CN116769814A - 一种大肠杆菌益生菌t7表达系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种大肠杆菌益生菌T7表达系统及其应用，以大肠杆菌益生菌Nissle1917(EcN)为原始菌株，通过基因编辑技术将噬菌体T7RNA聚合酶编码基因整合到EcN基因组中，获得EcN‑T7表达菌株，使之能够“无缝适配”目前最广泛应用的大肠杆菌表达载体；并且在EcN‑T7基础上对内毒素合成路径相关基因进行敲除，进一步降低改造菌株的内毒素水平。本发明构建的大肠杆菌益生菌T7表达系统能够高效表达外源基因，并且极大的降低了内毒素水平，不会引起细胞的免疫反应，简化了下游应用的操作，降低了生产成本，且能够拓展大肠杆菌活菌制剂的应用场景，具有极大的市场前景。

Description

一种大肠杆菌益生菌T7表达系统及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌益生菌T7表达系统及其应用。

背景技术

大肠杆菌(Escherichia coli)是一种革兰氏阴性、兼性厌氧菌，是目前应用最广泛的表达宿主。作为模式菌株，它具有遗传背景清晰、生长速度快、培养成本低、生物元件丰富、基因编辑工具成熟等优势。基于T7 RNA聚合酶(T7RNApolymerase，T7 RNAP)及T7强启动子之间的特异性和转录的高效性建立的T7-pET系统是最常用的大肠杆菌表达系统，其中菌株BL21(DE3)是研究最多、最成熟的大肠杆菌表达菌种。BL21(DE3)系列菌株来源于大肠杆菌B菌株，具有一定的致病性，无法作为代谢缺陷型疾病如苯丙酮尿症的长效药物或益生菌剂使用，其生物制品在食品保健品领域的应用也受到极大限制。此外，BL21(DE3)菌株在生长过程中不断合成、分泌内毒素即脂多糖(LPS)，其生物制品需要通过额外的纯化步骤如膜亲合法以去除内毒素，极大增加了生物制品的生产成本，也带来了环境污染风险，甚至还可能影响产品的安全性。

大肠杆菌Nissle 1917(Escherichia coliNissle 1917，EcN)是唯一一种不致病的大肠杆菌，是一种益生菌，并且该菌株对多种病原菌如Salmonella、Yersiniaenterocolitica、Shigellaflexneri等均具有高拮抗活性。除了抗菌性，EcN还表现出多种优良特性，不含肠毒素、溶血毒素和细胞毒素等致病因子，对宿主无安全风险。目前EcN益生制剂广泛应用于临床，主要治疗腹泻、炎症性肠炎以及便秘等；而由于其对宿主的安全性能，也越来越广泛地被应用于疫苗、肿瘤治疗和药物研发中。综上所述，EcN作为一种益生菌，在下游生产、应用的便捷性和应用场景丰富性显著优于BL21(DE3)菌株。EcN其LPS表达半粗糙型O6抗原，具有血清敏感性，所以EcN在体内遇血清极易被清除。这一特性导致EcN不具有致病性，但EcN细胞仍然表达内毒素，相应地仍会引起免疫反应，对于EcN的应用例如食品、保健品生产尤其是活菌制剂等产品的生产具有不利影响。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种大肠杆菌益生菌T7表达系统及其应用，以大肠杆菌益生菌EcN为原始菌株，通过基因编辑技术使之能够表达T7 RNA聚合酶，进而能够高效表达外源基因；并通过基因编辑技术敲除相关基因，进一步降低菌株的内毒素表达，削弱乃至消除其生物制品诱发细胞的免疫反应。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种大肠杆菌益生菌T7表达系统，包括表达载体和表达菌株，所述表达菌株以大肠杆菌益生菌EcN为原始菌株，通过基因编辑技术将T7 RNA聚合酶整合到EcN基因组中，获得EcN-T7表达菌株。

本发明构建的EcN-T7表达菌株能够表达T7 RNA聚合酶，进而能够高效表达T7启动子或其它元件调控下的外源基因。

优选地，所述EcN-T7表达菌株通过基因编辑技术敲除LPS合成途径的相关基因，获得极低内毒素水平的表达菌株Etxfree EcN-T7。

优选地，所述LPS合成途径的相关基因包括但不限于gutQ、kdsD、lpxL、lpxM、lpxP、pagP或eptA的任意组合，或者其它能够达到影响内毒素表达的基因组合。

