CN115851795B - 一种高产质粒、其构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种高产质粒、其构建方法及其应用。本发明的高产质粒包括正调控元件RNAII基因序列和透明颤菌血红蛋白基因序列。本发明的高产质粒在摇瓶发酵的产量相比原质粒有明显提高，且不影响其用于AAV包装后的病毒滴度水平。本发明的高产质粒对于质粒生产能力的提升和生产成本的降低具有重要的应用价值和意义。

Description

一种高产质粒、其构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高产质粒、其构建方法及其应用。

背景技术

质粒(plasmid)是广泛存在于生物界的环状双链DNA分子。质粒DNA作为最基本的基因载体工具，在分子生物学、生物化学与细胞生物学等学科中得到广泛的应用。质粒是基因工程和在稳定或瞬时转染的宿主中生产重组蛋白的最通用的工具。通过在质粒中插入目的基因，构建重组质粒，使目的基因在动物模型中表达，可以研究动物的生长发育、疾病发生等情况。从分子与细胞层次上探究这些基因的作用机制就需要构建基因的重组质粒，建立转基因宿主，以进行下一步的功能研究。基因编辑工具CRISPR/Cas9基因编辑技术，是以质粒作为表达载体和基因修复序列的供体，从而实现精准地敲除、插入或替换基因组中特定的DNA序列，基因功能研究与疾病的治疗中发挥重要的作用。同时，质粒DNA也是一种潜在的药物活性成分，特别是在兽用疫苗和基因治疗中。

获得足够量的质粒是质粒应用的重要一步。随着基因治疗等领域市场的扩大，质粒原料的生产能力经受的挑战越发严峻。且质粒产量的高低直接决定了企业投入的生产成本的高低。因此，如何提升质粒的生产产能是一个亟待解决的重要问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种高产质粒、其构建方法及其应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种高产质粒，包括正调控元件RNAII基因序列和透明颤菌血红蛋白基因序列。

作为本发明所述的高产质粒的优选实施方式，所述正调控元件RNAII基因序列如SEQ ID No.1所示。

作为本发明所述的高产质粒的优选实施方式，所述透明颤菌血红蛋白基因序列如SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示。

本发明的高产质粒添加了RNAII正向调控元件与透明颤菌血红蛋白vgb基因序列，在大肠杆菌中的质粒小提产量平均提升了7.89倍，中提产量最高提升了1.79倍；在对vgb密码子优化后与优化前相比质粒中提产量最高提升了2.67倍；vgb密码子未优化和优化前后，在5L体积的发酵罐中，发酵28h时的质粒产量分别较原质粒产量提高了1.69和2.08倍。通过质粒的病毒包装滴度测试的比较，改造后的质粒产量得到较大提升，且不显著影响下游的AAV包装滴度。

第二方面，本发明提供所述的高产质粒的构建方法，包括以下步骤：

(1)将所述正调控元件RNAII基因序列插入质粒载体复制起始位点上游；

(2)将所述透明颤菌血红蛋白基因序列插入所述正调控元件RNAII基因序列的上游，即成。

第三方面，本发明提供一种高产宿主菌，包含所述的高产质粒。

作为本发明所述的高产宿主菌的优选实施方式，所述宿主菌为大肠杆菌。

第四方面，本发明提供一种细胞，包含所述的高产质粒。

第五方面，本发明提供一种病毒，包含所述的高产质粒中的所述正调控元件RNAII基因序列和透明颤菌血红蛋白基因序列。

第六方面，本发明将所述的高产质粒、所述的构建方法、所述的高产宿主菌在发酵质粒生产中应用。

第七方面，本发明将所述的高产质粒、所述的构建方法、所述的细胞、所述的病毒在AAV包装中应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明通过分子手段将具有促进质粒复制的调控元件插入载体质粒复制起点上游，并对该元件进行部分优化，构建所得的高产质粒在摇瓶发酵的产量相比原质粒有明显提高，且不影响其用于AAV包装后的病毒滴度水平。本发明的高产质粒对于质粒生产能力的提升和生产成本的降低具有重要的应用价值和意义。

