CN111073902B - 提升胶霉毒素生物合成基因表达水平的CRISPR/dCas9载体及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了提升胶霉毒素生物合成基因表达水平的CRISPR/dCas9载体及其构建方法和应用。本发明首次公开利用CRISPR/dCas9对埃德菌胶霉毒素生物合成基因进行特异性转录调控，构建了提升胶霉毒素生物合成基因表达水平的pLX‑sgRNA‑pG重组载体和pCDNA‑pGPD‑dCas9‑VP64‑cbx重组载体，建立了一种适用于深海真菌埃德菌的CRISPR/dCas9特异性转录调控体系，从而促进埃德菌FS110胶霉毒素生物合成的转录调控，为获得更多具有显著生物学活性的胶霉毒素类衍生物奠定分子生物学基础。
Description
技术领域
本发明属于生物化学和分子生物学技术领域，具体涉及提升胶霉毒素生物合成基因表达水平的CRISPR/dCas9载体及其构建方法和应用。
背景技术
深海真菌埃德菌Dichotomomyces cejpii FS110是一种来源于深海的子囊菌，该真菌能产生种类丰富的次级代谢产物以适应深海环境。胶霉毒素是一类具有抗菌、抗肿瘤及抗免疫抑制等生物学活性的二酮哌嗪类化合物，前期已经有超过30种胶霉毒素类化合物及其衍生物从埃德菌FS110中发掘出来，其中还包括结构罕见的胶霉毒素类二聚体化合物。其中大部分胶霉毒素类化合物具有较显著的抗肿瘤活性，胶霉毒素类化合物衍生物Plinabulin已经用于临床 III期治疗非小细胞肺癌，因此胶霉毒素类化合物在生物医药领域有很好的应用前景。在此基础上，我们完成了对埃德菌FS110的全基因组测序，并预测了其胶霉毒素生物合成基因簇gli cluster，并对关键胶霉毒素部分生物合成功能基因包括GliG、GliI和GliO进行了体外生化功能验证。但是目前由于部分胶霉毒素类化合物及其衍生物产率较低，不利于其后期的大规模应用。CRISPR/dCas9-VP64系统由于其载体构建简单、转录调控效率较高广泛应用于哺乳动物细胞、酵母、斑马鱼等物种目的基因生物表达水平的提升。但目前CRISPR/dCas9-VP64系统在丝状真菌目的基因表达水平提升方面的研究鲜见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供适用于深海真菌埃德菌FS110的提升胶霉毒素生物合成基因表达水平的CRISPR/dCas9载体及其构建方法和应用。
本发明的第一个目的是提供一种提升胶霉毒素生物合成基因表达水平的CRISPR/dCas9 载体的构建方法，包括以下步骤：
a.以pGPD启动子为模板，利用引物pGPD F和pG R进行PCR扩增得到片段1；
所述的pGPD启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的引物pGPD F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的引物pG R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
b.以pLX-sgRNA载体为模板，利用引物pG F和sgRNAR进行PCR扩增得到片段2；
所述的引物pG F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述的引物sgRNAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
c.将步骤a得到的片段1和步骤b得到的片段2混合作为模板，以引物pGPD F和sgRNA R为引物进行融合PCR，得到融合片段3；
d.对融合片段3、pLX-sgRNA载体分别进行XhoI和NheI双酶切，酶切后用T4 DNA连接酶连接，得到pLX-sgRNA-pG重组载体；
e.将萎锈灵抗性基因cbx通过同源重组整合至pCDNA-dCas9-VP64载体得到pCDNA-dCas9-VP64-cbx重组载体，然后再将pGPD启动子片段通过同源重组插入该重组载体中替换CMV启动子，得到pCDNA-pGPD-dCas9-VP64-cbx重组载体；pLX-sgRNA-pG重组载体和pCDNA-pGPD-dCas9-VP64-cbx重组载体即为提升胶霉毒素生物合成基因表达水平的CRISPR/dCas9载体。
优选，所述的步骤d，是对融合片段3、pLX-sgRNA载体分别进行XhoI和NheI双酶切，然后将酶切过的融合片段3与酶切过的pLX-sgRNA载体以物质的量比1：10在添加T4 DNA 连接酶条件下，于22℃连接3h，得到pLX-sgRNA-pG重组载体。
