CN110699394A - 一种生产1,5-戊二胺的生物转化法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于遗传工程技术领域，涉及一种生产1,5‑戊二胺的生物转化法。该方法通过改造对大肠杆菌的代谢途径来提高1,5‑戊二胺的产率。具体步骤为所述通过改造大肠杆菌的代谢途径，包括以下步骤：选取大肠杆菌菌株，首先敲除1,5‑戊二胺降解路径；其次，增加1,5‑戊二胺的合成前体赖氨酸；再次，过表达转运蛋白基因，最后大肠杆菌菌株DFC1002直接发酵生产1,5‑戊二胺。该方法通过对大肠杆菌中的代谢路径进行改造后，得到的高产1,5‑戊二胺的方法，该方法简单易行，产量高，副产物少，且重复性好，适合产业化。

Description

一种生产1,5-戊二胺的生物转化法
技术领域
本发明属于遗传工程技术领域，涉及一种生产1,5-戊二胺的生物转化法。
背景技术
1,5-戊二胺,即尸胺，是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱,为蛋白质腐败时赖氨酸在脱羧酶作用下发生脱羧反应时生成。1,5-戊二胺具有许多重要的生理功能，如1,5-戊二胺是微生物细胞内调节铁离子浓度的“铁亲和系统”和一些严格厌氧的革兰氏阴性菌肽聚糖的主要组成成分；1,5-戊二胺在关闭微孔蛋白通道和保护大肠杆菌免受氧的毒害方面也起着重要的作用。1,5-戊二胺在农业、医学和工业上均具有广泛的应用：在农业上,可用于调控植物衰老过程、促进雌雄蕊的发育,改善植物果实发育,提高果实产量；在医学上,可作为一种有效治疗痢疾的药物；在工业上,将1,5-戊二胺与二元酸进行聚合反应可合成优质高分子材料新型尼龙，被广泛应用于航空航天,汽车部件、机械零部件、电子电器、包装材料、胶粘剂及化妆品等领域。
生物法生产1,5-戊二胺，是一条新颖且具有潜在竞争力的生产途径，而现有技术更多的关注在赖氨酸脱羧酶的表达和重组菌的构建等。利用生物法合成1,5-戊二胺的方法主要有两种。生物法制备1,5-戊二胺的一种途径是利用赖氨酸脱羧酶对赖氨酸或其盐进行生物催化。例如，凯赛生物产业有限公司在公开号为CN109536542A和CN104762336A的专利中将该方法在赖氨酸发酵过程中接入含有赖氨酸脱羧酶菌株的种子液，进行混合发酵生产1,5-戊二胺。此方法特点为先进行赖氨酸发酵，制备得到纯度较高的赖氨酸或其盐，再利用赖氨酸脱羧酶催化形成1,5-戊二胺。该方法工艺流程长，而且催化反应体系中需要昂贵的辅酶，原料成本较高。另一种是微生物利用葡萄糖通过复杂的代谢调控，从头合成1,5-戊二胺。例如，东丽株式会社在公开号为CN102844440A的专利中对谷氨酸棒杆菌中编码赖氨酸脱羧酶的基因进行修饰，来发酵生产1,5-戊二胺。由微生物经过葡萄糖直接发酵生产1,5-戊二胺，代谢调控复杂，发酵周期长，效率低，且1,5-戊二胺对微生物细胞毒性大，需要做的工作还有很多。
可见，现有技术并没有在如何对一步发酵生产1,5-戊二胺的大肠杆菌工程菌株进行代谢工程改造方面进行研究。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种生产1,5-戊二胺的生物转化法，该方法方法通过对大肠杆菌中的代谢路径进行改造后，得到的高产1,5-戊二胺的方法，该方法简单易行，产量高，副产物少，且重复性好，适合产业化。
为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：
一种生产1,5-戊二胺的生物转化法，通过改造对大肠杆菌的代谢途径来提高1,5-戊二胺的产率。
上述生产1,5-戊二胺的生物转化法，所述通过改造大肠杆菌的代谢途径，包括以下步骤：选取大肠杆菌菌株，首先敲除1,5-戊二胺降解路径；其次，增加1,5-戊二胺的合成前体赖氨酸；再次，过表达转运蛋白基因，最后大肠杆菌菌株DFC1002直接发酵生产1,5-戊二胺。
作为改进的是，所述大肠杆菌为导入了赖氨酸脱羧酶基因CadA的重组大肠杆菌DFC1001。
进一步改进的是，所述重组大肠杆菌DFC1001的构建步骤如下：将赖氨酸脱羧酶基因CadA插入出发载体pCDFduet的Not III和Bgl II酶切位点之间得到重组载体pCDFduet-CadA，将重组载体pCDFduet-CadA导入宿主菌大肠杆菌(Escherichia coli)中，重组大肠杆菌能够将发酵过程中产生的赖氨酸直接脱羧得到1,5-戊二胺，达到一步发酵生产1,5-戊二胺。
进一步改进的是，所述赖氨酸脱羧酶基因CadA来自于大肠杆菌(Escherichiacoli)MG1655；所述宿主菌大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M 2013239；所述发酵条件为30-37℃、200rpm-300rpm发酵12-48h。
上述生产1,5-戊二胺的生物转化法，包括以下步骤：
步骤1，1,5-戊二胺降解路径的敲除，增加1,5-戊二胺的积累
利用CRSIPR/Cas9基因编辑技术对出发菌株的1,5-戊二胺的代谢路径进行编辑，分别敲除了puuA，speE,speG和patA四个降解基因；
步骤2，1,5-戊二胺的合成前体赖氨酸的增加
利用CRSIPR/Cas9基因编辑技术对步骤1中敲除降解基因后菌株的1,5-戊二胺的代谢路径进行编辑，敲除了pepck和pck两个基因，从而分别增加了赖氨酸合成前体草酰乙酸的积累和减少了去往三羧酸循环的碳流量，进而增加磷酸烯醇式丙酮酸到草酰乙酸的碳流量，然后，过表达了基因ppc，促进磷酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸，并过表达了草酰乙酸到赖氨酸合成路径中的基因dapA，dapB和lysA，从而增加赖氨酸的积累；
步骤3，菌株转运蛋白的改造
在步骤2修饰后的菌株的基础上，对菌株的1,5-戊二胺的转运蛋白基因cadB进行过表达，增加1,5-戊二胺的排出，降低1,5-戊二胺对细胞的毒性；由于腐胺和1,5-戊二胺性质相似，对细胞有毒害作用，因此利用CRSIPR/Cas9基因编辑技术敲除了腐胺转入蛋白基因puuP，减轻了细胞内压力；
