAATACAACCGTTCAGGCTGTAGCAAGCGCAATCGGTCGGGCCATTGAGGACGAGGCTCGCTTCGGTCGTATCCGTGACCTTGAAGCTAAGCACTTCAAGAAAAACGTTGAGGAACAACTCAACAAGCGCGTAGGGCACGTCTACAAGAAAGCATTTATGCAAGTTGTCGAGGCTGACATGCTCTCTAAGGGTCTACTCGGTGGCGAGGCGTGGTCTTCGTGGCATAAGGAAGACTCTATTCATGTAGGAGTACGCTGCATCGAGATGCTCATTGAGTCAACCGGAATGGTTAGCTTACACCGCCAAAATGCTGGCGTAGTAGGTCAAGACTCTGAGACTATCGAACTCGCACCTGAATACGCTGAGGCTATCGCAACCCGTGCAGGTGCGCTGGCTGGCATCTCTCCGATGTTCCAACCTTGCGTAGTTCCTCCTAAGCCGTGGACTGGCATTACTGGTGGTGGCTATTGGGCTAACGGTCGTCGTCCTCTGGCGCTGGTGCGTACTCACAGTAAGAAAGCACTGATGCGCTACGAAGACGTTTACATGCCTGAGGTGTACAAAGCGATTAACATTGCGCAAAACACCGCATGGAAAATCAACAAGAAAGTCCTAGCGGTCGCCAACGTAATCACCAAGTGGAAGCATTGTCCGGTCGAGGACATCCCTGCGATTGAGCGTGAAGAACTCCCGATGAAACCGGAAGACATCGACATGAATCCTGAGGCTCTCACCGCGTGGAAACGTGCTGCCGCTGCTGTGTACCGCAAGGACAAGGCTCGCAAGTCTCGCCGTATCAGCCTTGAGTTCATGCTTGAGCAAGCCAATAAGTTTGCTAACCATAAGGCCATCTGGTTCCCTTACAACATGGACTGGCGCGGTCGTGTTTACGCTGTGTCAATGTTCAACCCGCAAGGTAACGATATGACCAAAGGACTGCTTACGCTGGCGAAAGGTAAACCAATCGGTAAGGAAGGTTACTACTGGCTGAAAATCCACGGTGCAAACTGTGCGGGTGTCGATAAGGTTCCGTTCCCTGAGCGCATCAAGTTCATTGAGGAAAACCACGAGAACATCATGGCTTGCGCTAAGTCTCCACTGGAGAACACTTGGTGGGCTGAGCAAGATTCTCCGTTCTGCTTCCTTGCGTTCTGCTTTGAGTACGCTGGGGTACAGCACCACGGCCTGAGCTATAACTGCTCCCTTCCGCTGGCGTTTGACGGGTCTTGCTCTGGCATCCAGCACTTCTCCGCGATGCTCCGAGATGAGGTAGGTGGTCGCGCGGTTAACTTGCTTCCTAGTGAAACCGTTCAGGACATCTACGGGATTGTTGCTAAGAAAGTCAACGAGATTCTACAAGCAGACGCAATCAATGGGACCGATAACGAAGTAGTTACCGTGACCGATGAGAACACTGGTGAAATCTCTGAGAAAGTCAAGCTGGGCACTAAGGCACTGGCTGGTCAATGGCTGGCTTACGGTGTTACTCGCAGTGTGACTAAGCGTTCAGTCATGACGCTGGCTTACGGGTCCAAAGAGTTCGGCTTCCGTCAACAAGTGCTGGAAGATACCATTCAGCCAGCTATTGATTCCGGCAAGGGTCTGATGTTCACTCAGCCGAATCAGGCTGCTGGATACATGGCTAAGCTGATTTGGGAATCTGTGAGCGTGACGGTGGTAGCTGCGGTTGAAGCAATGAACTGGCTTAAGTCTGCTGCTAAGCTGCTGGCTGCTGAGGTCAAAGATAAGAAGACTGGAGAGATTCTTCGCAAGCGTTGCGCTGTGCATTGGGTAACTCCTGATGGTTTCCCTGTGTGGCAGGAATACAAGAAGCCTATTCAGACGCGCTTGAACCTGATGTTCCTCGGTCAGTTCCGCTTACAGCCTACCATTAACACCAACAAAGATAGCGAGATTGATGCACACAAACAGGAGTCTGGTATCGCTCCTAACTTTGTACACAGCCAAGACGGTAGCCACCTTCGTAAGACTGTAGTGTGGGCACACGAGAAGTACGGAATCGAATCTTTTGCACTGATTCACGACTCCTTCGGTACCATTCCGGCTGACGCTGCGAACCTGTTCAAAGCAGTGCGCGAAACTATGGTTGACACATATGAGTCTTGTGATGTACTGGCTGATTTCTACGACCAGTTCGCTGACCAGTTGCACGAGTCTCAATTGGACAAAATGCCAGCACTTCCGGCTAAAGGTAACTTGAACCTCCGTGACATCTTAGAGTCGGACTTCGCGTTCGCGTAA
SEQ ID NO.67：P23+T7R(连接有P23启动子的T7R序列)，人工序列
TCCCGCCTTTAGGGGTGAATTGTTCTATACTGAATTGATGAACACGATTAACATCGCTAAGAACGACTTCTCTGACATCGAACTGGCTGCTATCCCGTTCAACACTCTGGCTGACCATTACGGTGAGCGTTTAGCTCGCGAACAGTTGGCCCTTGAGCATGAGTCTTACGAGATGGGTGAAGCACGCTTCCGCAAGATGTTTGAGCGTCAACTTAAAGCTGGTGAGGTTGCGGATAACGCTGCCGCCAAGCCTCTCATCACTACCCTACTCCCTAAGATGATTGCACGCATCAACGACTGGTTTGAGGAAGTGAAAGCTAAGCGCGGCAAGCGCCCGACAGCCTTCCAGTTCCTGCAAGAAATCAAGCCGGAAGCCGTAGCGTACATCACCATTAAGACCACTCTGGCTTGCCTAACCAGTGCTGACAATACAACCGTTCAGGCTGTAGCAAGCGCAATCGGTCGGGCCATTGAGGACGAGGCTCGCTTCGGTCGTATCCGTGACCTTGAAGCTAAGCACTTCAAGAAAAACGTTGAGGAACAACTCAACAAGCGCGTAGGGCACGTCTACAAGAAAGCATTTATGCAAGTTGTCGAGGCTGACATGCTCTCTAAGGGTCTACTCGGTGGCGAGGCGTGGTCTTCGTGGCATAAGGAAGACTCTATTCATGTAGGAGTACGCTGCATCGAGATGCTCATTGAGTCAACCGGAATGGTTAGCTTACACCGCCAAAATGCTGGCGTAGTAGGTCAAGACTCTGAGACTATCGAACTCGCACCTGAATACGCTGAGGCTATCGCAACCCGTGCAGGTGCGCTGGCTGGCATCTCTCCGATGTTCCAACCTTGCGTAGTTCCTCCTAAGCCGTGGACTGGCATTACTGGTGGTGGCTATTGGGCTAACGGTCGTCGTCCTCTGGCGCTGGTGCGTACTCACAGTAAGAAAGCACTGATGCGCTACGAAGACGTTTACATGCCTGAGGTGTACAAAGCGATTAACATTGCGCAAAACACCGCATGGAAAATCAACAAGAAAGTCCTAGCGGTCGCCAACGTAATCACCAAGTGGAAGCATTGTCCGGTCGAGGACATCCCTGCGATTGAGCGTGAAGAACTCCCGATGAAACCGGAAGACATCGACATGAATCCTGAGGCTCTCACCGCGTGGAAACGTGCTGCCGCTGCTGTGTACCGCAAGGACAAGGCTCGCAAGTCTCGCCGTATCAGCCTTGAGTTCATGCTTGAGCAAGCCAATAAGTTTGCTAACCATAAGGCCATCTGGTTCCCTTACAACATGGACTGGCGCGGTCGTGTTTACGCTGTGTCAATGTTCAACCCGCAAGGTAACGATATGACCAAAGGACTGCTTACGCTGGCGAAAGGTAAACCAATCGGTAAGGAAGGTTACTACTGGCTGAAAATCCACGGTGCAAACTGTGCGGGTGTCGATAAGGTTCCGTTCCCTGAGCGCATCAAGTTCATTGAGGAAAACCACGAGAACATCATGGCTTGCGCTAAGTCTCCACTGGAGAACACTTGGTGGGCTGAGCAAGATTCTCCGTTCTGCTTCCTTGCGTTCTGCTTTGAGTACGCTGGGGTACAGCACCACGGCCTGAGCTATAACTGCTCCCTTCCGCTGGCGTTTGACGGGTCTTGCTCTGGCATCCAGCACTTCTCCGCGATGCTCCGAGATGAGGTAGGTGGTCGCGCGGTTAACTTGCTTCCTAGTGAAACCGTTCAGGACATCTACGGGATTGTTGCTAAGAAAGTCAACGAGATTCTACAAGCAGACGCAATCAATGGGACCGATAACGAAGTAGTTACCGTGACCGATGAGAACACTGGTGAAATCTCTGAGAAAGTCAAGCTGGGCACTAAGGCACTGGCTGGTCAATGGCTGGCTTACGGTGTTACTCGCAGTGTGACTAAGCGTTCAGTCATGACGCTGGCTTACGGGTCCAAAGAGTTCGGCTTCCGTCAACAAGTGCTGGAAGATACCATTCAGCCAGCTATTGATTCCGGCAAGGGTCTGATGTTCACTCAGCCGAATCAGGCTGCTGGATACATGGCTAAGCTGATTTGGGAATCTGTGAGCGTGACGGTGGTAGCTGCGGTTGAAGCAATGAACTGGCTTAAGTCTGCTGCTAAGCTGCTGGCTGCTGAGGTCAAAGATAAGAAGACTGGAGAGATTCTTCGCAAGCGTTGCGCTGTGCATTGGGTAACTCCTGATGGTTTCCCTGTGTGGCAGGAATACAAGAAGCCTATTCAGACGCGCTTGAACCTGATGTTCCTCGGTCAGTTCCGCTTACAGCCTACCATTAACACCAACAAAGATAGCGAGATTGATGCACACAAACAGGAGTCTGGTATCGCTCCTAACTTTGTACACAGCCAAGACGGTAGCCACCTTCGTAAGACTGTAGTGTGGGCACACGAGAAGTACGGAATCGAATCTTTTGCACTGATTCACGACTCCTTCGGTACCATTCCGGCTGACGCTGCGAACCTGTTCAAAGCAGTGCGCGAAACTATGGTTGACACATATGAGTCTTGTGATGTACTGGCTGATTTCTACGACCAGTTCGCTGACCAGTTGCACGAGTCTCAATTGGACAAAATGCCAGCACTTCCGGCTAAAGGTAACTTGAACCTCCGTGACATCTTAGAGTCGGACTTCGCGTTCGCGTAA
SEQ ID NO.68：P24+T7R(连接有P24启动子的T7R序列)，人工序列
TCCCGCCTTTAGGGGCTAATTGTTCTATACTGAAATGATGAACACGATTAACATCGCTAAGAACGACTTCTCTGACATCGAACTGGCTGCTATCCCGTTCAACACTCTGGCTGACCATTACGGTGAGCGTTTAGCTCGCGAACAGTTGGCCCTTGAGCATGAGTCTTACGAGATGGGTGAAGCACGCTTCCGCAAGATGTTTGAGCGTCAACTTAAAGCTGGTGAGGTTGCGGATAACGCTGCCGCCAAGCCTCTCATCACTACCCTACTCCCTAAGATGATTGCACGCATCAACGACTGGTTTGAGGAAGTGAAAGCTAAGCGCGGCAAGCGCCCGACAGCCTTCCAGTTCCTGCAAGAAATCAAGCCGGAAGCCGTAGCGTACATCACCATTAAGACCACTCTGGCTTGCCTAACCAGTGCTGACAATACAACCGTTCAGGCTGTAGCAAGCGCAATCGGTCGGGCCATTGAGGACGAGGCTCGCTTCGGTCGTATCCGTGACCTTGAAGCTAAGCACTTCAAGAAAAACGTTGAGGAACAACTCAACAAGCGCGTAGGGCACGTCTACAAGAAAGCATTTATGCAAGTTGTCGAGGCTGACATGCTCTCTAAGGGTCTACTCGGTGGCGAGGCGTGGTCTTCGTGGCATAAGGAAGACTCTATTCATGTAGGAGTACGCTGCATCGAGATGCTCATTGAGTCAACCGGAATGGTTAGCTTACACCGCCAAAATGCTGGCGTAGTAGGTCAAGACTCTGAGACTATCGAACTCGCACCTGAATACGCTGAGGCTATCGCAACCCGTGCAGGTGCGCTGGCTGGCATCTCTCCGATGTTCCAACCTTGCGTAGTTCCTCCTAAGCCGTGGACTGGCATTACTGGTGGTGGCTATTGGGCTAACGGTCGTCGTCCTCTGGCGCTGGTGCGTACTCACAGTAAGAAAGCACTGATGCGCTACGAAGACGTTTACATGCCTGAGGTGTACAAAGCGATTAACATTGCGCAAAACACCGCATGGAAAATCAACAAGAAAGTCCTAGCGGTCGCCAACGTAATCACCAAGTGGAAGCATTGTCCGGTCGAGGACATCCCTGCGATTGAGCGTGAAGAACTCCCGATGAAACCGGAAGACATCGACATGAATCCTGAGGCTCTCACCGCGTGGAAACGTGCTGCCGCTGCTGTGTACCGCAAGGACAAGGCTCGCAAGTCTCGCCGTATCAGCCTTGAGTTCATGCTTGAGCAAGCCAATAAGTTTGCTAACCATAAGGCCATCTGGTTCCCTTACAACATGGACTGGCGCGGTCGTGTTTACGCTGTGTCAATGTTCAACCCGCAAGGTAACGATATGACCAAAGGACTGCTTACGCTGGCGAAAGGTAAACCAATCGGTAAGGAAGGTTACTACTGGCTGAAAATCCACGGTGCAAACTGTGCGGGTGTCGATAAGGTTCCGTTCCCTGAGCGCATCAAGTTCATTGAGGAAAACCACGAGAACATCATGGCTTGCGCTAAGTCTCCACTGGAGAACACTTGGTGGGCTGAGCAAGATTCTCCGTTCTGCTTCCTTGCGTTCTGCTTTGAGTACGCTGGGGTACAGCACCACGGCCTGAGCTATAACTGCTCCCTTCCGCTGGCGTTTGACGGGTCTTGCTCTGGCATCCAGCACTTCTCCGCGATGCTCCGAGATGAGGTAGGTGGTCGCGCGGTTAACTTGCTTCCTAGTGAAACCGTTCAGGACATCTACGGGATTGTTGCTAAGAAAGTCAACGAGATTCTACAAGCAGACGCAATCAATGGGACCGATAACGAAGTAGTTACCGTGACCGATGAGAACACTGGTGAAATCTCTGAGAAAGTCAAGCTGGGCACTAAGGCACTGGCTGGTCAATGGCTGGCTTACGGTGTTACTCGCAGTGTGACTAAGCGTTCAGTCATGACGCTGGCTTACGGGTCCAAAGAGTTCGGCTTCCGTCAACAAGTGCTGGAAGATACCATTCAGCCAGCTATTGATTCCGGCAAGGGTCTGATGTTCACTCAGCCGAATCAGGCTGCTGGATACATGGCTAAGCTGATTTGGGAATCTGTGAGCGTGACGGTGGTAGCTGCGGTTGAAGCAATGAACTGGCTTAAGTCTGCTGCTAAGCTGCTGGCTGCTGAGGTCAAAGATAAGAAGACTGGAGAGATTCTTCGCAAGCGTTGCGCTGTGCATTGGGTAACTCCTGATGGTTTCCCTGTGTGGCAGGAATACAAGAAGCCTATTCAGACGCGCTTGAACCTGATGTTCCTCGGTCAGTTCCGCTTACAGCCTACCATTAACACCAACAAAGATAGCGAGATTGATGCACACAAACAGGAGTCTGGTATCGCTCCTAACTTTGTACACAGCCAAGACGGTAGCCACCTTCGTAAGACTGTAGTGTGGGCACACGAGAAGTACGGAATCGAATCTTTTGCACTGATTCACGACTCCTTCGGTACCATTCCGGCTGACGCTGCGAACCTGTTCAAAGCAGTGCGCGAAACTATGGTTGACACATATGAGTCTTGTGATGTACTGGCTGATTTCTACGACCAGTTCGCTGACCAGTTGCACGAGTCTCAATTGGACAAAATGCCAGCACTTCCGGCTAAAGGTAACTTGAACCTCCGTGACATCTTAGAGTCGGACTTCGCGTTCGCGTAA
SEQ ID NO.69：plac+yebQ(连接有plac启动子的yebQ序列)，人工序列
GGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAGGAGCTCATGCCAAAAGTTCAGGCCGACGGCCTGCCATTGCCCCAGCGATACGGTGCGATATTAACCATTGTGATTGGTATTTCGATGGCCGTCCTTGACGGCGCAATCGCCAACGTCGCCCTGCCAACAATCGCCACGGACCTTCATGCCACGCCAGCCAGTTCCATCTGGGTAGTGAACGCCTATCAAATCGCCATTGTCATCTCCCTGCTCTCGTTTTCGTTTCTGGGCGATATGTTTGGCTATCGACGTATTTATAAATGCGGTCTGGTCGTTTTTCTGTTGTCTTCACTGTTCTGCGCCCTTTCTGATTCGCTGCAAATGCTCACCCTTGCGCGTGTCATACAAGGTTTCGGCGGTGCAGCGTTGATGAGCGTTAATACCGCACTTATCCGCCTGATCTATCCACAACGTTTTCTGGGTAGAGGGATGGGCATAAACTCGTTTATTGTTGCCGTCTCTTCTGCTGCCGGGCCGACAATTGCTGCAGCAATCCTCTCCATCGCATCCTGGAAATGGTTATTTTTAATCAACGTACCGTTAGGTATTATCGCCCTGCTTCTGGCGATGCGTTTTCTGCCACCCAATGGTTCTCGCGCCAGTAAACCCCGTTTCGACCTGCCCAGCGCCGTGATGAACGCGTTAACCTTCGGCCTGCTTATCACTGCGTTGAGTGGTTTCGCTCAGGGGCAATCGCTGACGTTAATTGCTGCGGAACTGGTGGTAATGGTTGTTGTTGGTATTTTCTTTATTCGCCGCCAGCTTTCTCTTCCCGTACCGCTGCTACCGGTGGATTTACTGCGTATCCCGCTGTTTTCACTTTCTATTTGCACATCTGTTTGCTCTTTCTGCGCACAAATGCTGGCAATGGTTTCCCTGCCCTTTTACCTGCAAACCGTGCTCGGGCGTAGTGAAGTCGAAACAGGTTTACTTCTGACACCGTGGCCGTTAGCAACGATGGTGATGGCTCCGCTGGCAGGCTATTTGATTGAACGCGTACATGCAGGATTGCTGGGGGCTTTAGGGTTGTTCATCATGGCTGCGGGGCTTTTTTCCCTGGTTCTGCTGCCCGCGTCACCTGCGGATATCAATATTATCTGGCCGATGATCTTATGTGGTGCTGGATTTGGCTTATTCCAGTCACCCAATAACCACACCATTATTACCTCCGCGCCTCGCGAACGTAGCGGTGGAGCCAGTGGCATGTTAGGAACGGCTCGTCTACTGGGTCAGAGTAGCGGCGCGGCGCTGGTGGCGCTGATGCTAAATCAGTTTGGAGATAATGGTACACACGTCTCGCTGATGGCTGCGGCTATTCTGGCAGTGATTGCTGCCTGTGTCAGTGGTTTACGTATCACTCAGCCACGATCCAGGGCATAA
SEQ ID NO.70：plac+mdtD(连接有plac启动子的mdtD序列)，人工序列
GGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAGGAGCTCATGACAGATCTTCCCGACAGCACCCGTTGGCAATTGTGGATTGTGGCTTTCGGCTTCTTTATGCAGTCGCTGGACACCACCATCGTAAACACCGCCCTTCCCTCAATGGCGCAAAGCCTCGGGGAAAGTCCGTTGCATATGCACATGGTCATTGTCTCTTATGTGCTGACCGTGGCGGTGATGCTGCCCGCCAGCGGCTGGCTGGCGGACAAAGTCGGCGTGCGCAATATTTTCTTTACCGCCATCGTGCTGTTTACTCTCGGTTCACTGTTTTGCGCGCTTTCCGGCACGCTGAACGAACTGTTGCTGGCACGCGCGTTACAGGGCGTTGGCGGCGCGATGATGGTGCCGGTCGGCAGATTGACGGTGATGAAAATCGTACCGCGCGAGCAATATATGGCGGCGATGACCTTTGTCACGTTACCCGGTCAGGTCGGTCCGCTGCTCGGTCCGGCGCTCGGCGGTCTGCTGGTGGAGTACGCATCGTGGCACTGGATCTTTTTGATCAACATTCCGGTGGGGATTATCGGTGCGATCGCCACATTGCTGTTAATGCCGAACTACACCATGCAGACGCGGCGCTTTGATCTCTCCGGATTTTTATTGCTGGCGGTTGGCATGGCGGTATTAACCCTGGCGCTGGACGGCAGTAAAGGTACAGGTTTATCGCCGCTGACGATTGCAGGCCTGGTCGCAGTTGGCGTGGTGGCACTGGTGCTTTATCTGCTGCACGCCAGAAATAACAACCGTGCCCTGTTCAGTCTGAAACTGTTCCGTACTCGTACCTTTTCGCTGGGCCTGGCGGGGAGCTTTGCCGGACGTATTGGCAGTGGCATGTTGCCCTTTATGACACCGGTTTTCCTGCAAATTGGCCTCGGTTTCTCGCCGTTTCATGCCGGACTGATGATGATCCCGATGGTGCTTGGCAGCATGGGAATGAAGCGAATTGTGGTACAGGTGGTGAATCGCTTTGGTTATCGTCGGGTACTGGTAGCGACCACGCTGGGTCTGTCGCTGGTCACCCTGTTGTTTATGACTACCGCCCTGCTGGGCTGGTACTACGTTTTGCCGTTCGTCCTGTTTTTACAAGGGATGGTCAACTCGACGCGTTTCTCCTCCATGAACACCCTGACGCTGAAAGATCTCCCGGACAATCTGGCGAGCAGCGGCAACAGCCTGCTGTCGATGATTATGCAATTGTCGATGAGTATCGGCGTCACTATCGCCGGGCTGTTGCTGGGACTTTTTGGTTCACAGCATGTCAGCGTCGACAGCGGCACCACACAAACCGTCTTTATGTACACCTGGCTTAGCATGGCGTTGATCATCGCCCTTCCGGCGTTCATCTTTGCCAGAGTGCCGAACGATACGCATCAAAATGTAGCTATTTCGCGGCGAAAAAGGAGCGCGCAATGA
SEQ ID NO.71：plac+cgl2893(连接有plac启动子的cgl2893序列)，人工序列
GGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAGGAGCTCATGACCAGCGAAACCTTACAGGCCCAAGCTCCAACTAAGACCCAGCGGTGGGCCTTCTTGGCCGTTATATCTGGCGGGTTATTCCTTATTGGTGTGGACAATAGCATCCTGTATACGGCGTTGCCATTGCTGCGCGAACAACTGGCGGCGACCGAAACGCAGGCCCTGTGGATTATCAATGCCTATCCACTGTTGATGGCTGGCCTGCTGCTTGGCACGGGTACTCTTGGTGACAAAATTGGCCATCGTCGTATGTTCTTGATGGGGCTGTCTATCTTTGGCATTGCGTCGTTGGGTGCGGCTTTCGCTCCGACCGCCTGGGCGCTGGTAGCTGCACGCGCCTTTCTTGGAATAGGTGCAGCGACAATGATGCCCGCCACACTGGCGTTAATCCGCATCACGTTTGAGGATGAACGTGAACGTAACACCGCGATCGGCATCTGGGGAAGCGTCGCTATACTGGGAGCGGCTGCGGGTCCAATAATCGGGGGTGCTCTGCTGGAGTTTTTTTGGTGGGGTAGCGTGTTTCTGATCAATGTGCCTGTGGCCGTGATTGCGCTTATCGCGACGTTATTTGTGGCTCCGGCAAATATCGCCAACCCGAGCAAACATTGGGACTTTTTGAGCAGCTTCTATGCGTTACTGACCTTAGCGGGCCTGATCATCACGATTAAGGAGAGCGTGAATACCGCCCGTCATATGCCACTGCTGTTAGGGGCGGTCATTATGTTGATTATCGGTGCCGTGCTGTTTAGCAGTCGTCAGAAGAAAATTGAGGAACCGCTTCTGGATCTGAGCTTATTTCGTAATCGTTTGTTCCTTGGGGGGGTGGTGGCAGCTGGCATGGCTATGTTTACCGTGAGCGGCCTGGAAATGACCACCAGTCAGCGTTTTCAACTGAGCGTGGGGTTTACCCCCCTGGAGGCGGGCTTGCTGATGATTCCTGCGGCACTGGGGTCTTTCCCTATGAGCATAATTGGAGGTGCAAATCTGCATCGGTGGGGCTTTAAGCCACTGATTAGCGGAGGCTTCGCCGCGACGGCGGTTGGAATTGCTTTATGCATTTGGGGTGCGACCCATACCGATGGTCTGCCGTTCTTTATAGCTGGCTTGTTCTTCATGGGCGCAGGTGCTGGTTCTGTGATGAGCGTATCAAGCACTGCCATCATCGGCAGCGCACCCGTTCGTAAAGCTGGGATGGCTTCGAGCATTGAAGAAGTTAGCTATGAATTTGGAACCCTGTTGTCGGTTGCTATCTTGGGAAGTCTGTTTCCGTTTTTCTACTCACTGCATGCCCCTGCAGAAGTGGCTGATAACTTTTCTGCCGGGGTGCATCATGCGATTGACGGGGATGCAGCTCGTGCAAGCCTTGACACAGCGTACATAAATGTACTGATAATTGCTCTGGTGTGCGCCGTTGCAGCGGCTCTGATATCGAGCTATCTGTTCCGTGGCAATCCGAAGGGCGCGAATAACGCGCATTAG
