CN102264905A - 用于多肽重组表达的基于t7双启动子的载体系统 - Google Patents
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Abstract
用于宽泛宿主范围的可诱导表达目的多肽的双载体系统,其包括:i)第一载体,其包括:(a)位于可诱导的启动子的5’的T7启动子;(b)位于可诱导的启动子的3’的克隆位点,其用于插入编码所述目的多肽的基因;和ii)使得宿主细胞能够进行T7RNA聚合酶表达的第二载体,其中所述载体包括处于可诱导的启动子控制之下的编码该T7RNA聚合酶的基因。
Description
利用多种表达系统,可以在原核宿主系统中重组表达目的多肽。
在大肠杆菌(E.coli)中广泛使用T7-表达系统。克隆靶基因,使其处于T7启动子的控制之下,该T7启动子由T7RNA聚合酶识别而不由大肠杆菌RNA聚合酶识别。T7RNA聚合酶是一种噬菌体-来源的聚合酶,其不内源存在于大肠杆菌中。然而,已经开发了表达T7RNA聚合酶的大肠杆菌宿主细胞。一个实例是包含携带编码T7RNA聚合酶的基因的λ噬菌体的大肠杆菌1。在另一种系统中,T7RNA聚合酶基因被插入到宿主大肠杆菌染色体(例如,大肠杆菌菌株BL212)中。
通常使用处于可诱导的启动子的控制下的pET表达系统。由lac操纵子调控的T7启动子是目前最广泛使用的可诱导的蛋白表达系统。在该系统中,T7启动子和lac操纵子位于要表达的多肽的5’。lac抑制剂与lac操纵子的结合防止由T7启动子转录。在存在乳糖类似物IPTG时,IPTG结合lac抑制剂并且使其从lac操纵子上脱离。因此,在存在IPTG的条件下,T7RNA聚合酶可以结合T7启动子并且可以继续转录目的基因。
不幸的是,lac/IPTG调控的系统仅能够在某些大肠杆菌菌株(例如,在BL21中)使用。除大肠杆菌外多种原核细胞是适于重组多肽表达的宿主,例如,发光光杆状菌(Photorhabdus luminescens),铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorencens),猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis),胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora),根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomalleri)。具有也可以用在其它宿主细胞诸如这些中的用于重组多肽表达的高度调控性系统将是有效的。
当多肽对细胞是毒性的时,不管是由于其先天的特性还是由于其以大量存在的事实,在特定的原核宿主中生产某些多肽可能导致宿主死亡。
对原核宿主细胞有毒性的多肽的实例是抗微生物肽(“AMP(s)”)。由于其用作治疗性抗生素的潜在用途,对抗微生物肽的兴趣日益增多。常规抗生素已经成功地应用了大于一个世纪,并且广泛地用于在人、动物和植物中的多种应用。尽管抗生素抗性是日益增加的问题,但是已经存在新抗生素开发的令人担忧的下降。34因此,禁止先前的抗生素的没有限制的和非必要的应用,诸如其用作家畜的食品添加剂。另外,在农业中常用的多种抗生素对人类消费具有副作用。为了克服常规抗生素的问题,需要新一代的抗生素。
先天免疫性是几乎所有活生物体的主要防御5,并且是针对微生物的快速且多功能性的防御。678大部分先天免疫性的抗微生物功能由小的阳离子肽介导,其具有针对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌、真菌、寄生虫、病毒,且在某些情形中,甚至针对哺乳动物细胞的有效活性。91011这些天然产物AMPs是常规抗生素的潜在后继者,因为其抗微生物机制基本上不同。12通过AMPs快速杀死微生物病原体的主要机制归因于微生物细胞膜的穿孔。1314因此,生物很难建立抗性。
最有希望用于哺乳动物的AMPs是具有针对微生物而非哺乳动物细胞的强活性的那些AMPs。因此,动物来源的AMPs将是替代常规抗生素的良好候选物。来源于牛奶中的牛乳铁蛋白(lactoferrin)的乳铁蛋白素B(Lactoferricin B)(LfcinB)151617和来源于猪肠的天蚕素P1(cecropin P1)1819是这些AMPs中的两种,并且它们可以作为用于动物治疗的备用抗生素。天然AMPs具有宽泛的针对微生物的活性,但是有一些,诸如LfcinB,需要高浓度才能有效。
AMPs的大规模应用是受限的,因为其制备可能是复杂的、费时的和成本高的。目前,通过化学合成生成AMPs成本太高以致它们不能用作用于动物(例如有蹄动物、猪、鱼或人)治疗的备用抗生素。因此,在它们可以替代大规模的抗生素应用之前,需要工业规模的成本有效的AMP生产方法。
因为AMPs可以穿透细菌膜并且引起细胞裂解,所以难以直接在细菌细胞中生产它们。因此,尚没有实现便利的且成本有效的细菌生产。
因此,本发明的一个目的是提供一种用于多肽重组表达的系统,该系统可以在宽泛的宿主范围中使用。
在lac/IPTG调控的系统中的诱导依赖IPTG,IPTG对于工业应用是昂贵的。本发明还有一个目的是提供一种较目前使用IPTG的系统廉价的用于多肽重组表达的系统。
本发明还有一个目的是提供一种高度可调控的用于重组表达的系统。
本发明还有一个目的是提供一种改进的AMP生产方法,该方法是成本有效的且规模可至工业水平。
因此,本发明提供一种用于宽泛宿主范围可诱导表达目的多肽的双载体系统,其包括:
i).第一载体,其包括:
(a)位于可诱导的启动子的5’的T7启动子;和
(b)位于可诱导的启动子的3’的克隆位点,其用于插入编码所述