步骤4，发酵
先对步骤3处理后的菌株进行摇管活化，活化后再接入发酵摇瓶培养基，于37℃，200rpm的条件下发酵24h，按常规操作，收集产物1,5-戊二胺。。
作为改进的是，所述的CRSIPR/Cas9基因编辑技术，基因敲除所用引物及sgRNA通过在线软件CHOPCHOP(http://chopchop.cbu.uib.no/)进行设计，具体操作如下：
(1)sg-X质粒的构建构建sg-X质粒(X代表欲敲除的基因名)，以pTargetF为模板，以欲敲除基因的sg-X-F/sg-X-R为引物进行PCR扩增，扩增后的产物用限制性核酸酶DpnI于37℃酶切30min，然后转入E.coli trans1-T1细胞中，平板涂布过夜培养，挑取两株生长良好的菌株克隆存菌，同时提质粒测序，测序引物为WF-sgRNA，测序正确的质粒命名为sg-X；
(2)构建替换片段构建用于敲除基因替换的同源臂片段，以E.coli BL21(DE3)基因组为模板，以欲敲除基因的X-F1/X-R1为引物扩增得到片段X-F，以X-F2/X-R2为引物扩增得到片段X-R，以X-F，X-R为模板，以X-F1/X-R2为引物通过重叠PCR的方式将两片段融合得到片段X，用于敲除基因替换；
(3)电转感受态的制备将质粒Pcas转入1,5-戊二胺的生产菌株DFC1001感受态细胞中，挑取单菌落接种于5mL的LB液体培养基中，30℃，200rpm，培养8h，以1％的接种量转接到50mL含的LB液体培养基中培养至OD600约为0.2，加入1.5mL 1mM的L-阿拉伯糖溶液，继续培养至OD600为0.4～0.5；随即转入50mL离心管中冰浴20min，使其停止生长，4℃，4000rpm，离心10min，收集菌体，再用40mL预冷的无菌水洗涤菌体，离心收集细胞，重复上述步骤；用20mL预冷的10％甘油洗涤菌体，离心收集细胞，最后用500μL预冷的10％甘油重悬菌体，将得到的NT1003-cas感受态进行分装备用；
(4)电转感受态的制备将质粒Pcas转入1,5-戊二胺的生产菌株DFC1001感受态细胞中，挑取单菌落接种于5mL的LB液体培养基中，30℃，200rpm，培养8h；以1％的接种量转接到50mL含的LB液体培养基中培养至OD600约为0.2，加入1.5mL 1mM的L-阿拉伯糖溶液，继续培养至OD600为0.4～0.5；随即转入50mL离心管中冰浴20min，使其停止生长；4℃，4000rpm，离心10min，收集菌体；再用40mL预冷的无菌水洗涤菌体，离心收集细胞；重复上述步骤；用20mL预冷的10％甘油洗涤菌体，离心收集细胞；最后用500μL预冷的10％甘油重悬菌体，将得到的NT1003-cas感受态进行分装备用；
(5)基因敲除
将质粒sg-X和X片段通过电转方式转入DFC1001-cas感受态细胞中，30℃，200rpm，培养2h，将涂布于含40μg·mL-1链霉素抗性和50μg·mL-1卡那霉素抗性的LB平板中30℃过夜培养；通过菌落PCR的方式筛选平板中的菌落，PCR引物为X-F1/X-R2；挑选其中3个阳性克隆菌株测序，测序正确的菌株，保存于-80℃冰箱备用。
作为改进的是，所述过表达的方法为通过同源重组的方式构建重组质粒再转化到菌株中表达，具体操作如下：根据同源重组酶ClonExpressⅡ试剂盒步骤进行同源重组反应，反应体系如表1所示，将该体系置于37℃反应30min后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min后，取20μl反应液，加入到200μl感受态细胞中进行转化，轻弹管壁混匀，在冰上放置30min，42℃热激45秒，冰水浴2min，加入900μlLB培养基，37℃摇菌45～60min，取100μl菌液均匀涂布在含有链霉素的平板上，将平板倒置，于37℃过夜培养
表1 ClonExpressⅡ体系
有益效果：
与现有技术相比，本发明的优势在于：
(1)本发明通过对1,5-戊二胺的生产菌株DFC1001进行代谢工程改造，提高了生物法直接发酵生产1,5-戊二胺的产量和收率，产量由12.8g/L提高到了16.1g/L，转化率由32％提高到了40.3％，提高了碳源使用率，节约了生产成本，为大规模生产1,5-戊二胺的工作打下基础；(2)本专利申请通过对菌株代谢途径进行改造，敲除分解基因或者抑制基因，过表达合成基因和对转运蛋白进行了改造，最后得到组合改造的生产菌株，达到了促进生产发酵的目的。
附图说明
图1为本发明改造大肠杆菌代谢过程的流程图；
图2为实施例1制备得1,5-戊二胺的液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。
出发菌株DFC1001的构建步骤如下：将赖氨酸脱羧酶基因CadA插入出发载体pCDFduet的Not III和Bgl II酶切位点之间得到重组载体pCDFduet-CadA，将重组载体pCDFduet-CadA导入宿主菌大肠杆菌(Escherichia coli)中，重组大肠杆菌能够将发酵过程中产生的赖氨酸直接脱羧得到1,5-戊二胺，达到一步发酵生产1,5-戊二胺。
LB活化培养基的配方如下：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，5g/L氯化钠，0.55g/L丙酮酸钠；
1,5-戊二胺发酵培养基的配方如下：葡萄糖20g/L，硫酸铵10g/L，酵母粉2g/L，蛋白胨5g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸镁1g/L，硫酸亚铁20mg/L，硫酸锰20mg/L，硫酸铜60mg/L，硫酸锌60mg/L。
CRSIPR/Cas9基因编辑技术，基因敲除所用引物及sgRNA通过在线软件CHOPCHOP(http://chopchop.cbu.uib.no/)进行设计，具体操作如下：
(1)sg-X质粒的构建