序列表
<110> 上海凯赛生物技术股份有限公司
<120> 用于发酵生产1,5-戊二胺的重组DNA、菌株及其用途
<130> LZ2101367CN01
<160> 71
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 235
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 1
tgctttttcc gatcgtcacg gcgatgttta tcgcgaacag atggtggact ttatccttag 60
cgcgttgaat ccgcagaact aacccatgat cgctagcacg ataatcattc acaaaaccac 120
cttaagacat gctaatccac tggtcagaac agtttaagat gagaaaaatt ctgtgacgct 180
tgccaacatt tctgatgatt agcattccct tcgccatttc cttgagcaaa cttta 235
<210> 2
<211> 238
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 2
tgtttggtaa aaattcccgc catcataaca ttgccaacgg cgaggggaag tgggtaaggc 60
atgtaaattc atcatgttga cgaaataatc gcccctggta aaagaaacac tgatgcgagg 120
cctgtgtttc aatctttaaa tcagtaaact tcatacgctt gacggaaaaa ccaggacgaa 180
acctaaatat ttgttgttaa gctgcaatgg aaacggtaaa agcggctagt atttaaag 238
<210> 3
<211> 233
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 3
ctcgcttaca tcgctaccag catggtcaac ctgcgcctgg cacaggaacg ttatccggac 60
gttcagttcc accagacccg cgagcattaa ttcttgcctc cagggcgcgg tagccgctgc 120
gccctgtcaa tttcccttcc ttattagccg cttacggaat gttcttaaaa cattcacttt 180
tgcttatgtt ttcgctgata tcccgagcgg tttcaaaatt gtgatctata ttt 233
<210> 4
<211> 237
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 4
gcagaaatga ctctcccatc agtacaaacg caacatattt gccacgcagc atccagacat 60
cacgaaacga atccatcttt atcgcatgtt ctggcggcgc gggttccgtg cgtgggacat 120
agctaataat ctggcggttt tgctggcgga gcggtttctt cattactggc ttcactaaac 180
gcatattaaa aatcagaaaa actgtagttt agccgattta gcccctgtac gtcccgc 237
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> P21序列
<400> 5
cactcccgcc tttaggggtc aaaattgttc tatactgtat tg 42
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> p22序列
<400> 6
tcccgccaaa ttcccaattt tgttctatac tgtattg 37
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> p23序列
<400> 7
tcccgccttt aggggtgaat tgttctatac tgaattg 37
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> p24序列
<400> 8
tcccgccttt aggggctaat tgttctatac tgaaatg 37
<210> 9
<211> 2148
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 9
atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60
gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120
gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180
aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240
gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt 300
agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360
actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420
cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480
agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540
tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600
gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660
tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccag caggcagcac cattctgatt 720
gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780
tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840
cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900
gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960
acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020
ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080
gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140
aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200
ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa aggcaatgca 1260
ggtaagcgtc tgatcaacgg ttctattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320
cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgtat ggcagccgga tcatatcgat 1380
acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440
aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500
gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560
catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620
atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgactttaa acgtgcgttc 1680
gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740
tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct cagaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800
aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860
tatgctgcat tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920
gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtacccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980
ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040
gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100
gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaataa 2148
<210> 10
<211> 715
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 10
Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu
1 5 10 15
Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln
20 25 30
Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn
35 40 45
Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu
50 55 60
Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr
65 70 75 80
Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp
100 105 110
Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile
115 120 125
Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys
130 135 140
Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys
145 150 155 160
Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met
165 170 175
Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp
180 185 190
His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe
195 200 205
Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn
210 215 220
Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile
225 230 235 240
Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp
245 250 255
Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu
260 265 270
Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg
275 280 285
Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys
305 310 315 320
Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr
325 330 335
Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly
340 345 350
Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu
355 360 365
Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val
370 375 380
Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser
385 390 395 400
Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met
405 410 415
Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala
420 425 430
Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly
435 440 445
Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys
450 455 460
Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp
465 470 475 480
Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro
485 490 495
Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser
500 505 510
Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr
515 520 525
Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr
530 535 540
Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe
545 550 555 560
Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu
565 570 575
Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn
580 585 590
Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg
595 600 605
Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe
610 615 620
Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met
625 630 635 640
Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val
645 650 655
Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val
660 665 670
Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly
675 680 685
Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr
690 695 700
Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys
705 710 715
<210> 11
<211> 457
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 11
Met Pro Lys Val Gln Ala Asp Gly Leu Pro Leu Pro Gln Arg Tyr Gly
1 5 10 15
Ala Ile Leu Thr Ile Val Ile Gly Ile Ser Met Ala Val Leu Asp Gly
20 25 30
Ala Ile Ala Asn Val Ala Leu Pro Thr Ile Ala Thr Asp Leu His Ala
35 40 45
Thr Pro Ala Ser Ser Ile Trp Val Val Asn Ala Tyr Gln Ile Ala Ile
50 55 60
Val Ile Ser Leu Leu Ser Phe Ser Phe Leu Gly Asp Met Phe Gly Tyr
65 70 75 80
Arg Arg Ile Tyr Lys Cys Gly Leu Val Val Phe Leu Leu Ser Ser Leu
85 90 95
Phe Cys Ala Leu Ser Asp Ser Leu Gln Met Leu Thr Leu Ala Arg Val
100 105 110
Ile Gln Gly Phe Gly Gly Ala Ala Leu Met Ser Val Asn Thr Ala Leu
115 120 125
Ile Arg Leu Ile Tyr Pro Gln Arg Phe Leu Gly Arg Gly Met Gly Ile
130 135 140
Asn Ser Phe Ile Val Ala Val Ser Ser Ala Ala Gly Pro Thr Ile Ala
145 150 155 160
Ala Ala Ile Leu Ser Ile Ala Ser Trp Lys Trp Leu Phe Leu Ile Asn
165 170 175
Val Pro Leu Gly Ile Ile Ala Leu Leu Leu Ala Met Arg Phe Leu Pro
180 185 190
Pro Asn Gly Ser Arg Ala Ser Lys Pro Arg Phe Asp Leu Pro Ser Ala
195 200 205
Val Met Asn Ala Leu Thr Phe Gly Leu Leu Ile Thr Ala Leu Ser Gly
210 215 220
Phe Ala Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu Ile Ala Ala Glu Leu Val Val
225 230 235 240
Met Val Val Val Gly Ile Phe Phe Ile Arg Arg Gln Leu Ser Leu Pro
245 250 255
Val Pro Leu Leu Pro Val Asp Leu Leu Arg Ile Pro Leu Phe Ser Leu
260 265 270
Ser Ile Cys Thr Ser Val Cys Ser Phe Cys Ala Gln Met Leu Ala Met
275 280 285
Val Ser Leu Pro Phe Tyr Leu Gln Thr Val Leu Gly Arg Ser Glu Val
290 295 300
Glu Thr Gly Leu Leu Leu Thr Pro Trp Pro Leu Ala Thr Met Val Met
305 310 315 320
Ala Pro Leu Ala Gly Tyr Leu Ile Glu Arg Val His Ala Gly Leu Leu
325 330 335
Gly Ala Leu Gly Leu Phe Ile Met Ala Ala Gly Leu Phe Ser Leu Val
340 345 350
Leu Leu Pro Ala Ser Pro Ala Asp Ile Asn Ile Ile Trp Pro Met Ile
355 360 365
Leu Cys Gly Ala Gly Phe Gly Leu Phe Gln Ser Pro Asn Asn His Thr
370 375 380
Ile Ile Thr Ser Ala Pro Arg Glu Arg Ser Gly Gly Ala Ser Gly Met
385 390 395 400
Leu Gly Thr Ala Arg Leu Leu Gly Gln Ser Ser Gly Ala Ala Leu Val
405 410 415
Ala Leu Met Leu Asn Gln Phe Gly Asp Asn Gly Thr His Val Ser Leu
420 425 430
Met Ala Ala Ala Ile Leu Ala Val Ile Ala Ala Cys Val Ser Gly Leu
435 440 445
Arg Ile Thr Gln Pro Arg Ser Arg Ala
450 455
<210> 12
<211> 471
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 12
Met Thr Asp Leu Pro Asp Ser Thr Arg Trp Gln Leu Trp Ile Val Ala
1 5 10 15
Phe Gly Phe Phe Met Gln Ser Leu Asp Thr Thr Ile Val Asn Thr Ala
20 25 30
Leu Pro Ser Met Ala Gln Ser Leu Gly Glu Ser Pro Leu His Met His
35 40 45
Met Val Ile Val Ser Tyr Val Leu Thr Val Ala Val Met Leu Pro Ala
50 55 60
Ser Gly Trp Leu Ala Asp Lys Val Gly Val Arg Asn Ile Phe Phe Thr
65 70 75 80
Ala Ile Val Leu Phe Thr Leu Gly Ser Leu Phe Cys Ala Leu Ser Gly
85 90 95
Thr Leu Asn Glu Leu Leu Leu Ala Arg Ala Leu Gln Gly Val Gly Gly
100 105 110
Ala Met Met Val Pro Val Gly Arg Leu Thr Val Met Lys Ile Val Pro
115 120 125
Arg Glu Gln Tyr Met Ala Ala Met Thr Phe Val Thr Leu Pro Gly Gln
130 135 140
Val Gly Pro Leu Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Leu Leu Val Glu Tyr
145 150 155 160
Ala Ser Trp His Trp Ile Phe Leu Ile Asn Ile Pro Val Gly Ile Ile
165 170 175
Gly Ala Ile Ala Thr Leu Leu Leu Met Pro Asn Tyr Thr Met Gln Thr
180 185 190
Arg Arg Phe Asp Leu Ser Gly Phe Leu Leu Leu Ala Val Gly Met Ala
195 200 205
Val Leu Thr Leu Ala Leu Asp Gly Ser Lys Gly Thr Gly Leu Ser Pro