目的多肽的基因;和
ii).使得宿主细胞能够进行T7RNA聚合酶表达的第二载体,其中所述载体包括处于可诱导的启动子控制之下的编码该T7RNA聚合酶的基因。
在一些实施方案中,目的多肽是对原核宿主有毒性的多肽,例如,是人杀菌渗透性增加的蛋白(BPI)29或AMP。在另一个实施方案中,目的多肽是难以以非常高的水平表达的蛋白,例如,使用本领域已知的标准重组表达法,其在原核宿主中很难以非常高的水平表达。在优选的实施方案中,目的多肽是AMP。在一些实施方案中,AMP是GB-LfcinB或GB-天蚕素P1。
在该系统中,除了处于T7启动子的控制下,目的多肽还处于其它的可诱导的启动子的控制下。这减少了多肽表达的可能的毒性作用,特别是当目的多肽是对原核宿主有毒性的蛋白时。因此,编码该目的多肽的DNA由两种RNA聚合酶转录:T7RNA聚合酶和内源性宿主RNA聚合酶。这是我们所知的使用两种独立的RNA聚合酶转录基因的第一个系统。
所述可诱导的启动子优选地具有活性状态和无活性状态,在活性状态下,RNA聚合酶可以结合该启动子并且由该启动子转录,并且在无活性状态下,相同的RNA聚合酶不能由该启动子转录。在一些实施方案中,可诱导的启动子被阻抑物结合,此时启动子处于其无活性状态。接着,从启动子上去除阻抑物使得可诱导的启动子转为其活性状态。去除阻抑物可以通过用诱导物结合该阻抑物的方式进行。阻抑物可以是宿主细胞中内源表达的。备选地,宿主细胞可以转化编码该阻抑物的基因。在优选的实施方案中,编码可诱导的启动子的阻抑物的基因存在于本发明的第一载体和/或第二载体上。
可诱导的启动子优选是在宽泛宿主范围内起作用的启动子。四环素可诱导的启动子,诸如Ptet20是特别优选的。使用四环素替代IPTG作为诱导物,能够使得该系统用在宽泛的宿主范围中,并且因为四环素比IPTG廉价,还导致较廉价的系统。实际上,目前,四环素或其衍生物(例如,四环素酐(anhydride-tetracycline)和多西环素(doxycycline))比IPTG便宜100多倍。另外,诱导所用的四环素的量比诱导所用的IPTG的量少100多倍。因此,四环素的总成本比IPTG少至少104倍。在其它实施方案中,可以使用任何其它合适的可诱导的启动子,例如,多西环素-调控的T7启动子或可糖诱导的启动子如lac操纵子,BAD启动子(可阿拉伯糖(arabinose)诱导的)或可鼠李糖(Rhamnose)诱导的启动子。然而,使用可糖诱导的启动子引起两个问题:1)它们不像四环素诱导的启动子那样在宽范围的细菌宿主菌株中起作用,和2)诱导物比四环素更昂贵。
专业人员能够确定对特定的宿主细胞所用的诱导物的量,如四环素或其衍生物的量。优选地,所述宿主细胞是原核细胞。当以高剂量使用,诸如3μg/ml细菌培养物使用时,四环素或其衍生物对一些原核细胞有毒性。不同的原核菌株对四环素及其衍生物具有不同的抗性特性。通过检测四环素及其衍生物,专业人员可以发现最适合用于特定原核菌株诱导的一种。因此,本发明以低于对宿主细胞有毒性所需要的最低剂量的剂量使用四环素或其衍生物。四环素或其衍生物的优选的量为0.5-1μg/ml细菌培养物。
克隆位点位于可诱导的启动子的3’,用于插入编码目的多肽的基因。可以通过任何合适的方法将编码目的多肽的基因插入到克隆位点中。在一些实施方案中,克隆位点包括用于克隆编码目的多肽的基因的两个限制性位点。这两个限制性位点可以是任何适当的限制性位点。优选使用在5’末端的保持核糖体结合位点距离的限制性位点,和在目的基因的ATG前的AT二核苷酸。因此,EcoRV是用在5’末端的特别优选的限制性位点。对于在大肠杆菌中的肽表达,在ATG前存在AT二核苷酸是特别优选的。可以用在3’末端的合适的限制性位点的实例是PvuII。
在其它实施方案中,克隆位点包括可以用于使载体线性化的限制性位点。然后,利用同源重组,例如,利用重组工程(recombineering)技术,可以将携带编码目的多肽的基因和基因两侧的与载体同源的序列的线性DNA片段与已被线性化的载体组合,从而形成载体。在一些实施方案中,克隆位点包括与携带编码目的多肽的基因的线性DNA片段同源的两个区域,并且将该线性DNA片段通过同源重组插入到载体中,例如,利用重组工程技术。重组工程技术在本领域中是已知的,例如,参见,WO99/29837,WO 01/04288,WO 02/062988和Wang J等.2006,Mol Biotechnol.(分子生物技术)32(1):43-53;Muyrers,J.P.P.等.2001,Trends inBiochemical Sciences(生物化学科学趋势),26,325-31.)。在克隆位点包括一个或多个限制性位点的实施方案中,所述一个或多个限制性位点优选不在载体的其它地方存在。
在优选实施方案中,第一载体在克隆位点包含目的多肽。例如,在一些实施方案中,第一载体在两个限制性位点之间包含目的多肽。
在一些实施方案中,第一载体有利地包含位于克隆位点的3’的终止子序列。在克隆位点的3’存在终止子序列确保,当从T7启动子发生转录时,其在终止子序列处终止,并且不超过该序列运行。因此,由于不存在无终止的转录,与不存在终止子序列时相比,终止子序列的存在导致蛋白表达效率的增加。在一些实施方案中,终止子是T7终止子。T7终止子的序列显示在图2中。
优选地,第一载体包含盒(还已知为构建体):T7启动子-可诱导的启动子-克隆位点-终止子。更优选地,第一载体包含盒:T7启动子-Ptet-EcoRV-[3’限制性位点]-T7终止子。甚至更优选地,这些载体包含在克隆位点插入的编码目的多肽的基因。这些载体还优选地包含编码针对可诱导的启动子的阻抑物的基因,所述阻抑物诸如tetR阻抑物。优选地,第一载体包含图2或图3所示的序列。更优选地,第一载体是图2或图3所示的质粒。