构建sg-X质粒(X代表欲敲除的基因名)，以pTargetF为模板，以欲敲除基因的sg-X-F/sg-X-R为引物进行PCR扩增，扩增后的产物用限制性核酸酶DpnI于37℃酶切30min，然后转入E.coli trans1-T1细胞中，平板涂布过夜培养，挑取三株阳性克隆菌株存菌，同时提质粒测序，测序引物为WF-sgRNA。测序正确的质粒命名为sg-X；
(2)构建替换片段
构建用于敲除基因替换的同源臂片段，以E.coli BL21(DE3)基因组为模板，以欲敲除基因的X-F1/X-R1为引物扩增得到片段X-F，以X-F2/X-R2为引物扩增得到片段X-R，以X-F，X-R为模板，以X-F1/X-R2为引物通过重叠PCR的方式将两片段融合得到片段X，用于敲除基因替换；
(3)电转感受态的制备
将质粒Pcas转入1,5-戊二胺的生产菌株DFC1001感受态细胞中，挑取单菌落接种于5mL的LB液体培养基中，30℃，200rpm，培养8h。以1％的接种量转接到50mL含的LB液体培养基中培养至OD600约为0.2，加入1.5mL 1mM的L-阿拉伯糖溶液，继续培养至OD600为0.4～0.5；随即转入50mL离心管中冰浴20min，使其停止生长。4℃，4000rpm，离心10min，收集菌体。再用40mL预冷的无菌水洗涤菌体，离心收集细胞。重复上述步骤；用20mL预冷的10％甘油洗涤菌体，离心收集细胞。最后用500μL预冷的10％甘油重悬菌体，将得到的NT1003-cas感受态进行分装备用；
(4)基因敲除
将质粒sg-X和X片段通过电转方式转入DFC1001-cas感受态细胞中，30℃，200rpm，培养2h，将涂布于含40μg·mL-1链霉素抗性和50μg·mL-1卡那霉素抗性的LB平板中30℃过夜培养。通过菌落PCR的方式筛选平板中的菌落，PCR引物为X-F1/X-R2。挑选其中3个阳性克隆菌株测序，测序正确的菌株，保存于-80℃冰箱备用。
过表达的方法为通过同源重组的方式构建重组质粒再转化到菌株中表达，具体操作如下：根据同源重组酶ClonExpressⅡ试剂盒步骤进行同源重组反应，反应体系如表1所示，将该体系置于37℃反应30min后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min后，取20μl反应液，加入到200μl感受态细胞中进行转化，轻弹管壁混匀，在冰上放置30min，42℃热激45秒，冰水浴2min，加入900μlLB培养基，37℃摇菌45～60min，取100μl菌液均匀涂布在含有链霉素平板上，将平板倒置，于37℃过夜培养。
表1 ClonExpressⅡ体系
Figure BDA0002193563520000061
实施例1生产菌株1,5-戊二胺降解路径的敲除
1、降解基因的敲除
分别构建puuA，speE,speG和patA四个降解基因的sgRNA和同源臂。引物见表2和表3。将质粒sg-X和X片段通过电转方式转入DFC1001-cas感受态细胞中，30℃，200rpm，培养2h，将涂布于含40μg·mL-1链霉素抗性和50μg·mL-1卡那霉素抗性的LB平板中30℃过夜培养。通过菌落PCR的方式筛选平板中的菌落，PCR引物为X-F1/X-R2。挑选其中3个阳性克隆菌株测序，测序正确的菌株，保存于-80℃冰箱备用。
表2 sgRNA-puuA，speE，speG和patA引物
Figure BDA0002193563520000062
表3 puuA，speE，speG和patA同源臂引物
Figure BDA0002193563520000071
2、敲除菌株的发酵验证
将四个敲除菌株分别进行摇瓶分批补料发酵验证。先分别接50ml摇管，加入LB活化培养基进行活化后，转接入发酵培养基，进行摇瓶分批补料发酵，并在第二批补料时，添加10g/L的1,5-戊二胺来验证其耐受性是否提高。
第一批发酵结果，原始菌株，敲除菌株puuA，speE,speG和patA的OD分别是8.2，9.3，11.7，11.9和11.2，1,5-戊二胺产量分别是7.1g/L，0g/L，4g/L，4.2g/L和3.8g/L。第二批发酵结果，原始菌株，敲除菌株puuA，speE,speG和patA的OD分别是10.6，9.4，12.9，12.8和12.4，1,5-戊二胺产量分别是5.7g/L，0.9g/L，6.3g/L，6.3g/L和3.7g/L。结果表明，两批补料发酵中四种敲除菌株的OD相比于原始菌株都有提高；而1,5-戊二胺的产量方面，敲除菌株puuA基本不会代谢生产，敲除菌株patA两批产量都不如原始菌株。而敲除菌株speE和speG第一批1,5-戊二胺低于原始菌株，第二批产量相比于原始菌株提高了11％，，但对比了总体转化率后，原始菌株为32％，敲除菌株speE和speG分别为26％和26.2％。
虽然敲除菌株speE和speG的第二批补料发酵结果优于原始菌株，但总体并没有提高，不过菌体生长量相比于原始菌株有了提高。
1,5-戊二胺检测方法为HPLC，检测条件为Agilgent 1260Infinity System；示差检测器；色谱柱：YMC Carotenoid色谱柱，250×4.6mml.D.S-5μm(产品货号：CT99S05-2546WT)；流动相成分：50mL乙腈+5mL三氟乙酸加水定容到1L；流速：0.8mL/min；进样量：10μL，柱温：35℃。
实施例2生产菌株1,5-戊二胺合成前体赖氨酸的增加
在实施例1中修饰后菌株的基础上，继续进行改造，通过增加1,5-戊二胺合成前体赖氨酸的合成，进一步提高产量，具体步骤如下：
1、赖氨酸合成抑制途径的敲除
分别构建pepck和r imL两个基因的sgRNA和同源臂。引物见表4和表5。将质粒sg-X和X片段通过电转方式转入DFC1001-cas感受态细胞中，30℃，200rpm，培养2h，将涂布于含40μg·mL-1链霉素抗性和50μg·mL-1卡那霉素抗性的LB平板中30℃过夜培养。通过菌落PCR的方式筛选平板中的菌落，PCR引物为X-F1/X-R2。挑选其中3个阳性克隆菌株测序，测序正确的菌株，保存于-80℃冰箱备用。
表4 sgRNA-r imL，pepck引物