附图说明

图1为质粒小提产量检测；

图中，图A中泳道1～3为1μL pAAV-EGFP质粒Sma I酶切，泳道4～6为1μL pAAV-vgb-RNAII-EGFP质粒Sma I酶切，泳道7～9为1μL pAAV-vgb2.0-RNAII-EGFP质粒Sma I酶切，M为Marker DL10000。

图2为质粒中提产量检测之一；

图中，图A中泳道1～3分别为pAAV-EGFP、pAAV-vgb-RNAII-EGFP、pAAV-vgb2.0-RNAII-EGFP质粒150ng Nde I酶切，泳道4～6分别为pAAV-EGFP、pAAV-vgb-RNAII-EGFP、pAAV-vgb2.0-RNAII-EGFP质粒150ng Mlu I酶切，泳道7～9分别为pAAV-EGFP、pAAV-vgb-RNAII-EGFP、pAAV-vgb2.0-RNAII-EGFP质粒1μL，M为Marker DL10000。

图3为质粒中提产量检测之二；

图中，图A中泳道1、4、7分别为pAAV-EGFP、pAAV-vgb-RNAII-EGFP、pAAV-vgb2.0-RNAII-EGFP质粒150ng Nde I酶切，泳道2、5、8分别为pAAV-EGFP、pAAV-vgb-RNAII-EGFP、pAAV-vgb2.0-RNAII-EGFP质粒150ng Mlu I酶切，泳道3、6、9分别为pAAV-EGFP、pAAV-vgb-RNAII-EGFP、pAAV-vgb2.0-RNAII-EGFP质粒1Μl，M为Marker DL10000。

图4为5L发酵罐不同发酵时间质粒产量检测。

图5为1:1000接种量的中提不同发酵时间质粒产量检测。

图6为1:100接种量的中提不同发酵时间质粒产量检测。

图7为质粒的AAV包装滴度的测定。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例中所涉及的培养基配方为：

LB培养基(1L)：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠。

TB培养基(1L)：12g蛋白胨，24g酵母粉，4ml甘油。

发酵培养基：12g无水硫酸氢二钠，14g无水磷酸二氢钾，6g硫酸铵，8g葡萄糖，5g蛋白胨，10g酵母提取物，5mL消泡剂，8g七水合硫酸镁，加入800mL超纯水，定容至1L，121℃灭菌30min。

细菌培养过程中添加终浓度100μg/mL的氨苄青霉素(Amp)以维持其质粒稳定性。

实施例中所涉及的细菌的培养条件为：32℃，250rpm，18～24h。

实施例中所涉及的质粒提取与浓度测定的方法为：

(1)质粒小量提取与浓度测定：取2mL的LB培养基生长约24h的菌液，使用Magen质粒小提试剂盒Hipure Plasmid Micro Kit提取质粒，使用微量分光光度计检测浓度，并通过酶切跑胶鉴定质粒的浓度与准确性。

(2)质粒的中量提取与浓度测定：取80mL的规格为250mL摇瓶培养的LB培养基生长约24h的菌液，使用质粒中量提取方法提取质粒，使用微量分光光度计检测浓度，并通过酶切跑胶鉴定质粒的浓度与准确性。

(3)发酵罐培养的质粒提取与浓度测定：取各发酵时段菌液50μL(或100μL)，使用Magen质粒小提试剂盒Hipure Plasmid Micro Kit提取质粒，并于发酵终点取10mL菌液使用质粒大量提取方法提取质粒，使用微量分光光度计检测浓度。

实施例中所涉及的引物序列如表1所示：

表1引物序列

实施例1：一种高产质粒的构建方法

以EA021质粒(pAAV-EGFP)(EA021质粒包含两端的5'ITR和3'ITR序列，GOI部分由CAG Promoter、EGFP、WPRE以及SV40 pA串联组成)为原始改造质粒，通过在线基因合成网站DNAWorks(v3.2.4)及无缝克隆等分子工具构建质粒。改造后得重组质粒pAAV-vgb-RNAII-EGFP或pAAV-vgb2.0-RNAII-EGFP。具体如下：