优选地，所述基因编辑技术包括同源重组、CRISPR/Cas基因编辑系统、锌指核酸酶ZFNs或转录激活样效应因子核酸酶TALENS。

优选地，本发明能够适配目前最广泛应用的大肠杆菌表达载体，特别是大肠杆菌T7启动子载体。

第二方面，本发明提供一种高效表达外源基因的方法，所述方法使用第一方面所述的大肠杆菌益生菌T7表达系统表达外源基因。

优选地，所述外源基因包括荧光蛋白基因、人表皮生长因子基因、血红素蛋白基因、GLP-1多肽基因、苯丙氨酸解氨酶基因、聚酮合酶、聚酮环化酶。

第三方面，本发明提供第一方面所述的大肠杆菌益生菌T7表达系统在基因工程疫苗、药物研发及合成生物学领域中的应用。

优选地，所述基因工程疫苗包括如下种类：流感疫苗、霍乱疫苗或活菌疫苗载体等；所述药物包括如下种类：重组人胰岛素、a2b型干扰素、兰尼单抗、青蒿素、CLP-1多肽等；所述合成生物学领域应用包括苯丙氨酸解氨酶、橄榄酸合成通路、萜类物质合成通路等。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明以唯一的大肠杆菌益生菌EcN为原始菌株，通过基因编辑技术将噬菌体T7RNA聚合酶编码基因整合到EcN基因组中，获得能够高效表达外源基因的EcN-T7表达菌株，使之能够“无缝适配”目前最广泛应用的大肠杆菌表达载体。并且本发明在EcN-T7表达菌株的基础上对内毒素合成路径相关基因进行敲除，以进一步降低改造菌株的内毒素水平，削弱乃至消除其生物制品诱发的细胞的免疫反应。与现有技术相比，本发明构建的大肠杆菌益生菌T7表达系统能够高效表达外源基因，并且极大的降低了内毒素水平，不会引起细胞的免疫反应，简化了下游应用的操作，降低了生产成本，同时能够拓展大肠杆菌活菌制剂的应用场景，具有极大的市场前景。

附图说明

图1为实施例1中敲入基因的donor片段构建示意图，其中a为donor片段的完整示意图，b为donor片段测序结果的组装示意图。

图2为实施例1中大肠杆菌EcN T7表达菌株敲入实验的PCR验证结果图，其中a为T7-CDS敲入的第一代EcN菌株实验的PCR鉴定结果，b为T7-CDS表达框敲入的第二代EcN菌株实验的PCR鉴定结果。

图3为实施例1中敲入T7-CDS的阳性大肠杆菌EcN克隆子基因组扩增及测序结果图，其中a为大肠杆菌EcN菌株T7-CDS敲入实验的阳性克隆的PCR扩增结果，b为敲入位点T7-CDS测序结果的组装示意图。

图4为实施例2中EcN-T7的各基因敲除克隆子的PCR鉴定电泳图。

图5为实施例2中EcN-T7的敲除克隆子的测序结果图。

图6为实施例3中质粒pET28-mRFP基因图谱。

图7为实施例3中编辑菌株的红色荧光蛋白基因的诱导表达对比图，每个菌株从左至右的离心管依次代表无诱导、0.1mM IPTG诱导、10％乳糖诱导。

图8为实施例3中表达红色荧光蛋白基因的编辑菌株的荧光值对比图。

图9为实施例3中不同菌株提取的质粒(a)及蛋白(b)中内毒素含量对比图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买获得的常规产品。

实施例1：EcN-T7表达菌株的构建

1、sgRNA及敲入基因的制备

以BL21(DE3)基因组为模板，使用T7RNAP-F/T7RNAP-R引物(如表1所示)PCR扩增得到T7 RNAP编码基因，并在编码区前添加lac UV5启动子和lac操纵子，构建成新的编码框，以下简称为T7-CDS(SEQ ID NO:1)。通过体外同源重组即Gibson方法将T7-CDS全长组装至pUC57-Amp载体上。