210 215 220
Leu Thr Ile Ala Gly Leu Val Ala Val Gly Val Val Ala Leu Val Leu
225 230 235 240
Tyr Leu Leu His Ala Arg Asn Asn Asn Arg Ala Leu Phe Ser Leu Lys
245 250 255
Leu Phe Arg Thr Arg Thr Phe Ser Leu Gly Leu Ala Gly Ser Phe Ala
260 265 270
Gly Arg Ile Gly Ser Gly Met Leu Pro Phe Met Thr Pro Val Phe Leu
275 280 285
Gln Ile Gly Leu Gly Phe Ser Pro Phe His Ala Gly Leu Met Met Ile
290 295 300
Pro Met Val Leu Gly Ser Met Gly Met Lys Arg Ile Val Val Gln Val
305 310 315 320
Val Asn Arg Phe Gly Tyr Arg Arg Val Leu Val Ala Thr Thr Leu Gly
325 330 335
Leu Ser Leu Val Thr Leu Leu Phe Met Thr Thr Ala Leu Leu Gly Trp
340 345 350
Tyr Tyr Val Leu Pro Phe Val Leu Phe Leu Gln Gly Met Val Asn Ser
355 360 365
Thr Arg Phe Ser Ser Met Asn Thr Leu Thr Leu Lys Asp Leu Pro Asp
370 375 380
Asn Leu Ala Ser Ser Gly Asn Ser Leu Leu Ser Met Ile Met Gln Leu
385 390 395 400
Ser Met Ser Ile Gly Val Thr Ile Ala Gly Leu Leu Leu Gly Leu Phe
405 410 415
Gly Ser Gln His Val Ser Val Asp Ser Gly Thr Thr Gln Thr Val Phe
420 425 430
Met Tyr Thr Trp Leu Ser Met Ala Leu Ile Ile Ala Leu Pro Ala Phe
435 440 445
Ile Phe Ala Arg Val Pro Asn Asp Thr His Gln Asn Val Ala Ile Ser
450 455 460
Arg Arg Lys Arg Ser Ala Gln
465 470
<210> 13
<211> 494
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）
<400> 13
Met Thr Ser Glu Thr Leu Gln Ala Gln Ala Pro Thr Lys Thr Gln Arg
1 5 10 15
Trp Ala Phe Leu Ala Val Ile Ser Gly Gly Leu Phe Leu Ile Gly Val
20 25 30
Asp Asn Ser Ile Leu Tyr Thr Ala Leu Pro Leu Leu Arg Glu Gln Leu
35 40 45
Ala Ala Thr Glu Thr Gln Ala Leu Trp Ile Ile Asn Ala Tyr Pro Leu
50 55 60
Leu Met Ala Gly Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Leu Gly Asp Lys Ile
65 70 75 80
Gly His Arg Arg Met Phe Leu Met Gly Leu Ser Ile Phe Gly Ile Ala
85 90 95
Ser Leu Gly Ala Ala Phe Ala Pro Thr Ala Trp Ala Leu Val Ala Ala
100 105 110
Arg Ala Phe Leu Gly Ile Gly Ala Ala Thr Met Met Pro Ala Thr Leu
115 120 125
Ala Leu Ile Arg Ile Thr Phe Glu Asp Glu Arg Glu Arg Asn Thr Ala
130 135 140
Ile Gly Ile Trp Gly Ser Val Ala Ile Leu Gly Ala Ala Ala Gly Pro
145 150 155 160
Ile Ile Gly Gly Ala Leu Leu Glu Phe Phe Trp Trp Gly Ser Val Phe
165 170 175
Leu Ile Asn Val Pro Val Ala Val Ile Ala Leu Ile Ala Thr Leu Phe
180 185 190
Val Ala Pro Ala Asn Ile Ala Asn Pro Ser Lys His Trp Asp Phe Leu
195 200 205
Ser Ser Phe Tyr Ala Leu Leu Thr Leu Ala Gly Leu Ile Ile Thr Ile
210 215 220
Lys Glu Ser Val Asn Thr Ala Arg His Met Pro Leu Leu Leu Gly Ala
225 230 235 240
Val Ile Met Leu Ile Ile Gly Ala Val Leu Phe Ser Ser Arg Gln Lys
245 250 255
Lys Ile Glu Glu Pro Leu Leu Asp Leu Ser Leu Phe Arg Asn Arg Leu
260 265 270
Phe Leu Gly Gly Val Val Ala Ala Gly Met Ala Met Phe Thr Val Ser
275 280 285
Gly Leu Glu Met Thr Thr Ser Gln Arg Phe Gln Leu Ser Val Gly Phe
290 295 300
Thr Pro Leu Glu Ala Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Ala Leu Gly Ser
305 310 315 320
Phe Pro Met Ser Ile Ile Gly Gly Ala Asn Leu His Arg Trp Gly Phe
325 330 335
Lys Pro Leu Ile Ser Gly Gly Phe Ala Ala Thr Ala Val Gly Ile Ala
340 345 350
Leu Cys Ile Trp Gly Ala Thr His Thr Asp Gly Leu Pro Phe Phe Ile
355 360 365
Ala Gly Leu Phe Phe Met Gly Ala Gly Ala Gly Ser Val Met Ser Val
370 375 380
Ser Ser Thr Ala Ile Ile Gly Ser Ala Pro Val Arg Lys Ala Gly Met
385 390 395 400
Ala Ser Ser Ile Glu Glu Val Ser Tyr Glu Phe Gly Thr Leu Leu Ser
405 410 415
Val Ala Ile Leu Gly Ser Leu Phe Pro Phe Phe Tyr Ser Leu His Ala
420 425 430
Pro Ala Glu Val Ala Asp Asn Phe Ser Ala Gly Val His His Ala Ile
435 440 445
Asp Gly Asp Ala Ala Arg Ala Ser Leu Asp Thr Ala Tyr Ile Asn Val
450 455 460
Leu Ile Ile Ala Leu Val Cys Ala Val Ala Ala Ala Leu Ile Ser Ser
465 470 475 480
Tyr Leu Phe Arg Gly Asn Pro Lys Gly Ala Asn Asn Ala His
485 490
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> upp-UF引物序列
<400> 14
aggcgtatca cgaggccctt tcgtcttcaa aaacccgcga catcgtaatc 50
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> upp-UR引物序列
<400> 15
ggattatacc tcctttcttc aaggcg 26
<210> 16
<211> 790
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Upp-U
<400> 16
aggcgtatca cgaggccctt tcgtcttcaa aaacccgcga catcgtaatc ctcaccgtga 60
tacatccccg gcatttctgc cgtttcgcca cccaccagtg aacagcctga ttgcagacaa 120
ccttccgcaa tgccgctgat caccgctgaa gcggtatcaa catccagttt tccggttgcg 180
taatagtcga ggaaaaacag cggctctgca ccttgcacca ccaggtcatt aacgcacatg 240
gcgaccagat caataccaat ggtgtcgtga cgttttaagt ccattgccag acgcagcttg 300
gtacctacgc cgtcagtgcc agaaaccagc acgggttcac gatatttttg cggcaatgca 360
cacagcgcac cgaagccgcc cagaccgccc atcacttccg gacgacgcgt tttcttcact 420
acgcctttga ttcttccaac cagagcatta cccgcgtcaa tatcaacacc ggcatctttg 480
tagctaagag aggttttatc ggtcactgct tgggtcccca cgcgttactt gcggtagaaa 540
aataaaattc ggcgcaattc taacagggaa agcaaacgtt tgcgagactg ctttacacaa 600
cctttttgca cgtcttttcc ccaggcgcgc ggcgaaagaa gacttgtgcc agggtaaagg 660
ttagttttcg gatggaataa tcttctttca taaccatctg aatataaaat aactttatct 720
caaaccgtta tcattttgac taaagtcaac gaaaagaata ttgccgcctt gaagaaagga 780
ggtataatcc 790
<210> 17
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> upp-DF引物序列
<400> 17
tgccgccttg aagaaaggag gtataatccg aattcagtcg gctttttttt gagtaaagcg 60
<210> 18
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> upp-DR引物序列
<400> 18
ccgcattaaa gcttatcgat gataagctgt caaacatgac cgggagtaaa cccgccata 59
<210> 19
<211> 574
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Upp-500bp-D
<400> 19
tgccgccttg aagaaaggag gtataatccg aattcagtcg gctttttttt gagtaaagcg 60
cctataacac ataatacaga ggataatact atgacgcgcc gtgctatcgg ggtgagtgaa 120
agaccgccac ttttacagac aatcccgctt agtttgcaac atttgttcgc catgtttggt 180
gcaaccgtcc tggtgcccgt cttatttcat attaacccgg cgactgtact gttatttaac 240
ggtattggaa cgctgctgta tctcttcatc tgtaaaggga aaattccggc ttatcttggt 300
tccagctttg cctttatttc accggtattg ttactgttgc cgttagggta tgaagtcgcg 360
ctgggcggct ttattatgtg cggcgtgctg ttctgcctgg tttcttttat cgtgaagaaa 420
gcggggaccg gctggctgga cgtgctgttt ccacctgcgg caatgggcgc aatcgttgcc 480
gtcatcggtc tggagctggc gggcgtagct gccggtatgg cgggtttact cccggtcatg 540
tttgacagct tatcatcgat aagctttaat gcgg 574
<210> 20
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> upp-F引物序列
<400> 20
tggagccggg ccacctcgac ctgaatggaa gccggcgtcg attttttttg tggctgccc 59
<210> 21
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> upp-R引物序列
<400> 21
tggagtggtg aatccgttag cgaggtgccg ctttgttgta atccactttc g 51
<210> 22
<211> 1905
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Pupp-UPP-D
<400> 22
tggagccggg ccacctcgac ctgaatggaa gccggcgtcg attttttttg tggctgcccc 60
tcaaaggaga aagagtatga agatcgtgga agtcaaacac ccactcgtca aacacaagct 120
gggactgatg cgtgagcaag atatcagcac caagcgcttt cgcgaactcg cttccgaagt 180
gggtagcctg ctgacttacg aagcgaccgc cgacctcgaa acggaaaaag taactatcga 240
aggctggaac ggcccggtag aaatcgacca gatcaaaggt aagaaaatta ccgttgtgcc 300
aattctgcgt gcgggtcttg gtatgatgga cggtgtgctg gaaaacgttc cgagcgcgcg 360
catcagcgtt gtcggtatgt accgtaatga agaaacgctg gagccggtac cgtacttcca 420
gaaactggtt tctaacatcg atgagcgtat ggcgctgatc gttgacccaa tgctggcaac 480
cggtggttcc gttatcgcga ccatcgacct gctgaaaaaa gcgggctgca gcagcatcaa 540
agttctggtg ctggtagctg cgccagaagg tatcgctgcg ctggaaaaag cgcacccgga 600
cgtcgaactg tataccgcat cgattgatca gggactgaac gagcacggat acattattcc 660
gggcctcggc gatgccggtg acaaaatctt tggtacgaaa taaagaataa aaataattaa 720
agccgacttt aagagtcggc ttttttttga gtaaagcgcc tataacacat aatacagagg 780
ataatactat gacgcgccgt gctatcgggg tgagtgaaag accgccactt ttacagacaa 840
tcccgcttag tttgcaacat ttgttcgcca tgtttggtgc aaccgtcctg gtgcccgtct 900
tatttcatat taacccggcg actgtactgt tatttaacgg tattggaacg ctgctgtatc 960
tcttcatctg taaagggaaa attccggctt atcttggttc cagctttgcc tttatttcac 1020
cggtattgtt actgttgccg ttagggtatg aagtcgcgct gggcggcttt attatgtgcg 1080
gcgtgctgtt ctgcctggtt tcttttatcg tgaagaaagc ggggaccggc tggctggacg 1140
tgctgtttcc acctgcggca atgggcgcaa tcgttgccgt catcggtctg gagctggcgg 1200
gcgtagctgc cggtatggcg ggtttactcc cggctgaagg gcaaacgcca gactccaaaa 1260
ccatcatcat ctctattacc accctggcgg tcacggtttt aggttccgtg ctgtttcgtg 1320
gtttcctggc aattatcccg attttaattg gcgtgctggt ggggtacgcg ctctctttcg 1380
caatgggaat tgtcgatacc acgccgatta ttaatgctca ctggtttgcg ctgccaaccc 1440
tctatacgcc gcgcttcgag tggtttgcca ttctgactat tctgccagcg gcgttagtgg 1500
ttattgccga acacgtaggg cacctggtag taacggctaa tatcgtcaaa aaagatctgc 1560
tgcgcgatcc aggtctgcac cgttcgatgt ttgctaatgg cttgtcgacc gtgatttccg 1620
gcttctttgg ctctacgcca aatactactt acggagaaaa cattggcgtg atggcgatca 1680
cccgtgttta cagtacctgg gttatcggcg gggcggcgat tttcgctatc ctgctttcct 1740
gcgtcggtaa actggctgcc gctatccaga tgatcccatt gccggtgatg ggcggcgttt 1800
cgctgctgct ttatggtgtc atcggtgctt ccggtattcg tgttttgatc gaatcgaaag 1860
tggattacaa caaagcggca cctcgctaac ggattcacca ctcca 1905
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> P1P2-tetA-F引物序列
<400> 23
tcatgtttga cagcttatca tcgataagc 29
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> P1P2-tetA-R引物序列
<400> 24
gccggcttcc attcaggtcg 20
<210> 25
<211> 1285
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> P1P2-tetA
<400> 25
tcatgtttga cagcttatca tcgataagct ttaatgcggt agtttatcac agttaaattg 60
ctaacgcagt caggcaccgt gtatgaaatc taacaatgcg ctcatcgtca tcctcggcac 120
cgtcaccctg gatgctgtag gcataggctt ggttatgccg gtactgccgg gcctcttgcg 180
ggatatcgtc cattccgaca gcatcgccag tcactatggc gtgctgctag cgctatatgc 240
gttgatgcaa tttctatgcg cacccgttct cggagcactg tccgaccgct ttggccgccg 300
cccagtcctg ctcgcttcgc tacttggagc cactatcgac tacgcgatca tggcgaccac 360
acccgtcctg tggatcctct acgccggacg catcgtggcc ggcatcaccg gcgccacagg 420
tgcggttgct ggcgcctata tcgccgacat caccgatggg gaagatcggg ctcgccactt 480
cgggctcatg agcgcttgtt tcggcgtggg tatggtggca ggccccgtgg ccgggggact 540
gttgggcgcc atctccttgc atgcaccatt ccttgcggcg gcggtgctca acggcctcaa 600
cctactactg ggctgcttcc taatgcagga gtcgcataag ggagagcgtc gaccgatgcc 660
cttgagagcc ttcaacccag tcagctcctt ccggtgggcg cggggcatga ctatcgtcgc 720
cgcacttatg actgtcttct ttatcatgca actcgtagga caggtgccgg cagcgctctg 780
ggtcattttc ggcgaggacc gctttcgctg gagcgcgacg atgatcggcc tgtcgcttgc 840
ggtattcgga atcttgcacg ccctcgctca agccttcgtc actggtcccg ccaccaaacg 900
tttcggcgag aagcaggcca ttatcgccgg catggcggcc gacgcgctgg gctacgtctt 960
gctggcgttc gcgacgcgag gctggatggc cttccccatt atgattcttc tcgcttccgg 1020
cggcatcggg atgcccgcgt tgcaggccat gctgtccagg caggtagatg acgaccatca 1080
gggacagctt caaggatcgc tcgcggctct taccagccta acttcgatca ctggaccgct 1140
gatcgtcacg gcgatttatg ccgcctcggc gagcacatgg aacgggttgg catggattgt 1200
aggcgccgcc ctataccttg tctgcctccc cgcgttgcgt cgcggtgcat ggagccgggc 1260
cacctcgacc tgaatggaag ccggc 1285
<210> 26
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7-RNA-F引物序列
<400> 26
cgccttgaag aaaggaggta taatccgagc tcatgaacac gattaacatc gctaagaac 59
<210> 27
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7-RNA-R引物序列
<400> 27
ggcgctttac tcaaaaaaaa gccgactgaa ttctgcgcgc acgaaaagca tca 53
<210> 28
<211> 2780
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 28
cgccttgaag aaaggaggta taatccgagc tcatgaacac gattaacatc gctaagaacg 60
acttctctga catcgaactg gctgctatcc cgttcaacac tctggctgac cattacggtg 120
agcgtttagc tcgcgaacag ttggcccttg agcatgagtc ttacgagatg ggtgaagcac 180
gcttccgcaa gatgtttgag cgtcaactta aagctggtga ggttgcggat aacgctgccg 240
ccaagcctct catcactacc ctactcccta agatgattgc acgcatcaac gactggtttg 300
aggaagtgaa agctaagcgc ggcaagcgcc cgacagcctt ccagttcctg caagaaatca 360
agccggaagc cgtagcgtac atcaccatta agaccactct ggcttgccta accagtgctg 420
acaatacaac cgttcaggct gtagcaagcg caatcggtcg ggccattgag gacgaggctc 480
gcttcggtcg tatccgtgac cttgaagcta agcacttcaa gaaaaacgtt gaggaacaac 540
tcaacaagcg cgtagggcac gtctacaaga aagcatttat gcaagttgtc gaggctgaca 600
