CN107858353B - 一种埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子及其应用 - Google Patents

一种埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子及其应用。该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过染色体步移技术获得GliG基因的上游启动子序列并进行启动子核心区域预测，获得埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子。本发明的启动子能够高效启动潮霉素抗性基因hph的表达，且启动效率显著高于pgpdA启动子，从而为后期通过转录调控和异源表达以提高胶霉毒素产量并获得更多高活性的新型胶霉毒素奠定分子生物学基础。

Description

一种埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子及其 应用
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子及其应用。
背景技术：
埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110是从深海中分离得到的真菌。从中分离得到了具有很强抗肿瘤及降血压活性的新型化合物胶霉毒素，从埃德菌FS110中共获得胶霉毒素15种，其中8种为新型胶霉毒素。胶霉毒素具有抗肿瘤、抗真菌活性、抗病毒和免疫调节活性，因此在抗肿瘤、抗肝纤维化、抗病毒及免疫抑制剂药物开发方面具有良好的开发前景。
启动子作为结构基因和功能基因转录调控的必要元件，能够募集转录因子与RNA聚合酶精确的起始转录。近年来，由于丝状真菌在新型、高活性次级代谢产物的发掘以及活性酶的研究和开发方面发展迅速，且丝状真菌中启动子对其内源基因的转录活性较高，因此很多不同种属丝状真菌的启动子相继被发掘，如里氏木霉(Trichoderma reesei)的cbh1、tef1启动子，gpdA启动子，木霉属(Trichoderma sp.)pki1启动子，曲霉属的glaA启动子等。但目前深海真菌次级代谢产物生物合成基因的启动子尚未被发掘。烟曲霉中胶霉毒素的生物合成基因簇已经被报道，而且已经证实GliG是胶霉毒素生物合成的关键基因(Dolan SK,O'Keeffe G,Jones GW,et al.Resistance is not futile:gliotoxinbiosynthesis,functionality and utility[J].Trends in Microbiology,2015,23(7):419-428)。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子。
所述的埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明的埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子GliGP通过以下方法获得的：通过转录组测序获得编码谷胱甘肽硫转移酶的胶霉毒素生物合成基因GliG，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。在其上游序列中设计特异性反向引物sp1、sp2和sp3，采用Genome walking试剂盒的通用正向引物AP3进行三轮巢式PCR扩增，每一轮扩增产物稀释后作为下一轮扩增的模板。最后一轮的扩增产物进行TA克隆，转化至大肠杆菌感受态细胞，涂布于氨苄青霉素抗性平板筛选出阳性克隆，菌液PCR验证阳性克隆并测序，获得目的基因GliG上游启动子序列，并利用启动子预测软件分析上游启动子序列，获得GliG启动子核心区域GliGP(即埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示)。
本发明设计2μ复制子正反向引物进行克隆，所采用引物为2μori-U：5’-GTTACCCCTGCAGGAACGAAGCATCTGTGCTTCATTT-3’，2μori-D：5’-GTTACCAAGCTTCATTGCGAATACCGCTTCCAC-3’。PCR扩增得到的2μ复制子片段用PstI和HindIII进行双酶切，再插入至用Pst I和HindIII进行双酶切pAN7-1载体，用菌液PCR筛选阳性克隆并测序验证，从而成功将酵母2μ复制子插入到pAN7-1载体中，得到2μ-pAN7-1载体，然后利用酶切连接的方法，对GliG启动子核心区域GliGP设计BglII和PshAI酶切位点的上下游引物，PCR扩增并用BglII和PshAI双酶切，与BglII和PshAI双酶切后的2μ-pAN7-1载体连接转化，将目的基因GliG启动子核心区域GliGP(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)取代pgpdA启动子，构建得到2μ-pAN7-1-GliGP载体，并电转入酿酒酵母BY4742细胞中，利用200μg/mL潮霉素抗性的YPD平板进行筛选和验证。与无质粒和含有2μ-pAN7-1质粒的酿酒酵母BY4742相比，含有重组载体2μ-pAN7-1-GliGP的酿酒酵母生长较快，而且菌落数较多。证明GliG启动子核心区域GliGP能启动潮霉素抗性基因hph的表达，且启动效率显著高于pgpdA启动子。