Figure BDA0002193563520000081
表5 r imL，pepck同源臂引物
Figure BDA0002193563520000082
2、合成途径的过表达
根据同源重组酶ClonExpressⅡ试剂盒步骤进行同源重组反应，将前体赖氨酸合成基因dapA，dapB，lysA和ppc和载体pCDF-duet片段进行重组反应。同源重组引物设计根据snapgene软件中Gibson clone程序进行设计，引物见表6。将反应产物进行转化，涂布到抗性平板上37℃过夜培养，验证后备用。
表6过表达基因dapA,dapB，lysA和ppc引物
Figure BDA0002193563520000091
3、改造菌株的发酵验证
摇瓶分批补料发酵验证方法同上，第一批发酵结果，原始菌株，敲除菌株r imL和pepck的OD分别是8.2，10和15.1，1,5-戊二胺产量分别是7.1g/L，6.2g/L和0g/L；第二批发酵结果，原始菌株，敲除菌株r imL和pepck的OD分别是10.6，9.4和18，1,5-戊二胺产量分别是5.7g/L，7.3g/L和0g/L。
结果表明，第一批和第二批补料发酵原始菌株和敲除菌株r imLOD相差不大，而敲除菌株pepck远高于原始菌株。但敲除菌株pepck的1,5-戊二胺为0，证明该基因的敲除破坏了菌株1,5-戊二胺的造成代谢；敲除菌株r imL第一批发酵的1,5-戊二胺为原始菌株的79％，但第二批补料发酵的1,5-戊二胺产量相比于原始菌株提高了27.7％，通过计算第二批转化率发现，敲除菌株r imL的转化率为37％相比于原始菌株提高了8.5％。总体转化率敲除菌株r imL的转化率相比于原始菌株提高了2％。
过表达菌株摇瓶分批发酵验证方法同上，第一批发酵结果，原始菌株，过表达菌株dapA，dapB，lysA和ppc的OD分别是8.2，9.1，9.4，9.1和8.6，1,5-戊二胺产量分别是7.1g/L，7.2g/L，7.2g/L，7.4g/L和7.7g/L；第二批发酵结果，原始菌株和过表达菌株dapA，dapB，lysA和ppc的OD分别是10.6，8.3，8.5，9.5和8，1,5-戊二胺产量分别是5.7g/L，7.1g/L，7.6g/L，7.3g/L和7.6g/L。结果表明，第一批补料发酵时，过表达菌株OD高于原始菌株但第二批不如原始菌株。1,5-戊二胺产量第一批原始菌株和过表达菌株相差不大，第二批过表达菌株高于原始菌株25％～33％。比较转化率，最佳的过表达菌株为ppc，总体转化率为38.5％相比于原始菌株提高了6.5％。
实施例3生产菌株转运蛋白的改造
在实施例2中修饰后菌株的基础上(即过表达基因ppc并敲除基因r imL的菌株)，继续进行改造，通过对菌株的转运蛋白进行改造，进一步提高产量，具体步骤如下：
1、腐胺转入蛋白的敲除
构建腐胺转入蛋白puup基因的sgRNA和同源臂。引物见表7。将质粒sg-X和X片段通过电转方式转入DFC1001-cas感受态细胞中，30℃，200rpm，培养2h，将涂布于含40μg·mL-1链霉素抗性和50μg·mL-1卡那霉素抗性的LB平板中30℃过夜培养。通过菌落PCR的方式筛选平板中的菌落，PCR引物为X-F1/X-R2。挑选其中3个阳性克隆菌株测序，测序正确的菌株，保存于-80℃冰箱备用。
表7 sgRNA-puup和同源臂
2、1,5-戊二胺转出蛋白的过表达
根据同源重组酶ClonExpressⅡ试剂盒步骤进行同源重组反应，将1,5-戊二胺转出蛋白基因cadB和载体pCDF-duet片段进行重组反应。同源重组引物设计根据snapgene软件中Gibson clone程序进行设计，引物见表8。将反应产物进行转化，涂布到抗性平板上37℃过夜培养，验证后备用。
表8过表达基因cadB引物
Figure BDA0002193563520000111
3、改造菌株的发酵验证
摇瓶分批补料发酵验证方法同上，第一批发酵结果，原始菌株，敲除菌株puup的OD分别是8.2和9.7，1,5-戊二胺产量分别是7.1g/L和1.5g/L；第二批发酵结果，原始菌株，敲除菌株puup的OD分别是10.6和11.6，1,5-戊二胺产量分别是5.7g/L和5g/L。
结果表明，两批发酵敲除菌株OD均高于原始菌株，但1,5-戊二胺产量远低于原始菌株。
过表达菌株摇瓶分批发酵验证方法同上，第一批发酵结果，原始菌株，过表达菌株cadB的OD分别是8.2和8.7，1,5-戊二胺产量分别是7.1g/L和7.8g/L；第二批发酵结果，原始菌株和过表达菌株cadB的OD分别是10.6和11.2，1,5-戊二胺产量分别是5.7g/L和8.3g/L。
结果表明，第一批原始菌株和过表达菌株cadB的OD和1,5-戊二胺产量相差不大，但第二批补料发酵中，过表达菌株cadB的1,5-戊二胺产量相比于原始菌株提高了41.5％，比原始菌株的28.5％提高了13％；总体转化率也达到了40.3％，比原始菌株的32％提高了8.3％。经过改造的菌株相比于原始菌株的产1,5-戊二胺的能力有了明显提高，并且可以在较高浓度1,5-戊二胺的条件下进行正常生长代谢。最终得到改造菌株DFC1002(过表达基因ppc，cadB，敲除基因r imL)。
实施例4表面活性剂对菌株发酵生产1,5-戊二胺的影响
表面活性剂可以改变菌体细胞的通透性，一方面可以增加胞内1,5-戊二胺分泌到胞外，增加1,5-戊二胺的积累；另一方面胞内1,5-戊二胺的含量减少后可以减少其对细胞的毒害作用，从而增加菌体的活力进一步增加1,5-戊二胺的发酵产量。
因此，选择了吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、吐温85、TritonX-100、司班40、司班60和司班80，这9种表面活性剂进行发酵验证，所用菌株为DFC1002，所用发酵培养基和上述一致。
摇瓶分批补料发酵验证方法如上所述。