tgctctctaa gggtctactc ggtggcgagg cgtggtcttc gtggcataag gaagactcta 660
ttcatgtagg agtacgctgc atcgagatgc tcattgagtc aaccggaatg gttagcttac 720
accgccaaaa tgctggcgta gtaggtcaag actctgagac tatcgaactc gcacctgaat 780
acgctgaggc tatcgcaacc cgtgcaggtg cgctggctgg catctctccg atgttccaac 840
cttgcgtagt tcctcctaag ccgtggactg gcattactgg tggtggctat tgggctaacg 900
gtcgtcgtcc tctggcgctg gtgcgtactc acagtaagaa agcactgatg cgctacgaag 960
acgtttacat gcctgaggtg tacaaagcga ttaacattgc gcaaaacacc gcatggaaaa 1020
tcaacaagaa agtcctagcg gtcgccaacg taatcaccaa gtggaagcat tgtccggtcg 1080
aggacatccc tgcgattgag cgtgaagaac tcccgatgaa accggaagac atcgacatga 1140
atcctgaggc tctcaccgcg tggaaacgtg ctgccgctgc tgtgtaccgc aaggacaagg 1200
ctcgcaagtc tcgccgtatc agccttgagt tcatgcttga gcaagccaat aagtttgcta 1260
accataaggc catctggttc ccttacaaca tggactggcg cggtcgtgtt tacgctgtgt 1320
caatgttcaa cccgcaaggt aacgatatga ccaaaggact gcttacgctg gcgaaaggta 1380
aaccaatcgg taaggaaggt tactactggc tgaaaatcca cggtgcaaac tgtgcgggtg 1440
tcgataaggt tccgttccct gagcgcatca agttcattga ggaaaaccac gagaacatca 1500
tggcttgcgc taagtctcca ctggagaaca cttggtgggc tgagcaagat tctccgttct 1560
gcttccttgc gttctgcttt gagtacgctg gggtacagca ccacggcctg agctataact 1620
gctcccttcc gctggcgttt gacgggtctt gctctggcat ccagcacttc tccgcgatgc 1680
tccgagatga ggtaggtggt cgcgcggtta acttgcttcc tagtgaaacc gttcaggaca 1740
tctacgggat tgttgctaag aaagtcaacg agattctaca agcagacgca atcaatggga 1800
ccgataacga agtagttacc gtgaccgatg agaacactgg tgaaatctct gagaaagtca 1860
agctgggcac taaggcactg gctggtcaat ggctggctta cggtgttact cgcagtgtga 1920
ctaagcgttc agtcatgacg ctggcttacg ggtccaaaga gttcggcttc cgtcaacaag 1980
tgctggaaga taccattcag ccagctattg attccggcaa gggtctgatg ttcactcagc 2040
cgaatcaggc tgctggatac atggctaagc tgatttggga atctgtgagc gtgacggtgg 2100
tagctgcggt tgaagcaatg aactggctta agtctgctgc taagctgctg gctgctgagg 2160
tcaaagataa gaagactgga gagattcttc gcaagcgttg cgctgtgcat tgggtaactc 2220
ctgatggttt ccctgtgtgg caggaataca agaagcctat tcagacgcgc ttgaacctga 2280
tgttcctcgg tcagttccgc ttacagccta ccattaacac caacaaagat agcgagattg 2340
atgcacacaa acaggagtct ggtatcgctc ctaactttgt acacagccaa gacggtagcc 2400
accttcgtaa gactgtagtg tgggcacacg agaagtacgg aatcgaatct tttgcactga 2460
ttcacgactc cttcggtacc attccggctg acgctgcgaa cctgttcaaa gcagtgcgcg 2520
aaactatggt tgacacatat gagtcttgtg atgtactggc tgatttctac gaccagttcg 2580
ctgaccagtt gcacgagtct caattggaca aaatgccagc acttccggct aaaggtaact 2640
tgaacctccg tgacatctta gagtcggact tcgcgttcgc gtaacgccaa atcaatacga 2700
ctccggatcc ccttcgaagg aaagacctga tgcttttcgt gcgcgcagaa ttcagtcggc 2760
ttttttttga gtaaagcgcc 2780
<210> 29
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> cadA-F引物序列
<400> 29
cgccttgaag aaaggaggta taatccgagc tcatgaacgt tattgcaata ttgaatcaca 60
tg 62
<210> 30
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> cadA-R引物序列
<400> 30
ggcgctttac tcaaaaaaaa gccgactgaa ttcccacttc ccttgtacga gctaa 55
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> pET30a质粒
<400> 31
taatacgact cactataggg 20
<210> 32
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> cadA-NdeI-F引物序列
<400> 32
aagaaggaga tatacatatg atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg 50
<210> 33
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> cadA-HindIII-R引物序列
<400> 33
tcgagtgcgg ccgcaagctt ccacttccct tgtacgagct aa 42
<210> 34
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7-cadA-F引物序列
<400> 34
aaggaaagac ctgatgcttt tcgtgcgcgc agaattcgtc attaggaagc agcccagta 59
<210> 35
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7-cadA-R引物序列
<400> 35
tatcctctgt attatgtgtt ataggcgctt tactcaaaaa aaagccgact agacccgttt 60
agaggcccca 70
<210> 36
<211> 2767
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7-cadA
<400> 36
aaggaaagac ctgatgcttt tcgtgcgcgc agaattcgtc attaggaagc agcccagtag 60
taggttgagg ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc 120
caacagtccc ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag 180
cccgaagtgg cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac 240
cgcacctgtg gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatcga 300
tctcgatccc gcgaaattaa tacgactcac tataggggaa ttgtgagcgg ataacaattc 360
ccctctagaa ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacatatgat gaacgttatt 420
gcaatattga atcacatggg ggtttatttt aaagaagaac ccatccgtga acttcatcgc 480
gcgcttgaac gtctgaactt ccagattgtt tacccgaacg accgtgacga cttattaaaa 540
ctgatcgaaa acaatgcgcg tctgtgcggc gttatttttg actgggataa atataatctc 600
gagctgtgcg aagaaattag caaaatgaac gagaacctgc cgttgtacgc gttcgctaat 660
acgtattcca ctctcgatgt aagcctgaat gacctgcgtt tacagattag cttctttgaa 720
tatgcgctgg gtgctgctga agatattgct aataagatca agcagaccac tgacgaatat 780
atcaacacta ttctgcctcc gctgactaaa gcactgttta aatatgttcg tgaaggtaaa 840
tatactttct gtactcctgg tcacatgggc ggtactgcat tccagaaaag cccggtaggt 900
agcctgttct atgatttctt tggtccgaat accatgaaat ctgatatttc catttcagta 960
tctgaactgg gttctctgct ggatcacagt ggtccacaca aagaagcaga acagtatatc 1020
gctcgcgtct ttaacgcaga ccgcagctac atggtgacca acggtacttc cactgcgaac 1080
aaaattgttg gtatgtactc tgctccagca ggcagcacca ttctgattga ccgtaactgc 1140
cacaaatcgc tgacccacct gatgatgatg agcgatgtta cgccaatcta tttccgcccg 1200
acccgtaacg cttacggtat tcttggtggt atcccacaga gtgaattcca gcacgctacc 1260
attgctaagc gcgtgaaaga aacaccaaac gcaacctggc cggtacatgc tgtaattacc 1320
aactctacct atgatggtct gctgtacaac accgacttca tcaagaaaac actggatgtg 1380
aaatccatcc actttgactc cgcgtgggtg ccttacacca acttctcacc gatttacgaa 1440
ggtaaatgcg gtatgagcgg tggccgtgta gaagggaaag tgatttacga aacccagtcc 1500
actcacaaac tgctggcggc gttctctcag gcttccatga tccacgttaa aggtgacgta 1560
aacgaagaaa cctttaacga agcctacatg atgcacacca ccacttctcc gcactacggt 1620
atcgtggcgt ccactgaaac cgctgcggcg atgatgaaag gcaatgcagg taagcgtctg 1680
atcaacggtt ctattgaacg tgcgatcaaa ttccgtaaag agatcaaacg tctgagaacg 1740
gaatctgatg gctggttctt tgatgtatgg cagccggatc atatcgatac gactgaatgc 1800
tggccgctgc gttctgacag cacctggcac ggcttcaaaa acatcgataa cgagcacatg 1860
tatcttgacc cgatcaaagt caccctgctg actccgggga tggaaaaaga cggcaccatg 1920
agcgactttg gtattccggc cagcatcgtg gcgaaatacc tcgacgaaca tggcatcgtt 1980
gttgagaaaa ccggtccgta taacctgctg ttcctgttca gcatcggtat cgataagacc 2040
aaagcactga gcctgctgcg tgctctgact gactttaaac gtgcgttcga cctgaacctg 2100
cgtgtgaaaa acatgctgcc gtctctgtat cgtgaagatc ctgaattcta tgaaaacatg 2160
cgtattcagg aactggctca gaatatccac aaactgattg ttcaccacaa tctgccggat 2220
ctgatgtatc gcgcatttga agtgctgccg acgatggtaa tgactccgta tgctgcattc 2280
cagaaagagc tgcacggtat gaccgaagaa gtttacctcg acgaaatggt aggtcgtatt 2340
aacgccaata tgatccttcc gtacccgccg ggagttcctc tggtaatgcc gggtgaaatg 2400
atcaccgaag aaagccgtcc ggttctggag ttcctgcaga tgctgtgtga aatcggcgct 2460
cactatccgg gctttgaaac cgatattcac ggtgcatacc gtcaggctga tggccgctat 2520
accgttaagg tattgaaaga agaaagcaaa aaataattag ctcgtacaag ggaagtggaa 2580
gcttgcggcc gcactcgagc accaccacca ccaccactga gatccggctg ctaacaaagc 2640
ccgaaaggaa gctgagttgg ctgctgccac cgctgagcaa taactagcat aaccccttgg 2700
ggcctctaaa cgggtctagt cggctttttt ttgagtaaag cgcctataac acataataca 2760
gaggata 2767
<210> 37
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pcsiE-F引物序列
<400> 37
cgccttgaag aaaggaggta taatccgagc tctgcttttt ccgatcgtca cg 52
<210> 38
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pcsiE-R引物序列
<400> 38
gtcgttctta gcgatgttaa tcgtgttcat taaagtttgc tcaaggaaat ggc 53
<210> 39
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pbolA-F引物序列
<400> 39
cgccttgaag aaaggaggta taatccgagc tctgtttggt aaaaattccc g 51
<210> 40
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pbolA-R引物序列
<400> 40
gtcgttctta gcgatgttaa tcgtgttcat ctttaaatac tagccgcttt tac 53
<210> 41
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> posmY-F引物序列
<400> 41
cgccttgaag aaaggaggta taatccgagc tcctcgctta catcgctacc agc 53
<210> 42
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> posmY-R引物序列
<400> 42
gtcgttctta gcgatgttaa tcgtgttcat aaatatagat cacaattttg aa 52
<210> 43
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pkatE-F引物序列
<400> 43
cgccttgaag aaaggaggta taatccgagc tcgcagaaat gactctccca tc 52
<210> 44
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pkatE-R引物序列
<400> 44
gtcgttctta gcgatgttaa tcgtgttcat gcgggacgta caggggc 47
<210> 45
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pcsiE-R2引物序列
<400> 45
catgtgattc aatattgcaa taacgttcat taaagtttgc tcaaggaaat ggc 53
<210> 46
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pbolA-R2引物序列
<400> 46
catgtgattc aatattgcaa taacgttcat ctttaaatac tagccgcttt tac 53
<210> 47
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> posmY-R2引物序列
<400> 47
catgtgattc aatattgcaa taacgttcat aaatatagat cacaattttg aa 52
<210> 48
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pkatE-R2引物序列
<400> 48
catgtgattc aatattgcaa taacgttcat gcgggacgta caggggc 47
<210> 49
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> yebQ-F引物序列
<400> 49
cggataacaa tttcacacag gaggagctca tgccaaaagt tcaggccgac 50
<210> 50
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> yebQ-R引物序列
<400> 50
cgccttgaag aaaggaggta taatccgagc tctcctgatc gacgcgcttt tttta 55
<210> 51
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> mdtD-F引物序列
<400> 51
cggataacaa tttcacacag gaggagctca tgacagatct tcccgacagc 50
<210> 52
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> mdtd-R引物序列
<400> 52
cgccttgaag aaaggaggta taatccgagc tcaataccgg gtcgccagaa cttca 55
<210> 53
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> mcgl2893-F引物序列
<400> 53
cggataacaa tttcacacag gaggagctca tgaccagcga aaccttacag gc 52
<210> 54
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> mcgl2893-R引物序列
<400> 54
cgccttgaag aaaggaggta taatccgagc tcgcagaatc atctcttttt tacta 55
<210> 55
<211> 1374
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 55
atgccaaaag ttcaggccga cggcctgcca ttgccccagc gatacggtgc gatattaacc 60
attgtgattg gtatttcgat ggccgtcctt gacggcgcaa tcgccaacgt cgccctgcca 120
acaatcgcca cggaccttca tgccacgcca gccagttcca tctgggtagt gaacgcctat 180
caaatcgcca ttgtcatctc cctgctctcg ttttcgtttc tgggcgatat gtttggctat 240
cgacgtattt ataaatgcgg tctggtcgtt tttctgttgt cttcactgtt ctgcgccctt 300
tctgattcgc tgcaaatgct cacccttgcg cgtgtcatac aaggtttcgg cggtgcagcg 360
ttgatgagcg ttaataccgc acttatccgc ctgatctatc cacaacgttt tctgggtaga 420
gggatgggca taaactcgtt tattgttgcc gtctcttctg ctgccgggcc gacaattgct 480
gcagcaatcc tctccatcgc atcctggaaa tggttatttt taatcaacgt accgttaggt 540
attatcgccc tgcttctggc gatgcgtttt ctgccaccca atggttctcg cgccagtaaa 600
ccccgtttcg acctgcccag cgccgtgatg aacgcgttaa ccttcggcct gcttatcact 660
gcgttgagtg gtttcgctca ggggcaatcg ctgacgttaa ttgctgcgga actggtggta 720
atggttgttg ttggtatttt ctttattcgc cgccagcttt ctcttcccgt accgctgcta 780
ccggtggatt tactgcgtat cccgctgttt tcactttcta tttgcacatc tgtttgctct 840
ttctgcgcac aaatgctggc aatggtttcc ctgccctttt acctgcaaac cgtgctcggg 900
cgtagtgaag tcgaaacagg tttacttctg acaccgtggc cgttagcaac gatggtgatg 960
gctccgctgg caggctattt gattgaacgc gtacatgcag gattgctggg ggctttaggg 1020
ttgttcatca tggctgcggg gcttttttcc ctggttctgc tgcccgcgtc acctgcggat 1080
atcaatatta tctggccgat gatcttatgt ggtgctggat ttggcttatt ccagtcaccc 1140
aataaccaca ccattattac ctccgcgcct cgcgaacgta gcggtggagc cagtggcatg 1200
ttaggaacgg ctcgtctact gggtcagagt agcggcgcgg cgctggtggc gctgatgcta 1260
aatcagtttg gagataatgg tacacacgtc tcgctgatgg ctgcggctat tctggcagtg 1320
attgctgcct gtgtcagtgg tttacgtatc actcagccac gatccagggc ataa 1374
<210> 56
<211> 1416
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 56
atgacagatc ttcccgacag cacccgttgg caattgtgga ttgtggcttt cggcttcttt 60
atgcagtcgc tggacaccac catcgtaaac accgcccttc cctcaatggc gcaaagcctc 120
ggggaaagtc cgttgcatat gcacatggtc attgtctctt atgtgctgac cgtggcggtg 180