T7-CDS的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)：

tttacactttatgcttccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaaggccactactagagaaagaggagaaatactagatgaacacgattaacatcgctaa

gaacgacttctctgacatcgaactggctgctatcccgttcaacactctggctgaccattacggtgagcgtttagctcgcgaacagttggcccttgagcatgagtcttacg

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ttgattccggcaagggtctgatgttcactcagccgaatcaggctgctggatacatggctaagctgatttgggaatctgtgagcgtgacggtggtagctgcggttgaagc

aatgaactggcttaagtctgctgctaagctgctggctgctgaggtcaaagataagaagactggagagattcttcgcaagcgttgcgctgtgcattgggtaactcctgatg

gtttccctgtgtggcaggaatacaagaagcctattcagacgcgcttgaacctgatgttcctcggtcagttccgcttacagcctaccattaacaccaacaaagatagcgag

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gaatcttttgcactgattcacgactccttcggtaccattccggctgacgctgcgaacctgttcaaagcagtgcgcgaaactatggttgacacatatgagtcttgtgatgtac

tggctgatttctacgaccagttcgctgaccagttgcacgagtctcaattggacaaaatgccagcacttccggctaaaggtaacttgaacctccgtgacatcttagagtcg

gacttcgcgttcgcgtaataa

表1菌株构建实验中所用的PCR扩增引物及产物长度

本发明通过CRISPR/Cas9方法进行T7-CDS的敲入。利用算法设计EcN基因组attB位点的sgRNA，详细信息如表2所示。将sgRNA通过Gibson方法同源重组至pSynbio-sgRNA载体(泓迅生物自行构建)上。为了使T7-CDS成功敲入EcN菌株(购自微生物菌种查询网)中，本发明在T7-CDS上下游加上基因组的同源重组臂，在靶标位点attB上下游各选择同源重组臂约350bp，分别设计引物进行扩增及拼接，构建过程中所有引物的详细序列如表1所示。使用Upstream-F/Upstream-R引物扩增上游重组臂，使用Downstream-F/Downstream-R引物扩增下游重组臂，使用EcN-KI-UPF/EcN-KI-DownR引物扩增T7-CDS。将上述三个片段作为模板，使用Upstream-F/Downstream-R引物进行扩增，PCR产物即为模板片段(donor)。经琼脂糖凝胶回收纯化后通过Gibson方法同源重组至pUC57-Kan载体上，次日提取单克隆提取质粒进行测序验证，测序结果如图1所示。利用AscI内切酶(泓迅生物自行生产)酶切含donor片段的质粒，通过琼脂糖凝胶电泳进行donor片段的纯化回收。

表2大肠杆菌EcN拟编辑位点的sgRNA序列

靶标位点	N20+PAM	基因组链	GC含量(％)	效率	编号
						attB	ctaacttgagcgaaacgggaagg	+	50	60.47	SEQ ID NO:14

2、大肠杆菌基因编辑

大肠杆菌电转感受态的制备方法具体方法如下：(1)挑取一个新鲜的单菌落接种到4ml LB培养基中，在通风良好的情况下37℃培养过夜。(2)稀释1ml过夜培养的细胞到300ml LB培养基中，在通风良好的情况下37℃培养2-3h，至OD600＝0.5。(3)3,500rpm离心10min收集细胞。(4)通过重悬于500ml冰冷的无菌冲洗缓冲液中洗涤细胞2遍，3,500rpm离心10min。(5)细胞悬液于3,500rpm离心10min，离心结束后立即倒出上清液，加入100mL10％甘油(10％超纯甘油，90％超纯双蒸水，体积比)冰浴1h。(6)10％甘油洗涤细胞2遍，4,000rpm离心10min。(7)将细胞重悬于冲洗缓冲液中(大约2ml)，分装，-80℃冻存。

