CN111690549A

CN111690549A - 利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌株及构建方法和应用

Info

Publication number: CN111690549A
Application number: CN202010422065.0A
Authority: CN
Inventors: 卢文玉; 张传波; 武玉芬; 鞠海燕
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2020-05-18
Filing date: 2020-05-18
Publication date: 2020-09-22

Abstract

本发明利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌株及构建方法和应用；以解脂耶氏酵母ATCC 201249为出发菌株，导入了优化的木糖还原酶XYL1、木糖醇脱氢酶XYL2以及过表达的内源的木酮糖激酶XKS表达盒，得重组菌株1；向重组菌1导入达玛烯二醇合酶基因DS，原人参二醇合酶基因PPDS及细胞色素P450还原酶基因ATR1，得重组菌株2；向重组菌株2导入截断的甲羟戊酸途径中编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸‑羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因tHMG1、鲨烯合酶的基因erg9和编码法尼烯焦磷酸合酶的erg20，得到重组菌株3。利用重组解脂耶氏酵母菌用木糖生产原人参二醇，摇瓶产量达到80.88mg/L。

Description

利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌株及构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌株及构建方法和应用。

背景技术

原人参二醇(Protopanaxadiol，缩写为PPD)是人参、红参等中药中的重要活性成分,是达玛烷型人参皂苷的前体。现代医学研究表明，PPD具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎症等生物活性，在冠心病，抗抑郁等方面也有出色的疗效。

由于人参中的PPD含量极少，不到人参干重的0.05％，因此，PPD的生产和制备主要来自于PPD型总皂苷的糖基水解、酶解获得，然而这类方法存在以下几个缺点。1)原料短缺。人参生长周期长，且易受到农药残留污染，导致产品品质无法满足国内外市场需求。2)人参提取物成分复杂，分离纯化成本较高。3)制备过程往往伴随着对环境的高污染。因此，利用合成生物学的方法，通过微生物发酵生产人参皂苷将从根本上解决上述问题。

解脂耶氏酵母作为一种GRAS(generally regarded as safe)非常规酵母，已有研究表明其适合作为萜类化合物生产底盘细胞。木糖是一种戊糖，是仅次于葡萄糖的木质纤维素水解产物中含量第二高的单糖。来源于林业、农业等的木质纤维素以及工业废料每年可达到1000亿吨，使这种生物质成为地球上最丰富的可再生资源，因此有效利用木质纤维素可有效的减少对能源和食物的需求。然而，由于碳分解代谢物的抑制作用，大多数微生物不能有效地从木质纤维素水解物中代谢木糖，这在很大程度上限制了木质纤维素的应用。因此，木糖的使用成为木质纤维素研究中的热点问题。在解脂耶氏酵母中已经有了许多使木糖作为底物的尝试。Ledesma-Amaro等设计了代谢木糖重组解脂耶氏酵母，成功得到了高达80g/L的柠檬酸。

然而，利用合成生物学方法在解脂耶氏酵母中代谢木糖来异源合成原人参二醇还未见报道。

发明内容

根据现有技术的复发展和目前存在的问题，本发明提出了利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌株及构建方法和应用：

本发明的第一个目的是提供一种利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌。

本发明的第二个目的是提供一种利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法。

本发明的第三个目的是提供一种利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌发酵生产原人参二醇的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种生产利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌株的构建方法，其特征是是包括如下步骤：

(1)将优化的木糖代谢基因木糖还原酶基因XYL1表达盒和木糖醇脱氢酶基因XYL2表

达盒，以及内源的木酮糖激酶基因XKS表达盒，同时导入解脂耶氏酵母，得到重组菌1；

木糖还原酶基因XYL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。木糖醇脱氢酶基因XYL2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。木酮糖激酶基因XKS的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

(2)向所述重组解脂耶氏酵母菌1中导入优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS表达盒、优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS表达盒和优化的细胞色素-NADPH-还原酶1的编码基因表达盒，得到重组解脂耶氏酵母菌2；

所述优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。所述优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。所述优化的细胞色素-NADPH-还原酶1编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