第一批发酵结果，不添加表面活性剂作为对照组、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、吐温85、TritonX-100、司班40、司班60和司班80的OD分别是8.2、6.5、6.8、7.6、6.4、12.1、7.2、12、16.3和8.6。其中吐温85，司班40和司班60因为其本身浊度较高，对菌体OD测量有一定影响；1,5-戊二胺的产量分别是7.1g/L、6.7g/L、5.7g/L、4.7g/L、5.9g/L、5.7g/L、6.2g/L、6.4g/L、6.5g/L和6.4g/L。
第二批发酵结果，不添加表面活性剂作为对照组、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、吐温85、TritonX-100、司班40、司班60和司班80的OD分别是10.6、8.7、7.6、9、6.6、11.1、8.7、16.3、16.9和8.7；1,5-戊二胺的产量分别是5.7g/L、4.6g/L、7.5g/L、7.1g/L、5g/L、7.8g/L、7.1g/L、5g/L、7.7g/L和7.9g/L。
对比两批发酵结果来看，优选司班60和司班80两个表面活性剂，对菌株发酵生产1,5-戊二胺有促进作用。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种生产1,5-戊二胺的生物转化法
<160> 62
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaatgtgacg gcgaaaaagc gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggc 55
<210> 2
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctttttcgc cgtcacattc actagtatta tacctaggac tgagctagct gtc 53
<210> 3
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acggcggtga gatagcccgg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggc 55
<210> 4
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgggctatc tcaccgccgt actagtatta tacctaggac tgagctagct gtc 53
<210> 5
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcgagcatct ttttcagcag gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggc 55
<210> 6
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctgctgaaaa agatgctcgc actagtatta tacctaggac tgagctagct gtc 53
<210> 7
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcgatcacca gcttaaagcg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggct 56
<210> 8
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgctttaagc tggtgatcga actagtatta tacctaggac tgagctagct gtca 54
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttaacggcag tttttgtctt tctgaagaac 30
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ataggtcggg atagcgccat tacgcgacc 29
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtaatggcgc tatcccgacc tattacggcg g 31
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gttttgtcga tgagtttcgg gtc 23
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tccaataatt tcacacagcg cagtagc 27
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atattgacca ttgtccaggc agcgcaaagt 30
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgctgcctgg acaatggtca atatcgtaat gccattcg 38
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtacgtttac agggaaaatg ccagc 25
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ttgaacaggt taccttcgag cg 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gccgccgcgg tgactggtaa gc 22
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agtcaccgcg gcggcgctg 19
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tcggaatgca tgctgttgtg tg 22