第二载体用来确保宿主细胞能够进行T7RNA聚合酶表达。优选地,编码T7RNA聚合酶的基因包括GenBank No.M38308提供的序列或由其组成,更优选地如图7所示,或者编码具有M38308所提供的序列的T7RNA聚合酶,更优选地如图8所示。在一些实施方案中,编码T7RNA聚合酶的基因是M38308或图7所示的序列的变体,例如,其与M38308或图7所示的序列有至少70%,至少80%,至少90%,至少95%,至少98%,至少99%的同一性,并且编码功能性T7 RNA聚合酶。蛋白之间的同一性优选地通过在MPSRCH程序(Oxford Molecular)中实施的史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜索算法确定,用下列参数:缺口开放罚分=12和缺口延伸罚分=1,用仿射缺口(affine gap)搜索进行。在一些实施方案中,编码T7RNA聚合酶的基因编码M38308或图8的T7RNA聚合酶的片段或变体。例如,编码T7 RNA聚合酶的基因可以是M38308或图7所示的序列的片段或其变体,其中所述片段编码功能性T7 RNA聚合酶。例如,所述片段至少2100个核苷酸长,至少2400个核苷酸长,至少2700个核苷酸长,至少2772个核苷酸长,至少2800个核苷酸长,至少2812个核苷酸长,或至少2818个核苷酸长。
编码T7 RNA聚合酶的基因处于可诱导的启动子的控制下。这确保仅在所述可诱导的启动子处于其活性状态时,编码T7 RNA聚合酶的基因转录并且随后表达,并且与组成型表达T7 RNA聚合酶的系统相比,有利地产生另外的调控水平。
在一些实施方案中,在第二载体上的可诱导的启动子与在第一载体上存在的可诱导的启动子相同。在其它实施方案中,第二载体上的可诱导的启动子与在第一载体上存在的可诱导的启动子不同。使编码T7 RNA聚合酶的基因和编码目的多肽的基因处于相同可诱导的启动子的控制下有利地确保目的多肽的表达由该可诱导的启动子的特定状态高度调控。在两种载体中使用相同的可诱导的启动子还在所述可诱导的启动子处于活性状态时导致目的多肽的迅速转录和随后的表达。优选地,在两种载体中的可诱导的启动子的诱导物是四环素或其衍生物。
在第一和第二载体上存在的盒可以通过任何适当的方法保留在宿主细胞中。例如,每种载体可以包含在宿主细胞中有功能的复制起点,或者所述盒可以通过整合到宿主染色体中或整合到内源性移动载体中而保留在宿主细胞中。第一载体包含T7启动子-可诱导的启动子-克隆位点的盒的部分可以通过与第二载体包含编码受控于可诱导的启动子的T7 RNA聚合酶的基因的部分不同的机制保留在宿主中。
在第一载体中的复制起点可以与第二载体中的复制起点相同或不同。复制起点可以是任何合适的起点,诸如质粒起点或噬菌体起点。在一些实施方案中,所述复制起点在宿主细胞中是有功能的。例如,在一些实施方案中,第一载体包含在宿主细胞中有功能的复制起点,如colE1 ori。在一些实施方案中,第二载体包含在宿主细胞中有功能的复制起点,因此,载体保留在宿主细胞中,并且由该载体表达T7 RNA聚合酶。
然而,在优选实施方案中,第二载体中的复制起点在能够进行T7RNA聚合酶表达的宿主细胞中是无功能的。这确保第二载体不在宿主细胞中复制,所述载体预定使得所述宿主细胞能够进行T7 RNA聚合酶表达,以致保持包含编码T7 RNA聚合酶的基因的区域存在于两个反向重复区(“IR(s)”)之间需要将该区域整合在宿主染色体中。可以使用在宿主细胞中无功能的任何适当的复制起点。然而,优选地,该起点在其它细胞中是有功能的,以致在用于本发明之前,可以制备所述载体和/或可以复制并且保存所述载体。在一些实施方案中,第二载体中的复制起点是R6K复制起点。R6K复制起点需要pir蛋白21进行复制,并且可以构建第二载体,并在用于本发明的宿主细胞之前保存在表达pir蛋白的另一种细胞中。然而,具有ori R6K作为唯一的复制起点的载体不在不表达pir蛋白的细胞中复制。在第二载体中可以使用任何其它适当的复制起点,例如,RK2。22
在一些实施方案中,第二载体中的复制起点是位于在反向重复之间的包含编码T7RNA聚合酶的基因的区域中。有时,确定盒整合在宿主染色体中的位置是合乎需要的。进行此的简单方式是制备基因组DNA,用一种限制性酶消化,然后连接并转化到pir菌株中以拯救包含R6K ori的载体。现在,该载体将包含其所整合的部分基因组DNA。通过测序接头(junction),人们可以找到在染色体中的整合位置。因此,复制起点存在于反向重复之间是有利的,因为这使得更加容易地通过质粒拯救检测插入位置。
编码T7 RNA聚合酶的基因优选地位于转座酶识别的两个反向重复区之间,以使在该两个反向重复之间的序列通过转座酶整合到染色体中。可以使用被转座酶识别的任何适当的反向重复区。由MycoMar转座酶识别的适当的反向重复区的实例为5’ACAGGTTGGCTGATAAGTCCCCGGTCT...AGACCGGGGACTTATCAGCCAACCTGT 3’。
优选地,转座酶的表达是瞬时的,以致一旦反向重复盒区已经整合到宿主染色体中,转座酶便不再表达。在一些实施方案中,转座酶由第二或第一载体编码。在优选的实施方案中,编码转座酶的基因存在于第二载体中,但是不存在于在两个反向重复之间的包含编码T7 RNA聚合酶的基因的区域中。这确保编码转座酶的基因不整合到宿主细胞染色体中。可以使用任何适当的转座酶。在一些实施方案中,所述转座酶是MycoMar转座酶23。