(3)向所述重组解脂耶氏酵母菌2中导入截短5'端1500个核苷酸的编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因tHMG1表达盒，法呢基焦磷酸合酶基因ERG20表达盒，鲨烯合酶的编码基因ERG9表达盒，得到重组解脂耶氏酵母菌3；

所述编码截短5'端1500个核苷酸的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。所述法呢基焦磷酸合酶基因ERG20的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。所述鲨烯合酶基因ERG9的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

上述方法制备的利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌。

本发明提供一种利用木糖为唯一碳源，在YPX培养基摇瓶发酵后，进行酵母破壁提取进行检测，LC-MS用于原人参二醇的定性以及HPLC用于原人参二醇的定量，生产原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌发酵生产原人参二醇的应用。

本发明的优点：

实验证明，本发明的利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌可以利用木糖生产原人参二醇，摇瓶产量达到80.88mg/L；首次尝试了在耶氏解脂酵母中利用木糖生产萜类化合物的研究，实现了对木糖的有效应用，并且证明了以耶氏解脂酵母为平台生产以乙酰辅酶A为前体的化合物，木糖比葡萄糖具有更大的优势及潜力。本发明成功构建的利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌，为人工细胞利用木糖合成其他萜类化合物奠定了基础。

附图说明

图1：重组菌株1的构建方式图

图2：重组菌株2的构建方式图

图3：重组菌株3的构建方式图

具体实施方式

原料解脂耶氏酵母ATCC 201249，以下简称解脂耶氏酵母。

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、解脂耶氏酵母重组菌株1的构建

向解脂耶氏酵母中导入优化的木糖还原酶基因XYL1表达盒和木糖醇脱氢酶基因XYL2表达盒，以及内源的木酮糖激酶基因XKS表达盒，得到重组解脂耶氏酵母菌1，所述优化的木糖还原酶基因XYL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述优化的木糖醇脱氢酶基因XYL2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述木酮糖激酶基因XKS的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；

一、模块构建

木糖还原酶(xylose reductase)基因(XYL1)和木糖醇脱氢酶(xylitoldehydrogenase)基因(XYL2)均来源于树干毕赤酵母(Pichia stipitis；)，两个基因由武汉金开瑞生物工程有限公司通过化学合成的方法合成，并针对解脂耶氏酵母进行密码子优化，且对XYL1进行了突变(K270R/N272D)，得到优化的木糖还原酶基因XYL1(SEQ ID NO.1)和木糖醇脱氢酶基因XYL2(SEQ ID NO.2)。

木酮糖激酶基因XKS(SEQ ID NO.3)，Zetaup(SEQ ID NO.10)，Pexp(SEQ IDNO.11)，xpr2t(SEQ ID NO.12)，Pgpd1(SEQ ID NO.13)，lip2t(SEQ ID NO.14)，Ptef1(SEQID NO.15)，cyc1t(SEQ ID NO.16)，Zetad(SEQ ID NO.17)均来自解脂耶氏酵母ATCC201249基因组,筛选标记基因leu2(SEQ ID NO.18)来源于质粒pINA1269(参考文献：Catherine Madzak et al.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.2000,2(2):207-216；)

以解脂耶氏酵母ATCC201249基因组为模板，以Zetaup-F，Zetaup-R-Pexp为引物，扩增基因Zetaup；

以Zetaup-Pexp-F(SEQ ID NO.19)为上引，Pexp-R-XYL1(SEQ ID NO.20)为下引，扩增Pexp片段；以tef1p-XKS-F(SEQ ID NO.21)为上引，XKS-R-cyc1t(SEQ ID NO.22)为下引，扩增XKS片段；以Pexp-XYL1-F(SEQ ID NO.23)为上引，XYL1-R-xpr2t(SEQ ID NO.24)为下引，扩增得到片段XYL1；XYL1-xpr2t-F(SEQ ID NO.25)为上引，以xpr2t-R-Pgpd1(SEQ IDNO.26)为下引，扩增出xpr2t；将得到得四个片段融合得到模块Zetaup-Pexp-XYL1-XPR2t，模块以Zetaup-Pexp-F，XPR2t-RPgpd1为引物PCR扩增。