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
attcctgttt caagcctgaa gaagc 25
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
atgcaaaata cgcgccatct gccg 24
<210> 23
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gcagatggcg cgtattttgc atggccttga taacgagctg c 41
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ctgtttagca agggaagcaa aggg 24
<210> 25
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
aatgtgatgt tgcatcaacg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctag 58
<210> 26
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cgttgatgca acatcacatt actagtatta tacctaggac tgagctagct gtc 53
<210> 27
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tggtgagaaa ggcgatgttg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctag 58
<210> 28
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
caacatcgcc tttctcacca actagtatta tacctaggac tgagctagct gtc 53
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tattcagttt gactggtatc cgacttcg 28
<210> 30
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aggataaaac catttctcct gctgcaggat tttgagc 37
<210> 31
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ctgcagcagg agaaatggtt ttatccttga aggttgcct 39
<210> 32
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ttgccagtat tgaaggtaat gaagagaaca a 31
<210> 33
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ttactattca ggcaatacat attggctaag gag 33
<210> 34
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gggtgttctc ggtttttgaa taaacatgtt tttgacaaaa tgcgcctgcc 50
<210> 35
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
aaaaacatgt ttattcaaaa accgagaaca cccgc 35
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gaatcttcgt gtctacgccc g 21
<210> 37
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tcgctgcctg tagttctgac gcggccgcac tcgag 35
<210> 38
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
tgttgtatgc atgttttttt ctagtatttc tcctctttct ctaaattgtt atccgc 56
<210> 39
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ttgatctcaa taatttgtaa gcggccgcac tcgag 35
<210> 40
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cggatgtttg catcatgcat ctagtatttc tcctctttct ctaaattgtt atccg 55
<210> 41
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tggcgctgga attgctttaa taagcggccg cactcg 36
<210> 42
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ctgaacagtg aatgtggcat catctagtat ttctcctctt tctctaaatt gttatccg 58
<210> 43
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gtatgcgtaa taccggctaa gcggccgcac tcgag 35
<210> 44
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gcggaatatt gttcgttcat ctagtatttc tcctctttct ctaaattgtt atcc 54