在一些实施方案中,第一和/或第二载体有利地包含选择基因。两种载体优选地都包含选择基因。在第一载体上的选择基因优选地不同于第二载体上的选择基因。在第二载体中的选择基因优选地位于两个反向重复之间,在存在的情形中,位于包含编码T7 RNA聚合酶的基因的区域中,以便可以选择已将该区域整合到其染色体中的宿主细胞。可以使用任何适当的选择基因,例如,抗生素抗性基因诸如庆大霉素(gentamycin)抗性、新霉素(neomycin)抗性、氨苄青霉素(ampicillin)抗性或潮霉素(hygromycin)抗性的基因,或宿主互补基因。选择基因优选是可去除的,特别在盒整合到宿主染色体中的情形中。例如,选择基因可以侧连用于切除该选择基因的位点。在一些实施方案中,可以用来切除选择基因的位点为loxP位点,例如,突变的loxP位点(loxP*),优选lox66和71。24在选择基因侧连loxP位点的实施方案中,在整合后可以利用Cre重组来去除选择基因。24因此,在优选的实施方案中,第二载体包括侧连突变的loxP位点的选择基因的去除,并且其中选择基因位于在反向重复之间的包含编码T7RNA聚合酶的基因的区域中。
在一些实施方案中,第二载体包含盒:IR-[复制起点]-loxP*-[选择基因]-loxP*-tetR-Ptet-T7RNApol-IR。该载体优选地还包含编码转座酶的基因,其中所述转座酶不存在于在两个反向重复之间的包含编码T7RNA聚合酶的基因的区域中。在优选的实施方案中,第二载体包含盒:IR-oriR6K-loxP*-genta-loxP*-tetR-Ptet-T7RNApol-IR。优选地,第二载体是图1所示的质粒。
在一些实施方案中,T7启动子紧接着可诱导的启动子的5′,从而在它们之间没有间插序列。两个限制性位点这样放置,以使编码目的多肽的基因的转录可以从T7启动子和从pTet发生。在一些实施方案中,克隆位点(例如,这两个限制性位点)紧接着可诱导的启动子的3’,从而在它们之间没有间插序列。此外,在一些实施方案中,T7终止子序列紧接着克隆位点的3’,从而在它们之间没有间插序列。在备选实施方案中,间插序列存在于T7启动子和可诱导的启动子之间和/或存在于克隆位点和可诱导的启动子之间和/或存在于T7终止子序列和克隆位点之间。在存在间插序列的实施方案中,优选地所述间插序列长度小于400bp,长度小于250bp,长度小于100bp,长度小于50bp,长度小于20bp,长度小于5bp或长度小于3bp。T7启动子和T7终止子的序列显示在图2,3A和3B中和在它们的描述中。
用于本发明的载体可以是可以用来转化宿主细胞、优选转化原核宿主细胞的任何适当的载体。在一些实施方案中,第一和/或第二载体是质粒载体。在一些实施方案中,第一和/或第二载体是噬菌体载体。在一些实施方案中,第一载体是质粒载体且第二载体是噬菌体载体。在一些实施方案中,第一载体是噬菌体载体且第二载体是质粒载体。
目的多肽可以是融合蛋白的一部分。特别优选的目的蛋白是目的多肽与内含体蛋白或与形成晶体的内含体蛋白的融合体。形成晶体的内含体蛋白以规则的结构形式聚集。
目的多肽结合到内含体中允许表达该目的多肽,同时掩蔽所述多肽对宿主细胞的任何潜在的毒性作用。例如,如果目的多肽具有抗生素活性,则与内含体蛋白融合掩蔽所述抗生素活性。如果目的多肽对宿主细胞有毒性,例如,如果其是AMP,这是特别有利的。当毒性活性被掩蔽时,本发明提供的系统允许获得非常高水平的目的多肽的表达。因此,本发明的系统可以用来以工业规模制备AMPs。
适合用于本发明的内含体蛋白的实例是来自发光光杆状菌、嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophilus)和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的晶体蛋白。25
形成晶体的内含体蛋白是特别优选的内含体蛋白融合配偶体。可以使用任何适当的形成晶体的内含体蛋白。可获自光杆状菌属或致病杆菌属(Xenorhabdus)的这些是良好的实例,因为它们以非常高的水平表达。另外,它们天然聚集形成不溶解的粒子,并且通过收集它们的内含体非常容易纯化。在优选的实施方案中,所述形成晶体的内含体蛋白是光杆状菌属CipB。26该100个氨基酸的小蛋白可以在细胞中累积至多至总蛋白的40%。27本发明人已经发现,使用本发明的双载体系统,当多肽与CipB融合时,获得非常高水平的目的多肽表达。在一些使用CipB的实施方案中,多至70%的总蛋白包括该多肽。在其它实施方案中,可以使用任何其它适当的形成晶体的内含体,诸如光杆状菌属CipA27或嗜线虫致病杆菌PixA28。也可以使用内含体蛋白的片段和变体,其中所述片段或变体保留全长或天然序列蛋白的功能,只要到其形成内含体的程度。
内含体蛋白优选地融合在目的多肽的5’。在优选实施方案中,内含体蛋白通过可裂解的接头与目的多肽融合,所述可裂解的接头允许从该内含体蛋白快速而简单的释放目的多肽。在优选实施方案中,所述可裂解的接头是在内含体蛋白和目的多肽的N端之间的Asp-Pro二肽接头。所述Asp-Pro二肽接头可以使用HCl裂解29。在其它实施方案中,可以使用任何其它适当的可裂解的接头。
因此,在目的多肽具有毒性活性的实施方案中,例如,在目的多肽对宿主细胞有毒性的情形中(例如,在其为AMP的情形中),目的多肽结合到内含体中允许没有毒性活性的非常高水平的表达,并且还允许快速简单的纯化。
因此,第一载体优选地包含盒:5’-T7启动子-可诱导的启动子-融合在编码目的多肽的基因5’的编码内含体蛋白的基因-终止子-3’。
本发明的系统的应用还有利地允许在工业上便利的原核宿主中表达AMPs,而不干扰宿主的生长。
因此,本发明提供编码融合蛋白的多核苷酸,该融合蛋白包含与目的多肽融合的形成晶体的内含体蛋白。
已经发现,在本发明的系统中,与较长的多肽相比,短的多肽可以以更高的产量表达。因此,在优选实施方案中,目的多肽长度小于500个氨基酸,例如,长度小于200个氨基酸,小于150个氨基酸,小于100个氨基酸,小于80个氨基酸,小于60个氨基酸,小于50个氨基酸,小于30个氨基酸或长度小于20个氨基酸。