以xpr2t-Pgpd1-F(SEQ ID NO.27)为上引，Pgpd1-R-XYL2(SEQ ID NO.28)为下引，扩增Pgpd1；以Pgpd1-XYL2-F(SEQ ID NO.29)为上引，XYL2-R-lip2t(SEQ ID NO.30)为下引，扩增XYL2；XYL2-lip2t-F(SEQ ID NO.31)为上引，lip2t-R-tef1p(SEQ ID NO.32)为下引，扩增lip2t，将这三个单独的片段回收后融合，并以xpr2t-Pgpd1-F，lip2t-R-tef1p为引物得到模块Pgpd1-XYL2-lip2t。

lip2t-Ptef1-F(SEQ ID NO.33)为上引，Ptef1-R-XKS(SEQ ID NO.34)为下引，扩增得到Ptef1；Ptef1-XKS-F(SEQ ID NO.35)为上引，XKS-R-cyc1t(SEQ ID NO.36)为下引，扩增XKS；XKS-cyc1t-F(SEQ ID NO.37)为上引，cyc1t-R-Leu2(SEQ ID NO.38)为下引，扩增cyc1t；将DNA片段融合，以lip2t-tef1p-F，cyc1t-R-Leu2为引物，扩增获得模块Ptef1-XKS-cyc1t。

cyc1t-Leu2-F(SEQ ID NO.39)为上引，Leu2-R-Zetad(SEQ ID NO.40)为下引，扩增得到Leu2；Leu2-Zetad-F(SEQ ID NO.41)为上引，Zetad-R(SEQ ID NO.42)为下引，扩增得到Zetad，两个DNA片段融合，以cyc1t-Leu2-F，Zetad-R为引物，PCR扩增得到Leu2-Zetad。

本发明所用PCR酶为南京诺唯赞生物科技有限公司的

Max Super-Fidelity聚合酶。50μL的PCR扩增体系如下：DNA模板，1μL；前引(10μM)和后引(10μM)各2μL；dNTP(10mM)，1μL；2×Phanta Max Buffer，25μL；

Max Super-Fidelity聚合酶，1μL；最后用双蒸水补齐50μL。在PCR仪上设置扩增程序。扩增条件为95℃预变性4min(1个循环)；95℃变性15sec、退火60℃15sec、72℃延伸1min(34个循环)；72℃延伸5min(1个循环)。

本发明所用融合PCR体系如下：DNA片段总量800ng，摩尔比1:1；dNTP(10mM)，1μL；2×Phanta Max Buffer，25μL；

Max Super-Fidelity聚合酶，1μL；最后用双蒸水补齐50μL。在PCR仪上设置扩增程序。扩增条件为95℃预变性4min(1个循环)；95℃变性15sec、60℃退火30sec、72℃延伸1min(11个循环)，72℃延伸5min(1个循环)。重组菌1构建方式如图1所示。

二、解脂耶氏酵母转化

初始菌株解脂耶氏酵母ATCC 201249在YPX培养基中培养12h后取300μL加入至3mL新鲜YPX培养基中，培养6h。5000rpm离心5min，收集菌体，弃上清，用灭菌的ddH₂O洗涤菌体，在5000rpm离心5min，收集菌体，弃上清。然后将1mL 100mM的醋酸锂加入菌体中，轻轻吹打使细胞悬浮均匀，室温下放置5min后在4000rpm常温离心5min，收集菌体，制备酵母感受态细胞。转化混合体系包括240μL PEG(50％W/V)，36μL 1.0M醋酸锂，10μL ss-DNA，转化片段分Zetaup-Pexp-XYL1-xpr2t，Pgpd1-XYL2-lip2t，Ptef1-XKS-cyc1t，Leu2-Zetad片段各1μg。最后用灭菌的ddH₂O补齐至360μL。按上述顺序将各项依次加入刚制备的解脂耶氏酵母感受态细胞中，用移液枪吹打均匀，在42℃水浴放置30min，4000rpm离心2min，弃上清后加入1mLYPX液体培养基，30℃220rpm培养2h。然后4000rpm常温离心5min，弃上清，无菌水洗涤2次，最后用100μL无菌水重悬细胞，涂缺失leu的平板进行筛选。筛选培养条件为30℃，培养48h以上。挑取转化子过夜培养，提基因组，并PCR验证，得到正确目的片段的为正确克隆，命名为重组解脂耶氏酵母菌1。