<210> 45
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
agaaagagga gaaatactag aaaaaaacat gcatacaaca atcagaacgg 50
<210> 46
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
tggtgctcga gtgcggccgc gtcagaacta caggcagcga gt 42
<210> 47
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
agaaagagga gaaatactag atgcatgatg caaacatccg c 41
<210> 48
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
tggtgctcga gtgcggccgc ttacaaatta ttgagatcaa gtacatctcg catatcaaaa 60
ag 62
<210> 49
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
aagaggagaa atactagatg atgccacatt cactgttcag cac 43
<210> 50
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
tgctcgagtg cggccgctta ttaaagcaat tccagcgcca gt 42
<210> 51
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
agaaagagga gaaatactag atgaacgaac aatattccgc attgc 45
<210> 52
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
tggtgctcga gtgcggccgc ttagccggta ttacgcatac ctgc 44
<210> 53
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gacgctcttc agattcgcgg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggc 55
<210> 54
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
ccgcgaatct gaagagcgtc actagtatta tacctaggac tgagctagct gtc 53
<210> 55
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
atggctatta attcaccact gaatattgct gc 32
<210> 56
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
ggtgccaacg ccaaaaagag ataatccagc agcgatgac 39
<210> 57
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
atctcttttt ggcgttggca ccgtct 26
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
cccatcacat acagcagacg c 21
<210> 59
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
ccgcgtctaa cgcacattaa gcggccgcac tcgag 35
<210> 60
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
atcttcttgg cagaactcat ctagtatttc tcctctttct ctaaattgtt atccg 55
<210> 61
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
agaaagagga gaaatactag atgagttctg ccaagaagat cgg 43
<210> 62
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
tggtgctcga gtgcggccgc ttaatgtgcg ttagacgcgg tgt 43

Claims (8)

1.一种生产1,5-戊二胺的生物转化法，其特征在于，通过改造对大肠杆菌的代谢途径来提高1,5-戊二胺的产率。
2.根据权利要求1所述的生产1,5-戊二胺的生物转化法，其特征在于，所述通过改造大肠杆菌的代谢途径，包括以下步骤：选取大肠杆菌菌株，首先敲除1,5-戊二胺降解路径；其次，增加1,5-戊二胺的合成前体赖氨酸；再次，过表达转运蛋白基因，最后大肠杆菌菌株DFC1002直接发酵生产1,5-戊二胺。
3.根据权利要求1所述的生产1,5-戊二胺的生物转化法，其特征在于，所述大肠杆菌为导入了赖氨酸脱羧酶基因CadA的重组大肠杆菌DFC1001。
4.根据权利要求3所述的生产1,5-戊二胺的生物转化法，其特征在于，将赖氨酸脱羧酶基因CadA插入出发载体pCDFduet的Not III和Bgl II酶切位点之间得到重组载体pCDFduet-CadA，将重组载体pCDFduet-CadA导入宿主菌大肠杆菌（Escherichia coli）中，重组大肠杆菌能够将发酵过程中产生的赖氨酸直接脱羧得到1,5-戊二胺，达到一步发酵生产1,5-戊二胺。