优选地,目的多肽是AMP。可以使用的AMPs的实例是乳铁蛋白素B或天蚕素P1。本发明提供与天然AMP序列相比在其5’末端具有另外的脯氨酸的AMPs。脯氨酸的存在是融合蛋白中的Asp-Pro二肽接头的裂解的人为产物。本发明人已经发现,令人惊讶地,该5’脯氨酸的存在不影响AMP的抗生素活性。
可以用在本发明中并且由本发明提供的目的多肽的一个具体实例是乳铁蛋白的GB-LfcinB 衍生物,其具有序列:PAWFKCWRWQWRWKKLGA。
本发明还提供与上述形成晶体的内含体蛋白融合的目的多肽。
还提供的是如上述的第一载体或第二载体。
本发明还提供用于表达目的多肽的方法,所述方法包括:
(i).用本发明的第一载体转化宿主细胞,其中所述宿主细胞包含处于可诱导的启动子控制下的T7RNA聚合酶;和
(ii).为所述宿主细胞提供所述可诱导的启动子的诱导物。
优选地,所述T7 RNA聚合酶处于与第一载体中存在的可诱导的启动子相同的可诱导的启动子的控制下。
宿主细胞可以已经包含T7 RNA聚合酶。备选地,可以必要地为所述细胞提供T7 RNA聚合酶,并且因此,用于表达目的多肽的方法可以包括:
(i).用本发明所述的第一载体和本发明所述的第二载体转化宿主细胞,和
(ii).为所述宿主细胞提供所述可诱导的启动子的诱导物。
所述第一和第二载体可以同时或以任何顺序转化到宿主细胞中。例如,第一载体可以在第二载体之前转化到宿主中。备选地,第二载体可以在第一载体之前转化到宿主中。
在转化宿主细胞之后,宿主细胞优选地生长至适宜的细胞密度,然后加入可诱导的启动子的诱导物。适宜的细胞密度是这样的密度,即在该密度下,存在足够的细胞,从而以所需要的水平表达目的多肽。在一些实施方案中,适宜的细胞密度在OD600~0.4至OD600~2.0之间,例如,OD600~0.7。细胞优选地生长至终浓度0.1mg/ml-1.5mg/ml,更优选地约0.5mg/ml,然后加入诱导物(优选四环素)。然后,在用第一(并且,在一些实施方案中,第二)载体转化后允许生产目的多肽的适当时间后,例如,12-20小时,更优选约16小时后,可以收获细胞。
在目的多肽融合到内含体蛋白上的实施方案中,内含体蛋白的存在使得在蛋白表达后目的多肽结合到内含体中。因此,为了纯化目的多肽,所述方法可以另外包括下述步骤:纯化包含融合蛋白的内含体并且裂解在内含体蛋白和目的多肽之间的可裂解的接头,从而释放目的多肽。例如,在可裂解的接头是Asp-Pro二肽接头的实施方案中,所述方法可以包括向宿主细胞中加入HCl,以裂解所述接头。裂解步骤优选地在收获细胞后进行。以适当的浓度加入HCl到细胞中,以裂解接头。有利地,加入HCl还起裂解细胞的作用,这在一个单一的步骤中导致目的多肽从内含体蛋白上裂解下来并且目的多肽从宿主细胞的释放。在一些实施方案中,使用0.05-0.2N HCl裂解细胞。优选使用0.1N HCl。使用HCl的温育期间取决于所用的HCl的浓度而不同。要用的温育时间将是专业人员所清楚的。优选地,将细胞用HCl(优选地用0.1N HCl)在较高温度下温育足以裂解接头并且裂解细胞的时间阶段。在一些实施方案中,将细胞用HCl在70℃-95℃的温度下温育约30分钟至4小时。优选在约85℃约2小时的温育时间。
所述方法还可以进一步包括层析步骤,以在其从宿主细胞释放后进一步纯化目的多肽。
所述宿主细胞可以是原核的或真核的。优选地,所述宿主细胞是原核的。在第二载体中的复制起点是R6K的实施方案中,所述宿主细胞优选不表达pir蛋白。在一些实施方案中,所述宿主细胞选自大肠杆菌K12,大肠杆菌Nissle 1917,光杆状菌属,假单胞菌属(Pseudomonas),土壤杆菌属(Agrobacterium),粘球菌属(Myxococcus)和伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)。例如,所述细胞可以是发光光杆状菌(Photorhabdusluminescens),铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorencens),根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderiapseudomalleri)。在一些实施方案中,所述宿主细胞是猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)或胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)。在其它实施方案中,所述宿主细胞是酿酒酵母(S.cerevisiae)。
本发明还提供一种试剂盒,其包括本发明所述的第一载体和本发明所述的第二载体。
如上文提及,目的多肽优选是对原核宿主有毒性的多肽,诸如AMP。本发明的系统有利地允许AMPs以大量生产,以致其可以用于工业应用。最近,欧盟(European Union)已经禁止用常规抗生素治疗动物。因此,由于细菌感染引起的动物损失再一次成为农民的主要问题。对于小猪培育存在特定的问题。在用母乳喂养一个月后,小猪与其母亲分离,并且与其它小猪一起开始正常饮食。此时,小猪面临一些压力:没有母亲,没有母乳,新的伙伴和新的食物。一些小猪在这些压力下生病,体重减轻,并且在最初的10天之内死亡。小猪的主要问题是由微生物感染引起的腹泻。这段时期是最危险的时期,并且治疗小猪的常规方法是给予抗生素数天。对于为小猪寻找抗生素的替代品存在紧急需求,因为EU即将不允许农民使用常规抗生素。