电转步骤如下：(1)0.1cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。(2)取-80℃保存的电击感受态细胞插入冰中5分钟，待其融化，加入目的DNA(质粒或连接产物)并用手拨打离心管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。(3)用200μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-pUC57混合物快速移到电击杯中，避免产生气泡，盖上杯盖。(4)启动电转仪，设置参数(按所用电转仪推荐的参数操作)，将电击杯快速放入电转槽中点击。(5)加入700μl不含抗生素的无菌SOC培养基(室温)，用1ml枪吹吸电击杯底部数次混匀后，转移到1.5ml离心管。37℃，225rpm复苏60分钟。(6)5000rpm离心一分钟收菌，重悬后取100-200μl涂布到含相应抗生素的SOC平板上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养13-17小时。

首先，将pSynbio-Cas9质粒(泓迅生物自行构建)电转至EcN细胞中，复苏后菌液涂布至对应抗性SOC固体培养基。按上述电转感受态制备方法再次制备含pSynbio-Cas9质粒的大肠杆菌EcN的感受态细胞。将pSynbio-sgRNA质粒及线性化的donor片段混匀，加入刚刚融化的感受态细胞中，按上述步骤转化至EcN中，复苏后菌液涂布至对应抗性SOC固体培养基，倒置过夜培养。

克隆子鉴定和基因扩增引物T7-RNAP-SEQF2/T7-RNAP-SEQR3如表1所示。通过上述引物我们鉴定得到阳性克隆子，进行传代后再次进行PCR鉴定，结果如图2所示。PCR电泳结果初步显示，成功将T7-CDS敲入EcN基因组。以阳性克隆子作为模板，以EcNc-KI-SEQF/R为引物扩增敲入位点上下游序列，详细信息如表1所示。琼脂糖凝胶回收正确条带，并进行测序验证(如图3所示)。经测序验证，敲入片段序列与donor片段一致，T7-CDS成功敲入菌株EcN，命名为EcN-T7。

实施例2：Etxfree EcN-T7表达菌株的构建

为了降低EcN-T7表达菌株的内毒素含量，本发明对LPS合成途径的相关基因进行了筛选，本实施例以敲除以下7个基因为例，详细信息如表3所示。

表3大肠杆菌EcN-T7拟敲除基因

1、sgRNA与donor片段的合成与构建

利用算法，本发明设计了EcN-T7表达菌株上述7个基因的sgRNA(如表4所示)及其donor的扩增引物(如表5所示)。将sgRNA通过Gibson方法同源重组至pSynbio-sgRNA载体上，donor片段的扩增引物如表5所示，以gutQ为例：第1轮以基因组为模板，使用gutQ-donor-F1/R1和gutQ-donor-F2/R2分别扩增，PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化回收；第2轮以第1轮的PCR产物为模板，使用gutQ-donor-F1/R2引物对进行扩增，琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物，即为gutQ对应的donor片段。

2、大肠杆菌基因编辑

以gutQ基因敲除为例：首先，将pSynbio-Cas9质粒电转至EcN-T7细胞中，复苏后菌液涂布至对应抗性SOC固体培养基。按上述电转感受态制备方法再次制备含pSynbio-Cas9质粒的大肠杆菌EcN-T7的感受态细胞。将pSynbio-sgRNA质粒及线性化的donor片段混匀，加入刚刚融化的感受态细胞中，按上述步骤转化至EcN-T7中，复苏后菌液涂布至对应抗性SOC固体培养基，倒置过夜培养。

克隆子鉴定和基因扩增使用靶标基因的gutQ-donor-F1/R2引物对，通过上述引物我们鉴定得到阳性克隆子(如图4所示)。琼脂糖凝胶回收正确条带，并进行测序验证，经测序验证，确认靶标基因被成功敲除，命名为EcN-T7ΔgutQ(如图5所示)。pSynbio-sgRNA质粒为温敏型质粒，在42℃培养会丢失。因此，将阳性克隆接种新鲜LB培养基中，42℃过夜培养，获得无sgRNA质粒的敲除菌株。以此菌株再次制备感受态，重复上述步骤，再次进行后续基因的敲除，重复7次，即获得敲除7个靶标基因的菌株，基因型为EcN-T7{ΔgutQΔkdsDΔlpxLΔlpxMΔlpxPΔpagPΔeptA}，命名为Etxfree EcN-T7。