优选，所述的步骤e中的通过同源重组整合至pCDNA-dCas9-VP64载体的萎锈灵抗性基因cbx：是以PMD-gcas9载体为模板，用引物cbx F: CAGCGGACCTTCCTTCCCGCGCATGCGGAGAGACGGACGGAC和cbx R: GATGACATGAACTACTATACGTCGCGTGGAGCCAAGAGC经PCR扩增得到的。
所述的萎锈灵抗性基因cbx的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选，所述的步骤e中的插入重组载体中的pGPD启动子片段：是以pGPD启动子为模板，以引物pGPD F1:GCGTTGACATTGATTATTGAGCATGCGGAGAGACGGAC和pGPD R1: GTCATCGTCATCCTTGTAATGGTGATGTCTGCTCAAGCGG经PCR扩增得到的。
本发明还提供根据所述的构建方法构建得到的pLX-sgRNA-pG重组载体和 pCDNA-pGPD-dCas9-VP64-cbx重组载体。
本发明还提供含有所述的pLX-sgRNA-pG重组载体和pCDNA-pGPD-dCas9-VP64-cbx重组载体的真菌。
优选，所述的真菌为埃德菌FS110或埃德菌FS140。
本发明还提供所述的pLX-sgRNA-pG重组载体和pCDNA-pGPD-dCas9-VP64-cbx重组载体在提升胶霉毒素生物合成基因表达水平中的应用。
优选，所述的应用，包括以下步骤：
将pLX-sgRNA-pG重组载体和pCDNA-pGPD-dCas9-VP64-cbx重组载体通过PEG介导法导入埃德菌FS110原生质体，用含有萎锈灵的PDA平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆扩大培养，提取DNA验证重组载体的导入，获得提升胶霉毒素生物合成基因表达水平的重组埃德菌FS110。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
目前，真菌生物合成基因转录调控一般采取全局转录调控因子hat等，但大多存在转化效率较低，特异性较差，载体构建复杂及目的基因表达水平提升有限等缺点，导致丝状真菌目的基因表达水平提升进展缓慢，严重阻碍了丝状真菌生物合成基因的转录调控及活性次级代谢产物生物合成效率的提升。埃德菌FS110胶霉毒素生物合成基因gliG(编码谷胱甘肽硫转移酶)在胶霉毒素生物合成过程中发挥重要作用，其启动子pG已经被克隆且其功能也已经被验证。因此CRISPR/dCas9-VP64系统特异性靶向pG启动子能显著提升胶霉毒素生物合成基因表达水平，从而提升胶霉毒素的产量。本发明能有效促进丝状真菌次级代谢产物的转录调控，提升真菌活性次级代谢产物的生物合成效率并发掘更多新型有生物活性的次级代谢产物。
本发明首次将CRISPR/dCas9-VP64系统应用于深海真菌埃德菌胶霉毒素生物合成基因表达水平的提升及胶霉毒素类化合物及其衍生物产量的提升，促进胶霉毒素类化合物在生物医药领域的应用。同时为后期解析埃德菌FS110胶霉毒素生物合成及转录调控机制奠定分子生物学基础。
附图说明
图1为靶向胶霉毒素生物合成基因启动子pG的pLX-sgRNA-pG重组载体构建图；其中，图A为含有pGPD、sgRNA及pG靶向序列融合PCR产物电泳图；图B为pGPD-pG-sgRNA 片段插入PLX-sgRNA的菌液PCR验证电泳图；
图2为pCDNA-pGPD-dCas9-VP64-cbx重组载体构建图，其中图A为cbx插入载体构建验证图，图B为pGPD插入载体验证图；
图3为重组pcDNA-dCas9-VP64和PLX-sgRNA载体导入埃德菌FS110验证图，图A为重组埃德菌FS110中cbx基因菌液PCR扩增验证图；图B为重组埃德菌FS110中 pGPD-pG-sgRNA片段菌液PCR扩增验证图；
图4为野生埃德菌FS110和重组埃德菌FS110中胶霉毒素生物合成基因荧光定量PCR 分析图；
图5为野生埃德菌FS110和重组埃德菌FS110中胶霉毒素生物合成基因表达水平对比图；其中图A为野生埃德菌FS110和重组埃德菌FS110中gliG基因荧光定量PCR产物分析；图 B为野生埃德菌FS110和重组埃德菌FS110中gliG和gliZ表达水平分析；
图6为野生埃德菌FS110和重组埃德菌FS110中胶霉毒素HPLC分析图；其中，FS110-17-41代表化合物Dichomycytes B，FS110-17-41-52-30代表化合物Dichomycytes C；