本发明的第二个目的是提供一种表达载体，含有上述的埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子。
本发明的第三个目的是提供一种宿主细胞，含有上述的表达载体。
所述的宿主细胞优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4742。
本发明的第四个目的是提供上述的埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子在启动下游基因在宿主细胞中表达的应用。
所述的宿主细胞优选为埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4742。
所述的下游基因优选为谷胱甘肽硫转移酶基因GliG或潮霉素抗性基因hph。
本专利所涉及的埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110分离自3739米的深海，本课题组前期对该菌进行了转录组测序并对胶霉毒素生物合成相关基因进行了注释。鉴于目前关于埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110的启动子尚未见报道，而转录组测序及荧光定量PCR结果也表明，编码谷胱甘肽硫转移酶的胶霉毒素生物合成基因GliG的表达水平较高，预示该基因的启动子具有较高的转录活性。因此本发明采用genome walking试剂盒，利用通用引物和反向特异性引物，利用TAIL-PCR原理获得埃德菌FS110GliG基因的上游启动子序列，启动子核心区域预测获得启动子核心区域并进行功能验证，从而为后期通过转录调控和异源表达以提升胶霉毒素的表达水平并获得新型胶霉毒素奠定分子生物学基础。
本发明的埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110，其公开于文献：杨小岚，陈玉婵，李浩华，章卫民，23株海洋真菌的分子鉴定及其抗植物病原真菌和细胞毒活性研究。生物技术通报，2014,8:132-137。该菌种本申请人也持有，保证自发明的申请日起20年内向公众提供。
附图说明：
图1是埃德菌FS110胶霉毒素生物合成基因表达水平；
图2是埃德菌GliG启动子序列获得；其中A为GliG启动子的染色体步移扩增产物的电泳图，G-1为第一次巢式PCR扩增产物，G-2为第二次巢式PCR扩增产物，G-3为第三次巢式PCR扩增产物；B为菌液PCR扩增产物的电泳图；C为GliG启动子核心区域GliGP扩增产物的电泳图；
图3是重组载体2μ-pAN7-1和2μ-pAN7-1-GliGP的构建；其中A为2μ-pAN7-1载体图谱；B为GliG启动子核心区域GliGP的菌落PCR扩增产物的电泳图；
图4是不同浓度潮霉素抗性平板对酿酒酵母生长的影响；
图5是2μ-pAN7-1-GliGP载体对酿酒酵母生长的影响；
图6是GliG启动子核心区域GliGP的菌落PCR扩增产物的电泳图。
具体实施方式：
以下将参照附图，结合具体实施例对本发明进行进一步说明。而不是对本发明的限制。
本实施例中Genome walking试剂盒购买自Takara生物工程有限公司(大连，中国)；TA克隆试剂盒购买自全氏金生物工程有限公司(北京，中国)。
本实施例中所用的YPD培养基的配方为：每升含有酵母粉10g、蛋白胨20g和琼脂20g，余量为蒸馏水。
实施例1：埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110胶霉毒素生物合成基因GliG的启动子序列的获得
胶霉毒素生物合成基因表达水平分析：深海真菌埃德菌(Dichotomomycescejpii)FS110接种于YPD培养基平板，37℃培养72h，挑取新鲜的菌丝体，利用植物RNA提取试剂盒提取RNA，利用All-in-one RT Master Kit逆转录获得cDNA，并采用Hiseq2000进行转录组测序，通过前期转录组测序得到的目的基因序列设计胶霉毒素生物合成基因GliG、GliI、GliO引物，引物序列为：针对GliG基因(FP:5′-atgaccgaacgaccttcttgatctcg-3′，RP:5′-caatagtccatactccttctcgcc-3′)，针对GliI基因(FP:5′-atgcctcacgcagaaacactcccc-3′，RP:5′-ccacctcttatccacccccaatg-3′)，针对GliO基因(FP:5′-atggccaattctcgacccaacatcg-3′，RP:5′-gttgaagttatccaggattgcg-3′)，以cDNA为模板进行荧光定量PCR，分析这三个基因的相对内参基因GAPDH的表达水平，并通过琼脂糖凝胶电泳进一步验证目的基因的表达水平。如图1所示，GliG的相对表达水平远高于GliI和GliO的表达水平，暗示GliG的启动子具有更高的转录活性，因此对GliG的启动子序列进行扩增。