实施例2、重组解脂耶氏酵母菌株2的构建

向所述重组解脂耶氏酵母酵母菌2中导入优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS表达盒、优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS表达盒和优化的细胞色素-NADPH-还原酶1的编码基因表达盒，得到利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏菌2。

所述的达玛烯二醇合酶编码基因(DS)来源于植物人参(Panax ginseng)，基因由武汉金开瑞生物工程有限公司通过化学合成的方法合成，并针对解脂耶氏酵母进行密码子优化，得到优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS(SEQ ID NO.4)；

所述的原人参二醇合酶编码基因PPDS来源于植物人参(Panax ginseng),基因由武汉金开瑞生物工程有限公司通过化学合成的方法合成，并针对解脂耶氏酵母进行密码子优化，得到优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述的细胞色素-NADPH-还原酶1的编码基因AtCPR1来源于拟南芥(Arabidopsisthaliana)，基因由武汉金开瑞生物工程有限公司通过化学合成的方法合成，并针对解脂耶氏酵母进行密码子优化，优化的细胞色素-NADPH-还原酶1编码基因的核苷酸序列用SEQ IDNO.6所示；

一、模块构建

基因rDNA-up(SEQ ID NO.43)，Ptef1(SEQ ID NO.15)，xpr2t(SEQ ID NO.12)，Pexp1(SEQ ID NO.11)，mig1t(SEQ ID NO.44)，Pgpd1(SEQ ID NO.13)；lip2t(SEQ IDNO.14)，rDNA-down(SEQ ID NO.45)均来自解脂耶氏酵母ATCC 201249基因组，筛选标记基因ura3(SEQ ID NO.46)来自质粒pURA3(参考文献：Production of TriterpeneGinsenoside Compound K in the Non-conventional Yeast Yarrowia lipolytica，Journal of Agricultural and Food Chemistry，2019)。

以rDNAup-F(SEQ ID NO.47)，rDNAup-R-Ptef1(SEQ ID NO.48)为引物，扩增rDNAup片段；以Ptef1-F-rDNAup(SEQ ID NO.49)，Ptef1-R-DS(SEQ ID NO.50)为引物，扩增Ptef1片段；以DS-F-Ptef1(SEQ ID NO.51)，xpr2t-F-DS(SEQ ID NO.52)为引物，扩增DS片段；以xpr2t-F-DS(SEQ ID NO.53)，xpr2t-R-Pexp1(SEQ ID NO.54)为引物，扩增xpr2t片段；将rDNAup，Ptef1，DS，xpr2t四个片段融合，以rDNAup-F，xpr2t-R-Pexp1为引物，扩增融合片段，得到rDNAup-Ptef1-DS-xpr2t模块。

以Pexp1-F-xpr2t(SEQ ID NO.55)，Pexp1-R-PPDS(SEQ ID NO.56)为引物，扩增Pexp1片段；以PPDS-F-Pexp1(SEQ ID NO.57)，Pexp1-R-PPDS(SEQ ID NO.58)为引物，扩增PPDS片段；以mig1t-F-PPDS(SEQ ID NO.59)，mig1t-R-Pgpd1(SEQ ID NO.60)为引物，扩增mig1t片段；将Pexp1，PPDS，mig1t三个片段融合PCR，以Pexp1-F-xpr2t，mig1t-R-Pgpd1为引物，扩增融合片段，得到Pexp1-PPDS-mig1t模块。

以Pgpd1-F-mig1t(SEQ ID NO.61)，Pgpd1-R-ATR1(SEQ ID NO.62)为引物，扩增Pgpd1片段；以ATR1-F-Pgpd1(SEQ ID NO.63)，ATR1-R-lip2t(SEQ ID NO.64)为引物，扩增ATR1片段；以lip2t-F-ATR(SEQ ID NO.65)，lip2t-R-LUL(SEQ ID NO.66)为引物，扩增lip2t片段；将Pgpd1，ATR1，lip2t三个片段融合PCR，以Pgpd1-F-mig1t，lip2t-RLUL为引物，扩增融合片段，得到Pgpd1-ATR1-lip2t模块。