atgctgcccg ccagcggctg gctggcggac aaagtcggcg tgcgcaatat tttctttacc 240
gccatcgtgc tgtttactct cggttcactg ttttgcgcgc tttccggcac gctgaacgaa 300
ctgttgctgg cacgcgcgtt acagggcgtt ggcggcgcga tgatggtgcc ggtcggcaga 360
ttgacggtga tgaaaatcgt accgcgcgag caatatatgg cggcgatgac ctttgtcacg 420
ttacccggtc aggtcggtcc gctgctcggt ccggcgctcg gcggtctgct ggtggagtac 480
gcatcgtggc actggatctt tttgatcaac attccggtgg ggattatcgg tgcgatcgcc 540
acattgctgt taatgccgaa ctacaccatg cagacgcggc gctttgatct ctccggattt 600
ttattgctgg cggttggcat ggcggtatta accctggcgc tggacggcag taaaggtaca 660
ggtttatcgc cgctgacgat tgcaggcctg gtcgcagttg gcgtggtggc actggtgctt 720
tatctgctgc acgccagaaa taacaaccgt gccctgttca gtctgaaact gttccgtact 780
cgtacctttt cgctgggcct ggcggggagc tttgccggac gtattggcag tggcatgttg 840
ccctttatga caccggtttt cctgcaaatt ggcctcggtt tctcgccgtt tcatgccgga 900
ctgatgatga tcccgatggt gcttggcagc atgggaatga agcgaattgt ggtacaggtg 960
gtgaatcgct ttggttatcg tcgggtactg gtagcgacca cgctgggtct gtcgctggtc 1020
accctgttgt ttatgactac cgccctgctg ggctggtact acgttttgcc gttcgtcctg 1080
tttttacaag ggatggtcaa ctcgacgcgt ttctcctcca tgaacaccct gacgctgaaa 1140
gatctcccgg acaatctggc gagcagcggc aacagcctgc tgtcgatgat tatgcaattg 1200
tcgatgagta tcggcgtcac tatcgccggg ctgttgctgg gactttttgg ttcacagcat 1260
gtcagcgtcg acagcggcac cacacaaacc gtctttatgt acacctggct tagcatggcg 1320
ttgatcatcg cccttccggc gttcatcttt gccagagtgc cgaacgatac gcatcaaaat 1380
gtagctattt cgcggcgaaa aaggagcgcg caatga 1416
<210> 57
<211> 1485
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 密码子优化后的cgl2893的基因序列
<400> 57
atgaccagcg aaaccttaca ggcccaagct ccaactaaga cccagcggtg ggccttcttg 60
gccgttatat ctggcgggtt attccttatt ggtgtggaca atagcatcct gtatacggcg 120
ttgccattgc tgcgcgaaca actggcggcg accgaaacgc aggccctgtg gattatcaat 180
gcctatccac tgttgatggc tggcctgctg cttggcacgg gtactcttgg tgacaaaatt 240
ggccatcgtc gtatgttctt gatggggctg tctatctttg gcattgcgtc gttgggtgcg 300
gctttcgctc cgaccgcctg ggcgctggta gctgcacgcg cctttcttgg aataggtgca 360
gcgacaatga tgcccgccac actggcgtta atccgcatca cgtttgagga tgaacgtgaa 420
cgtaacaccg cgatcggcat ctggggaagc gtcgctatac tgggagcggc tgcgggtcca 480
ataatcgggg gtgctctgct ggagtttttt tggtggggta gcgtgtttct gatcaatgtg 540
cctgtggccg tgattgcgct tatcgcgacg ttatttgtgg ctccggcaaa tatcgccaac 600
ccgagcaaac attgggactt tttgagcagc ttctatgcgt tactgacctt agcgggcctg 660
atcatcacga ttaaggagag cgtgaatacc gcccgtcata tgccactgct gttaggggcg 720
gtcattatgt tgattatcgg tgccgtgctg tttagcagtc gtcagaagaa aattgaggaa 780
ccgcttctgg atctgagctt atttcgtaat cgtttgttcc ttgggggggt ggtggcagct 840
ggcatggcta tgtttaccgt gagcggcctg gaaatgacca ccagtcagcg ttttcaactg 900
agcgtggggt ttacccccct ggaggcgggc ttgctgatga ttcctgcggc actggggtct 960
ttccctatga gcataattgg aggtgcaaat ctgcatcggt ggggctttaa gccactgatt 1020
agcggaggct tcgccgcgac ggcggttgga attgctttat gcatttgggg tgcgacccat 1080
accgatggtc tgccgttctt tatagctggc ttgttcttca tgggcgcagg tgctggttct 1140
gtgatgagcg tatcaagcac tgccatcatc ggcagcgcac ccgttcgtaa agctgggatg 1200
gcttcgagca ttgaagaagt tagctatgaa tttggaaccc tgttgtcggt tgctatcttg 1260
ggaagtctgt ttccgttttt ctactcactg catgcccctg cagaagtggc tgataacttt 1320
tctgccgggg tgcatcatgc gattgacggg gatgcagctc gtgcaagcct tgacacagcg 1380
tacataaatg tactgataat tgctctggtg tgcgccgttg cagcggctct gatatcgagc 1440
tatctgttcc gtggcaatcc gaagggcgcg aataacgcgc attag 1485
<210> 58
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> plac-R引物序列
<400> 58
gagctcctcc tgtgtgaaat tgttatc 27
<210> 59
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> plac-F引物序列
<400> 59
ttttgacccc taaaggcggg agtggagctc ggataaccgt attaccgcct ttgag 55
<210> 60
<211> 308
<212> DNA
<213> pUC18质粒
<400> 60
ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga 60
gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc 120
cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg 180
cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca 240
ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg 300
aggagctc 308
<210> 61
<211> 2887
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 连接有pcsiE启动子的T7R序列
<400> 61
tgctttttcc gatcgtcacg gcgatgttta tcgcgaacag atggtggact ttatccttag 60
cgcgttgaat ccgcagaact aacccatgat cgctagcacg ataatcattc acaaaaccac 120
cttaagacat gctaatccac tggtcagaac agtttaagat gagaaaaatt ctgtgacgct 180
tgccaacatt tctgatgatt agcattccct tcgccatttc cttgagcaaa ctttaatgaa 240
cacgattaac atcgctaaga acgacttctc tgacatcgaa ctggctgcta tcccgttcaa 300
cactctggct gaccattacg gtgagcgttt agctcgcgaa cagttggccc ttgagcatga 360
gtcttacgag atgggtgaag cacgcttccg caagatgttt gagcgtcaac ttaaagctgg 420
tgaggttgcg gataacgctg ccgccaagcc tctcatcact accctactcc ctaagatgat 480
tgcacgcatc aacgactggt ttgaggaagt gaaagctaag cgcggcaagc gcccgacagc 540
cttccagttc ctgcaagaaa tcaagccgga agccgtagcg tacatcacca ttaagaccac 600
tctggcttgc ctaaccagtg ctgacaatac aaccgttcag gctgtagcaa gcgcaatcgg 660
tcgggccatt gaggacgagg ctcgcttcgg tcgtatccgt gaccttgaag ctaagcactt 720
caagaaaaac gttgaggaac aactcaacaa gcgcgtaggg cacgtctaca agaaagcatt 780
tatgcaagtt gtcgaggctg acatgctctc taagggtcta ctcggtggcg aggcgtggtc 840
ttcgtggcat aaggaagact ctattcatgt aggagtacgc tgcatcgaga tgctcattga 900
gtcaaccgga atggttagct tacaccgcca aaatgctggc gtagtaggtc aagactctga 960
gactatcgaa ctcgcacctg aatacgctga ggctatcgca acccgtgcag gtgcgctggc 1020
tggcatctct ccgatgttcc aaccttgcgt agttcctcct aagccgtgga ctggcattac 1080
tggtggtggc tattgggcta acggtcgtcg tcctctggcg ctggtgcgta ctcacagtaa 1140
gaaagcactg atgcgctacg aagacgttta catgcctgag gtgtacaaag cgattaacat 1200
tgcgcaaaac accgcatgga aaatcaacaa gaaagtccta gcggtcgcca acgtaatcac 1260
caagtggaag cattgtccgg tcgaggacat ccctgcgatt gagcgtgaag aactcccgat 1320
gaaaccggaa gacatcgaca tgaatcctga ggctctcacc gcgtggaaac gtgctgccgc 1380
tgctgtgtac cgcaaggaca aggctcgcaa gtctcgccgt atcagccttg agttcatgct 1440
tgagcaagcc aataagtttg ctaaccataa ggccatctgg ttcccttaca acatggactg 1500
gcgcggtcgt gtttacgctg tgtcaatgtt caacccgcaa ggtaacgata tgaccaaagg 1560
actgcttacg ctggcgaaag gtaaaccaat cggtaaggaa ggttactact ggctgaaaat 1620
ccacggtgca aactgtgcgg gtgtcgataa ggttccgttc cctgagcgca tcaagttcat 1680
tgaggaaaac cacgagaaca tcatggcttg cgctaagtct ccactggaga acacttggtg 1740
ggctgagcaa gattctccgt tctgcttcct tgcgttctgc tttgagtacg ctggggtaca 1800
gcaccacggc ctgagctata actgctccct tccgctggcg tttgacgggt cttgctctgg 1860
catccagcac ttctccgcga tgctccgaga tgaggtaggt ggtcgcgcgg ttaacttgct 1920
tcctagtgaa accgttcagg acatctacgg gattgttgct aagaaagtca acgagattct 1980
acaagcagac gcaatcaatg ggaccgataa cgaagtagtt accgtgaccg atgagaacac 2040
tggtgaaatc tctgagaaag tcaagctggg cactaaggca ctggctggtc aatggctggc 2100
ttacggtgtt actcgcagtg tgactaagcg ttcagtcatg acgctggctt acgggtccaa 2160
agagttcggc ttccgtcaac aagtgctgga agataccatt cagccagcta ttgattccgg 2220
caagggtctg atgttcactc agccgaatca ggctgctgga tacatggcta agctgatttg 2280
ggaatctgtg agcgtgacgg tggtagctgc ggttgaagca atgaactggc ttaagtctgc 2340
tgctaagctg ctggctgctg aggtcaaaga taagaagact ggagagattc ttcgcaagcg 2400
ttgcgctgtg cattgggtaa ctcctgatgg tttccctgtg tggcaggaat acaagaagcc 2460
tattcagacg cgcttgaacc tgatgttcct cggtcagttc cgcttacagc ctaccattaa 2520
caccaacaaa gatagcgaga ttgatgcaca caaacaggag tctggtatcg ctcctaactt 2580
tgtacacagc caagacggta gccaccttcg taagactgta gtgtgggcac acgagaagta 2640
cggaatcgaa tcttttgcac tgattcacga ctccttcggt accattccgg ctgacgctgc 2700
gaacctgttc aaagcagtgc gcgaaactat ggttgacaca tatgagtctt gtgatgtact 2760
ggctgatttc tacgaccagt tcgctgacca gttgcacgag tctcaattgg acaaaatgcc 2820
agcacttccg gctaaaggta acttgaacct ccgtgacatc ttagagtcgg acttcgcgtt 2880
cgcgtaa 2887
<210> 62
<211> 2890
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 连接有pbolA启动子的T7R序列
<400> 62
tgtttggtaa aaattcccgc catcataaca ttgccaacgg cgaggggaag tgggtaaggc 60
atgtaaattc atcatgttga cgaaataatc gcccctggta aaagaaacac tgatgcgagg 120
cctgtgtttc aatctttaaa tcagtaaact tcatacgctt gacggaaaaa ccaggacgaa 180
acctaaatat ttgttgttaa gctgcaatgg aaacggtaaa agcggctagt atttaaagat 240
gaacacgatt aacatcgcta agaacgactt ctctgacatc gaactggctg ctatcccgtt 300
caacactctg gctgaccatt acggtgagcg tttagctcgc gaacagttgg cccttgagca 360
tgagtcttac gagatgggtg aagcacgctt ccgcaagatg tttgagcgtc aacttaaagc 420
tggtgaggtt gcggataacg ctgccgccaa gcctctcatc actaccctac tccctaagat 480
gattgcacgc atcaacgact ggtttgagga agtgaaagct aagcgcggca agcgcccgac 540
agccttccag ttcctgcaag aaatcaagcc ggaagccgta gcgtacatca ccattaagac 600
cactctggct tgcctaacca gtgctgacaa tacaaccgtt caggctgtag caagcgcaat 660
cggtcgggcc attgaggacg aggctcgctt cggtcgtatc cgtgaccttg aagctaagca 720
cttcaagaaa aacgttgagg aacaactcaa caagcgcgta gggcacgtct acaagaaagc 780
atttatgcaa gttgtcgagg ctgacatgct ctctaagggt ctactcggtg gcgaggcgtg 840
gtcttcgtgg cataaggaag actctattca tgtaggagta cgctgcatcg agatgctcat 900
tgagtcaacc ggaatggtta gcttacaccg ccaaaatgct ggcgtagtag gtcaagactc 960
tgagactatc gaactcgcac ctgaatacgc tgaggctatc gcaacccgtg caggtgcgct 1020
ggctggcatc tctccgatgt tccaaccttg cgtagttcct cctaagccgt ggactggcat 1080
tactggtggt ggctattggg ctaacggtcg tcgtcctctg gcgctggtgc gtactcacag 1140
taagaaagca ctgatgcgct acgaagacgt ttacatgcct gaggtgtaca aagcgattaa 1200
cattgcgcaa aacaccgcat ggaaaatcaa caagaaagtc ctagcggtcg ccaacgtaat 1260
caccaagtgg aagcattgtc cggtcgagga catccctgcg attgagcgtg aagaactccc 1320
gatgaaaccg gaagacatcg acatgaatcc tgaggctctc accgcgtgga aacgtgctgc 1380
cgctgctgtg taccgcaagg acaaggctcg caagtctcgc cgtatcagcc ttgagttcat 1440
gcttgagcaa gccaataagt ttgctaacca taaggccatc tggttccctt acaacatgga 1500
ctggcgcggt cgtgtttacg ctgtgtcaat gttcaacccg caaggtaacg atatgaccaa 1560
aggactgctt acgctggcga aaggtaaacc aatcggtaag gaaggttact actggctgaa 1620
aatccacggt gcaaactgtg cgggtgtcga taaggttccg ttccctgagc gcatcaagtt 1680
cattgaggaa aaccacgaga acatcatggc ttgcgctaag tctccactgg agaacacttg 1740
gtgggctgag caagattctc cgttctgctt ccttgcgttc tgctttgagt acgctggggt 1800
acagcaccac ggcctgagct ataactgctc ccttccgctg gcgtttgacg ggtcttgctc 1860
tggcatccag cacttctccg cgatgctccg agatgaggta ggtggtcgcg cggttaactt 1920
gcttcctagt gaaaccgttc aggacatcta cgggattgtt gctaagaaag tcaacgagat 1980
tctacaagca gacgcaatca atgggaccga taacgaagta gttaccgtga ccgatgagaa 2040
cactggtgaa atctctgaga aagtcaagct gggcactaag gcactggctg gtcaatggct 2100
ggcttacggt gttactcgca gtgtgactaa gcgttcagtc atgacgctgg cttacgggtc 2160
caaagagttc ggcttccgtc aacaagtgct ggaagatacc attcagccag ctattgattc 2220
cggcaagggt ctgatgttca ctcagccgaa tcaggctgct ggatacatgg ctaagctgat 2280
ttgggaatct gtgagcgtga cggtggtagc tgcggttgaa gcaatgaact ggcttaagtc 2340
tgctgctaag ctgctggctg ctgaggtcaa agataagaag actggagaga ttcttcgcaa 2400
gcgttgcgct gtgcattggg taactcctga tggtttccct gtgtggcagg aatacaagaa 2460
gcctattcag acgcgcttga acctgatgtt cctcggtcag ttccgcttac agcctaccat 2520
taacaccaac aaagatagcg agattgatgc acacaaacag gagtctggta tcgctcctaa 2580
ctttgtacac agccaagacg gtagccacct tcgtaagact gtagtgtggg cacacgagaa 2640
gtacggaatc gaatcttttg cactgattca cgactccttc ggtaccattc cggctgacgc 2700
tgcgaacctg ttcaaagcag tgcgcgaaac tatggttgac acatatgagt cttgtgatgt 2760
actggctgat ttctacgacc agttcgctga ccagttgcac gagtctcaat tggacaaaat 2820
gccagcactt ccggctaaag gtaacttgaa cctccgtgac atcttagagt cggacttcgc 2880
gttcgcgtaa 2890
<210> 63
<211> 2885
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 连接有posmY启动子的T7R序列
<400> 63
ctcgcttaca tcgctaccag catggtcaac ctgcgcctgg cacaggaacg ttatccggac 60
gttcagttcc accagacccg cgagcattaa ttcttgcctc cagggcgcgg tagccgctgc 120
gccctgtcaa tttcccttcc ttattagccg cttacggaat gttcttaaaa cattcacttt 180
tgcttatgtt ttcgctgata tcccgagcgg tttcaaaatt gtgatctata tttatgaaca 240
cgattaacat cgctaagaac gacttctctg acatcgaact ggctgctatc ccgttcaaca 300
ctctggctga ccattacggt gagcgtttag ctcgcgaaca gttggccctt gagcatgagt 360
cttacgagat gggtgaagca cgcttccgca agatgtttga gcgtcaactt aaagctggtg 420
aggttgcgga taacgctgcc gccaagcctc tcatcactac cctactccct aagatgattg 480