同样地,由传染病引起的鱼类损失也是全世界水产业的重要问题。抗微生物肽保护鱼类抵抗由鱼类病原体引起的感染的能力正在研究中,并且早期结果揭示AMPs保护鱼类抵抗感染的潜力。30但是,在这些肽可以用于鱼类养殖之前,这些肽的制备成本必须减少。
这些应用,以及其它的应用,需要成本有效的、工业规模的、生产方案。本发明的方法首次允许AMPs的大规模生产,这使得AMPs能够大规模用在农业和水产业中,这在本发明之前是不可能的。因此,本发明提供用于治疗或预防动物中的细菌感染的方法,所述方法包括使用由本发明的系统生产的AMP。在一些实施方案中,所述动物是人类或其他哺乳动物,诸如动物幼崽,例如小猪或小牛,特别是已经离开母亲的那些动物幼崽。
具体地,本发明提供用于治疗或预防小猪中的细菌感染的方法,所述方法包括施用GB-LfcinB或GB-天蚕素P1。优选地,小猪是在过去10天内,更优选在过去5天内,更优选在过去1或2天内,离开其母亲的那些小猪,或例如是将在未来1-10天内离开其母亲的那些小猪。所述细菌感染优选是大肠杆菌感染。使用AMP优选地预防小猪的腹泻和/或导致小猪体重增重。优选地,将1mg GB-LfcinB或GB-天蚕素P1以单一剂量施用给小猪。备选地,可以以单一剂量施用0.5-2mg或2-3mg。在一些实施方案中,2mg或多于2mg以单一剂量给予,例如,3-5mg,5-8mg或8-10mg以单一剂量给予。在一些实施方案中,仅给予单一剂量。在其它实施方案中,每只小猪给予多次剂量,例如,以连续每天给予或每隔一天给予。
在其它实施方案中,所述动物是鱼类。在优选的实施方案中,提供用于治疗或预防鱼类中细菌感染的方法,所述方法包括向所述鱼类游动的水中添加通过本发明的方法产生的AMPs。在一些实施方案中,治疗或预防鱼类中的细菌感染包括向所述鱼类游动的水中添加至少0.1mg,至少0.5mg,至少1mg,至少2mg,至少5mg,至少500mg,至少1g,至少5g,至少10g,至少50g,至少100g,至少300g,至少500g,至少750g,至少1kg,至少2kg的量的AMPs。优选地,向水中添加AMP获得至少0.001mgAMP/升,至少0.01mg/升,至少0.1mg/升,至少1mg/升,至少10mg/升,至少100mg/升,至少500mg/升,或至少1g/升的浓度。在鱼类存在的水是湖泊、池塘、河流、海洋、大洋、或其它巨大的水体的一部分的实施方案中,制备大量的AMPs的能力是特别有利的。然而,所述方法还适用于治疗或预防在其它水体如在盆或桶中存在的鱼类中的细菌感染。专业人员能够根据存在的水的体积,AMP在该体积的水中分散的潜能,特定的AMP的功效和存在的鱼类的数目,来确定加入多少AMP。
AMPs还具有作为食品防腐剂的潜能,并且因此,本发明提供由本发明方法生产的AMP用作食品防腐剂的应用。优选地,将AMP加入到食品中,以获得至少0.0001mg AMP/cm3食品,至少0.001mg AMP/cm3食品,至少0.01mg AMP/cm3食品,至少0.1mg AMP/cm3食品,至少1mgAMP/cm3食品,或至少5mg AMP/cm3食品的浓度。
本发明还提供本发明的AMPs在这些方法的任一种中的应用。
现在,将参考下述附图,通过实施例,进一步描述本发明,在所述附图中:
图1:通用的T7 RNA聚合酶表达系统;
图2:宽泛宿主范围的可诱导表达的载体;显示了T7启动子的序列(TAATACGACTCACTATA),Ptet启动子序列(GTTGACACTCTATCATTGATAGAGTTATTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAA)和T7终止子序列(CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTG)。为清楚起见,在图2中所示的注解的序列又用纯文本形式显示;
图3A和3B.作为在微生物中进行AMP表达的实例的GB-天蚕素P1。与AMP(此处GB-天蚕素P1:TCTTGGCTGTCCAAAACCGCGAAAAAACTGGAAAACTCTGCGAAAAAACGTATCTCCGAAGGTATCGCGATCGCGATCCAGGGTGGTCCGCGT)融合的CipB基因:
(ATGATAATTAAGAAAGATATTTTGTTAAATGAAGAGCTGATTGTCGATGATGATCTTAAAGTGGGTAAAGTAGAGAAGGTCAATATTGATATTCTGTCACCCAGCTCAGTCATTGTTAGTCTGAATATTTTAGGCGTAGTTGATGATTTTCATCTATTACTAGTTGATGATAAAGATAAAGATAAGATTGTGCTGCTCTATCTTTCTCTTTTACGTGTTCTTCATGAAAAATTAGATGTAAAAGTAAAAGTCGCAAAAAGTAAACTTACTAAGATAAAATATATAGTAGGTGTTGAAATT)处在四环素调控的T7+Ptet启动子的控制下。两个氨基酸,D-P(粗体,GACCCG),位于在CipB和AMP之间的编码序列中。为清楚起见,在图3A中所示的注解的序列又在图3B中以纯文本形式显示;
图4:在染色体中具有oriR6K-loxP*-genta-loxP*-tetR-Ptet-T7RNApol盒的大肠杆菌中表达AMPs;
图5:由配偶体CipB释放AMPs;
图6:在用大肠杆菌攻击后小猪的体重。将未进行任何处理的宰杀的小猪的体重作为基线(0)。标记1-5(即1-5“天”)意指在第33天(在攻击和AMPs后5天)测量的体重,标记6-11意指在第39天(在攻击和AMPs后11天)测量的体重。标记1-11表示增加的平均体重;
图7:T7RNA聚合酶核苷酸序列(编码序列和核糖体结合位点);和
图8:T7 RNA聚合酶氨基酸序列。
实施例1:构建通用T7 RNA聚合酶表达系统