表4大肠杆菌EcN-T7拟敲除基因的sgRNA序列

表5大肠杆菌EcN-T7拟敲除基因的donor扩增引物序列

实施例3：编辑菌株的功能验证

1、菌株EcN-T7及Etxfree EcN-T7的T7系统表达测试

为了验证编辑菌株T7 RNA聚合酶的诱导表达能力，本发明通过红色荧光蛋白来进行表征、量化。首先，基因合成红色荧光蛋白(mRFP)编码基因，并通过Gibson同源重组方法组装至pET28，其基因图谱如图6所示。

分别制备BL21(DE3)、EcN、EcN-T7及Etxfree EcN-T7菌株的电转感受态细胞，按实施例1方法将验证正确的pET28-mRFP质粒分别转化至上述菌株中，复苏后菌液涂布至Kan抗性SOC固体培养基，倒置过夜培养。次日早晨挑取3个单克隆分别接种于含Kan抗性的4ml LB培养液的试管中，37℃220rpm振摇培养至菌体OD值约为0.6；一管不加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)做阴性对照；一管加IPTG至终浓度为0.1mM，一管加乳糖至终浓度为10％，37℃诱导3小时。结果如图7所示，野生型EcN菌株中pET28质粒上的mRFP蛋白不能被IPTG或乳糖诱导表达，而EcN-T7及Etxfree EcN-T7菌株则与BL21(DE3)结果相同，IPTG和乳糖均能诱导表达mRFP蛋白。将适当稀释的培养基添加到黑色96孔板中(Corning透明平底)，通过Thermo荧光酶标仪测定mRFP荧光强度，激发波长：532nm，发射波长：588nm。结果如图8所示，三种菌株乳糖诱导处理的荧光值均高于IPTG诱导的处理，而EcN-T7及Etxfree EcN-T7菌株与BL21(DE3)则无显著差距。

2、菌株EcN-T7及Etxfree EcN-T7的内毒素测试

为了进一步评估编辑菌株的内毒素表达水平，本发明分别对BL21(DE3)、EcN-T7及Etxfree EcN-T7菌株的内毒素表达水平进行了测试。通过LPS合成路径相关的7个基因的敲除，使细胞体内合成的LPS发生了显著的结构变化：去除了2个酰基链，使LPS原有的6个酰基链减少为4个；同时删除了聚合在LPS上的所有低聚糖链，从而导致LPS变成了lipid IVA，不会引发内毒素反应。目前，内毒素含量检测的最常见方法为鲎试剂分析法(LAL)，但该方法基于蛋白酶级联反应，由LPS的4’-单磷酰二葡萄糖胺骨架激活，缺乏区分类脂A和类脂IVA的特异性，因此本发明同时还采用了重组C因子方法(rFC)来进行内毒素检测。

首先，接种1中BL21(DE3)、EcN-T7及Etxfree EcN-T7菌株，37℃培养箱过夜培养13-17小时。次日，部分菌液通过碱裂解法提取质粒，具体方法如下：取1.5ml培养液倒入2.0ml离心管中，12000rmp离心1-2min；弃上清，将离心管倒置于卫生纸上几分钟，使液体尽可能流尽；菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡，使菌体分散混匀)，室温下放置5-10min；加入新配制的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，快速温和颠倒离心管数次，以混匀内容物(不要振荡)，冰浴5min，使细胞膜裂解(溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清)；加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置5min；12000rmp离心10min；上清液移入干净核酸纯化柱中，12000rmp离心1～2min；小心弃去过滤液，加入500μl溶液Ⅳ于纯化柱中，12000rmp离心1～2min，弃去过滤液，重复2次；再次12000rmp离心空纯化柱10min；将离心后的纯化柱转移至新的微量离心管中，室温静置5min；向纯化柱中央加入40μl预热的Tris-EDTA缓冲液(TE)，12000rmp离心1～2min，储于-20℃冰箱中。剩余菌液破壁后进行蛋白提取，具体方法如下：诱导完毕的菌液分装至离心管中，配平，8000rpm离心5min，弃上清；加入1/10体积的20mM Tris-HCl(pH 8.0)、500mM NaCl溶液颠倒混匀菌体后转移到50ml离心管中，放置冰上进行超声破碎，破碎程序为：350W功率，破碎4s间隔6s，共150循环，破碎至菌液澄清半透明为止，如果达不到可适当增加破碎循环数；破碎完菌液分装到高速离心管，配平，4℃12000rpm离心10min；收集上清进行镍柱纯化，填料类型为Ni-IMAC；纯化后蛋白低温保存。使用鲎试剂分析法和重组C因子方法检测质粒、蛋白样品中的内毒素含量。