(1)以质粒EA021为模板，以#1和#2为引物，通过PCR扩增，获得RNAII序列(如SEQID No.1所示)；以#3和#4为引物，通过PCR扩增，回收目的产物片段；以#5和#6为引物，通过PCR扩增，回收目的产物片段；以#7～#22为引物，通过PCR人工合成vgb基因序列(如SEQ IDNo.2所示)。将上述DNA片段通过融合，连接至Ear I/AlwN I酶切过的EA021质粒中，得重组质粒pAAV-vgb-RNAII-EGFP。

(2)以EA021为模板，以#23和#24为引物，通过PCR扩增，回收目的产物片段；以#1和#25为引物，通过PCR扩增，回收目的产物片段；通过Thermo Fisher SCITIFIC网站的密码子优化功能，获得优化后的vgb基因序列，并设计引物#26～#37，PCR人工合成密码子优化的vgb基因序列，记为vgb2.0(如SEQ ID No.3所示)。将上述DNA片段通过融合，连接至Mlu I/PvU I酶切过的EA021质粒中，得重组质粒pAAV-vgb2.0-RNAII-EGFP。

(3)在冰上解冻XL10-Gold化学感受态细胞(购自上海唯地生物)，分别用移液枪吸取10μL两种重组质粒产物转移至细胞中，轻弹管壁，冰浴30min；42℃水浴热激45s，立即置于冰上3min；向细胞内加入600μL的SOC培养基，32℃，250rpm，培养1h；准备LB固体培养基(含100μg/mL Amp)，将菌液均匀涂布，风干后倒置平板于32℃培养箱内，18h；

分别接种单克隆若干至LB液体培养基(含100μg/mL Amp)，32℃，250rpm，培养18～24h；使用质粒小提试剂盒Hipure Plasmid Micro Kit提取质粒，检测浓度；酶切鉴定：使用限制性核酸内切酶酶切，电泳鉴定条带大小；将酶切结果符合预期的质粒送测序验证得重组质粒pAAV-vgb-RNAII-EGFP或pAAV-vgb2.0-RNAII-EGFP。

所涉及的序列具体如下：

SEQ ID No.1的碱基序列为：

GCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTT。

SEQ ID No.2的碱基序列为：

TGTGGATTAAGTTTTAAGAGCATACTGATGTAGGCAAAACGCAATAAAGATTATAATAAGCATAATAATGAACTTAAGGATGCTGCTACACAGACCCTCATGTTAGACCAGCAAACCATTAACATCATCAAAGCCACTGTTCCTGTATTGAAGGAGCATGGCGTTACCATTACCACGACTTTTTATAAAAACTTGTTTGCCAAACACCCTGAAGTACGTCCTTTGTTTGATATGGGTCGCCAAGAATCTTTGGAGCAGCCTAAGGCTTTGGCGATGACGGTATTGGCGGCAGCGCAAAACATTGAAAATTTGCCAGCTATTTTGCCTGCGGTCAAAAAAATTGCAGTCAAACATTGTCAAGCAGGCGTGGCAGCAGCGCATTATCCGATTGTCGGTCAAGAATTGTTGGGTGCGATTAAAGAAGTATTGGGCGATGCCGCAACCGATGACATTTTGGACGCGTGGGGCAAGGCTTATGGCGTGATTGCAGATGTGTTTATTCAAGTGGAAGCAGATTTGTACGCTCAAGCGGTTGAATAA。

SEQ ID No.3的碱基序列为：

TGTGGATTAAGTTTTAAGAGCATACTGATGTAGGCAAAACGCAATAAAGATTATAATAAGCATAATAATGAACTTAAGGATGCTGCTACACAGACCCTCATGCTGGATCAGCAGACCATCAATATTATCAAAGCAACCGTTCCGGTGCTGAAAGAACATGGTGTTACCATTACCACCACCTTCTATAAAAACCTGTTTGCCAAACATCCGGAAGTTCGTCCGCTGTTTGATATGGGTCGTCAAGAAAGCCTGGAACAGCCGAAAGCACTGGCAATGACCGTTCTGGCAGCAGCACAGAATATTGAAAATCTGCCTGCAATTCTGCCTGCCGTTAAAAAGATTGCAGTTAAACATTGTCAGGCAGGCGTTGCAGCAGCCCATTATCCGATTGTTGGTCAAGAACTGCTGGGTGCAATTAAAGAAGTTCTGGGCGACGCAGCAACCGATGATATTCTGGATGCATGGGGTAAAGCATATGGTGTTATTGCCGATGTTTTTATTCAGGTTGAAGCAGATCTGTATGCACAGGCAGTTGAATAA。