图7为野生埃德菌FS110和重组埃德菌FS110中胶霉毒素LC-MS对比分析图；其中，FS110-13-5代表化合物Dichomycytes A，FS110-17-41代表化合物Dichomycytes B。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：靶向胶霉毒素生物合成基因转录调控载体的构建
由于胶霉毒素经验证具有较强的抗肿瘤活性，但埃德菌FS110中胶霉毒素类化合物的产量相对较低。CRSISPR/dCas9-VP64系统经证实具有激活目的基因并提升目的基因表达水平的功能。
因此，发明人在胶霉毒素生物合成基因gliG基因的启动子pG上寻找CRISPR/dCas9的靶标序列，设计gRNA序列CATCAAATCCGCGGCGGAAATTG，根据pGPD启动子序列(如 SEQ IDNO.1所示)和pG靶标序列设计引物pGPD F(SEQ ID NO.2)和pG R(SEQ ID NO. 3)；以人工合成的pGPD启动子序列为模板，利用引物pGPD F和pG R进行PCR扩增得到片段1。根据pG R序列进行反向互补设计pG F，其序列如SEQ ID NO.4所示；根据sgRNA 骨架载体(其序列见pLX-sgRNA载体，具体可在www.addgene.org上查询)及酶切位点设计引物sgRNAR(SEQ IDNO.5)；以pLX-sgRNA载体为模板，利用引物pG F和sgRNAR进行PCR扩增得到片段2。以回收的片段1和片段2为混合模板，以引物pGPD F和sgRNAR 为引物，用Prime STAR max mix(Takara,Japan)扩增得到融合片段3(其电泳结果如图1A 所示)。对融合片段3进行XhoI和NheI酶切，然后将酶切片段与用XhoI和NheI酶切过的 pLX-sgRNA载体以物质的量比(摩尔比)1：10在添加T4 DNA连接酶条件下，于22℃连接 3h，将酶切融合片段3插入酶切pLX-sgRNA载体。连接产物转化至DH5α感受态细胞，用 Amp平板进行筛选。所得克隆扩大培养，用引物pGPD F和sgRNAR进行菌液PCR验证(PCR 产物电泳结果如图1B所示)，所得390bp左右片段进行测序验证，即得到靶向pG启动子的 pLX-sgRNA-pG重组载体。
将萎锈灵抗性基因cbx(其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)通过同源重组整合至pC DNA-dCas9-VP64载体。具体为：以PMD-gcas9(Hao et al.,CRISPR-Cas9 assisted gened isruption in the higher fungus Ganoderma species，Process chemistry,2017,http://dx.doi.org/ 10.1016/j.procbio.2017.02.012)载体为模板，所采用引物为cbxF:CAGCGGACCTTCCTTCC CGCGCATGCGGAGAGACGGACGGAC和cbx R:GATGACATGAACTACTATACGTCGCGT GGAGCCAAGAGC，扩增得到cbx基因片段；将该cbx基因片段和pCDNA-dCas9-VP64载体以摩尔比1：10进行混合，配制10μL体系，用含有重组酶的一步克隆试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)于50℃反应30min，转化DH5α感受态细胞。挑取克隆扩大培养，以引物cbx F和cbx R进行菌液PCR验证(PCR产物电泳如图2A所示)。所得阳性克隆扩大培养，提取质粒进行验证，表明成功构建pCDNA-dCas9-VP64-cbx载体。然后，将pGPD启动子片段插入该载体中，以替换载体中原有的CMV启动子。具体为：将适用于埃德菌FS110的pGPD启动子片段按如前方法通过同源重组插入至pCDNA-dCas9-VP64-cbx载体，所采用引物为pGPD F1:GCGTTGACATTGATTATTGAGCATGCGGAGAGACGGAC和pGPD R1: GTCATCGTCATCCTTGTAATGGTGATGTCTGCTCAAGCGG；将载体转化挑阳性克隆培养后的菌液PCR验证结果如图2B所示；所得阳性克隆扩大培养，提取质粒进行测序验证，结果表明重组载体pCDNA-pGPD-dCas9-VP64-cbx构建成功。
实施例2：pLX-sgRNA-pG重组载体和pCDNA-pGPD-dCas9-VP64-cbx重组载体导入埃德菌FS110及胶霉毒素生物合成基因表达水平分析
外源基因导入埃德菌FS110原生质体方法如下：