第一载体由四环素调控的启动子表达T7聚合酶。该载体是基于R6K起点的质粒,并且仅可以在存在pir蛋白的条件下复制。当将其转化到不存在pir的任何宿主中时,由于作用在反向重复(IRs)上的TPase(MycoMar转座酶(MycoMar Transposase))介导的转座作用,IR-oriR6K-loxP*-genta-loxP*-tetR-Ptet-T7RNApol-IR盒将整合到染色体中。23具体地,T7 RNA聚合酶由四环素可诱导的启动子Ptet驱动。利用IR(反向重复)-IR盒通过由编码的转座酶(Tpase,其未被整合)介导的转座作用进行染色体整合。在IRs之间,除了T7基因,还存在下述特征:ori R6K,其需要pir蛋白进行复制;庆大霉素抗性基因,其用于进行整合选择并且侧连突变的loxP*位点(lox66和71),该位点可以用于切下庆大霉素抗性基因,以使庆大霉素可以再次用于宿主选择;和四环素阻抑物(tetR)基因。尽管本实施例使用庆大霉素抗性基因进行举例说明,但是在该载体中可以使用任何选择基因。
已经通过该载体转化了大肠杆菌K12,大肠杆菌Nissle 1917,光杆状菌属,假单胞菌属,土壤杆菌属,粘球菌属和伯克霍尔德氏菌属。在四环素诱导之后,T7 RNA聚合酶可以在这些转化体中表达。
第二载体是携带目的基因(即,CipB-AMP融合体;图3)的质粒。该基因在双重即T7和Ptet双重启动子下克隆,其由四环素双重调控,一个是通过四环素诱导T7聚合酶,一个是直接通过四环素阻抑物(TetR)的去阻遏作用。我们发现,该双重启动子是高度可诱导的并且非常强。具体地,如图所示,将T7启动子插入到Ptet前方。在启动子末端有两个用于克隆目的基因的限制性位点,然后是用于转录终止的T7终止子。当表达载体转化到由图1所示的构建体的整合产生的细菌菌株中时,目的基因由于T7RNA聚合酶基因和Ptet被tetR阻抑而沉默。在加入四环素后,对两个启动子进行抑制去除,并且T7启动子由T7聚合酶激活,导致大量的诱导。
用于外源基因表达的这一系统比常规T7表达系统具有一些优点:1,T7 RNA聚合酶处在更可控的启动子-可四环素诱导的启动子的控制下;2,所述可四环素诱导的启动子是宽泛范围的启动子,并且可以用于多种细菌菌株;3,诱导物,即四环素,比IPTG便宜超过104倍,因此可以以工业规模使用。
实施例2:融合蛋白的结构和表达
使用图2所示的表达载体已经克隆和表达了超过20种AMPs。图3显示在克隆CipB-AMP(此处为GB-天蚕素P1)融合蛋白基因后的一个这样的实例。我们已经在大肠杆菌K12、大肠杆菌nissle和光杆状菌属中使用了这一AMP表达系统。理论上,其可以在所有细菌菌株中使用。
为了在纯化内含体后由CipB释放AMP,两个氨基酸Asp-Pro位于CipB和AMP之间。这允许通过HCl消化由CipB释放AMP31,HCl消化还具有使得该AMP激活步骤简单、便宜和易于以工业生产规模进行的优点。
在大肠杆菌(图4)和光杆状菌属(数据未显示)中获得融合蛋白的可诱导表达。诱导前-;四环素诱导后+。泳道1和2是GB-天蚕素P1;泳道3和4是GB-Buforin II,其来源于中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans);泳道5和6是GB-LfcinB1。为了诱导,将四环素加入到生长至OD600~0.7的大肠杆菌中至终浓度0.5μg/ml,并且在16小时后收集细胞。将来自大肠杆菌细胞裂解物的蛋白提取物加载在SDS-PAGE上。在图4中,在诱导后获得多至总细胞蛋白70%的CipB-AMPs的表达。这验证了两种策略:(i)通过与CipB融合使AMP失活;和(ii)使用双重启动子,以非常高的水平可诱导性表达蛋白。
在收获含有CipB-AMP内含体的细菌细胞后,将细胞直接溶解在0.1NHCl中进行消化。
图5显示,在85℃用0.1N HCl处理2小时后,AMPs可以从CipB释放。将在0.1N HCL中的细菌细胞在85℃温育2小时。在0.5小时、1.0小时和2小时取出样品进行SDS-PAGE检验。样品1,2和3为图4中的泳道2,4和6。样品1为GB-天蚕素P1,样品2为GB-Buforin II和样品3为GB-LfcinB。释放的AMPs可以通过层析步骤进一步纯化。
尽管在生物合成的AMPs的开头总有脯氨酸,但是其不干扰AMPs的活性。在体外检测具有和不具有第一脯氨酸残基的一些合成的AMPs对大肠杆菌Nissle 1917的杀伤。数据支持在所检测的AMPs中,在具有脯氨酸的AMPs和不具有脯氨酸的AMPs之间没有区别。通过这一系统表达了多于20种AMPs。
实施例3:小猪的攻击实验
AMPs GB-天蚕素P1(GB-Ce P1)和GB-乳铁蛋白素B(LfcinB15)用在小猪攻击实验中。
·GB-天蚕素P1(GB-Ce P1)
天蚕素18,19是由31个氨基酸组成的多肽,并且其序列为SW LSK TAKKLE NSA KKR ISE GIA IAI QGG PR(Ser-Trp-Leu-Ser-Lys-Thr-Ala-Lys-Lys-Leu-Glu-Asn-Ser-Ala-Lys-Lys-Arg-Ile-Ser-Glu-Gly-Ile-Ala-Ile-Ala-Ile-Gln-Gly-Gly-Pro-Arg)。GB-Ce P1是加上一个脯氨酸的天蚕素P1,并且具有序列PSW LSK TAK KLE NSA KKRISE GIA IAI QGG PR。
·GB-LcfinB