LoxP序列((SEQ ID NO.67))由人工合成将其加于ura3序列两端，以lip2t-LUL-F(SEQ ID NO.68)，LUL-R-rDNAdown(SEQ ID NO.69)为引物，扩增LoxP-ura3-LoxP(LUL)片段(带有LoxP位点的ura3标记基因)；以LUL-rDNAdown-F(SEQ ID NO.70)，rDNAdown-R(SEQ IDNO.71)为引物，扩增下游同源臂rDNAdown，通过融合片段LUL和rDNAdown，得到LUL-rDNAdown模块。

本发明所用PCR酶为南京诺唯赞生物科技有限公司的

Max Super-Fidelity聚合酶，1μL；最后用双蒸水补齐50μL。在PCR仪上设置扩增程序。扩增条件为95℃预变性4min(1个循环)；95℃变性15sec、60℃退火30sec、72℃延伸1min(11个循环)，72℃延伸5min(1个循环)。重组菌2构建方式如图2所示。

二、解脂耶氏酵母转化

将重组解脂耶氏酵母菌1在YPX培养基中培养12h后取300μL加入至3mL新鲜YPX培养基中，培养6h。5000rpm离心5min，收集菌体，弃上清，用灭菌的ddH₂O洗涤菌体，在5000rpm离心5min，收集菌体，弃上清。然后将1mL 100mM的醋酸锂加入菌体中，轻轻吹打使细胞悬浮均匀，室温下放置5min后在4000rpm常温离心5min，收集菌体，制备酵母感受态细胞。转化混合体系包括240μL PEG(50％W/V)，36μL 1.0M醋酸锂，10μL ss-DNA，转化片段分rDNAup-Ptef1-DS-xpr2t，Pexp1-PPDS-mig1t，Pgpd1-ATR1-lip2t，LUL-rDNAdown片段各1μg。最后用灭菌的ddH₂O补齐至360μL。按上述顺序将各项依次加入刚制备的解脂耶氏酵母感受态细胞中，用移液枪吹打均匀，在42℃水浴放置30min，4000rpm离心2min，弃上清后加入1mLYPX液体培养基，30℃220rpm培养2h。然后4000rpm常温离心5min，弃上清，无菌水洗涤2次，最后用100μL无菌水重悬细胞，涂缺失leu，ura的平板进行筛选。筛选培养条件为30℃，培养48h以上。挑取转化子过夜培养，提基因组，并PCR验证，得到正确目的片段的为正确克隆，命名为重组解脂耶氏酵母菌2。

实施例3、重组解脂耶氏酵母菌3的构建

向所述用木糖生产原人参二醇的重组菌株2中导入截短5'端1500个核苷酸的编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因tHMG1表达盒，法呢基焦磷酸合酶基因ERG20表达盒，鲨烯合酶的编码基因ERG9表达盒，得到利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏菌3；

所述编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因tHMG1的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示，所述法呢基焦磷酸合酶基因ERG20的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述鲨烯合酶基因ERG9的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

一、模块构建

基因POX1A(SEQ ID NO.72)，Pfbain(SEQ ID NO.73),xpr2t(SEQ ID NO.12),Pexp1(SEQ ID NO.11),lip2t(SEQ ID NO.14),Pgpd1(SEQ ID NO.13),cyc1t(SEQ IDNO.16),POX1B(SEQ ID NO.74)均来自解脂耶氏酵母ATCC 201249基因组。

以POX1A-F(SEQ ID NO.75)，POX1A-R-Pfbain(SEQ ID NO.76)为引物，扩增POX1A；以POX1A-Pfbain-F(SEQ ID NO.77)，Pfbain-R-tHMG1(SEQ ID NO.78)为引物，扩增Pfbain；以Pfbain-tHMG1-F(SEQ ID NO.79)，tHMG1-R-xpr2t(SEQ ID NO.80)为引物，扩增tHMG1片段；将纯化回收得到的三个片段融合，并以POX1A-F，Pfbain-R-tHMG1为引物，扩增得到POX1A-Pfbain-tHMG1模块。