(1)将制备好的原生质体(1×108/mL)(具体制备方法参照发明人的专利号201510540618.1、名称为：一种埃德菌FS110原生质体及其制备方法和转化方法的专利)与3.0 μg pLX-sgRNA-pG重组载体和pCDNA-pGPD-dCas9-VP64-cbx重组载体质粒混匀，置于冰上 5min，然后再加入200μL体积分数30％PEG4000，30℃放置15min，再加入400μL PEG4000，30℃放置15min，然后加入1.2mLW5溶液终止反应，最后加入4mL的WI缓冲液放置于30℃摇床低速过夜培养；
(2)将融化的TB3固体培养基冷却至室温后，每次取20mL与步骤(1)制备的过夜培养的溶液轻轻混匀，此外再加入终浓度为200μg/mL的萎锈灵，混匀后均匀涂板，30℃培养5d；
(3)长出较小的菌丝体后，再挑取真菌菌落转移至含终浓度为200μg/mL萎锈灵的PDA培养基上，再进行筛选；
(4)在步骤(3)中萎锈灵PDA平板上长出的阳性克隆菌丝先进行保存(即挑取部分菌丝转移至新的萎锈灵PDA平板)，然后将剩余真菌菌丝置于无菌EP管中，加入液氮充分研磨，然后立刻放在100℃的水浴锅中5min，然后再放在液氮中1min，重复该过程3次，最后加入50μL超纯水溶解，最大转速离心5min，取上清(即总基因组DNA)放置于-20℃保存。并利用萎秀灵抗性基因前后引物cbx-F和cbx-R扩增萎秀灵抗性基因序列，以验证 pCDNA-pGPD-dCas9-VP64-cbx重组载体是否成功导入埃德菌FS110(图3A)；并通过引物 pGPD F和sgRNAR扩增pGPD-pG-sgRNA片段，以验证pLX-sgRNA-pG重组载体成功导入埃德菌FS110(图3B)，分别提取野生埃德菌FS110和重组埃德菌FS110总DNA，利用对应引物对萎锈灵抗性基因cbx(引物cbx F和cbx R)以及gliG sgRNA序列(引物pGPD F和sgRNA R)进行扩增。结果表明，以野生埃德菌FS110总DNA为模板，无法扩增得到cbx基因及gliG sgRNA序列，而以重组埃德菌FS110的总DNA为模板则可以扩增得到cbx基因和gliG sgRNA 序列，证明重组埃德菌FS110中pCDNA-pGPD-dCas9-VP64-cbx重组载体和pLX-sgRNA-pG 重组载体成功导入至埃德菌FS110中。
采用RNA提取试剂盒(Umagen，广州，中国)分别提取野生埃德菌FS110和重组埃德菌FS110的总RNA，测定RNA浓度，并用DEPC水调整至相同浓度，采用Abm的逆转录试剂盒(Abm,加拿大)逆转录获得cDNA。设计gliG、gliI、gliO和gliZ基因的荧光定量PCR 引物(具体序列见表1)，进行荧光定量PCR鉴定(图4)，以GAPDH为内参，结果表明， pLX-sgRNA-pG重组载体和pCDNA-pGPD-dCas9-VP64-cbx重组载体导入埃德菌FS110使 gliG表达水平提升了15.17±4.04倍，gliZ表达水平提高至野生埃德菌FS110菌株的1.23倍(图 5)，其余胶霉毒素生物合成基因表达水平无提升。说明靶向pG启动子的转录调控主要影响 gliG和gliZ基因的表达水平，从而影响胶霉毒素的生物合成。
表1胶霉毒素生物合成基因表达水平分析引物
实施例3：野生埃德菌FS110和重组埃德菌FS110的胶霉毒素类化合物产量对比分析
对野生埃德菌FS110和重组埃德菌FS110进行接种，用YPD培养基进行培养，于28℃培养7天后。收集野生和重组埃德菌FS110的发酵液，用乙酸乙酯进行萃取，旋转蒸发浓缩。用HPLC(岛津，日本)和Agilent 6430液质联用仪进行野生埃德菌FS110和重组埃德菌FS110乙酸乙酯粗提物分析，并以野生埃德菌FS110中的新型胶霉毒素类化合物Dichomycytes A和 Dichomycytes B作为阳性对照。用C18柱(4.6×250mm)进行分析检测。检测条件为：50min 内洗脱液从30％甲醇增加至100％甲醇，流速为1.0mL/min。HPLC检测分析结果表明，野生埃德菌FS110和重组埃德菌FS110均可以检测出Dichomycytes A及Dichomycytes B对应的峰。而且重组埃德菌FS110对应的Dichomycytes A的峰显著大于野生埃德菌FS110的峰面积(图 6)。野生和重组埃德菌FS110粗提物上样至Agilent 6430液质联用仪，以标准品为对照。根据m/z及其丰度计算野生埃德菌FS110和重组埃德菌FS110中胶霉毒素类化合物Dichomycytes的产量(图7)。结果表明，pCDNA-pGPD-dCas9-VP64-cbx重组载体导入埃德菌FS110可使得Dichomycytes A及Dichomycytes B的产量分别提高1.46和2.84倍。通过野生埃德菌FS110和重组埃德菌FS110次级代谢产物比对分析表明，在40.0min处有新的峰产生，可能通过转录激活产生了部分新型胶霉毒素类化合物，后续可进一步分离鉴定。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