鲎试剂分析法详细步骤如下：使用无内毒素超纯水配置梯度稀释的内毒素标准样品；取无热原试管加入100μl细菌内毒素检查用水(作为阴性对照)、内毒素标准溶液或供试品；再加入100μl鲎试剂溶液混匀，37℃温育T1分钟；温育结束加入100μl显色基质溶液混匀，37℃温育T2分钟(T1、T2以试剂盒说明书标注时间为准)；温育结束，加入500μl偶氮化试剂1溶液，混匀；加入500μl偶氮化试剂2溶液，混匀；加入500μl偶氮化试剂3溶液，混匀，静置5分钟；于545nm波长处读取吸光度值；根据标准品数据绘制拟合标准曲线，计算得到样品内毒素含量。重组C因子方法详细步骤如下：使用无内毒素超纯水配置梯度稀释的内毒素标准样品；预热荧光微孔板读数仪，设置检测温度为37℃；取所需数量的黑色微孔板条，装至微孔板架上，相应孔中分别加入细菌内毒素检查用水(作为阴性对照)、内毒素标准品溶液或稀释液，供试品溶液等各100μl，分别2～3个重复；微孔板放入预热的荧光微孔板读数仪中，37℃孵育至少10分钟；取出微孔板，每孔小心加入50μl重组因子试剂(避免产生气泡)；将微孔板放入荧光微孔板读数仪中(不要盖上微孔板盖)，运行检测程序读取荧光值(激发波长355nm，发射波长460nm)；进行数据处理和数据分析，根据标准品数据绘制拟合标准曲线，计算得到样品内毒素含量。

内毒素结果如图9所示，不管是质粒溶液还是蛋白溶液，BL21(DE3)菌株制品的内毒素含量最高，EcN菌株次之，Etxfree EcN-T7菌株最低。与预期一致，LAL方法仍能从Etxfree EcN-T7菌株制备的质粒溶液中检测出较高的内毒素，呈现假阳性，而rFC方法检测出Etxfree EcN-T7菌株的生物制品中几乎不含内毒素。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (8)

1.一种大肠杆菌益生菌T7表达系统，包括表达载体和表达菌株，其特征在于，所述表达菌株以大肠杆菌益生菌EcN为原始菌株，通过基因编辑技术将T7RNA聚合酶整合到EcN基因组中，获得EcN-T7表达菌株。

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌益生菌T7表达系统，其特征在于，所述EcN-T7表达菌株通过基因编辑技术敲除LPS合成途径的相关基因，获得极低内毒素水平的表达菌株EtxfreeEcN-T7。

3.根据权利要求2所述的大肠杆菌益生菌T7表达系统，其特征在于，所述LPS合成途径的相关基因包括：gutQ、kdsD、lpxL、lpxM、lpxP、pagP或eptA的任意组合。

4.根据权利要求1或2所述的大肠杆菌益生菌T7表达系统，其特征在于，所述基因编辑技术包括同源重组、CRISPR/Cas、ZFNs或TALENS。

5.根据权利要求1所述的大肠杆菌益生菌T7表达系统，其特征在于，所述表达载体包括但不限于大肠杆菌T7启动子载体。

6.一种高效表达外源基因的方法，其特征在于，所述方法使用权利要求1-5任一项所述的大肠杆菌益生菌T7表达系统表达外源基因。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述外源基因包括荧光蛋白基因、人表皮生长因子基因、血红素蛋白基因、GLP-1多肽基因、苯丙氨酸解氨酶基因、聚酮合酶、聚酮环化酶。

8.权利要求1～5任一项所述的大肠杆菌益生菌T7表达系统在基因工程疫苗、药物研发及合成生物学领域中的应用。