以tHMG1-xpr2t-F(SEQ ID NO.81)，xpr2t-R-Pexp1(SEQ ID NO.82)为引物，扩增xpr2t；以xpr2t-Pexp1-F(SEQ ID NO.83)，Pexp1-R-erg9(SEQ ID NO.84)为引物，扩增Pexp1；以Pexp1-erg9-F(SEQ ID NO.85)，erg9-R-lip2t(SEQ ID NO.86)为引物，扩增erg9；以erg9-lip2t-F(SEQ ID NO.87)，lip2t-R-Pgpd1(SEQ ID NO.88)为引物，扩增lip2t；将得到的四个片段融合PCR后，以tHMG1-xpr2t-F，lip2t-R-Pgpd1为引物扩增得到xpr2t-Pexp1-erg9-lip2t模块。

以lip2t-Pgpd1-F(SEQ ID NO.89)，Pgpd1-R-erg20(SEQ ID NO.90)为引物，扩增启动子Pgpd1；以Pgpd1-erg20-F(SEQ ID NO.91)，erg20-R-cyc1t(SEQ ID NO.92)为引物，扩增erg20；以erg20-cyc1t-F(SEQ ID NO.93)，cyc1t-R-LUL(SEQ ID NO.94)为引物，扩增cyc1t，得到的三个片段融合扩增得到Pgpd1-erg20-cyc1t模块。

LUL-POX1B-F(SEQ ID NO.95)为上引，POX1B-R(SEQ ID NO.96)为下引，扩增同源臂POX1B，以LUL-rDNAdown模块为模板，以cyc1t-LUL-F(SEQ ID NO.97)为上引，LUL-R-POX1B(SEQ ID NO.98)为下引，扩增LUL；，将两个片段融合并以cyc1t-LUL-F，POX1B-R为引物扩增得到模块LUL-POX1B。

本发明所用PCR酶为南京诺唯赞生物科技有限公司的

Max Super-Fidelity聚合酶，1μL；最后用双蒸水补齐50μL。在PCR仪上设置扩增程序。扩增条件为95℃预变性4min(1个循环)；95℃变性15sec、60℃退火30sec、72℃延伸1min(11个循环)，72℃延伸5min(1个循环)。重组菌3构建方式如图3所示。

二、解脂耶氏酵母转化

将重组解脂耶氏酵母菌2在YPX培养基中培养12h后取300μL加入至3mL新鲜YPX培养基中，培养6h。5000rpm离心5min，收集菌体，弃上清，用灭菌的ddH₂O洗涤菌体，在5000rpm离心5min，收集菌体，弃上清。然后将1mL 100mM的醋酸锂加入菌体中，轻轻吹打使细胞悬浮均匀，室温下放置5min后在4000rpm常温离心5min，收集菌体，制备酵母感受态细胞。转化混合体系包括240μL PEG(50％W/V)，36μL 1.0M醋酸锂，10μL ss-DNA，转化片段分POX1A-Pfbain-tHMG1，xpr2t-Pexp1-erg9-lip2t，Pgpd1-erg20-cyc1t，LUL-POX1B片段各1μg。最后用灭菌的ddH₂O补齐至360μL。按上述顺序将各项依次加入刚制备的解脂耶氏酵母感受态细胞中，用移液枪吹打均匀，在42℃水浴放置30min，4000rpm离心2min，弃上清后加入1mLYPX液体培养基，30℃220rpm培养2h。然后4000rpm常温离心5min，弃上清，无菌水洗涤2次，最后用100μL无菌水重悬细胞，涂缺失leu，ura的平板进行筛选。筛选培养条件为30℃，培养48h以上。挑取转化子过夜培养，提基因组，并PCR验证，得到正确目的片段的为正确克隆，命名为重组解脂耶氏酵母菌3。