<120> 提升胶霉毒素生物合成基因表达水平的CRISPR/dCas9载体及其构建方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 271
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agctttaaga ggtccgcaag tagattgaaa gttcagtacg tttttaacaa tagagcattt 60
tcgaggcttg cgtcattctg tgtcaggcta gcagtttata agcgttgagg atctagagct 120
gctgttcccg cgtctcgaat gttctcggtg tttaggggtt agcaatctga tatgataata 180
atttgtgatg acatcgatag tacaaaaacc ccaattccgg tcacatccac catctccgtt 240
ttctcccatc tacacacaac aacttatcgc c 271
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaactcgaga gctttaagag gtccg 25
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caatttccgc cgcggatttg atgggcgata agttgttgtg tg 42
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cacacaacaa cttatcgccc atcaaatccg cggcggaaat tg 42
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaagctagct aatgccaact ttgtacaaga aagctg 36
<210> 6
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgcagtccc tcgtcgccac ccgctccagt gctctcaagc agaccgttcg cggcttcgca 60
gcttctgccg cgcgggccca ggccaccccg ctccagaagc cggtccggaa caaggagttc 120
aagatttacc gttggattct cgacgccctc atcaaaatca agaacgagat agaccctacc 180
ttgacttttc gtcggtcatg ccgcgagggt atctgcggct cgtgtgcaat gaacattaac 240
ggccaaaaca cgctggcgtg cctctgcagg atcgacacaa acgcgagcaa ggataccaag 300
atctaccccc ttccccacat gtacattgtt aaggacctcg tgcccgacct cacccaattc 360
tacaagcaat acaagtccat cgagccctac ctgcagaacg acaaccctcc agcggaccgg 420
gagttcttgc agtcgcagga ggacaggaag aagctcgacg gcatgtatga gtgcatcctg 480
tgcgcgtgct gctcgacctc gtgccccagc tactggtgga accaggacga gtacctcggg 540
cccgcgacgc tcatggccgc ctaccgctgg atggcggact ctcgggacac gtataaggcg 600
caccggatgg agaagatgca gaacgagctc agcctatacc gctgccacac gatcttcaac 660
tgcgcacgca cgtgccccaa gggcctcaac cccgccgcgg cgatcgcaaa gatgaagctc 720
gagcttgccg ccgag 735
Claims (8)
1.一种提升胶霉毒素生物合成基因表达水平的CRISPR/dCas9载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