实施例2：检测重组质粒的产量

为比较构建前后的重组质粒在实际生产中的产量水平，分别进行了重组质粒小、中及发酵罐(5L)水平的质粒产量测定，以验证重组质粒产量的提升效果，所有质粒均统一重新转化至stbl3感受态细胞(购自上海生工生物)。

(1)质粒小提

分别接种质粒pAAV-EGFP、pAAV-vgb-RNAII-EGFP及pAAV-vgb-RNAII-EGFP的3个单克隆菌落至2.5mL LB液体培养基(含100μg/mL Amp)，32℃，250rpm，培养24h，提取质粒，50μL Elution Buffer洗脱，测定产量；质粒提取结果如表2和图1所示。

表2质粒小提产量

可知，与原质粒pAAV-EGFP产量相比，pAAV-vgb-RNAII-EGFP、pAAV-vgb2.0-RNAII-EGFP质粒小提产量分别平均提升了6.54和7.89倍。

(2)质粒中提

分别接种转化有pAAV-EGFP、pAAV-vgb-RNAII-EGFP和pAAV-vgb2.0-RNAII-EGFP质粒的分别按照1‰的接种量接种至80mL LB液体培养基(含100μg/mL Amp)，32℃，250rpm，培养24h，提取质粒，300μL中提洗脱液洗脱，测定产量，重复2次实验。质粒提取结果如表3、表4和图2、图3所示。

表3质粒第一次中提产量

质粒	编号	浓度(ng/μL)	A260/A280	A260/230
					pAAV-EGFP	1	366.7	1.89	2.40
pAAV-vgb-RNAII-EGFP	2	635.9	1.89	2.30
					pAAV-vgb2.0-RNAII-EGFP	3	1037.7	1.86	2.31

表4质粒第二次中提产量

质粒	编号	浓度(ng/μL)	A260/A280	A260/230
					pAAV-EGFP	1	450.4	1.92	2.36
pAAV-vgb-RNAII-EGFP	2	804.1	1.89	2.33
					pAAV-vgb2.0-RNAII-EGFP	3	1204.1	1.90	2.37

以上可知，与原质粒pAAV-EGFP产量相比，pAAV-vgb-RNAII-EGFP质粒中提产量最高提升了1.81倍，pAAV-vgb2.0-RNAII-EGFP质粒中提产量最高提升了2.82倍。

(3)5L发酵罐质粒提取

分别按照1‰的体积比接种转化有pAAV-EGFP、pAAV-vgb-RNAII-EGFP和pAAV-vgb2.0-RNAII-EGFP质粒载体的菌液至80mL LB液体培养基(含100μg/mL Amp)，32℃，250rpm，培养18h，以制备种子液；接种发酵，打开发酵罐，迅速按照4％的体积比接种上述种子液，进行发酵，于发酵第11、13、24、26、28收集100μL菌液小提质粒，50μL Elution Buffer洗脱，做产量比较。质粒提取结果如表5和图4所示。

表5发酵罐(5L)质粒提取产量

可知，与原质粒pAAV-EGFP产量相比，在28h内pAAV-vgb-RNAII-EGFP和pAAV-vgb2.0-RNAII-EGFP的质粒产量高于前者约1.69倍和2.08倍。

(4)质粒中提发酵过程中，不同接种比例、不同发酵时段质粒产量的比较

接种转化pAAV-EGFP、pAAV-vgb-RNAII-EGFP和pAAV-vgb2.0-RNAII-EGFP质粒的种子液，至5mL LB液体培养基(含100μg/mL Amp)，32℃，250rpm，培养8h，调整菌液OD600＝0.2，再次分别以1:1000和1:100的接种比例接种至80mL LB液体培养基(含100μg/mL Amp)，32℃，250rpm，培养20h，并于接种第8、12、16、24h时取菌液，提取质粒，质粒产量测定情况如图5和图6所示。