5.根据权利要求4所述的生产1,5-戊二胺的生物转化法，其特征在于，所述赖氨酸脱羧酶基因CadA来自于大肠杆菌（Escherichia coli）MG1655；所述宿主菌大肠杆菌（Escherichia coli）MG1655在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M2013239；所述发酵条件为30-37 ℃、200 rpm-300 rpm发酵12-48 h。
6.根据权利要求1所述的生产1,5-戊二胺的生物转化法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤1，1,5-戊二胺降解路径的敲除，增加1,5-戊二胺的积累
利用CRSIPR/Cas9基因编辑技术对出发菌株的1,5-戊二胺的代谢路径进行编辑，分别敲除了puuA，speE,speG和patA四个降解基因；
步骤2，1,5-戊二胺的合成前体赖氨酸的增加
利用CRSIPR/Cas9基因编辑技术对步骤1中敲除降解基因后菌株的1,5-戊二胺的代谢路径进行编辑，敲除了pepck和pck两个基因，从而分别增加了赖氨酸合成前体草酰乙酸的积累和减少了去往三羧酸循环的碳流量，进而增加磷酸烯醇式丙酮酸到草酰乙酸的碳流量，然后，过表达了基因ppc，促进磷酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸，并过表达了草酰乙酸到赖氨酸合成路径中的基因dapA，dapB和lysA，从而增加赖氨酸的积累；
步骤3，菌株转运蛋白的改造
在步骤2修饰后的菌株的基础上，对菌株的1,5-戊二胺的转运蛋白基因cadB进行过表达，增加1,5-戊二胺的排出，降低1,5-戊二胺对细胞的毒性；由于腐胺和1,5-戊二胺性质相似，对细胞有毒害作用，因此利用CRSIPR/Cas9基因编辑技术敲除了腐胺转入蛋白基因puuP，减轻了细胞内压力；
步骤4，发酵
先对步骤3处理后的菌株进行摇管活化，活化后再接入发酵摇瓶培养基，于37℃，200rpm的条件下发酵24h，按常规操作，收集产物1,5-戊二胺。
7.根据权利要求6所述的生产1,5-戊二胺的生物转化法，其特征在于，所述的CRSIPR/Cas9基因编辑技术，基因敲除所用引物及sgRNA通过在线软件CHOPCHOP（http://chopchop.cbu.uib.no/）进行设计，具体操作如下：
（1）sg-X质粒的构建
构建sg-X质粒（X代表欲敲除的基因名），以pTargetF为模板，以欲敲除基因的sg-X-F/sg-X-R为引物进行PCR扩增，扩增后的产物用限制性核酸酶DpnI于37℃酶切30 min，然后转入E. coli trans1-T1细胞中，平板涂布过夜培养，挑取两株生长良好的菌株克隆存菌，同时提质粒测序，测序引物为WF-sgRNA，测序正确的质粒命名为sg-X；
（2）构建替换片段
构建用于敲除基因替换的同源臂片段，以E. coli BL21(DE3)基因组为模板，以欲敲除基因的X-F1/X-R1为引物扩增得到片段X-F，以X-F2/X-R2为引物扩增得到片段X-R，以X-F，X-R为模板，以X-F1/X-R2为引物通过重叠PCR的方式将两片段融合得到片段X，用于敲除基因替换；
电转感受态的制备
将质粒Pcas转入1,5-戊二胺的生产菌株DFC1001感受态细胞中，挑取单菌落接种于5mL的LB液体培养基中，30℃，200 rpm，培养8 h，以1%的接种量转接到50 mL含的LB液体培养基中培养至OD600约为0.2，加入1.5 mL 1 mM的L-阿拉伯糖溶液，继续培养至OD600为0.4~0.5；随即转入50 mL离心管中冰浴20 min，使其停止生长，4℃，4000 rpm，离心10 min，收集菌体，再用40 mL预冷的无菌水洗涤菌体，离心收集细胞，重复上述步骤；用20 mL预冷的10%甘油洗涤菌体，离心收集细胞，最后用500 μL预冷的10%甘油重悬菌体，将得到的NT1003-cas感受态进行分装备用；
电转感受态的制备
将质粒Pcas转入1,5-戊二胺的生产菌株DFC1001感受态细胞中，挑取单菌落接种于5mL的LB液体培养基中，30℃，200 rpm，培养8 h；以1%的接种量转接到50 mL含的LB液体培养基中培养至OD600约为0.2，加入1.5 mL 1 mM的L-阿拉伯糖溶液，继续培养至OD600为0.4~0.5；随即转入50 mL离心管中冰浴20 min，使其停止生长；
4℃，4000 rpm，离心10 min，收集菌体；再用40 mL预冷的无菌水洗涤菌体，离心收集细胞；重复上述步骤；用20 mL预冷的10%甘油洗涤菌体，离心收集细胞；最后用500 μL预冷的10%甘油重悬菌体，将得到的NT1003-cas感受态进行分装备用；
基因敲除
将质粒sg-X和X片段通过电转方式转入DFC1001-cas感受态细胞中，30℃，200 rpm，培养2 h，将涂布于含40 μg·mL-1链霉素抗性和50 μg·mL-1卡那霉素抗性的LB平板中30°C过夜培养；通过菌落PCR的方式筛选平板中的菌落，PCR引物为X-F1/X-R2；挑选其中3个阳性克隆菌株测序，测序正确的菌株，保存于-80℃冰箱备用。
8.根据权利要求6所述的生产1,5-戊二胺的生物转化法，其特征在于，所述过表达的方法为通过同源重组的方式构建重组质粒再转化到菌株中表达，具体操作如下：根据同源重组酶ClonExpressⅡ试剂盒步骤进行同源重组反应，反应体系如表1所示，将该体系置于37℃反应30min后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min后，取20μl反应液，加入到200μl感受态细胞中进行转化，轻弹管壁混匀，在冰上放置30min，42℃热激45秒，冰水浴2min，加入900μlLB培养基，37℃摇菌45~60min，取100μl菌液均匀涂布在含有链霉素的平板上，将平板倒置，于37℃过夜培养
表1 ClonExpressⅡ体系
。
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