cacgcatcaa cgactggttt gaggaagtga aagctaagcg cggcaagcgc ccgacagcct 540
tccagttcct gcaagaaatc aagccggaag ccgtagcgta catcaccatt aagaccactc 600
tggcttgcct aaccagtgct gacaatacaa ccgttcaggc tgtagcaagc gcaatcggtc 660
gggccattga ggacgaggct cgcttcggtc gtatccgtga ccttgaagct aagcacttca 720
agaaaaacgt tgaggaacaa ctcaacaagc gcgtagggca cgtctacaag aaagcattta 780
tgcaagttgt cgaggctgac atgctctcta agggtctact cggtggcgag gcgtggtctt 840
cgtggcataa ggaagactct attcatgtag gagtacgctg catcgagatg ctcattgagt 900
caaccggaat ggttagctta caccgccaaa atgctggcgt agtaggtcaa gactctgaga 960
ctatcgaact cgcacctgaa tacgctgagg ctatcgcaac ccgtgcaggt gcgctggctg 1020
gcatctctcc gatgttccaa ccttgcgtag ttcctcctaa gccgtggact ggcattactg 1080
gtggtggcta ttgggctaac ggtcgtcgtc ctctggcgct ggtgcgtact cacagtaaga 1140
aagcactgat gcgctacgaa gacgtttaca tgcctgaggt gtacaaagcg attaacattg 1200
cgcaaaacac cgcatggaaa atcaacaaga aagtcctagc ggtcgccaac gtaatcacca 1260
agtggaagca ttgtccggtc gaggacatcc ctgcgattga gcgtgaagaa ctcccgatga 1320
aaccggaaga catcgacatg aatcctgagg ctctcaccgc gtggaaacgt gctgccgctg 1380
ctgtgtaccg caaggacaag gctcgcaagt ctcgccgtat cagccttgag ttcatgcttg 1440
agcaagccaa taagtttgct aaccataagg ccatctggtt cccttacaac atggactggc 1500
gcggtcgtgt ttacgctgtg tcaatgttca acccgcaagg taacgatatg accaaaggac 1560
tgcttacgct ggcgaaaggt aaaccaatcg gtaaggaagg ttactactgg ctgaaaatcc 1620
acggtgcaaa ctgtgcgggt gtcgataagg ttccgttccc tgagcgcatc aagttcattg 1680
aggaaaacca cgagaacatc atggcttgcg ctaagtctcc actggagaac acttggtggg 1740
ctgagcaaga ttctccgttc tgcttccttg cgttctgctt tgagtacgct ggggtacagc 1800
accacggcct gagctataac tgctcccttc cgctggcgtt tgacgggtct tgctctggca 1860
tccagcactt ctccgcgatg ctccgagatg aggtaggtgg tcgcgcggtt aacttgcttc 1920
ctagtgaaac cgttcaggac atctacggga ttgttgctaa gaaagtcaac gagattctac 1980
aagcagacgc aatcaatggg accgataacg aagtagttac cgtgaccgat gagaacactg 2040
gtgaaatctc tgagaaagtc aagctgggca ctaaggcact ggctggtcaa tggctggctt 2100
acggtgttac tcgcagtgtg actaagcgtt cagtcatgac gctggcttac gggtccaaag 2160
agttcggctt ccgtcaacaa gtgctggaag ataccattca gccagctatt gattccggca 2220
agggtctgat gttcactcag ccgaatcagg ctgctggata catggctaag ctgatttggg 2280
aatctgtgag cgtgacggtg gtagctgcgg ttgaagcaat gaactggctt aagtctgctg 2340
ctaagctgct ggctgctgag gtcaaagata agaagactgg agagattctt cgcaagcgtt 2400
gcgctgtgca ttgggtaact cctgatggtt tccctgtgtg gcaggaatac aagaagccta 2460
ttcagacgcg cttgaacctg atgttcctcg gtcagttccg cttacagcct accattaaca 2520
ccaacaaaga tagcgagatt gatgcacaca aacaggagtc tggtatcgct cctaactttg 2580
tacacagcca agacggtagc caccttcgta agactgtagt gtgggcacac gagaagtacg 2640
gaatcgaatc ttttgcactg attcacgact ccttcggtac cattccggct gacgctgcga 2700
acctgttcaa agcagtgcgc gaaactatgg ttgacacata tgagtcttgt gatgtactgg 2760
ctgatttcta cgaccagttc gctgaccagt tgcacgagtc tcaattggac aaaatgccag 2820
cacttccggc taaaggtaac ttgaacctcc gtgacatctt agagtcggac ttcgcgttcg 2880
cgtaa 2885
<210> 64
<211> 2889
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 连接有pkatE启动子的T7R序列
<400> 64
gcagaaatga ctctcccatc agtacaaacg caacatattt gccacgcagc atccagacat 60
cacgaaacga atccatcttt atcgcatgtt ctggcggcgc gggttccgtg cgtgggacat 120
agctaataat ctggcggttt tgctggcgga gcggtttctt cattactggc ttcactaaac 180
gcatattaaa aatcagaaaa actgtagttt agccgattta gcccctgtac gtcccgcatg 240
aacacgatta acatcgctaa gaacgacttc tctgacatcg aactggctgc tatcccgttc 300
aacactctgg ctgaccatta cggtgagcgt ttagctcgcg aacagttggc ccttgagcat 360
gagtcttacg agatgggtga agcacgcttc cgcaagatgt ttgagcgtca acttaaagct 420
ggtgaggttg cggataacgc tgccgccaag cctctcatca ctaccctact ccctaagatg 480
attgcacgca tcaacgactg gtttgaggaa gtgaaagcta agcgcggcaa gcgcccgaca 540
gccttccagt tcctgcaaga aatcaagccg gaagccgtag cgtacatcac cattaagacc 600
actctggctt gcctaaccag tgctgacaat acaaccgttc aggctgtagc aagcgcaatc 660
ggtcgggcca ttgaggacga ggctcgcttc ggtcgtatcc gtgaccttga agctaagcac 720
ttcaagaaaa acgttgagga acaactcaac aagcgcgtag ggcacgtcta caagaaagca 780
tttatgcaag ttgtcgaggc tgacatgctc tctaagggtc tactcggtgg cgaggcgtgg 840
tcttcgtggc ataaggaaga ctctattcat gtaggagtac gctgcatcga gatgctcatt 900
gagtcaaccg gaatggttag cttacaccgc caaaatgctg gcgtagtagg tcaagactct 960
gagactatcg aactcgcacc tgaatacgct gaggctatcg caacccgtgc aggtgcgctg 1020
gctggcatct ctccgatgtt ccaaccttgc gtagttcctc ctaagccgtg gactggcatt 1080
actggtggtg gctattgggc taacggtcgt cgtcctctgg cgctggtgcg tactcacagt 1140
aagaaagcac tgatgcgcta cgaagacgtt tacatgcctg aggtgtacaa agcgattaac 1200
attgcgcaaa acaccgcatg gaaaatcaac aagaaagtcc tagcggtcgc caacgtaatc 1260
accaagtgga agcattgtcc ggtcgaggac atccctgcga ttgagcgtga agaactcccg 1320
atgaaaccgg aagacatcga catgaatcct gaggctctca ccgcgtggaa acgtgctgcc 1380
gctgctgtgt accgcaagga caaggctcgc aagtctcgcc gtatcagcct tgagttcatg 1440
cttgagcaag ccaataagtt tgctaaccat aaggccatct ggttccctta caacatggac 1500
tggcgcggtc gtgtttacgc tgtgtcaatg ttcaacccgc aaggtaacga tatgaccaaa 1560
ggactgctta cgctggcgaa aggtaaacca atcggtaagg aaggttacta ctggctgaaa 1620
atccacggtg caaactgtgc gggtgtcgat aaggttccgt tccctgagcg catcaagttc 1680
attgaggaaa accacgagaa catcatggct tgcgctaagt ctccactgga gaacacttgg 1740
tgggctgagc aagattctcc gttctgcttc cttgcgttct gctttgagta cgctggggta 1800
cagcaccacg gcctgagcta taactgctcc cttccgctgg cgtttgacgg gtcttgctct 1860
ggcatccagc acttctccgc gatgctccga gatgaggtag gtggtcgcgc ggttaacttg 1920
cttcctagtg aaaccgttca ggacatctac gggattgttg ctaagaaagt caacgagatt 1980
ctacaagcag acgcaatcaa tgggaccgat aacgaagtag ttaccgtgac cgatgagaac 2040
actggtgaaa tctctgagaa agtcaagctg ggcactaagg cactggctgg tcaatggctg 2100
gcttacggtg ttactcgcag tgtgactaag cgttcagtca tgacgctggc ttacgggtcc 2160
aaagagttcg gcttccgtca acaagtgctg gaagatacca ttcagccagc tattgattcc 2220
ggcaagggtc tgatgttcac tcagccgaat caggctgctg gatacatggc taagctgatt 2280
tgggaatctg tgagcgtgac ggtggtagct gcggttgaag caatgaactg gcttaagtct 2340
gctgctaagc tgctggctgc tgaggtcaaa gataagaaga ctggagagat tcttcgcaag 2400
cgttgcgctg tgcattgggt aactcctgat ggtttccctg tgtggcagga atacaagaag 2460
cctattcaga cgcgcttgaa cctgatgttc ctcggtcagt tccgcttaca gcctaccatt 2520
aacaccaaca aagatagcga gattgatgca cacaaacagg agtctggtat cgctcctaac 2580
tttgtacaca gccaagacgg tagccacctt cgtaagactg tagtgtgggc acacgagaag 2640
tacggaatcg aatcttttgc actgattcac gactccttcg gtaccattcc ggctgacgct 2700
gcgaacctgt tcaaagcagt gcgcgaaact atggttgaca catatgagtc ttgtgatgta 2760
ctggctgatt tctacgacca gttcgctgac cagttgcacg agtctcaatt ggacaaaatg 2820
ccagcacttc cggctaaagg taacttgaac ctccgtgaca tcttagagtc ggacttcgcg 2880
ttcgcgtaa 2889
<210> 65
<211> 2694
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 连接有P21启动子的T7R序列
<400> 65
cactcccgcc tttaggggtc aaaattgttc tatactgtat tgatgaacac gattaacatc 60
gctaagaacg acttctctga catcgaactg gctgctatcc cgttcaacac tctggctgac 120
cattacggtg agcgtttagc tcgcgaacag ttggcccttg agcatgagtc ttacgagatg 180
ggtgaagcac gcttccgcaa gatgtttgag cgtcaactta aagctggtga ggttgcggat 240
aacgctgccg ccaagcctct catcactacc ctactcccta agatgattgc acgcatcaac 300
gactggtttg aggaagtgaa agctaagcgc ggcaagcgcc cgacagcctt ccagttcctg 360
caagaaatca agccggaagc cgtagcgtac atcaccatta agaccactct ggcttgccta 420
accagtgctg acaatacaac cgttcaggct gtagcaagcg caatcggtcg ggccattgag 480
gacgaggctc gcttcggtcg tatccgtgac cttgaagcta agcacttcaa gaaaaacgtt 540
gaggaacaac tcaacaagcg cgtagggcac gtctacaaga aagcatttat gcaagttgtc 600
gaggctgaca tgctctctaa gggtctactc ggtggcgagg cgtggtcttc gtggcataag 660
gaagactcta ttcatgtagg agtacgctgc atcgagatgc tcattgagtc aaccggaatg 720
gttagcttac accgccaaaa tgctggcgta gtaggtcaag actctgagac tatcgaactc 780
gcacctgaat acgctgaggc tatcgcaacc cgtgcaggtg cgctggctgg catctctccg 840
atgttccaac cttgcgtagt tcctcctaag ccgtggactg gcattactgg tggtggctat 900
tgggctaacg gtcgtcgtcc tctggcgctg gtgcgtactc acagtaagaa agcactgatg 960
cgctacgaag acgtttacat gcctgaggtg tacaaagcga ttaacattgc gcaaaacacc 1020
gcatggaaaa tcaacaagaa agtcctagcg gtcgccaacg taatcaccaa gtggaagcat 1080
tgtccggtcg aggacatccc tgcgattgag cgtgaagaac tcccgatgaa accggaagac 1140
atcgacatga atcctgaggc tctcaccgcg tggaaacgtg ctgccgctgc tgtgtaccgc 1200
aaggacaagg ctcgcaagtc tcgccgtatc agccttgagt tcatgcttga gcaagccaat 1260
aagtttgcta accataaggc catctggttc ccttacaaca tggactggcg cggtcgtgtt 1320
tacgctgtgt caatgttcaa cccgcaaggt aacgatatga ccaaaggact gcttacgctg 1380
gcgaaaggta aaccaatcgg taaggaaggt tactactggc tgaaaatcca cggtgcaaac 1440
tgtgcgggtg tcgataaggt tccgttccct gagcgcatca agttcattga ggaaaaccac 1500
gagaacatca tggcttgcgc taagtctcca ctggagaaca cttggtgggc tgagcaagat 1560
tctccgttct gcttccttgc gttctgcttt gagtacgctg gggtacagca ccacggcctg 1620
agctataact gctcccttcc gctggcgttt gacgggtctt gctctggcat ccagcacttc 1680
tccgcgatgc tccgagatga ggtaggtggt cgcgcggtta acttgcttcc tagtgaaacc 1740
gttcaggaca tctacgggat tgttgctaag aaagtcaacg agattctaca agcagacgca 1800
atcaatggga ccgataacga agtagttacc gtgaccgatg agaacactgg tgaaatctct 1860
gagaaagtca agctgggcac taaggcactg gctggtcaat ggctggctta cggtgttact 1920
cgcagtgtga ctaagcgttc agtcatgacg ctggcttacg ggtccaaaga gttcggcttc 1980
cgtcaacaag tgctggaaga taccattcag ccagctattg attccggcaa gggtctgatg 2040
ttcactcagc cgaatcaggc tgctggatac atggctaagc tgatttggga atctgtgagc 2100
gtgacggtgg tagctgcggt tgaagcaatg aactggctta agtctgctgc taagctgctg 2160
gctgctgagg tcaaagataa gaagactgga gagattcttc gcaagcgttg cgctgtgcat 2220
tgggtaactc ctgatggttt ccctgtgtgg caggaataca agaagcctat tcagacgcgc 2280
ttgaacctga tgttcctcgg tcagttccgc ttacagccta ccattaacac caacaaagat 2340
agcgagattg atgcacacaa acaggagtct ggtatcgctc ctaactttgt acacagccaa 2400
gacggtagcc accttcgtaa gactgtagtg tgggcacacg agaagtacgg aatcgaatct 2460
tttgcactga ttcacgactc cttcggtacc attccggctg acgctgcgaa cctgttcaaa 2520
gcagtgcgcg aaactatggt tgacacatat gagtcttgtg atgtactggc tgatttctac 2580
gaccagttcg ctgaccagtt gcacgagtct caattggaca aaatgccagc acttccggct 2640
aaaggtaact tgaacctccg tgacatctta gagtcggact tcgcgttcgc gtaa 2694
<210> 66
<211> 2689
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 连接有P22启动子的T7R序列
<400> 66
tcccgccaaa ttcccaattt tgttctatac tgtattgatg aacacgatta acatcgctaa 60
gaacgacttc tctgacatcg aactggctgc tatcccgttc aacactctgg ctgaccatta 120
cggtgagcgt ttagctcgcg aacagttggc ccttgagcat gagtcttacg agatgggtga 180
agcacgcttc cgcaagatgt ttgagcgtca acttaaagct ggtgaggttg cggataacgc 240
tgccgccaag cctctcatca ctaccctact ccctaagatg attgcacgca tcaacgactg 300
gtttgaggaa gtgaaagcta agcgcggcaa gcgcccgaca gccttccagt tcctgcaaga 360
aatcaagccg gaagccgtag cgtacatcac cattaagacc actctggctt gcctaaccag 420
tgctgacaat acaaccgttc aggctgtagc aagcgcaatc ggtcgggcca ttgaggacga 480
ggctcgcttc ggtcgtatcc gtgaccttga agctaagcac ttcaagaaaa acgttgagga 540
acaactcaac aagcgcgtag ggcacgtcta caagaaagca tttatgcaag ttgtcgaggc 600
tgacatgctc tctaagggtc tactcggtgg cgaggcgtgg tcttcgtggc ataaggaaga 660
ctctattcat gtaggagtac gctgcatcga gatgctcatt gagtcaaccg gaatggttag 720
cttacaccgc caaaatgctg gcgtagtagg tcaagactct gagactatcg aactcgcacc 780
tgaatacgct gaggctatcg caacccgtgc aggtgcgctg gctggcatct ctccgatgtt 840
ccaaccttgc gtagttcctc ctaagccgtg gactggcatt actggtggtg gctattgggc 900
taacggtcgt cgtcctctgg cgctggtgcg tactcacagt aagaaagcac tgatgcgcta 960
cgaagacgtt tacatgcctg aggtgtacaa agcgattaac attgcgcaaa acaccgcatg 1020
gaaaatcaac aagaaagtcc tagcggtcgc caacgtaatc accaagtgga agcattgtcc 1080
ggtcgaggac atccctgcga ttgagcgtga agaactcccg atgaaaccgg aagacatcga 1140
catgaatcct gaggctctca ccgcgtggaa acgtgctgcc gctgctgtgt accgcaagga 1200
caaggctcgc aagtctcgcc gtatcagcct tgagttcatg cttgagcaag ccaataagtt 1260
tgctaaccat aaggccatct ggttccctta caacatggac tggcgcggtc gtgtttacgc 1320
tgtgtcaatg ttcaacccgc aaggtaacga tatgaccaaa ggactgctta cgctggcgaa 1380
aggtaaacca atcggtaagg aaggttacta ctggctgaaa atccacggtg caaactgtgc 1440
gggtgtcgat aaggttccgt tccctgagcg catcaagttc attgaggaaa accacgagaa 1500
catcatggct tgcgctaagt ctccactgga gaacacttgg tgggctgagc aagattctcc 1560
gttctgcttc cttgcgttct gctttgagta cgctggggta cagcaccacg gcctgagcta 1620