实施例4、重组解脂耶氏酵母菌生产原人参二醇

(1)重组菌培养及产物提取

首先将实施例1、2、3中得到的重组菌1，重组菌2，重组菌3，连同ATCC 201249，在固体筛培养基上活化；然后将各个重组菌接种到试管YPX液体培养基中，过夜培养，待OD600长到约为4.0，接种到含30mLYPX培养基的摇瓶中进行摇瓶发酵，使初始OD600为0.05。发酵条件为30℃，220rpm，培养4天。发酵结束后，取1mL发酵液，加入1/2体积石英砂，400μL正丁醇，剧烈振荡30min，进行酵母破壁提取，通过14000rpm离心10min。收集上清正丁醇相进行检测，样品需要将上清过0.22mm有机膜后备用。发酵培养基为YPX液体培养基，其中各组分及其终浓度如下：终浓度为2％(质量百分比)的木糖，2％(质量百分比)的蛋白胨，1％(质量百分比)的酵母浸粉，用水补足体积。

(2)LC-MS鉴定原人参二醇

原人参二醇的定性用LC-MS进行。液相色谱条件：进样量5μL，安捷伦ZORBAX SB-Aq；流动相为90％乙腈，流速：0.2mL/min。质谱条件：雾化气和干燥气都为N2；碰撞电压：-70V；喷雾电压：3.8kV；离子源：APCI；离子源温度：120℃；脱溶温度：300℃；柱后流出物导入离子源速率：5μL/min；质谱扫描质量数范围：200-1000Da。

原人参二醇的定量用HPLC进行，液相色谱条件：进样量20μL，安捷伦ZORBAX SB-Aq；流动相为甲醇：乙腈＝4:6，流速：1mL/min。原人参二醇标准品购自北京索莱宝科技有限公司(www.solarbio.cn)。

(3)结果

如表1所示：解脂耶氏酵母ATCC 201249以及重组菌1没有合成原人参二醇；重组菌1在整合原人参二醇表达盒后得到重组菌2，以木糖为碳源，摇瓶发酵生产得到18.18mg/L原人参二醇；重组菌3进一步过表达截短5'端1500个核苷酸的编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因tHMG1表达盒，法呢基焦磷酸合酶基因ERG20表达盒，鲨烯合酶的编码基因ERG9表达盒后，木糖为碳源，摇瓶发酵生产得到80.88mg/L原人参二醇，原人参二醇产量明显提高，实现了解脂耶氏酵母以木糖为唯一碳源，发酵生产得到原人参二醇，为解脂耶氏酵母利用木糖生产其他萜类天然产物奠定了基础。

各重组菌株发酵生产原人参二醇的能力详见表1。

表1重组菌株生产原人参二醇能力

菌名	原人参二醇产量(mg/L)
		解脂耶氏酵母ATCC201249	0
重组菌1	0
		重组菌2	18.18
重组菌3	80.88

本发明公开和提出的技术方案，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

序列表

<110> 天津大学

<120> 利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌株及构建方法和应用

<160> 98

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 957

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgccctcta tcaagctgaa ctctggctac gacatgcccg ccgtcggctt cggctgctgg 60