GliG启动子GliGP的扩增：采用Genome walking试剂盒，利用TAIL-PCR技术扩增得到埃德菌FS110中胶霉毒素生物合成的关键基因GliG的上游序列，通过TA克隆测序获得上游序列的核苷酸序列，利用启动子分析软件获得该启动子的核心区域GliGP。设计GliG序列中特异性反向引物(表1)，并利用Genome walking试剂盒的通用正向引物AP3进行巢式PCR扩增，通过3次巢式PCR反应对D.cejpii基因组扩增，得到对应的扩增产物G-1、G-2和G-3，最后一次巢式PCR扩增产物G-3的目的条带大小约为4kb(图2A)，并将最后一次巢式PCR获得的目的条带利用pEASY-T1试剂盒进行TA克隆，转化至trans5α感受态细胞，涂布于氨苄青霉素抗性平板筛选出阳性克隆，利用T7-F和T7-ter引物进行菌液PCR验证阳性克隆并测序，获得目的基因GliG上游启动子序列(图2B)，并利用启动子预测软件(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)分析上游启动子序列，获得GliG启动子核心区域GliGP，大小为509bp(图2C，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)。
表1 目的基因GliG特异性反向引物序列
Figure BDA0001464765530000061
实施例2：GliG启动子核心区域GliGP的功能验证：
设计2μ复制子正反向引物进行克隆，所采用引物为2μori-U：5’-GTTACCCCTGCAGGAACGAAGCATCTGTGCTTCATTT-3’，2μori-D：5’-GTTACCAAGCTTCATTGCGAATACCGCTTCCAC-3’。PCR扩增得到的2μ复制子片段用PstI和HindIII进行双酶切，再插入至用PstI和HindIII进行双酶切pAN7-1载体，用菌液PCR筛选阳性克隆并测序验证，从而成功将酵母2μ复制子插入到pAN7-1载体(质粒pAN7-1为带有潮霉素B抗性基因hph和真菌启动子gpdA的广宿主载体pAN7-1，为现有技术中的已知产品)中，具体插入位置于终止子tTRPC终止子前，得到2μ-pAN7-1载体(图3A)，然后利用酶切连接的方法，对GliG启动子核心区域GliGP设计含有BglII和PshAI酶切位点的上下游引物(GliG-promoter-BglII-R:5′-GGAAGATCTTCGTCCCCTATCCGTAGG-3′，GliG-promoter-PshAI-F:5′-ACGTCGCGGTGA GTTCATGTC TGCCATGGTGATGGGAC-3′)。PCR扩增并用BglII和PshAI双酶切目的产物，与BglII和PshAI双酶切后的2μ-pAN7-1载体连接转化感受态细胞，筛选阳性克隆，菌落PCR结果表明，GliGP成功插入2μ-pAN7-1载体中，并测序成功验证(图3B)，得到2μ-pAN7-1-GliGP载体。
用不同浓度(0、50、100、150、200、250μg/mL)的潮霉素抗性平板对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4742(保藏于广东省微生物菌种保藏中心)抗性进行筛选，30℃培养3d，确定潮霉素对于酿酒酵母的最适筛选浓度。发现在100μg/mL浓度以上的潮霉素抗性平板上酿酒酵母的生长受到能明显抑制，在200μg/mL的潮霉素平板上，几乎没有菌落生长(图4)，因此选用含有200μg/mL潮霉素的YPD平板作为抗性筛选平板。制备酿酒酵母BY4742的感受态细胞，将2μ-pAN7-1载体以及2μ-pAN7-1-GliGP载体分别电转入酿酒酵母细胞中(1500V，5ms)，均匀涂布于含有200μg/mL潮霉素抗性的YPD平板中，并利用菌落PCR筛选阳性克隆，并进一步测序验证。与阴性对照(无质粒)和阳性对照(含有2μ-pAN7-1质粒)相比，发现在200μg/mL的潮霉素平板上，含有2μ-pAN7-1-GliGP载体的酿酒酵母生长较快，而且菌落数较多(图5)，证明GliG启动子核心区域GliGP能启动潮霉素抗性基因hph的表达，且启动效率显著高于pgpdA启动子。挑取含有重组载体2μ-pAN7-1-GliGP的酿酒酵母进行菌落PCR，所采用引物序列为：GliG-promoter-BglII-R:5′-GGAAGATCTTCGTCC CCTATCCGTAGG-3′，GliG-promoter-PshAI-F:5′-ACGTCGCGGTGAGTTCATGTC TGCCA TGGTGATGGGAC-3′。扩增得到GliG启动子核心区域GliGP，筛选得到阳性克隆，并通过测序得到验证(图6)。
序列表
<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
<120> 一种埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 509
<212> DNA
<213> 埃德菌FS110(Dichotomomyces cejpii FS110)
<400> 1
gaggaccgct cgtcccctat ccgtagggtt gtctgtttgt cgggagtaaa aggggcgaca 60
cttgcgaaag acggctcgac atatggaatg ccaaagatgt caaatgtcag ataatgtgag 120
ggaacgacga ccggcttgat atccagcgcc ttgatacctc gtcgctcgag gacggacagt 180
cggaggttgg agccataggc aaagtaccag actttttctg gaacagtatc ctcctttgcc 240