taactgctcc cttccgctgg cgtttgacgg gtcttgctct ggcatccagc acttctccgc 1680
gatgctccga gatgaggtag gtggtcgcgc ggttaacttg cttcctagtg aaaccgttca 1740
ggacatctac gggattgttg ctaagaaagt caacgagatt ctacaagcag acgcaatcaa 1800
tgggaccgat aacgaagtag ttaccgtgac cgatgagaac actggtgaaa tctctgagaa 1860
agtcaagctg ggcactaagg cactggctgg tcaatggctg gcttacggtg ttactcgcag 1920
tgtgactaag cgttcagtca tgacgctggc ttacgggtcc aaagagttcg gcttccgtca 1980
acaagtgctg gaagatacca ttcagccagc tattgattcc ggcaagggtc tgatgttcac 2040
tcagccgaat caggctgctg gatacatggc taagctgatt tgggaatctg tgagcgtgac 2100
ggtggtagct gcggttgaag caatgaactg gcttaagtct gctgctaagc tgctggctgc 2160
tgaggtcaaa gataagaaga ctggagagat tcttcgcaag cgttgcgctg tgcattgggt 2220
aactcctgat ggtttccctg tgtggcagga atacaagaag cctattcaga cgcgcttgaa 2280
cctgatgttc ctcggtcagt tccgcttaca gcctaccatt aacaccaaca aagatagcga 2340
gattgatgca cacaaacagg agtctggtat cgctcctaac tttgtacaca gccaagacgg 2400
tagccacctt cgtaagactg tagtgtgggc acacgagaag tacggaatcg aatcttttgc 2460
actgattcac gactccttcg gtaccattcc ggctgacgct gcgaacctgt tcaaagcagt 2520
gcgcgaaact atggttgaca catatgagtc ttgtgatgta ctggctgatt tctacgacca 2580
gttcgctgac cagttgcacg agtctcaatt ggacaaaatg ccagcacttc cggctaaagg 2640
taacttgaac ctccgtgaca tcttagagtc ggacttcgcg ttcgcgtaa 2689
<210> 67
<211> 2689
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 连接有P23启动子的T7R序列
<400> 67
tcccgccttt aggggtgaat tgttctatac tgaattgatg aacacgatta acatcgctaa 60
gaacgacttc tctgacatcg aactggctgc tatcccgttc aacactctgg ctgaccatta 120
cggtgagcgt ttagctcgcg aacagttggc ccttgagcat gagtcttacg agatgggtga 180
agcacgcttc cgcaagatgt ttgagcgtca acttaaagct ggtgaggttg cggataacgc 240
tgccgccaag cctctcatca ctaccctact ccctaagatg attgcacgca tcaacgactg 300
gtttgaggaa gtgaaagcta agcgcggcaa gcgcccgaca gccttccagt tcctgcaaga 360
aatcaagccg gaagccgtag cgtacatcac cattaagacc actctggctt gcctaaccag 420
tgctgacaat acaaccgttc aggctgtagc aagcgcaatc ggtcgggcca ttgaggacga 480
ggctcgcttc ggtcgtatcc gtgaccttga agctaagcac ttcaagaaaa acgttgagga 540
acaactcaac aagcgcgtag ggcacgtcta caagaaagca tttatgcaag ttgtcgaggc 600
tgacatgctc tctaagggtc tactcggtgg cgaggcgtgg tcttcgtggc ataaggaaga 660
ctctattcat gtaggagtac gctgcatcga gatgctcatt gagtcaaccg gaatggttag 720
cttacaccgc caaaatgctg gcgtagtagg tcaagactct gagactatcg aactcgcacc 780
tgaatacgct gaggctatcg caacccgtgc aggtgcgctg gctggcatct ctccgatgtt 840
ccaaccttgc gtagttcctc ctaagccgtg gactggcatt actggtggtg gctattgggc 900
taacggtcgt cgtcctctgg cgctggtgcg tactcacagt aagaaagcac tgatgcgcta 960
cgaagacgtt tacatgcctg aggtgtacaa agcgattaac attgcgcaaa acaccgcatg 1020
gaaaatcaac aagaaagtcc tagcggtcgc caacgtaatc accaagtgga agcattgtcc 1080
ggtcgaggac atccctgcga ttgagcgtga agaactcccg atgaaaccgg aagacatcga 1140
catgaatcct gaggctctca ccgcgtggaa acgtgctgcc gctgctgtgt accgcaagga 1200
caaggctcgc aagtctcgcc gtatcagcct tgagttcatg cttgagcaag ccaataagtt 1260
tgctaaccat aaggccatct ggttccctta caacatggac tggcgcggtc gtgtttacgc 1320
tgtgtcaatg ttcaacccgc aaggtaacga tatgaccaaa ggactgctta cgctggcgaa 1380
aggtaaacca atcggtaagg aaggttacta ctggctgaaa atccacggtg caaactgtgc 1440
gggtgtcgat aaggttccgt tccctgagcg catcaagttc attgaggaaa accacgagaa 1500
catcatggct tgcgctaagt ctccactgga gaacacttgg tgggctgagc aagattctcc 1560
gttctgcttc cttgcgttct gctttgagta cgctggggta cagcaccacg gcctgagcta 1620
taactgctcc cttccgctgg cgtttgacgg gtcttgctct ggcatccagc acttctccgc 1680
gatgctccga gatgaggtag gtggtcgcgc ggttaacttg cttcctagtg aaaccgttca 1740
ggacatctac gggattgttg ctaagaaagt caacgagatt ctacaagcag acgcaatcaa 1800
tgggaccgat aacgaagtag ttaccgtgac cgatgagaac actggtgaaa tctctgagaa 1860
agtcaagctg ggcactaagg cactggctgg tcaatggctg gcttacggtg ttactcgcag 1920
tgtgactaag cgttcagtca tgacgctggc ttacgggtcc aaagagttcg gcttccgtca 1980
acaagtgctg gaagatacca ttcagccagc tattgattcc ggcaagggtc tgatgttcac 2040
tcagccgaat caggctgctg gatacatggc taagctgatt tgggaatctg tgagcgtgac 2100
ggtggtagct gcggttgaag caatgaactg gcttaagtct gctgctaagc tgctggctgc 2160
tgaggtcaaa gataagaaga ctggagagat tcttcgcaag cgttgcgctg tgcattgggt 2220
aactcctgat ggtttccctg tgtggcagga atacaagaag cctattcaga cgcgcttgaa 2280
cctgatgttc ctcggtcagt tccgcttaca gcctaccatt aacaccaaca aagatagcga 2340
gattgatgca cacaaacagg agtctggtat cgctcctaac tttgtacaca gccaagacgg 2400
tagccacctt cgtaagactg tagtgtgggc acacgagaag tacggaatcg aatcttttgc 2460
actgattcac gactccttcg gtaccattcc ggctgacgct gcgaacctgt tcaaagcagt 2520
gcgcgaaact atggttgaca catatgagtc ttgtgatgta ctggctgatt tctacgacca 2580
gttcgctgac cagttgcacg agtctcaatt ggacaaaatg ccagcacttc cggctaaagg 2640
taacttgaac ctccgtgaca tcttagagtc ggacttcgcg ttcgcgtaa 2689
<210> 68
<211> 2689
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 连接有P24启动子的T7R序列
<400> 68
tcccgccttt aggggctaat tgttctatac tgaaatgatg aacacgatta acatcgctaa 60
gaacgacttc tctgacatcg aactggctgc tatcccgttc aacactctgg ctgaccatta 120
cggtgagcgt ttagctcgcg aacagttggc ccttgagcat gagtcttacg agatgggtga 180
agcacgcttc cgcaagatgt ttgagcgtca acttaaagct ggtgaggttg cggataacgc 240
tgccgccaag cctctcatca ctaccctact ccctaagatg attgcacgca tcaacgactg 300
gtttgaggaa gtgaaagcta agcgcggcaa gcgcccgaca gccttccagt tcctgcaaga 360
aatcaagccg gaagccgtag cgtacatcac cattaagacc actctggctt gcctaaccag 420
tgctgacaat acaaccgttc aggctgtagc aagcgcaatc ggtcgggcca ttgaggacga 480
ggctcgcttc ggtcgtatcc gtgaccttga agctaagcac ttcaagaaaa acgttgagga 540
acaactcaac aagcgcgtag ggcacgtcta caagaaagca tttatgcaag ttgtcgaggc 600
tgacatgctc tctaagggtc tactcggtgg cgaggcgtgg tcttcgtggc ataaggaaga 660
ctctattcat gtaggagtac gctgcatcga gatgctcatt gagtcaaccg gaatggttag 720
cttacaccgc caaaatgctg gcgtagtagg tcaagactct gagactatcg aactcgcacc 780
tgaatacgct gaggctatcg caacccgtgc aggtgcgctg gctggcatct ctccgatgtt 840
ccaaccttgc gtagttcctc ctaagccgtg gactggcatt actggtggtg gctattgggc 900
taacggtcgt cgtcctctgg cgctggtgcg tactcacagt aagaaagcac tgatgcgcta 960
cgaagacgtt tacatgcctg aggtgtacaa agcgattaac attgcgcaaa acaccgcatg 1020
gaaaatcaac aagaaagtcc tagcggtcgc caacgtaatc accaagtgga agcattgtcc 1080
ggtcgaggac atccctgcga ttgagcgtga agaactcccg atgaaaccgg aagacatcga 1140
catgaatcct gaggctctca ccgcgtggaa acgtgctgcc gctgctgtgt accgcaagga 1200
caaggctcgc aagtctcgcc gtatcagcct tgagttcatg cttgagcaag ccaataagtt 1260
tgctaaccat aaggccatct ggttccctta caacatggac tggcgcggtc gtgtttacgc 1320
tgtgtcaatg ttcaacccgc aaggtaacga tatgaccaaa ggactgctta cgctggcgaa 1380
aggtaaacca atcggtaagg aaggttacta ctggctgaaa atccacggtg caaactgtgc 1440
gggtgtcgat aaggttccgt tccctgagcg catcaagttc attgaggaaa accacgagaa 1500
catcatggct tgcgctaagt ctccactgga gaacacttgg tgggctgagc aagattctcc 1560
gttctgcttc cttgcgttct gctttgagta cgctggggta cagcaccacg gcctgagcta 1620
taactgctcc cttccgctgg cgtttgacgg gtcttgctct ggcatccagc acttctccgc 1680
gatgctccga gatgaggtag gtggtcgcgc ggttaacttg cttcctagtg aaaccgttca 1740
ggacatctac gggattgttg ctaagaaagt caacgagatt ctacaagcag acgcaatcaa 1800
tgggaccgat aacgaagtag ttaccgtgac cgatgagaac actggtgaaa tctctgagaa 1860
agtcaagctg ggcactaagg cactggctgg tcaatggctg gcttacggtg ttactcgcag 1920
tgtgactaag cgttcagtca tgacgctggc ttacgggtcc aaagagttcg gcttccgtca 1980
acaagtgctg gaagatacca ttcagccagc tattgattcc ggcaagggtc tgatgttcac 2040
tcagccgaat caggctgctg gatacatggc taagctgatt tgggaatctg tgagcgtgac 2100
ggtggtagct gcggttgaag caatgaactg gcttaagtct gctgctaagc tgctggctgc 2160
tgaggtcaaa gataagaaga ctggagagat tcttcgcaag cgttgcgctg tgcattgggt 2220
aactcctgat ggtttccctg tgtggcagga atacaagaag cctattcaga cgcgcttgaa 2280
cctgatgttc ctcggtcagt tccgcttaca gcctaccatt aacaccaaca aagatagcga 2340
gattgatgca cacaaacagg agtctggtat cgctcctaac tttgtacaca gccaagacgg 2400
tagccacctt cgtaagactg tagtgtgggc acacgagaag tacggaatcg aatcttttgc 2460
actgattcac gactccttcg gtaccattcc ggctgacgct gcgaacctgt tcaaagcagt 2520
gcgcgaaact atggttgaca catatgagtc ttgtgatgta ctggctgatt tctacgacca 2580
gttcgctgac cagttgcacg agtctcaatt ggacaaaatg ccagcacttc cggctaaagg 2640
taacttgaac ctccgtgaca tcttagagtc ggacttcgcg ttcgcgtaa 2689
<210> 69
<211> 1682
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 连接有plac启动子的yebQ序列
<400> 69
ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga 60
gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc 120
cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg 180
cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca 240
ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg 300
aggagctcat gccaaaagtt caggccgacg gcctgccatt gccccagcga tacggtgcga 360
tattaaccat tgtgattggt atttcgatgg ccgtccttga cggcgcaatc gccaacgtcg 420
ccctgccaac aatcgccacg gaccttcatg ccacgccagc cagttccatc tgggtagtga 480
acgcctatca aatcgccatt gtcatctccc tgctctcgtt ttcgtttctg ggcgatatgt 540
ttggctatcg acgtatttat aaatgcggtc tggtcgtttt tctgttgtct tcactgttct 600
gcgccctttc tgattcgctg caaatgctca cccttgcgcg tgtcatacaa ggtttcggcg 660
gtgcagcgtt gatgagcgtt aataccgcac ttatccgcct gatctatcca caacgttttc 720
tgggtagagg gatgggcata aactcgttta ttgttgccgt ctcttctgct gccgggccga 780
caattgctgc agcaatcctc tccatcgcat cctggaaatg gttattttta atcaacgtac 840
cgttaggtat tatcgccctg cttctggcga tgcgttttct gccacccaat ggttctcgcg 900
ccagtaaacc ccgtttcgac ctgcccagcg ccgtgatgaa cgcgttaacc ttcggcctgc 960
ttatcactgc gttgagtggt ttcgctcagg ggcaatcgct gacgttaatt gctgcggaac 1020
tggtggtaat ggttgttgtt ggtattttct ttattcgccg ccagctttct cttcccgtac 1080
cgctgctacc ggtggattta ctgcgtatcc cgctgttttc actttctatt tgcacatctg 1140
tttgctcttt ctgcgcacaa atgctggcaa tggtttccct gcccttttac ctgcaaaccg 1200
tgctcgggcg tagtgaagtc gaaacaggtt tacttctgac accgtggccg ttagcaacga 1260
tggtgatggc tccgctggca ggctatttga ttgaacgcgt acatgcagga ttgctggggg 1320
ctttagggtt gttcatcatg gctgcggggc ttttttccct ggttctgctg cccgcgtcac 1380
ctgcggatat caatattatc tggccgatga tcttatgtgg tgctggattt ggcttattcc 1440
agtcacccaa taaccacacc attattacct ccgcgcctcg cgaacgtagc ggtggagcca 1500
gtggcatgtt aggaacggct cgtctactgg gtcagagtag cggcgcggcg ctggtggcgc 1560
tgatgctaaa tcagtttgga gataatggta cacacgtctc gctgatggct gcggctattc 1620
tggcagtgat tgctgcctgt gtcagtggtt tacgtatcac tcagccacga tccagggcat 1680
aa 1682
<210> 70
<211> 1724
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> plac+mdtD人工序列
<400> 70
ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga 60
gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc 120
cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg 180
cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca 240
ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg 300
aggagctcat gacagatctt cccgacagca cccgttggca attgtggatt gtggctttcg 360
gcttctttat gcagtcgctg gacaccacca tcgtaaacac cgcccttccc tcaatggcgc 420
aaagcctcgg ggaaagtccg ttgcatatgc acatggtcat tgtctcttat gtgctgaccg 480
tggcggtgat gctgcccgcc agcggctggc tggcggacaa agtcggcgtg cgcaatattt 540
tctttaccgc catcgtgctg tttactctcg gttcactgtt ttgcgcgctt tccggcacgc 600
tgaacgaact gttgctggca cgcgcgttac agggcgttgg cggcgcgatg atggtgccgg 660
tcggcagatt gacggtgatg aaaatcgtac cgcgcgagca atatatggcg gcgatgacct 720
ttgtcacgtt acccggtcag gtcggtccgc tgctcggtcc ggcgctcggc ggtctgctgg 780
tggagtacgc atcgtggcac tggatctttt tgatcaacat tccggtgggg attatcggtg 840
cgatcgccac attgctgtta atgccgaact acaccatgca gacgcggcgc tttgatctct 900
ccggattttt attgctggcg gttggcatgg cggtattaac cctggcgctg gacggcagta 960
aaggtacagg tttatcgccg ctgacgattg caggcctggt cgcagttggc gtggtggcac 1020
tggtgcttta tctgctgcac gccagaaata acaaccgtgc cctgttcagt ctgaaactgt 1080
tccgtactcg taccttttcg ctgggcctgg cggggagctt tgccggacgt attggcagtg 1140
gcatgttgcc ctttatgaca ccggttttcc tgcaaattgg cctcggtttc tcgccgtttc 1200
atgccggact gatgatgatc ccgatggtgc ttggcagcat gggaatgaag cgaattgtgg 1260
tacaggtggt gaatcgcttt ggttatcgtc gggtactggt agcgaccacg ctgggtctgt 1320
cgctggtcac cctgttgttt atgactaccg ccctgctggg ctggtactac gttttgccgt 1380
tcgtcctgtt tttacaaggg atggtcaact cgacgcgttt ctcctccatg aacaccctga 1440