乳铁蛋白素B(LfcinB)通过胃蛋白酶消化牛的乳铁蛋白(Lf)而分离。在胃蛋白酶消化后分离的肽LfcinB具有比Lf好得多的抗微生物活性。LfcinB是由牛Lf的氨基酸17至氨基酸41的25个氨基酸的序列。因此,LfcinB具有序列FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF(Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-Ala-Phe)。更近地,发现LfcinB的前15个氨基酸(FKCRRWQWRMKKLGA)是活性区。尽管来自其它生物体的乳中包含相似的LfcinB肽,但是来自牛的这种(LfcinB)具有针对细菌、真菌、甚至是病毒的最强的活性。LfcinB具有中等针对微生物的活性(MIC在12-100μg/ml之间)。通过改变LfcinB中的一些氨基酸,其它LfcinB衍生物具有比原始LfcinB肽更好的活性32。GB-LfcinB是通过按照活性预测交换氨基酸产生的肽。33在第一位的脯氨酸通过生物合成步骤产生。因此,GB-LfcinB的序列是PAWFKCWRWQWRWKKLGA。使用表1所述的实验流程将GB-天蚕素P1和GB-LfcinB1用于动物实验。
表1动物攻击实验
将48头28日龄的小猪分成4组。将在第28天未经任何处理的组0(12头小猪)宰杀作为对照。组1在第28天和第29天用猪致病性大肠杆菌菌株攻击两次,该猪致病性大肠杆菌菌株可以在小猪中引起腹泻。组2在第28天用致病性大肠杆菌攻击,并且在致病性大肠杆菌攻击后给予小猪1mg的GB-LfcinB。在第29天,小猪再用致病性大肠杆菌攻击一次。组3如组2同样处理,但是使用不同的AMP(GB-Ce P1)。在第33天将组1-3中的6头小猪宰杀,并且在第39天宰杀另外6头。在宰杀它们后检查小猪的腹泻和体重。在被攻击的小猪中出现腹泻(表2)。然而,数据表明,在用AMPs处理后,少于一半的被攻击的小猪患有腹泻。
表2:小猪中的腹泻
在第28天、第33天和第39天测量每头宰杀的小猪的体重。图6中的数据显示在第33天和第39天用大肠杆菌攻击后的体重增重或减轻。其表明,仅用大肠杆菌攻击的小猪(组1)在5天后减轻约0.08kg的体重。使用另外的AMP GB-LfcinB,小猪减轻约0.05kg(组2)。使用GB-Ce P1,小猪(组3)仅减轻0.005kg体重。平均在11天后,与对照组相比,用GB-CeP1处理的小猪增加了2倍更多的体重。
结果表明,两种AMPs减轻小猪中由大肠杆菌菌株引起的腹泻问题。另外,当用AMPs处理时,小猪体重增重。
上述仅通过实施例的方式描述了本发明。可以进行落入本发明的范围之内的进一步的修改。
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Claims (18)
1.用于宽泛宿主范围的可诱导表达目的多肽的双载体系统,所述双载体系统包括:
i).第一载体,其包括:
(a)位于可诱导的启动子的5’的T7启动子;
(b)位于可诱导的启动子的3’的克隆位点,其用于插入编码所述目的多肽的基因;和
ii).使得宿主细胞能够进行T7 RNA聚合酶表达的第二载体,其中所述载体包括处于可诱导的启动子控制之下的编码所述T7RNA聚合酶的基因。
2.根据权利要求1的系统,其中在所述第一和/或第二载体中的所述可诱导的启动子是四环素诱导启动子Ptet。
3.根据权利要求1或权利要求2的系统,其中所述第二载体另外包含可去除的选择基因和在宿主细胞中无功能的复制起点。
4.根据权利要求1-3中任一项的系统,其中所述第二载体包含盒:oriR6K-loxP*-genta-loxP*-tetR-Ptet-T7RNApol,其位于由转座酶识别的两个反向重复区之间。
5.根据权利要求1-4中任一项的系统,其中所述第一载体包含位于所述克隆位点3’的T7终止子序列。
6.根据权利要求1-5中任一项的系统,其中所述第一载体包含已经插入到所述克隆位点的目的多肽。
7.根据权利要求6的系统,其中所述目的多肽与内含体蛋白融合。
8.根据权利要求7的系统,其中所述内含体蛋白是光杆状菌属(Photorhabdus)CipB或来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的晶体蛋白。
9.根据权利要求7或权利要求8的系统,其中所述目的多肽通过Asp-Pro二肽接头与所述内含体蛋白融合。
10.根据权利要求1-9中任一项的系统,其中所述目的多肽是对宿主细胞有毒性的多肽。
11.根据权利要求10的系统,其中所述目的多肽是抗微生物多肽。
12.一种试剂盒,其包含按照前述权利要求中任一项的第一载体和第二载体。
13.用于表达目的多肽的方法,所述方法包括:
i.用权利要求1-11中任一项所述的第一载体转化原核宿主细胞,其中所述宿主细胞包含处于可诱导的启动子控制下的T7 RNA聚合酶;和
ii为所述宿主细胞提供所述可诱导的启动子的诱导物。
14.根据权利要求13的方法,其中所述原核宿主细胞选自大肠杆菌(E.coli)K12,大肠杆菌Nissle 1917,光杆状菌属,假单胞菌属(Pseudomonas),土壤杆菌属(Agrobacterium),粘球菌属(Myxococcus)和伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)。
15.按照权利要求13或14的方法,其还包括纯化包含融合蛋白的内含体,并且裂解可裂解的接头以释放目的多肽。
16.一种抗微生物肽,其具有序列:PAWFKCWRWQWRWKKLGA。
17.一种用于治疗或预防小猪中的细菌感染的方法,其包括施用GB-LfcinB或GB-天蚕素P1。
18.一种用于治疗或预防鱼类中的细菌感染的方法,其包括向所述鱼类游动的水中添加通过按照权利要求13-15中任一项的方法产生的AMPs。
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