a. 以pGPD启动子为模板，利用引物pGPD F和pGR进行PCR扩增得到片段1；所述的pGPD启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的引物pGPD F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的引物pGR的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；
b. 以pLX-sgRNA载体为模板，利用引物pG F和sgRNA R进行PCR扩增得到片段2；所述的引物pG F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，所述的引物sgRNA R的核苷酸序列如SEQ IDNO. 5所示；
c. 将步骤a得到的片段1和步骤b得到的片段2混合作为模板，以引物pGPD F和sgRNA R为引物进行融合PCR，得到融合片段3；
d. 对融合片段3、pLX-sgRNA载体分别进行XhoI和NheI双酶切，酶切后用T4 DNA连接酶连接，得到pLX-sgRNA-pG重组载体；
e. 将萎锈灵抗性基因cbx通过同源重组整合至pCDNA-dCas9-VP64载体得到pCDNA-dCas9-VP64-cbx重组载体，然后再将pGPD启动子片段通过同源重组插入该重组载体中替换CMV启动子，得到pCDNA-pGPD-dCas9-VP64-cbx重组载体；pLX-sgRNA-pG重组载体和pCDNA-pGPD-dCas9-VP64-cbx重组载体即为提升胶霉毒素生物合成基因表达水平的CRISPR/dCas9载体。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤d，是对融合片段3、pLX-sgRNA载体分别进行XhoI和NheI双酶切，然后将酶切过的融合片段3与酶切过的pLX-sgRNA载体以物质的量比1：10在添加T4 DNA连接酶条件下，于22℃连接3 h，得到pLX-sgRNA-pG重组载体。
3. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤e中的通过同源重组整合至pCDNA-dCas9-VP64载体的萎锈灵抗性基因cbx：是以PMD-gcas9载体为模板，用引物cbxF:CAGCGGACCTTCCTTCCCGCGCATGCGGAGAGACGGACGGAC和cbx R: GATGACATGAACTACTATACGTCGCGTGGAGCCAAGAGC经PCR扩增得到的。
4. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤e中的插入重组载体中的pGPD启动子片段：是以pGPD启动子为模板，以引物pGPD F1: GCGTTGACATTGATTATTGAGCATGCGGAGAGACGGAC和pGPD R1: GTCATCGTCATCCTTGTAATGGTGATGTCTGCTCAAGCGG经PCR扩增得到的。
5.根据权利要求1-4任一所述的构建方法构建得到的pLX-sgRNA-pG重组载体和pCDNA-pGPD-dCas9-VP64-cbx重组载体。
6.含有权利要求5所述的pLX-sgRNA-pG重组载体和pCDNA-pGPD-dCas9-VP64-cbx重组载体的真菌；所述的真菌为埃德菌FS110。
7.权利要求5所述的pLX-sgRNA-pG重组载体和pCDNA-pGPD-dCas9-VP64-cbx重组载体在提升胶霉毒素生物合成基因表达水平中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
将pLX-sgRNA-pG重组载体和pCDNA-pGPD-dCas9-VP64-cbx重组载体通过PEG介导法导入埃德菌FS110原生质体，用含有萎锈灵的PDA平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆扩大培养，提取DNA验证重组载体的导入，获得提升胶霉毒素生物合成基因表达水平的重组埃德菌FS110。
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| Publication number | Publication date |
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| CN111073902A (zh) | 2020-04-28 |
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