CN104630258A - 一种酿酒酵母基因表达系统及其构建与应用 - Google Patents
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Abstract
一种整合型酿酒酵母基因表达系统，包括一种表达载体，所述表达载体从5’-3’依次包括以下可操作性元件：pMD19-Tsimple质粒骨架、rDNA同源重组序列、外源基因表达盒和筛选标记基因表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依次包括启动子、外源基因插入酶切位点以及转录终止子；所述筛选标记基因表达盒包括启动子、抗生素抗性基因、转录终止子。所述酵母为酿酒酵母。本发明的表达载体可实现在酿酒酵母中的整合型稳定表达，对酿酒酵母的基础理论研究及产品开发具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种整合型酿酒酵母基因表达系统及其构建方法及应用。
背景技术
随着基因组学日新月异地发展，人们迫切寻求合适的表达系统用于新型基因的挖掘和新型工程细胞的构建，为此，各种不同的表达体系应运而生，如细菌、昆虫细胞、酵母、哺乳动物细胞表达系统等。近年来以酿酒酵母为代表的酵母表达系统以其独特生物学特性，已成为代谢工程改造生产生物基产品、有效表达新型外源基因，服务于基础研究、工业和医药应用的重要工具。酿酒酵母是迄今为止伴随人类生产、生活最长，和人类关系最密切的一种酵母。不仅可用于酿酒、面包和馒头制作等，是最具生物安全性的微生物，还可用于酒精、酶、氨基酸等工业生产，是现代分子和细胞生物学中重要的真核模式菌株。
由于酿酒酵母在工业生产中具有良好的发酵性能，在发酵过程中能够快速繁殖、对杂菌污染具有较强抗性，使其在基因工程技术中常被用于代谢工程改造的出发菌株。通过基因表达和基因敲除等手段的运用，所构建的酿酒酵母代谢工程菌常被用于大宗化学产品的生产，如燃料乙醇、丁醇、大宗化学品乳酸、高附加值产品木糖醇、有机酸类以及微生物菌体蛋白等多种生物基产品，同时由于其较好的生物安全性，使其在医药、食品行业也具有广泛的应用。
然而，良好的模式菌株，除自身具有的优良特色外，还需要可适用的载体工具的有效支持，用以充分挖掘相关菌株优良信息，因此，目前发展了多种类型的表达载体。其中，附加型质粒是应用于酿酒酵母的常规质粒，以酿酒酵母自身2μ复制子序列作为能够在细胞内自主复制的调控序列。附加型质粒具有较高的转化效率和拷贝数，但是在非选择压力条件下不稳定，传代易丢失(Malissard M,Zeng S,Berger E.The yeast expression system for recombinant glycosyltransferases.Glycocon Jugate Journal,1999,16(2):125-139)，因此附加型质粒难以有效进行外源基因的稳定表达，无法适应大规模生产的要求。
因此，为了提高质粒系统在酿酒酵母中稳定传代与表达，需采用整合的方式将质粒有效整合于酿酒酵母的基因组中，在细胞繁殖过程中使其复制能够同基因组的复制同时进行。同时，也需要兼顾基因的拷贝数情况来选择合适的整合位点。早期的整合型质粒的整合位点多为营养标记基因，在基因组中的拷贝数较少，导致整合的质粒拷贝数也较少，使得蛋白表达量低，无法满足大规模生产的需求。
rDNA序列在酵母基因组中有100-200个拷贝单元，是整合型质粒在酿酒酵母基因组中优良的整合位点。因此可选择以该序列为基础构建在酿酒酵母中适用的整合型表达载体，从而实现所构建的质粒在酵母细胞中以一定拷贝数稳定存在并表达。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种应用于酿酒酵母的表达系统。本发明的表达载体可实现在酿酒酵母中的整合型稳定表达，对酿酒酵母的基础理论研究及产品开发具有重要的意义。
本发明的技术方案如下：
本发明一方面涉及一种酿酒酵母的基因表达系统，包括一种新型表达载体，其为环状，从5’-3’依次可操作性地连接有以下元件：
pMD19-Tsimple质粒骨架、rDNA同源重组序列、外源基因表达盒和筛选标记基因表达盒；
所述外源基因表达盒自上游至下游依次包括启动子、外源基因插入酶切位点以及转录终止子；
所述筛选标记基因表达盒包括启动子、抗生素抗性基因、转录终止子。
所述酵母为酿酒酵母。
所述的表达载体中的外源基因表达盒启动子和转录终止子的DNA序列来自Spathaspora passalidarum，该酵母全基因组序列在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的编号为NZ_AEIK00000000，其中所述酵母可为来自美国农业研究菌种保藏中心的细胞株NRRL Y-27907。
优选的，所述的rDNA同源重组序列为18s rDNA，序列如SEQ ID NO:1所示。另一个选择是，所述的rDNA序列与SEQ ID NO:1的相似性不低于90％，优选为95％，更优为98％。
所述rDNA同源重组序列为18s rDNA序列。
所述外源基因表达盒中的启动子包括SpADHP、SpXYLP；转录终止子包括SpCYC1T、SpXYLT。
所述筛选标记基因表达盒中的启动子包括SpTEF1P；抗生素抗性基因可以是表达载体中常用的，包括潮霉素抗性基因、博来霉素抗性基因、G418；转录终止子包括SpCYC1T、ScCYC1T。
所述的18s rDNA序列如SEQ ID NO:1所示；
所述的SpADHP启动子为Spathaspora passalidarum来源的乙醇脱氢酶基因ADH1启动子，该启动子的DNA序列如SEQ ID NO:2所示；
所述的SpXYLP启动子为Spathaspora passalidarum来源的木糖还原酶基因XYL启动子，该启动子的DNA序列如SEQ ID NO:3所示；
所述的SpTEF1P启动子为Spathaspora passalidarum来源的转录起始因子基因TEF1启动子，该启动子的DNA序列如SEQ ID NO:4所示；
所述的SpCYC1T终止子为Spathaspora passalidarum来源的细胞色素C基因CYC1终止子，该终止子的DNA序列如SEQ ID NO:5所示；
所述的SpXYLT终止子为Spathaspora passalidarum来源的木糖还原酶基因XYL终止子，该终止子的DNA序列如SEQ ID NO:6所示。
所述的ScCYC1T终止子为Saccharomyces cerevisiae来源的细胞色素C基因CYC1终止子，该终止子的DNA序列如SEQ ID NO:7所示。
所述外源基因的DNA片段可包括所述外源基因和筛选标记基因，所述外源基因插入所述外源基因表达盒中启动子和转录终止子之间。在本发明的一个实施例中，所述外源基因为gfp基因，该基因的DNA序列如SEQ ID NO:11所示。
所述的筛选标记基因表达盒中可包括一个以上的标记基因，所述标记基因可为潮霉素B抗性基因、博来霉素抗性基因和/或G418；在本发明的一个实施方案中，所述标记基因是潮霉素B抗性基因。
所述的潮霉素B抗性基因的DNA序列如SEQ ID NO:8所示。
所述的博来霉素抗性基因的DNA序列如SEQ ID NO:9所示。
所述的G418的DNA序列如SEQ ID NO:10所示。
本发明所使用的宿主酵母为酿酒酵母。具体的，该酿酒酵母为a型单倍体菌株Saccharomyces cerevisiae ANGA1。所述Saccharomyces cerevisiae ANGA1的制 备方法为：郭忠鹏.代谢工程改善工业酒精酵母发酵性能[D]:[博士学位论文].无锡：江南大学生物工程学院，2011，第二章内容所述。
具体而言，发明人按照下述技术方案制备得到了新型表达载体：
以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P1和P2进行PCR扩增获得18s rDNA同源重组序列；以引物P5和P6进行PCR扩增获得SpTEF1P启动子；以引物P7和P8进行PCR扩增获得SpADH1P启动子；以引物P9和P10进行PCR扩增获得SpXYLP启动子；以引物P11和P12进行PCR扩增获得SpCYC1T终止子；以引物P13和P14进行PCR扩增获得SpXYLT终止子。以pRS303H质粒DNA为模板，以引物P3和P4进行PCR扩增获得片段hph-ScCYC1T。所述引物P1-P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.13-14所示，所述P5-P14的核苷酸序列如SEQ ID NO17-26所示。
以pMD19-Tsimple为骨架，将上述各片段连接，所述连接是在适当的限制酶酶切位点上进行的。具体连接方式为：在pMD19-Tsimple的EcoR V酶切位点连接18s rDNA后，沿着18s rDNA的方向依次连接外源基因表达盒启动子、外源基因表达盒转录终止子、SpTEF1P启动子、hph-ScCYC1T。
酵母基因表达调控是一个非常复杂的过程，选择合适的启动子和转录终止子对外源蛋白的表达至关重要。本发明提供了可供外源蛋白表达的启动子和转录终止子组合，包括SpADHP-SpCYC1T、SpXYLP-SpCYC1T、SpADHP-SpXYLT、SpXYLP-SpXYLT、SpTEF1P-SpCYC1T、、SpXYLP-SpXYLT。
所述启动子根据以下方法预测获得：
(1)根据Spathaspora passalidarum基因组序列，选择酵母表达系统中常用的启动子所属基因与上一个基因的开放阅读框之间的所有核苷酸片段；
(2)采用启动子在线测评软件，对可能的启动子序列进行在线预测；
(3)根据高评分值的潜在启动子序列，设计引物扩增获得待测启动子序列。
所述终止子根据以下方法获得：
(1)根据Spathaspora passalidarum基因组序列，选择酵母表达系统中常用的终止子所属基因的开放阅读框后约300bp作为待测终止子序列。
(2)设计引物扩增获得所述待测终止子。
所述外源蛋白表达的启动子和转录终止子组合用于外源基因的功能表达。在实施例中，gfp基因插入所述外源蛋白表达的启动子和转录终止子之间。
所述的基因表达载体整合于所述酿酒酵母宿主菌的基因组中。
所述酿酒酵母宿主菌是(但不限于)Saccharomyces cerevisiae ANGA1(郭忠鹏.代谢工程改善工业酒精酵母发酵性能[D]:[博士学位论文].无锡：江南大学生物工程学院，2011)。
在本发明的一个实施例中，所述酿酒酵母宿主菌为Saccharomyces cerevisiae ANGA1(郭忠鹏.代谢工程改善工业酒精酵母发酵性能[D]:[博士学位论文].无锡：江南大学生物工程学院，2011)。
本发明的另一个方面，提供了一种酿酒酵母基因表达系统的构建方法，包括以下步骤：
所述酿酒酵母基因表达系统的表达载体构建：
根据Spathaspora passalidarum全基因组序列，调取Spathaspora passalidarum18s rDNA部分序列作为同源重组位点。以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P1和P2进行PCR扩增获得18s rDNA同源重组序列，同时在片段上游引入酶切位点EcoR I，下游引入酶切位点Bgl II、BamH I和Kpn I。将PCR产物纯化后克隆至质粒pMD19-Tsimple，获得重组质粒pMD-18s rDNA。
以pRS303H质粒DNA为模板，以引物P3和P4进行PCR扩增获得片段hph-ScCYC1T，同时在片段上游引入BamH I、Pst I，下游引入Kpn I。将纯化的PCR产物和重组质粒pMD-18s rDNA分别用BamH I和Kpn I双酶切，酶切产物连接获得重组质粒PR-hph。
以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P5和P6进行PCR扩增获得SpTEF1P启动子，同时在片段两端引入酶切位点BamH I和Pst I。将纯化的PCR产物和重组质粒PR-hph分别用BamH I和Pst I双酶切，酶切产物连接获得重组质粒PRTH。
以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P7和P8进行PCR扩增获得SpADHP启动子；以引物P9和P10进行PCR扩增获得SpXYLP启动子；同时在片段的上游引入酶切位点Bgl II，下游引入酶切位点Sal I和BamH I。将纯化的PCR产物和重组质粒PRTH分别用Bgl II和Sal I双酶切，将酶切的重组质粒和PCR产物连接获得重组质粒PRATH和PRXTH。
以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P11和P12进行PCR扩增获得SpCYC1T终止子；以引物P13和P14进行PCR扩增获得SpXYLT终止 子。在片段上游引入酶切位点Sal I和Not I，在片段下游引入酶切位点BamH I。将纯化的PCR产物和重组质粒PRATH与PRXTH分别用Sal I和BamH I双酶切，酶切产物连接获得PR系列重组质粒PRACTH、PRAXTH、PRXCTH和PRXXTH。
所述引物P1-P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.13-14所示；
所述引物P5-P14的核苷酸序列如SEQ ID NO17-26所示。
本发明提供了宿主菌酿酒酵母的活化与培养。
本发明还提供了PR系列重组质粒在宿主菌酿酒酵母中的遗传转化。
本发明还提供了宿主菌酿酒酵母阳性转化子筛选。
所述酿酒酵母基因表达系统的构建方法，其中，所述表达载体是重组质粒PRACTH，其中外源基因表达盒的启动子和终止子分别为SpADHP和SpCYC1T。
所述酿酒酵母基因表达系统的构建方法，其中，所述表达载体是重组质粒PRAXTH，其中外源基因表达盒的启动子和终止子分别为SpADHP和SpXYLT。
所述酿酒酵母基因表达系统的构建方法，其中，所述表达载体是重组质粒PRXCTH，其中外源基因表达盒的启动子和终止子分别为SpXYLP和SpCYC1T。
所述酿酒酵母基因表达系统的构建方法，其中，所述表达载体是重组质粒PRXXTH，其中外源基因表达盒的启动子和终止子分别为SpXYLP和SpXYLT。
所述酿酒酵母基因表达系统的构建方法，其中所述的遗传转化方法包括PEG-LiAC转化法、电转化法和原生质体转化法，优选的转化方法是PEG-LiAC转化法。
所述酿酒酵母基因表达系统的构建方法，其中，所述宿主菌酿酒酵母转化子筛选方法为抗性平板筛选，对经过初步筛选的转化子进行菌落PCR或基因组PCR检测，并最终通过检测外源蛋白活性或代谢产物的方法确定转化子。
本发明提供了一种表达外源基因的方法，包括如下步骤：
(1)提供所述的整合型酿酒酵母基因表达系统；
(2)将外源基因插入所述表达载体的外源基因插入酶切位点，获得重组表达载体；
(3)将所述重组表达载体转化宿主菌酿酒酵母并在宿主菌中表达所述外源基因。
本发明还提供了一种代谢工程改造宿主菌酿酒酵母的方法，包括如下步骤：
(1)提供权利要求1所述的整合型酿酒酵母表达系统；
(2)将目标基因插入所述表达载体的外源基因插入酶切位点，获得重组表达载体；
(3)将所述重组表达载体转化宿主菌酿酒酵母并在宿主菌中表达所述目标基因；
(4)培养所述重组菌，检测所述重组菌代谢产物。
发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。本发明有益的技术效果在于：
1、本发明提供了能够应用于酿酒酵母表达外源基因的启动子和终止子，并以此构建了一系列新型表达载体，采用该系列表达载体，可方便地对该酵母进行外源蛋白的表达和代谢工程改造。
2、本发明所述的整合型表达载体中，尝试采用多个rDNA序列作为整合位点，但仅有其中一个序列表现出整合效应，该序列为18s rDNA的部分序列，且该位点表现出拷贝数高，稳定性好的特点，使得该系列整合型表达载体成为能够适用于酿酒酵母表达外源蛋白及代谢工程改造的酵母多拷贝整合型表达载体。
3、本发明提供了用其他DNA分子转化酿酒酵母的方法，所述的DNA分子可来自在上述载体启动子和终止子之间连接酿酒酵母基因组片段所构成的文库中或合成的DNA分子。本发明从而可提供，能够用于表达基因多样性文库，产生能够从中筛选新的生物活性物质的产品的技术。
附图说明
图1为实施例1的潮霉素B抗性基因hph的CDS序列；
图2为实施例4的绿色荧光蛋白基因CDS序列；
图3为实施例4的绿色荧光蛋白重组质粒PRACTH-gfp的质粒图谱；
图4为实施例4的为绿色荧光蛋白重组质粒转化子菌落PCR验证图(M为Maker，泳道1-8为阳性转化子扩增结果，泳道9为阴性对照)；
图5为实施例4的绿色荧光蛋白重组质粒PRACTH-gfp转化酿酒酵母及GFP荧光显微镜检测(左图为暗场，右图为明场)；
图6为实施例5的植物乳杆菌L-乳酸脱氢酶基因序列；
图7为实施例5的乳酸脱氢酶重组质粒PRACTH-ldh的质粒图谱；
图8为实施例5的酿酒酵母基因工程菌生长及葡萄糖代谢情况。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行详细阐述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均视为落入本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本都按照常用克隆手册或制造商所建议的条件进行实验操作；所用试剂或仪器未注明生产商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
除非在本文中另作限定，本文所用的全部术语具有本发明所属领域的普通人员通常所理解的相同含义。
在本发明中，术语“可操作地连接”是指两个或多个核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子序列被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得该目的基因的转录受到该启动子的引导，使表达变得可行，从而，启动子序列被“可操作地连接”到该核酸序列上。通常，术语“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是相邻的，所述序列的连接是通过在适当的限制酶切位点上进行连接来实施的。如果所述位点不存在，可以使用根据常规方法合成的寡聚核苷酸衔接子或接头。
实施例1：PR系列整合型表达载体的构建
一、重组质粒pMD-18s rDNA的构建
(1)根据Spathaspora passalidarum全基因组序列(GenBank accession NZ_AEIK00000000)，设计两条引物截取Spathaspora passalidarum 18s rDNA部分序列作为同源重组位点。引物序列如下：引物P1下划线部分为EcoR I的识别位点，引物P2下划线部分由5’到3’端分别为Bgl II、BamH I和Kpn I的识别位点。
P1：5’GCCGGAATTCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTC3’
P2：5’ATATTAGGGGTACCCGGGATCCGAAGATCTGTTGAAGAGCAATAAT3’
(2)过夜培养Spathaspora passalidarum，收集细胞，分离、提取基因组DNA。
(3)以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P1和P2进行PCR扩增。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃ 延伸1.5min，30个循环，72℃延伸5min。纯化回收PCR扩增产物后克隆至pMD19-Tsimple载体，获得重组质粒pMD-18s rDNA。
二、重组质粒PR-hph的构建
(1)根据质粒pRS303H(Taxis C,Knop M.System of centromeric,episomal,and integrative vectors based on drug resistance markers for Saccharomyces cerevisiae.BioTechniques,2006,40(1):73-78.)中潮霉素抗性基因表达盒序列，设计两条引物：引物P3下划线部分由5’到3’端分别为BamH I和Pst I的识别位点，引物P4下划线部分为Kpn I的识别位点。
P3：5’CGGGATCCAAACTGCAGATGGGTAAAAAGCCTGAACTCAC3’
P4：5’GGGGTACCAACTCCTTCCTTTTCGGTTAGAGCG3’
(2)以pRS303H质粒DNA为模板，以引物P3和P4进行PCR扩增，获得PCR产物。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃延伸5min。
(3)将纯化的PCR产物和重组质粒pMD-18s rDNA分别用BamH I和Kpn I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞(购自北京全式金公司)，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后BamH I和Kpn I双酶切验证，获得重组质粒PR-hph，潮霉素B抗性基因hph的CDS序列如图1所示。
三、重组质粒PRTH的构建
(1)根据Spathaspora passalidarum全基因组序列(GenBank accession NZ_AEIK00000000)和在线数据库EMBL-EBI(http://www.ebi.ac.uk/)提供的序列信息，获得Spathaspora passalidarum转录起始因子和上一个基因开放阅读框之间的所有DNA序列。根据启动子软件(http：//www.softberrv.com和http://www.cbs.dtu.dk/services/)对上述序列进行在线预测，之后根据所选序列酶切位点情况设计两条引物，调取Spathaspora passalidarum转录起始因子上游700bp左右作为启动子SpTEF1P：引物P5下划线部分为BamH I的识别位点，引物P6下划线部分为Pst I的识别位点。
P5：5’CGGGATCCACCACTTACATAATAGAAAGAC 3’
P6：5’ACGAGCCTGCAGTTTTGATTGATTGATTG 3’
(2)以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P5和P6进行 PCR扩增，获得PCR产物。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环，72℃延伸5min。
(3)将纯化的PCR产物和重组质粒PR-hph分别用BamH I和Pst I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后BamH I和Pst I双酶切验证，获得重组质粒PRTH。
四、重组质粒PRATH和PRXTH的构建
(1)根据Spathaspora passalidarum全基因组序列(GenBank accession NZ_AEIK00000000)和在线数据库EMBL-EBI(http://www.ebi.ac.uk/)提供的序列信息，获得Spathaspora passalidarum乙醇脱氢酶与木糖还原酶分别和上一个基因开放阅读框之间的所有DNA序列。根据启动子软件(http：//www.softberrv.com和http://www.cbs.dtu.dk/services/)对上述序列进行在线预测，之后根据所选序列酶切位点情况设计引物，调取Spathaspora passalidarum乙醇脱氢酶和木糖还原酶开放阅读框上游1000bp左右作为启动子，即SpADHP和SpXYLP：引物P7和P9下划线部分为Bgl II的识别位点，引物P8和P10下划线部分由5’到3’端分别为BamH I和Sal I的识别位点。
P7：5’GCCGGAAGATCTGTAAATTAATGCTACATCAGTTGAGG 3’
P8：5’CGGGATCCACGCGTCGACTATATTTTATTTAGGAATT 3’
P9：5’GCCGGAAGATCTGTGACATAGTTAACTATGGC 3’
P10：5’CGGGATCCACGCGTCGACTTTATTGTATTGTG 3’
(2)以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P7和P8进行PCR扩增，获得片段SpADHP。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸5min。
(3)以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P9和P10进行PCR扩增，获得片段SpXYLP。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸5min。
(4)将纯化的片段SpADHP和重组质粒PRTH分别用Bgl II和BamH I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Bgl II和BamH I双酶切验证，凝胶电泳后显示1000bp左右条带的即正向连接，获得重组质粒 PRATH。
(5)将纯化的片段SpXYLP和重组质粒PRTH分别用Bgl II和BamH I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Bgl II和BamH I双酶切验证，凝胶电泳后显示1000bp左右条带的即正向连接，获得重组质粒PRXTH。
五、PR系列整合型表达载体的构建
(1)根据Spathaspora passalidarum全基因组序列(GenBank accession NZ_AEIK00000000)和在线数据库EMBL-EBI(http://www.ebi.ac.uk/)提供的序列信息，获得Spathaspora passalidarum细胞色素C1和木糖还原酶开放阅读框下游序列。设计引物调取Spathaspora passalidarum细胞色素C1和木糖还原酶开放阅读框下游300bp左右作为转录终止子，即SpCYC1T和SpXYLT：引物P11和P13下划线部分由5’到3’端分别为Sal I和Not I的识别位点，引物P12和P14下划线部分为BamH I的识别位点。
P11：5’ACGCGTCGACATAAGAATGCGGCCGCGCTAACTTCAATTAGAAT3’
P12：5’CGGGATCCCATCACTATAAGCGAAATCGGGTTTC 3’
P13：5’ACGCGTCGACATAAGAATGCGGCCGCGTTTGATTCTAGTTTATAT3’
P14：5’GCGCGGATCCATAGTTAACTATGTCACTTGAACTC 3’
(2)以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P11和P12进行PCR扩增，获得片段SpCYC1T。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸5min。
(3)以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物P13和P14进行PCR扩增，获得片段SpXYLT。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸5min。
(4)将纯化的片段SpCYC1T和重组质粒PRATH分别用Sal I和BamH I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和BamH I双酶切验证，获得重组质粒PRACTH。
(5)将纯化的片段SpCYC1T和重组质粒PRXTH分别用Sal I和BamH I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和BamH I双酶切验证，获得重组质粒PRXCTH。
(6)将纯化的片段SpXYLT和重组质粒PRATH分别用Sal I和BamH I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和BamH I双酶切验证，获得重组质粒PRAXTH。
(7)将纯化的片段SpXYLT和重组质粒PRXTH分别用Sal I和BamH I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和BamH I双酶切验证，获得重组质粒PRXXTH。
实施例2：PEG/LiAc介导的酿酒酵母转化方法的建立。
根据：郭忠鹏.代谢工程改善工业酒精酵母发酵性能[D]:[博士学位论文].无锡：江南大学生物工程学院，2011提供的方法制备Saccharomyces cerevisiae ANGA1作为宿主菌，采用PEG/LiAc介导转化酵母的方法实施如下：
一、Saccharomyces cerevisiae ANGA1感受态的制备
(1)将冻存管保藏的Saccharomyces cerevisiae ANGA1接种于YPD培养基，摇瓶活化培养48h。
(2)将活化好的菌液在YPD平板上划线培养，并4℃保存。
(3)于YPD平板中挑取酿酒酵母单菌落，接种于20ml YPD培养基中，于100ml摇瓶中30℃过夜培养。
(4)将过夜培养的新鲜菌液接种于50ml YPD培养基中，于250ml摇瓶中30℃，200rpm培养，至菌液OD600到1.2左右。
(5)5000rpm室温离心5min，收集菌体细胞。
(6)将细胞重新悬浮于500μl 0.1mol/L的LiAc中，离心，弃上清，获得感受态细胞。
二、线性化重组质粒的制备
(1)将含有重组表达质粒的E.coli接种于LB培养基，过夜培养。
(2)收集E.coli菌体细胞，采用碱裂法提取重组质粒，具体方法参照博大泰克质粒提取试剂盒。
(3)采用限制性内切酶Stu I单酶切重组质粒，酶切反应体系(50μL)：40μL DNA，5μL buffer，1.5μL限制性内切酶Stu I，用双蒸水补足50μL，混匀后置于37℃恒温箱中酶切2h。
(4)纯化酶切产物，获得线性化重组质粒。
三、PEG/LiAc法转化酿酒酵母
(1)在感受态细胞中顺序加入下列转化混合液：240μL PEG3350，36μL1.0mol/L LiAc，25μL鲑鱼精DNA，50μL待转化线性DNA，其中鲑鱼精DNA沸水浴10min后立即冰浴；
(2)剧烈振荡每个反应管直至细胞完全混匀；
(3)置于30℃温育1h；
(4)置于42℃金属浴热击22min；
(5)待降至室温后，5000rpm离心5min，弃上清；
(6)加入1ml YPD培养基，于30℃后培养2h；
(7)5000rpm离心5min，弃掉800μl上清，混匀菌体并涂布潮霉素B(250mg/mL)抗性平板，30℃培养3-4d，获得转化子。
实施例3：电穿孔法介导的酵母酿酒酵母转化方法的建立
根据：郭忠鹏.代谢工程改善工业酒精酵母发酵性能[D]:[博士学位论文].无锡：江南大学生物工程学院，2011提供的方法制备Saccharomyces cerevisiae ANGA1作为宿主菌，采用电穿孔法介导转化酵母的实施如下：
一、Saccharomyces cerevisiae ANGA1电转感受态细胞的制备
(1)将冻存管保藏的Saccharomyces cerevisiae ANGA1接种于YPD培养基，摇瓶活化培养48h；
(2)将活化好的菌液在YPD平板上划线培养，并4℃保存；
(3)于YPD平板中挑取酿酒酵母单菌落，接种于20ml YPD培养基中，于100ml摇瓶中30℃过夜培养；
(4)将过夜培养的新鲜菌液接种于50ml YPD培养基中，于250ml摇瓶中30℃，200rpm培养，至菌液OD600到1.2左右；
(5)将菌液置于冰上30min，5000rpm，4℃离心5min，收集菌体细胞；
(6)加入预冷的20ml双蒸水洗涤菌体2次，5000rpm，4℃离心5min，收集菌体细胞；
(7)加入20ml预冷的1.0mol/L山梨醇洗涤菌体2次，5000rpm，4℃离心5min，收集菌体细胞；
(8)加入200μl预冷的1.0mol/L山梨醇混匀菌体细胞，获得感受态细胞。
二、线性化重组质粒的制备
(1)将含有重组表达质粒的E.coli接种于LB培养基，过夜培养。
(2)收集E.coli菌体细胞，采用碱裂法提取重组质粒，具体方法参照博大泰克质粒提取试剂盒。
(3)采用限制性内切酶Stu I单酶切重组质粒，酶切反应体系(50μL)：40μL DNA，5μL buffer，1.5μL限制性内切酶Stu I，用双蒸水补足50μL，混匀后置于37℃恒温箱中酶切2h。
(4)纯化酶切产物，获得线性化重组质粒。
三、酿酒酵母的电转化
(1)取100μl电转化感受态细胞和10μl DNA混合，加入到0.2cm电转杯中；
(2)电转杯冰浴5min，设定条件1500v，电击5s，进行电转化；
(3)立即向电转杯中加入1ml预冷的1.0mol/L山梨醇，转移至培养箱30℃温育1h；
(4)5000rpm离心5min，弃上清；
(5)加入1ml YPD培养基，混匀菌体细胞，于培养箱30℃后培养2h；
(6)5000rpm离心5min，弃掉800μl上清，混匀菌体并涂布潮霉素B(250mg/mL)抗性平板，30℃培养3-4d，获得转化子。
实施例4：PR系列整合型表达载体在表达外源基因方面的应用。
一、构建绿色荧光蛋白重组表达载体
(1)根据绿色荧光蛋白的基因序列，设计引物：引物P33下划线部分为Sal I的识别位点，引物P34下划线部分为Not I的识别位点。
P15：5’ACGCGTCGACATGGGTAAGGGAGAAGAACTTTTCAC 3’
P16：5’ATAAGAATGCGGCCGCTTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATG 3’
(2)以绿色荧光蛋白基因的DNA为模板，以引物P33和P34进行PCR扩增，获得基因gfp。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸5min。
(3)将纯化的gfp片段克隆至pMD19-Tsimple载体，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和Not I双酶切验证，获得重组质粒pMD-gfp，绿色荧光蛋白基因gfp的CDS序列如图2所示。
(4)将重组质粒pMD-gfp和PRACTH分别用Sal I和Not I双酶切。gfp片段酶切纯化后与质粒PRACTH的酶切产物过夜连接，转化E.coli JM109菌株，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和Not I双酶切验证，获得绿色荧光蛋白重组表达载体PRACTH-gfp，质粒图谱如图3所示。
二、构建酿酒酵母重组菌
将经Stu I线性化的质粒PRACTH-gfp按实施例2或实施例3中所述方法，转化到Saccharomyces cerevisiae ANGA1(根据：郭忠鹏.代谢工程改善工业酒精酵母发酵性能[D]:[博士学位论文].无锡：江南大学生物工程学院，2011提供的方法制备)中，获得转化子。
三、转化子筛选与验证
(1)通过高浓度潮霉素B抗性平板筛选转化子。将绿色荧光蛋白重组表达载体转化酿酒酵母后获得的转化子转接于更高浓度潮霉素B(350μg/mL)抗性平板上，30℃培养2-3d，采用相同的方法连续转接3次，获得纯培养转化子菌株。
(2)阳性转化子的菌落PCR验证。以引物P3和P4配制PCR扩增体系，并在体系中加入微量微波处理的转化子菌体。PCR扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃延伸5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳显示1100bp左右条带，如图4所示，与DNA片段hph-ScCYC1T条带大小相符合。
(3)阳性转化子的荧光检测。将步骤(1)中获得的纯培养转化子菌株接种于YPD培养基中，摇瓶30℃培养18h后，收集菌体，双蒸水洗涤菌体细胞2次 并重悬于双蒸水中。吸取少量悬液置于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下用油镜观察并拍照。如图5所示，可以观察到细胞发出绿色荧光。
实施例5：PR系列整合型表达载体在酿酒酵母代谢工程改造方面的应用。
一、构建L-乳酸脱氢酶重组表达载体
(1)根据植物乳杆菌的L-乳酸脱氢酶基因序列，设计引物：引物P37下划线部分为Sal I和Xba I的识别位点，引物P38下划线部分为Not I的识别位点。
P17：5’ACGCGTCGACTGCTCTAGAATGCCAAATCATCAAAAAGTT 3’
P18：5’GGCGATAAGAATGCGGCCGCTTATTTATTTTCTAATTCAGC 3’
(2)以植物乳杆菌(购自江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心，http://cicim-cu.jiangnan.edu.cn/)菌体细胞为模板，采用高保真性聚合酶Primerstar，以引物P37和P38进行菌落PCR扩增，获得L-乳酸脱氢酶基因L-ldh。扩增条件为98℃预变性2min，98℃变性10s，62℃退火20s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸5min。
(3)将纯化的L-ldh片段克隆至pMD19-Tsimple载体，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和Not I双酶切验证，将验证正确的质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，挑选L-ldh的DNA序列正确的质粒，命名为pMD-ldh。L-ldh的DNA序列为SEQ ID NO:12，如图6所示。
(4)将重组质粒pMD-ldh和PRACTH分别用Sal I和Not I双酶切。将经酶切的L-ldh片段纯化后与质粒PRACTH的酶切产物过夜连接，转化E.coli JM109菌株，涂布于LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和Not I双酶切验证，获得L-乳酸脱氢酶重组表达载体PRACTH-ldh，质粒图谱如图7所示。
二、构建酿酒酵母基因工程菌
将经Stu I线性化的质粒PRACTH-ldh按实施例2或实施例3中所述方法，转化到Saccharomyces cerevisiae ANGA1(根据：郭忠鹏.代谢工程改善工业酒精酵母发酵性能[D]:[博士学位论文].无锡：江南大学生物工程学院，2011提供的方法制备)中，获得转化子。
三、转化子筛选与验证
(1)通过高浓度潮霉素B抗性平板筛选转化子。将L-乳酸脱氢酶重组表达载体转化酿酒酵母后获得的转化子转接于更高浓度潮霉素B(350μg/mL)抗性平板上，30℃培养2-3d，采用相同的方法连续转接3次，获得纯培养转化子菌株。
(2)阳性转化子的菌落PCR验证。以引物P21和P22配制PCR扩增体系，并在体系中加入微量微波处理的转化子菌体。PCR扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃延伸5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳显示1100bp左右条带，与DNA片段hph-ScCYC1T条带大小相符合。
四、阳性转化子摇瓶发酵及代谢产物分析。
(1)将上述步骤中获得的纯培养转化子菌株接种于20ml YPD培养基中，于100ml摇瓶中，30℃，200rpm条件下培养18h后，收集菌体，双蒸水洗涤菌体细胞2次并重悬于双蒸水中，获得种子细胞。
(2)将种子细胞接种于50ml YPD培养基中，使初始OD600在0.5左右。于100ml摇瓶，30℃，静置条件下进行发酵培养。定时取样测定菌液OD600及相关物质含量，其中OD600采用可见分光光度计在600nm下测定。葡萄糖、L-乳酸和乙醇用高效液相色谱法(HPLC)测定，色谱仪为DIONEX P680；泵为Agilent1100；检测器为示差折光检测器(RID)；色谱柱为SUGAR SH1011，条件：0.01mol/L H2SO4，流速0.8ml/min，进样量20ul，柱温50℃。取发酵上清液加入等体积10％的三氯乙酸，沉淀蛋白3小时以上，12000r/min离心20min，经0.45μm水膜过滤处理后，取20μl进样，采用示差检测器检测相关物质。酿酒酵母生长及葡萄糖代谢情况如图8所示。
Claims (9)
1.一种整合型酿酒酵母基因表达系统，其特征在于包括一种表达载体，所述表达载体从5’-3’依次包括以下可操作性元件：
pMD19-Tsimple质粒骨架、rDNA同源重组序列、外源基因表达盒和筛选标记基因表达盒；
所述外源基因表达盒自上游至下游依次包括启动子、外源基因插入酶切位点以及转录终止子；
所述筛选标记基因表达盒包括启动子、抗生素抗性基因、转录终止子。
所述酵母为酿酒酵母。
2.根据权利要求1所述的表达系统，其特征在于所述rDNA同源重组序列为18s rDNA序列。
3.根据权利要求1所述的表达系统，其特征在于所述外源基因表达盒中的启动子包括SpADHP、SpXYLP；转录终止子包括SpCYC1T、SpXYLT。
4.根据权利要求1所述的表达系统，其特征在于所述筛选标记基因表达盒中的启动子包括SpTEF1P；抗生素抗性基因包括潮霉素抗性基因、博来霉素抗性基因、G418；转录终止子包括SpCYC1T、ScCYC1T。
5.根据权利要求2～4任一项所述的表达系统，其特征在于：
所述的18s rDNA序列如SEQ ID NO:1所示；
所述的SpADHP启动子为Spathaspora passalidarum来源的乙醇脱氢酶基因ADH1启动子，该启动子的DNA序列如SEQ ID NO:2所示；
所述的SpXYLP启动子为Spathaspora passalidarum来源的木糖还原酶基因XYL启动子，该启动子的DNA序列如SEQ ID NO:3所示；
所述的SpTEF1P启动子为Spathaspora passalidarum来源的转录起始因子基因TEF1启动子，该启动子的DNA序列如SEQ ID NO:4所示；
所述的SpCYC1T终止子为Spathaspora passalidarum来源的细胞色素C基因CYC1终止子，该终止子的DNA序列如SEQ ID NO:5所示；
所述的SpXYLT终止子为Spathaspora passalidarum来源的木糖还原酶基因XYL终止子，该终止子的DNA序列如SEQ ID NO:6所示；
所述的ScCYC1T终止子为Saccharomyces cerevisiae来源的细胞色素C基因CYC1终止子，该终止子的DNA序列如SEQ ID NO:7所示；
所述的潮霉素抗性基因的DNA序列如SEQ ID NO:8所示；
所述的博来霉素抗性基因的DNA序列如SEQ ID NO:9所示；
所述的G418的DNA序列如SEQ ID NO:10所示。
6.权利要求1～4任一所述的表达载体在宿主菌酿酒酵母遗传转化中的应用。
7.权利要求1所述的一种酿酒酵母基因表达系统的用途，其特征在于用于表达外源蛋白和宿主菌自身代谢工程改造。
8.一种表达外源基因的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)制备所述表达系统；
(2)将外源基因插入所述表达载体的外源基因插入酶切位点，获得重组表达载体；
(3)将所述重组表达载体转化宿主菌酿酒酵母并在宿主菌中表达所述外源基因。
9.一种代谢工程改造宿主菌酿酒酵母的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)制备所述表达系统；
(2)将目标基因插入所述表达载体的外源基因插入酶切位点，获得重组表达载体；
(3)将所述重组表达载体转化宿主菌酿酒酵母并在宿主菌中表达所述目标基因；
(4)培养所述重组菌，检测所述重组菌代谢产物。
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