结果表明，质粒pAAV-vgb-RNAII-EGFP和pAAV-vgb2.0-RNAII-EGFP在发酵后期仍保持更高的产量，且进一步提高接种比例更有利于质粒产量提升。优化后的透明颤菌血红蛋白基因vgb在重组质粒中表达后，能够提高细胞对溶氧的利用率，改善细胞的氧输送效率，使细胞适应低溶氧水平，在贫氧环境中已然保持生长活性，通式提高细胞中目的产物的产量和收率。

实施例3：测定质粒的AVV包装滴度

(1)细胞铺板

转染前24h解离293T细胞(购自ATCC)铺板，1+E7 cell/15cm皿，25mL/皿A液(10％FBS+1％青霉素-链霉素+DMEM)，37℃，5％CO₂培养24h；

(2)贴壁转染

质粒pAAV-EGFP、pAAV-vgb-RNAII-EGFP和pAAV-vgb2.0-RNAII-EGFP各2皿。

(3)试剂与质粒配比

转染溶液I(DMEM)：0.75mL/皿，转染溶液II(PEI pro)：皿数*21.6μL/皿。

(4)质粒与转染溶液的孵育

50mL离心管中加入分别转染溶液I、血清型、辅助质粒混合液、转染溶液II和重组质粒pAAV-EGFP/pAAV-vgb-RNAII-EGFP/pAAV-vgb2.0-RNAII-EGFP，混匀，静置5min，加50mL的B液(1％FBS+1％青霉素-链霉素+DMEM)，混匀；

(5)细胞与转染试剂和质粒的结合：去除24h前铺板的293T细胞A液，加入上述混合液25mL/皿，37℃，5％CO₂培养72h后收病毒。

进行AAV滴度检测：收集细胞及悬液，加入2mL氯仿，37℃，摇床震荡裂解1h，12000rpm，离心5min，取上清，检测裂解液中病毒滴度。

AAV包装滴度测定结果如图7所示，vgb+RNAII调控基因序列的引入略微降低了AAV包装滴度，但vgb密码子优化后的vgb2.0+RNAII序列改善了这一不利影响。

本发明构建了一种高产质粒，通过添加RNAII正向调控元件与vgb基因序列插入一个腺相关病毒载体质粒复制起点上游，并对vgb基因序列密码子进行优化。重组质粒可在大肠杆菌感受态细胞中复制。通过不同规模的质粒发酵测试结果分析，构建后的质粒在大肠杆菌中的质粒小提产量平均提升了7.89倍，中提产量最高提升了1.79倍；在对透明颤菌血红蛋白基因(vgb)密码子优化后与优化前相比质粒中提产量最高提升了2.67倍；vgb密码子未优化和优化前后，在5L体积的发酵罐中，发酵28h时的质粒产量分别较原质粒产量提高了1.69和2.08倍。通过质粒的病毒包装滴度测试的比较，改造后的质粒产量得到较大提升，且不显著影响下游的AAV包装滴度，具有较高的应用价值。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.一种高产质粒，其特征在于，所述质粒为包括正调控元件RNAII基因序列和透明颤菌血红蛋白基因序列的AAV载体质粒；

所述正调控元件RNAII基因序列如SEQ ID No.1所示；

所述透明颤菌血红蛋白基因序列如SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示。

2.权利要求1所述的高产质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将所述正调控元件RNAII基因序列插入所述AAV载体质粒复制起始位点上游；

（2）将所述透明颤菌血红蛋白基因序列插入所述正调控元件RNAII基因序列的上游。

3.一种高产宿主菌，其特征在于，包含权利要求1所述的高产质粒；所述宿主菌为大肠杆菌。

4.一种细胞，其特征在于，包含权利要求1所述的高产质粒。

5.一种病毒，其特征在于，包含权利要求1所述的高产质粒中的所述正调控元件RNAII基因序列和透明颤菌血红蛋白基因序列。

6.权利要求1所述的高产质粒、权利要求2所述的构建方法、权利要求3所述的高产宿主菌在发酵质粒生产中的应用。

7.权利要求1所述的高产质粒、权利要求2所述的构建方法、权利要求4所述的细胞、权利要求5所述的病毒在AAV包装中的应用。