atcttccctc tttatgcaga ttaaactgat agccatcata ggattataat tgaagatgtt 300
tctatgtcta tatcggagga gtgatcaacg gcgtccgaaa attcggcccg cggttgtctt 360
agggctggcc tgcaggtgta gggttcatta tgaaagactg gtagtattat gctgctattt 420
agtcaaaagc agaagaacag tttgtcttta gaccttgaat agatatctgt caagacaaga 480
gccaagaaag tcccatcacc atggcagac 509
<210> 2
<211> 711
<212> DNA
<213> 埃德菌FS110(Dichotomomyces cejpii FS110)
<400> 2
atgaccgaac gaccttctga tctcgttgtg gacaggctgg ttctcttcgt ggtcaaggga 60
accgccacgt ccacgcacaa taccgtgaaa ccactgatcc tgatcgagga gctcggagtg 120
cctcatgata tctacgtggt tgaaaaggtg tcagcgccct ggtttagcaa tatcaacccg 180
cacaagatgg tgccggctat cgaagaccaa ttgcccgacg gccagattgt gcgggcctgg 240
gaatcctcat cgactttgac ctacattgcc gatgcctacg acaaggacgg gacctttggc 300
ggtcgtaacc tacacgagag ggcggaaatc ggcaactggt tgaccctgca tacggctgcc 360
ttgggaccca cggccaagta ctggctgtat ttccatgcgc tgcatccgga gaaacttccc 420
agactattga aaaactgcgg acaaatatca ctgtgcaata tgacatcctg gaacgacgtc 480
tcaatcagcc aggacagcaa tacttggccc tggctgaccg gccgacgatt gccgatattg 540
ccaccctgcc ttttgccatg aaatccacgg cggagctgtt tggattggac ttcgatcggt 600
gtggcccaag ttgcaggaat ggtccattcg tatgagtgag cgcgaggctg tgaaaagggc 660
atggaagcgg gtggccggct tcggccatgg cgagaaggag tatggactat t 711

Claims (7)

1.一种埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因启动子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
2.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求1所述的埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因启动子。
3.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求2所述的表达载体。
4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BY4742。
5.权利要求1所述的埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因启动子在启动下游基因在宿主细胞中表达的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的宿主细胞为埃德菌（Dichotomomyces cejpii）FS110或酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BY4742。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的下游基因为谷胱甘肽硫转移酶基因或潮霉素抗性基因。
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN105039183A (zh) * 2015-08-28 2015-11-11 广东省微生物研究所 一种埃德菌fs110原生质体及其制备方法和转化方法

Non-Patent Citations (2)

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Title
Dichotocejpins A–C: New Diketopiperazines from a Deep-Sea-Derived Fungus Dichotomomyces cejpii FS110;Zhen Fan等;《Mar. Drugs》;20160909;第14卷(第164期);全文 *
丝状真菌启动子研究进展;林涛等;《安徽农业科学》;20131231;第41卷(第7期);全文 *

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