cgctgaaaga tctcccggac aatctggcga gcagcggcaa cagcctgctg tcgatgatta 1500
tgcaattgtc gatgagtatc ggcgtcacta tcgccgggct gttgctggga ctttttggtt 1560
cacagcatgt cagcgtcgac agcggcacca cacaaaccgt ctttatgtac acctggctta 1620
gcatggcgtt gatcatcgcc cttccggcgt tcatctttgc cagagtgccg aacgatacgc 1680
atcaaaatgt agctatttcg cggcgaaaaa ggagcgcgca atga 1724
<210> 71
<211> 1793
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 连接有plac启动子的cgl2893序列
<400> 71
ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga 60
gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc 120
cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg 180
cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca 240
ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg 300
aggagctcat gaccagcgaa accttacagg cccaagctcc aactaagacc cagcggtggg 360
ccttcttggc cgttatatct ggcgggttat tccttattgg tgtggacaat agcatcctgt 420
atacggcgtt gccattgctg cgcgaacaac tggcggcgac cgaaacgcag gccctgtgga 480
ttatcaatgc ctatccactg ttgatggctg gcctgctgct tggcacgggt actcttggtg 540
acaaaattgg ccatcgtcgt atgttcttga tggggctgtc tatctttggc attgcgtcgt 600
tgggtgcggc tttcgctccg accgcctggg cgctggtagc tgcacgcgcc tttcttggaa 660
taggtgcagc gacaatgatg cccgccacac tggcgttaat ccgcatcacg tttgaggatg 720
aacgtgaacg taacaccgcg atcggcatct ggggaagcgt cgctatactg ggagcggctg 780
cgggtccaat aatcgggggt gctctgctgg agtttttttg gtggggtagc gtgtttctga 840
tcaatgtgcc tgtggccgtg attgcgctta tcgcgacgtt atttgtggct ccggcaaata 900
tcgccaaccc gagcaaacat tgggactttt tgagcagctt ctatgcgtta ctgaccttag 960
cgggcctgat catcacgatt aaggagagcg tgaataccgc ccgtcatatg ccactgctgt 1020
taggggcggt cattatgttg attatcggtg ccgtgctgtt tagcagtcgt cagaagaaaa 1080
ttgaggaacc gcttctggat ctgagcttat ttcgtaatcg tttgttcctt gggggggtgg 1140
tggcagctgg catggctatg tttaccgtga gcggcctgga aatgaccacc agtcagcgtt 1200
ttcaactgag cgtggggttt acccccctgg aggcgggctt gctgatgatt cctgcggcac 1260
tggggtcttt ccctatgagc ataattggag gtgcaaatct gcatcggtgg ggctttaagc 1320
cactgattag cggaggcttc gccgcgacgg cggttggaat tgctttatgc atttggggtg 1380
cgacccatac cgatggtctg ccgttcttta tagctggctt gttcttcatg ggcgcaggtg 1440
ctggttctgt gatgagcgta tcaagcactg ccatcatcgg cagcgcaccc gttcgtaaag 1500
ctgggatggc ttcgagcatt gaagaagtta gctatgaatt tggaaccctg ttgtcggttg 1560
ctatcttggg aagtctgttt ccgtttttct actcactgca tgcccctgca gaagtggctg 1620
ataacttttc tgccggggtg catcatgcga ttgacgggga tgcagctcgt gcaagccttg 1680
acacagcgta cataaatgta ctgataattg ctctggtgtg cgccgttgca gcggctctga 1740
tatcgagcta tctgttccgt ggcaatccga agggcgcgaa taacgcgcat tag 1793

Claims (15)

1.重组DNA，其包括：
A)在稳定期特异性启动子控制之下的T7 RNA聚合酶基因；和
B)在T7启动子控制之下的赖氨酸脱羧酶基因。
2.如权利要求1所述的重组DNA，其中，
所述稳定期特异性启动子选自pcsiE、pbolA、posmY、pkatE、P21、P22、P23或P24中的任意一种，例如所述pcsiE的序列是SEQ ID NO.1，pbolA的序列是SEQ ID NO.2，posmY的序列是SEQ ID NO.3，pkatE的序列是SEQ ID NO.4，P21的序列是SEQ ID NO.5，P22的序列是SEQID NO.6，P23的序列是SEQ ID NO.7，P24的序列是SEQ ID NO.8；和/或
所述T7 RNA聚合酶基因选自来源于大肠杆菌的T7 RNA聚合酶基因、噬菌体的T7 RNA聚合酶基因或者合成的T7 RNA聚合酶基因，例如所述T7RNA聚合酶基因的序列是SEQ IDNO.28；和/或
所述T7启动子是选自来源于噬菌体、pET30a质粒或者合成的T7启动子，例如T7启动子的序列是SEQ ID NO.31；和/或
所述赖氨酸脱羧酶基因选自大肠杆菌的cadA基因、ldcC基因、haldc基因、cadA基因的片段、ldcC基因的片段或haldc基因的片段，例如所述cadA基因的序列是SEQ ID NO.9。
3.如权利要求1或2所述的重组DNA，其还包括：
C)促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因；
进一步地，所述促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因在组成型启动子控制之下。
4.如权利要求3所述的重组DNA，所述促进1,5-戊二胺排出的基因是透过酶基因，例如yebQ、mdtD、cgl2893，例如yebQ基因的序列是SEQ ID NO.55，mdtD基因的序列是SEQ IDNO.56，cgl2893基因的序列是SEQ ID NO.57或SEQ ID NO.13的编码序列。
5.如权利要求3或4所述的重组DNA，其中所述组成型启动子是plac、trp、tac或trc。
6.如权利要求3所述的重组DNA，其包括：
A)在稳定期特异性启动子控制之下的T7 RNA聚合酶基因，序列选自SEQ ID NOs.61、62、63、64、65、66、67或68；
B)在T7启动子控制之下的赖氨酸脱羧酶基因，序列是SEQ ID NO.36；和
C)在组成型启动子控制之下的促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因，序列选自SEQ IDNOs.69、70或71。
7.含有权利要求1-6任一项所述重组DNA的质粒。
8.生产1,5-戊二胺的基因工程菌，其包含权利要求1-6任一项所述的重组DNA或者使用权利要求7所述的质粒而获得。
9.根据权利要求8所述的生产1,5-戊二胺的基因工程菌，所述重组DNA通过基因工程手段整合到所述生产1,5-戊二胺的基因工程菌的染色体上。
10.权利要求8所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌的染色体中包含在所述在稳定期特异性启动子控制之下的T7 RNA聚合酶基因和在T7启动子控制之下的赖氨酸脱羧酶基因。
11.权利要求8-10任一项所述的基因工程菌，其中，所述基因工程菌在染色体中包含通过重组引入的所述促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因或在所转化的表达质粒中包含所述促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因，任选地所述促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因在组成型启动子控制之下。
12.如权利要求8-11任一项所述的基因工程菌，其来源于埃希氏菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、哈夫尼菌属(Hafnia)的菌种，例如大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜热菌(Thermus.thermophilus)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。
13.如权利要求8-11任一项所述的基因工程菌，其来源于大肠杆菌M11-A3菌株，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No：M2018456。
14.如权利要求13所述的基因工程菌，其在染色体中包含：
A)在稳定期特异性启动子控制之下的T7 RNA聚合酶基因，序列选自SEQ ID NOs.61、62、63、64、65、66、67或68；
B)在T7启动子控制之下的赖氨酸脱羧酶基因，序列是SEQ ID NO.36；
C)通过重组引入的在组成型启动子控制之下的促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因，序列选自SEQ ID NOs.69、70或71。
15.生产1,5-戊二胺的方法，包括培养权利要求8-14任一项所述的基因工程菌。
CN202110402224.5A 2021-04-14 2021-04-14 用于发酵生产1,5-戊二胺的重组dna、菌株及其用途 Pending CN115197954A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110402224.5A CN115197954A (zh) 2021-04-14 2021-04-14 用于发酵生产1,5-戊二胺的重组dna、菌株及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110402224.5A CN115197954A (zh) 2021-04-14 2021-04-14 用于发酵生产1,5-戊二胺的重组dna、菌株及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115197954A true CN115197954A (zh) 2022-10-18

Family

ID=83574187

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110402224.5A Pending CN115197954A (zh) 2021-04-14 2021-04-14 用于发酵生产1,5-戊二胺的重组dna、菌株及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115197954A (zh)

Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080054482A (ko) * 2006-12-13 2008-06-18 씨제이제일제당 (주) ｙｅｂＱ 유전자의 발현이 증가된 Ｌ-쓰레오닌 생산 미생물및 이를 이용한 Ｌ-쓰레오닌 생산 방법
CN101715490A (zh) * 2007-04-06 2010-05-26 协和发酵生化株式会社 谷胱甘肽及γ-谷氨酰半胱氨酸的制造方法
CN102264905A (zh) * 2008-10-30 2011-11-30 基因桥有限责任公司 用于多肽重组表达的基于t7双启动子的载体系统
CN103276005A (zh) * 2013-05-07 2013-09-04 清华大学 一种基于t7表达系统的重组质粒
CN103492553A (zh) * 2011-02-22 2014-01-01 巴斯夫欧洲公司 用于生产尸胺的方法和重组微生物
CN106795485A (zh) * 2014-08-12 2017-05-31 Cj第制糖株式会社 生产o‑磷酸丝氨酸的微生物和利用其生产o‑磷酸丝氨酸或l‑半胱氨酸的方法
US20170152491A1 (en) * 2014-07-01 2017-06-01 Wacker Chemie Ag T7 expression system, method for its production and use thereof for producing recombinant proteins
US20170226544A1 (en) * 2014-06-27 2017-08-10 Institute Of Microbiology, Chinese Academy Of Sciences E. coli engineering bacteria producing 1,5-pentanediamine through whole cell catalysis and application thereof
CN107849576A (zh) * 2015-06-24 2018-03-27 Cj第制糖株式会社 用于产生腐胺或鸟氨酸的微生物以及使用这些微生物产生腐胺或鸟氨酸的方法
CN108026556A (zh) * 2015-09-12 2018-05-11 詹尼温生物技术有限责任公司 在具有经改造的输入/输出的微生物宿主中人乳寡糖的产生
CN108034736A (zh) * 2017-12-19 2018-05-15 河北农业大学 用于大肠杆菌氟喹诺酮类抗生素耐药性的检测试剂盒、检测方法及应用
CN108220288A (zh) * 2016-12-13 2018-06-29 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 一种聚核苷酸、转化子及其应用
CN108456688A (zh) * 2017-02-21 2018-08-28 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 一种基于t7启动子的重组表达质粒、转化子及其应用
CN110699394A (zh) * 2019-09-06 2020-01-17 南京工业大学 一种生产1,5-戊二胺的生物转化法
CN111321141A (zh) * 2018-12-14 2020-06-23 上海凯赛生物技术股份有限公司 稳定期特异性启动子及其应用
CN111662903A (zh) * 2019-03-08 2020-09-15 上海凯赛生物技术股份有限公司 对数期特异性启动子及其应用
CN111763699A (zh) * 2019-04-02 2020-10-13 上海凯赛生物技术股份有限公司 用于发酵生产1,5-戊二胺的重组dna、菌株及其应用

Patent Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080054482A (ko) * 2006-12-13 2008-06-18 씨제이제일제당 (주) ｙｅｂＱ 유전자의 발현이 증가된 Ｌ-쓰레오닌 생산 미생물및 이를 이용한 Ｌ-쓰레오닌 생산 방법
CN101715490A (zh) * 2007-04-06 2010-05-26 协和发酵生化株式会社 谷胱甘肽及γ-谷氨酰半胱氨酸的制造方法
CN102264905A (zh) * 2008-10-30 2011-11-30 基因桥有限责任公司 用于多肽重组表达的基于t7双启动子的载体系统
CN103492553A (zh) * 2011-02-22 2014-01-01 巴斯夫欧洲公司 用于生产尸胺的方法和重组微生物
CN103276005A (zh) * 2013-05-07 2013-09-04 清华大学 一种基于t7表达系统的重组质粒
US20170226544A1 (en) * 2014-06-27 2017-08-10 Institute Of Microbiology, Chinese Academy Of Sciences E. coli engineering bacteria producing 1,5-pentanediamine through whole cell catalysis and application thereof
US20170152491A1 (en) * 2014-07-01 2017-06-01 Wacker Chemie Ag T7 expression system, method for its production and use thereof for producing recombinant proteins
CN106795485A (zh) * 2014-08-12 2017-05-31 Cj第制糖株式会社 生产o‑磷酸丝氨酸的微生物和利用其生产o‑磷酸丝氨酸或l‑半胱氨酸的方法
CN107849576A (zh) * 2015-06-24 2018-03-27 Cj第制糖株式会社 用于产生腐胺或鸟氨酸的微生物以及使用这些微生物产生腐胺或鸟氨酸的方法
CN108026556A (zh) * 2015-09-12 2018-05-11 詹尼温生物技术有限责任公司 在具有经改造的输入/输出的微生物宿主中人乳寡糖的产生
CN108220288A (zh) * 2016-12-13 2018-06-29 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 一种聚核苷酸、转化子及其应用
CN108456688A (zh) * 2017-02-21 2018-08-28 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 一种基于t7启动子的重组表达质粒、转化子及其应用
CN108034736A (zh) * 2017-12-19 2018-05-15 河北农业大学 用于大肠杆菌氟喹诺酮类抗生素耐药性的检测试剂盒、检测方法及应用
CN111321141A (zh) * 2018-12-14 2020-06-23 上海凯赛生物技术股份有限公司 稳定期特异性启动子及其应用
CN111662903A (zh) * 2019-03-08 2020-09-15 上海凯赛生物技术股份有限公司 对数期特异性启动子及其应用
CN111763699A (zh) * 2019-04-02 2020-10-13 上海凯赛生物技术股份有限公司 用于发酵生产1,5-戊二胺的重组dna、菌株及其应用
CN110699394A (zh) * 2019-09-06 2020-01-17 南京工业大学 一种生产1,5-戊二胺的生物转化法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
F.WILLIAM STUDIER 等: "Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes", JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, vol. 189, no. 1, pages 113 - 130 *
GERHARD MIKSCH 等: "Libraries of synthetic stationary-phase and stress promoters as a tool for fine-tuning of expression of recombinant proteins in Escherichia coli", JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, vol. 120, no. 1, pages 25 - 27 *
KUNIHIKO NISHINO 等: "Analysis of a Complete Library of Putative Drug Transporter Genes in Escherichia coli", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 183, no. 20, 31 October 2001 (2001-10-31), pages 5803, XP008125245, DOI: 10.1128/JB.183.20.5803-5812.2001 *
MECHESSO, A, F 等: "MFS transporter [Escherichia coli]", GENBANK DATABASE, 17 March 2020 (2020-03-17), pages 37082 *
MIKIRO HAYASHI 等: "Effect of multidrug-efflux transporter genes on dipeptide resistance and overproduction in Escherichia coli", FEMS MICROBIOLOGY LETTERS, vol. 304, no. 1, 1 March 2010 (2010-03-01), pages 12 - 19 *
SATOSHI NAGAKUBO 等: "The Putative Response Regulator BaeR Stimulates Multidrug Resistance of Escherichia coli via a Novel Multidrug Exporter System, MdtABC", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 184, no. 15, 31 August 2002 (2002-08-31), pages 4161 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110699394B (zh) 一种生产1,5-戊二胺的生物转化法
CN108949661B (zh) 一种产o-琥珀酰-l-高丝氨酸重组大肠杆菌及其应用
CN114457122B (zh) 生产l-缬氨酸的重组微生物及构建方法、应用
CN111394288B (zh) 重组谷氨酸棒杆菌、其构建方法及其生产四氢嘧啶的方法
CN109055290A (zh) 一种高产l-高丝氨酸的重组大肠杆菌及其应用
WO2022174597A1 (zh) 一种用于l-肌氨酸生产的基因工程菌及构建方法与应用
CN112877270B (zh) 一种生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其应用
CN111411092B (zh) 高产l-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌及其应用
CN111705030B (zh) 高产l-高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌、构建方法及菌株
CN113278568A (zh) 生产l-缬氨酸的重组大肠杆菌及其应用
CN101463358B (zh) 一种腈水合酶基因簇及其应用
CN112375723B (zh) 生产马来酸的工程菌及其构建方法和应用
KR101695830B1 (ko) 사이코스 에퍼머화 효소의 발현 시스템 및 이를 이용한 사이코스의 생산
CN110713962B (zh) 一株高产丙二酰辅酶a的基因工程菌及其构建方法和应用
CN114854659B (zh) 一种麦角硫因生产工艺及其应用
CN114426983B (zh) 敲除谷氨酸棒杆菌中转录调控因子Ncgl0580生产5-氨基乙酰丙酸的方法
KR101725454B1 (ko) 하프니아 알베이 유래의 라이신 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자, 이를 포함하는 재조합 벡터, 숙주세포 및 이를 이용한 카다베린의 생산방법
CN115197954A (zh) 用于发酵生产1,5-戊二胺的重组dna、菌株及其用途
CN114058560A (zh) 甘氨酸的生产方法
CN115873852A (zh) 重组核酸序列、基因工程菌及生产1,5-戊二胺的方法
CN115873880A (zh) 重组核酸序列、重组表达载体以及基因工程菌
KR102031886B1 (ko) 신규한 프로모터 및 이의 용도
KR102489243B1 (ko) S-메틸메티오닌 생산용 재조합 미생물 및 이를 이용한 s-메틸메티오닌의 제조방법
CN108866017B (zh) 一种酶法制备β-羟基-β-甲基丁酸的方法
CN117305209A (zh) 一种合成三七素的谷氨酸棒状杆菌工程菌及其构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination