CN112592954A - 基因GliT作为筛选标记基因在抗性筛选中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基因GliT作为筛选标记基因在抗性筛选中的应用。GliT基因其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。鉴于目前尚未有关于深海真菌基因作为分子筛选标记的相关报道。因此本发明从深海真菌FS140的cDNA文库中获得了筛选标记GliT基因序列，并成功导入到酿酒酵母S.cerevisiae BJ5464中通过抗生素药物筛选进行功能验证，从结果推测GliT基因将抗生素药物转化成不具有生物活性的氧化产物，从而起到解毒作用。针对这一原理，GliT是一种非常有用的选择性标记，用来筛选和维持培养成功转染抗生素抗性基因的真核细胞，利于后续解析GliT基因与抗生素作用机制奠定分子生物学基础，同时可开发成一种高效表达且高抗的筛选标记基因应用于分子生物学、微生物学和医药等领域。

Description

基因GliT作为筛选标记基因在抗性筛选中的应用

技术领域

本发明涉及一种筛选标记基因，具体涉及基因GliT作为筛选标记基因在抗性筛选中的应用。

背景技术

筛选标记基因可使转化子获得自身所不具备的新的遗传特性；是遗传转化载体所必备的基本元件；是利用特定的选择培养基筛选转化子的一类特殊标记基因。抗性筛选是将抗性基因转入受体菌中使其在一定药物浓度下生长而表现抗药性的一类筛选方式。常用的抗性筛选标记基因分为抗生素抗性基因和除草剂抗性基因两类。抗生素类药物对细胞生长的抑制作用主要在于影响细胞壁的形成和细胞膜的功能、抑制核酸或蛋白质的生物合成。常用的抗生素包括潮霉素、遗传霉素、寡霉素、博来霉素及苯菌灵。

随着基因组时代的发展，主要丝状真菌基因组测序基本完成而被广泛应用于工业、农业、医药等领域。然而丝状真菌的遗传转化效率极低，为了保证在大量非转化子背景下能筛选到目标转化子，恰当的筛选标记显得尤为重要。在使用潮霉素抗性基因为分子标记的真菌遗传转化实验中，常会出现较多的假阳性和遗传性能不稳定的转化子，需要大量的筛选工作，降低了工作效率。因此探索找到一个能在真核系统中高效表达且高抗基因对于进一步提高阳性转化子的筛选效率意义重大。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供基因GliT作为筛选标记基因在抗性筛选中的应用。

本发明根据深海真菌Geosmithia pallid FS140基因组测序结果显示，GliT基因编码的氧化还原酶，通过在酿酒酵母S.cerevisiae BJ5464中抗生素药物筛选的功能验证，从结果推测其可将抗生素转化成不具有生物活性的氧化产物，从而起到解毒作用。针对这一原理，GliT是一种非常有用的选择性标记，用来筛选和维持培养成功转染抗生素抗性基因的真核细胞，可开发成一种高效表达且高抗的筛选标记基因应用于分子生物学、微生物学和医药等领域。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明的第一个目的是提供基因GliT作为筛选标记基因在抗性筛选中的应用，所述的基因GliT，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的抗性基因GliT通过以下方法获得的：通过转录组测序结果预测编码筛选标记基因GliT的序列，在其上下游设计特异性引物，其引物序列为GliT-F:5'-ATGTCCATCGGAAAACTTCTCGC-3'；GliT-R:5'-CTATGGCTCCCAATCAATCCCAAAT-3'，以由深海真菌FS140转录组反转录而得的cDNA文库为模板，通过PCR扩增获得产物并纯化回收片段，获得抗性基因基因GliT，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明利用同源重组法将GliT基因插入到酵母载体YEp352-TEF1-CYC1的表达盒内部。首先设计含有同源臂的GliT基因的上下游引物，其引物序列为YEp352-GliT-F:5'-G CAATCTAATCTAAGTCTAGAATGTCCATCGGAAAACTTCTCGC-3'；YEp352-GliT-R:5'-TACATGATGCGG CCCGTCGACCTATGGCTCCCAATCAATCCCAAAT-3'(下划线序列为同源臂片段)，通过PCR扩增获得产物并纯化回收片段。对已构建的YEp352-TEF1-CYC1载体采用内切酶Sal I和Xba I双酶切，然后使用ClonExpress II One Step Cloning Kit C112(Vazyme)将片段和酶切载体重组连接并转化至大肠杆菌感受态细胞，涂布于氨苄青霉素抗性平板筛选出阳性克隆。经过此轮分子克隆，目的基因GliT(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)插入到启动子TEF1和终止子CYC1之间，构建得到YEp352-TEF1-GliT载体，将其电转入酿酒酵母BJ5464细胞中，利用尿嘧啶缺陷型的SD培养基平板进行筛选和验证。与转入YEp352-TEF1-CYC1质粒(阴性对照)的酿酒酵母BJ5464相比，含有重组载体YEp352-TEF1-GliT的酿酒酵母生长速度明显加快，相同培养时间内菌落密度更高，证明功能基因GliT能有效协助酿酒酵母在含有潮霉素HYRB、博来霉素Zeocin、遗传霉素G418和放线菌酮的药物平板中生长，为在酿酒酵母内解析筛选标记基因GliT与抗生素的作用机制奠定分子生物学基础。

优选，所述的基因GliT作为筛选标记基因在潮霉素、博来霉素、遗传霉素或放线菌酮抗性筛选中的应用。

本发明的第二个目的是提供基因GliT在协助宿主细胞在抵抗抗生素中的应用。

优选地，所述抗生素为潮霉素、博来霉素、遗传霉素或放线菌酮中的至少一种。

优选地，所述的宿主细胞优选为深海真菌Geosmithia pallida FS140或酿酒酵母S.cerevisi ae BJ5464。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所涉及的深海真菌G.pallida FS140分离自南海沉积物，本课题组前期对该菌株进行了基因组测序并对胶霉毒素生物合成相关基因进行了注释。鉴于目前尚未有关于深海真菌基因作为分子筛选标记的相关报道。因此本发明从深海真菌FS140的cDNA文库中获得了筛选标记GliT基因序列，并成功导入到酿酒酵母S.cerevisiae BJ5464中通过抗生素药物筛选进行功能验证，利于后续解析筛选标记GliT基因与抗生素作用机制奠定分子生物学基础。同时可开发成一种高效表达且高抗的筛选标记基因应用于分子生物学、微生物学和医药等领域。

本发明的深海真菌G.pallida FS140，其公开于文献：Zhang-Hua Sun,JiangyongGu,Wei Ye,Liang-Xi Wen,Qi-Bin Lin,Sai-Ni Li,Yu-Chan Chen,Hao-Hua Li,Wei-MinZhang.Geospallins A–C:New Thiodiketopiperazines with Inhibitory Activityagainst Angiotensin-Converting Enzyme from a Deep-Sea-Derived FungusGeosmithia pallida FS140.Marine Drugs,2018,16(12),464.https://doi.org/10.3390/md16120464。该菌种本申请人也持有，保证自发明的申请日起20年内向公众提供。

附图说明

图1是筛选标记基因GliT基因序列的获得：以FS140 cDNA文库为模板，基因GliT扩增产物的电泳图；

图2为重组载体YEp352-TEF1-GliT的构建；其中A为YEp352-TEF1-CYC1载体图谱；B为YEp352-TEF1-GliT载体图谱；C为基因GliT的菌落PCR扩增产物的电泳图；

图3为实验所使用博来霉素Zeocin的结构式及酿酒酵母BJ5464和酿酒酵母YEp352-TEF1-GliT(Glit)在YPD平板和含不同浓度的抗生素平板中培养30h的效果图；

图4为实验所使用潮霉素Hygromycin B的结构式及酿酒酵母BJ5464和酿酒酵母YEp352-TEF1-GliT(Glit)在YPD平板和含不同浓度的抗生素平板中培养30h的效果图；

图5为实验所使用遗传霉素Geneticin的结构式及酿酒酵母BJ5464和酿酒酵母YEp352-TEF1-GliT(Glit)在YPD平板和含不同浓度的抗生素平板中培养30h的效果图；

图6为实验所使用放线菌酮Cycloheximide的结构式及酿酒酵母BJ5464和酿酒酵母YEp352-TEF1-GliT(Glit)在YPD平板和含不同浓度的抗生素平板中培养30h的效果图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

本实施例中所用的SD固体培养基的配方为：每升含有葡萄糖20g、Do supplement0.62g(-Leu/-Trp/-Ura，Clontech)、无氨基酵母氮源YNB 6.7g(普博欣)、亮氨酸0.06g、色氨酸0.04g和琼脂粉20g，余量为蒸馏水，其配制方法是将各成分混合均匀，灭菌制得。

本实施例中所用的YPD固体培养基的配方为：每升含有酵母粉10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g和琼脂粉20g，余量为蒸馏水，其配制方法是将各成分混合均匀，灭菌制得。

本实施例中所用抗生素：潮霉素购于上海翊圣生物科技有限公司、博来霉素Zeocin购于Invitrogen、遗传霉素G418购于Sigma和放线菌酮购于Dr.Ehrenstorfer。

实施例1新型筛选标记基因GliT基因序列的获得

基因GliT的扩增：将深海真菌Geosmithia pallida FS140接种于YPD培养基平板，于37℃培养72h，挑取新鲜的菌丝体，利用真菌RNA提取试剂盒提取RNA，再用All-in-one RTMaster Kit逆转录获得cDNA。根据转录组测序结果预测编码新型筛选标记GliT基因序列，设计上下游引物GliT-F和GliT-R，其引物序列为GliT-F:5'-ATGTCCATCGGAAAACTTCTCGC-3'；GliT-R:5'-CTATGGCTCCCAATCAATCCCAAAT-3'，以cDNA文库为模板扩增，获得PCR产物(图1)。回收产物并用pEASY-T1试剂盒进行TA克隆，转化至大肠杆菌感受态细胞，涂布于氨苄青霉素抗性平板筛选出阳性克隆，以通用引物M13-F(5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′)和M13-R(5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′)进行菌液PCR验证阳性克隆并测序，获得目的基因GliT序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，atgtccatcggaaaacttctcgccaacggagccctgttggttgatgtcctcatcatcggtgcaggcccctcgggtctgtctaccgcaaccggactggcccgtcagcttcataccgcggtcgtctttgactccggagtgtatcgcaacgcaaagacacagcacatgcacaatgtcctaggctgggaccaccggaatccgtccgagctacgggccgccggtcgagctgatctcgctgcgcggtactcgacgatccagttccagaatgccaccgtcgagacgatcaagaggatcggggagaagcaactcttcgaggcgcgtgacacggacggtaagcgctggtatggtcggaaggtcgtgttggccacgggagtccgagacattcctctggatattgagggttactcggaatgctgggccaatggaatctaccactgcctgttctgtgacggctatgaagaacgaggccaggagaccgtcggtgtcctcgccatgggccccatcgccaatcctccacgagccctacacttggcccgaatggcccatcgactctctgaatctgtcaccgtctacacccacggcgatgagcaactggccaaggagattcagcaggcggccgggggtgattcctcgtggctgaagctggagacccggcccatcgtgcgattcgagaagggggatgttgccaaaaccgttatcgtccatttctccgagacgacagacacgaagcaagaaggcttcctggcctataaccccaagacggagatcaacggcccctttgccaaccagctctcattgcagttgtccgaagtcggggacatccagacctcggctccgttctatgagaccagtgtgcccggggtattcgccgttggagactgtgccaccccgttgaaggccgtcagtccggcgattgcaatgggatcgttggctgctggaggtctggttgctcagctgcaggcccagccagtgatggaatttgggattgattgggagccatag)。

实施例2新型筛选标记基因GliT的功能验证

利用同源重组法将抗性基因GliT插入到酵母载体YEp352-TEF1-CYC1中(YEp352-TEF1-CYC1为早期构建质粒，携带有组成型启动子TEF1和终止子CYC1，载体图谱见图2A，为现有技术中的已知产品：Xiaodan Ouyang,Yaping Cha,Wen Li,Chaoyi Zhu,Muzi Zhu,Shuang Li,Min Zhuo,Shaobin Huang and Jianjun Li.Stepwise engineering ofSaccharomyces cerevisiae to produce(+)-valencene and its relatedsesquiterpenes,RSC Adv.,2019,9,30171,DOI:10.1039/c9ra05558d)。首先设计针对基因GliT(SEQ ID NO.1)扩增的上下游引物YEp352-GliT-F和YEp352-GliT-R，其引物序列为YEp352-GliT-F:5'-GCAATCTAATCTAAGTCTAGAATGTCCATCGGAAAACTTCTCGC-3'；YEp352-GliT-R:5'-TACATGATGCGGCCCGTCGACCTATGGCTCCCAATCAATCCCAAAT-3'(下划线序列为同源臂片段)，以深海真菌Geosmithia pallida FS140的cDNA为模板，通过PCR扩增获得产物。对载体YEp352-TEF1-CYC1采用Sal I和Xba I双酶切并回收产物，然后使用ClonExpress II OneStep Cloning Kit C112(Vazyme)将两个产物重组连接并转化至DH5α中筛选阳性克隆。采用引物YEp352-GliT-F和YEp352-GliT-R进行菌落PCR验证，结果表明基因GliT成功插入YEp352-TEF1-CYC1载体中(图2C)，并通过测序予以确认，得到YEp352-TEF1-GliT载体(载体图谱见图2B)。

将YEp352-TEF1-GliT质粒载体以及YEp352-TEF1-CYC1质粒载体(阴性对照)分别电转入酿酒酵母BJ5464细胞中(1500V，5ms)，均匀涂布于尿嘧啶缺陷型的SD平板中，在30℃培养2d，利用菌落PCR筛选阳性克隆，获得分别含有YEp352-TEF1-GliT质粒以及YEp352-TEF1-CYC1质粒的酿酒酵母BJ5464细胞。

分别将酿酒酵母BJ5464(YEp352-TEF1-CYC1)、酿酒酵母BJ5464(YEp352-TEF1-GliT)接种于相应缺陷型的SD培养基中，在30℃培养2d。用分光光度计测量各菌液OD₆₀₀，将各菌液用无菌水稀释到OD₆₀₀≈1.0作为原液，再以100μL的原液加900μL的无菌水的方式稀释成10^-1，以同样的方式稀释成10^-2、10^-3、10^-4。各取100μL不同菌株的10^-4的稀释液分别在YPD平板和YPD-各种抗生素平板上点板，在30℃培养并实时观察。培养30h的平板结果显示(图3、4、5、6)，酿酒酵母BJ5464(YEp352-TEF1-CYC1，图中的BJ5464)、酿酒酵母BJ5464(YEp352-TEF1-GliT，图中的Glit)在不添加任何抗生素的YPD平板上生长状况一致，但在含有抗生素(包括各个浓度潮霉素HYRB、博来霉素Zeocin、遗传霉素G418和放线菌酮)的YPD平板上，阴性对照BJ5464(YEp352-TEF1-CYC1)明显生长受阻不能生长。而导入新型筛选标记基因GliT的酿酒酵母则生长良好，菌体密度与无抗平板正常酿酒酵母相当，说明新型筛选标记基因GliT部分或全部恢复了酿酒酵母BJ5464对外抗生素的耐受性(耐受浓度分别为潮霉素HYRB＜500μg/mL、博来霉素Zeocin≥500μg/mL、遗传霉素G418＞500μg/mL和放线菌酮＞500μg/mL)，有效帮助酿酒酵母在含有抗生素的环境下正常生长。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)

<120> 基因GliT作为筛选标记基因在抗性筛选中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 999

<212> DNA

<213> 深海真菌FS140(Geosmithia pallida)

<400> 1

atgtccatcg gaaaacttct cgccaacgga gccctgttgg ttgatgtcct catcatcggt 60

gcaggcccct cgggtctgtc taccgcaacc ggactggccc gtcagcttca taccgcggtc 120

gtctttgact ccggagtgta tcgcaacgca aagacacagc acatgcacaa tgtcctaggc 180

tgggaccacc ggaatccgtc cgagctacgg gccgccggtc gagctgatct cgctgcgcgg 240

tactcgacga tccagttcca gaatgccacc gtcgagacga tcaagaggat cggggagaag 300

caactcttcg aggcgcgtga cacggacggt aagcgctggt atggtcggaa ggtcgtgttg 360

gccacgggag tccgagacat tcctctggat attgagggtt actcggaatg ctgggccaat 420

ggaatctacc actgcctgtt ctgtgacggc tatgaagaac gaggccagga gaccgtcggt 480

gtcctcgcca tgggccccat cgccaatcct ccacgagccc tacacttggc ccgaatggcc 540

catcgactct ctgaatctgt caccgtctac acccacggcg atgagcaact ggccaaggag 600

attcagcagg cggccggggg tgattcctcg tggctgaagc tggagacccg gcccatcgtg 660

cgattcgaga agggggatgt tgccaaaacc gttatcgtcc atttctccga gacgacagac 720

acgaagcaag aaggcttcct ggcctataac cccaagacgg agatcaacgg cccctttgcc 780

aaccagctct cattgcagtt gtccgaagtc ggggacatcc agacctcggc tccgttctat 840

gagaccagtg tgcccggggt attcgccgtt ggagactgtg ccaccccgtt gaaggccgtc 900

agtccggcga ttgcaatggg atcgttggct gctggaggtc tggttgctca gctgcaggcc 960

cagccagtga tggaatttgg gattgattgg gagccatag 999

Claims (5)

1.基因GliT作为筛选标记基因在抗性筛选中的应用，所述的基因GliT，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的基因GliT作为筛选标记基因在潮霉素、博来霉素、遗传霉素或放线菌酮抗性筛选中应用。

3.基因GliT在协助宿主细胞在抵抗抗生素中的应用，所述的基因GliT，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗生素为潮霉素、博来霉素、遗传霉素或放线菌酮中的至少一种。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的宿主细胞为深海真菌Geosmithiapallida FS140或酿酒酵母S.cerevisiae BJ5464。

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