aaggtggacg tggacacctg ttctgagcag atctaccgag ccatcaagac cggctaccga 120

ctgttcgacg gcgccgagga ctacgccaac gagaagctgg tcggagccgg cgtgaagaag 180

gccatcgacg agggcatcgt gaagcgagag gacctgttcc tgacctctaa gctgtggaac 240

aactaccacc atcctgacaa cgtcgagaag gccctgaacc gaactctgtc tgacctccag 300

gtggactacg tggacctgtt tctcattcac ttccccgtga ccttcaagtt cgtgcccctg 360

gaagagaagt accctcctgg cttctactgc ggcaagggcg acaacttcga ctacgaggac 420

gtgcccatcc tcgagacttg gaaggccctc gagaagctcg tgaaggccgg caagatccga 480

tctatcggcg tgtctaactt ccccggtgct ctgctgctgg acctgctgcg aggcgccacc 540

atcaagccct ctgtgctgca ggtcgagcat cacccctact tgcagcagcc ccgactgatc 600

gagttcgctc agtcccgagg aatcgccgtg accgcctact cttcgttcgg accccagtct 660

ttcgtcgagc tgaaccaggg acgagccctg aacacctcgc ctctgttcga gaacgagact 720

atcaaggcca ttgccgccaa gcacggcaag tctcccgctc aggtgctgct ccgatggtcc 780

tctcagcgag gcattgccat cattccccga tctgacaccg tgcctcgact gctcgagaac 840

aaggacgtga actctttcga cctggacgag caggacttcg ccgacattgc caagctggac 900

atcaacctgc gattcaacga cccctgggac tgggacaaga tccccatctt cgtgtaa 957

<210> 2

<211> 1092

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgactgcta acccctctct ggtgctgaac aagatcgacg acatctcttt cgagacttac 60

gacgctcccg agatctctga gcccaccgac gtgctggtgc aggtcaagaa gaccggcatc 120

tgcggctctg acatccactt ctacgcccac ggccgaatcg gcaacttcgt gctgaccaag 180

cctatggtgc tgggccacga gtctgccggc accgtggtcc aggtcggcaa gggcgtgacc 240

tctctgaagg tgggcgacaa cgtggctatc gagcccggca ttccctctcg attctctgac 300

gagtacaagt ctggccacta caacctgtgt cctcacatgg ccttcgccgc tactcccaac 360

tctaaggaag gcgagcccaa ccctcctggc actctgtgca agtacttcaa gtctcccgag 420

gacttcctgg tgaagctgcc cgaccatgtg tctctcgagc tgggcgccct ggtcgagccc 480

ctgtctgtgg gagtgcacgc ctctaagctg ggctctgtgg ccttcggaga ctacgtggcc 540

gtgttcggcg ctggccccgt gggcctgctg gccgctgccg tggccaagac cttcggcgcc 600

aagggcgtca tcgtggtgga catcttcgac aacaagctga agatggccaa ggacatcggc 660

gctgctaccc acaccttcaa ctccaagacc ggcggatctg aggaactgat caaggctttc 720

ggcggcaacg tgcccaacgt ggtgctcgag tgcaccggcg ctgagccctg catcaagctc 780

ggcgtggacg ctatcgctcc cggcggacga ttcgtgcagg tcggaaacgc cgctggaccc 840

gtgtctttcc ccatcaccgt gttcgccatg aaggaactga ccctgttcgg ctctttccga 900

tacggcttca acgactacaa gaccgccgtg ggcattttcg acaccaacta ccagaacggc 960

cgagagaacg ctcccatcga cttcgagcag ctgatcaccc accgatacaa gttcaaggac 1020

gccatcgagg cctacgacct ggtgcgagcc ggaaagggcg ccgtgaagtg cctgatcgac 1080

ggccccgagt aa 1092

<210> 3

<211> 1623

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtatctcg gactggatct ttcgactcaa cagctcaagg gcatcattct ggacacaaaa 60

acgctggaca cggtcacaca agtccatgtg gactttgagg acgacttgcc gcagttcaac 120

accgaaaagg gcgtctttca cagctctaca gtggccggag aaatcaatgc tcctgtggca 180

atgtgggggg cagctgtgga cttgctgata gagcgtctgt caaaggaaat agacctttcc 240

acgatcaagt ttgtgtcggg ctcgtgccag caacacggct ctgtttatct caacagcagc 300

tacaaggagg gcctgggttc tctggacaaa cacaaagact tgtctacagg agtgtcatcc 360

ttactggcgc tcgaagtcag ccccaattgg caggatgcaa gcacggagaa ggagtgtgcg 420

cagtttgagg ctgcagtcgg cggtcccgag cagctggctg agatcactgg ctctcgagca 480

catactcgtt tcaccgggcc ccagattctc aaggtcaagg aacgcaaccc caaggtattc 540

aaggccacgt cacgggtcca gctcatatcc aactttctag catctctgtt tgccggcaag 600

gcgtgcccct ttgatcttgc tgacgcctgt ggaatgaatc tgtgggacat ccagaatggc 660

cagtggtgca agaaactcac agatctcatc accgatgaca cccactcggt cgagtccctc 720

cttggagacg tggaaacaga ccccaaggct ctactgggca aaatctcgcc ctatttcgtc 780

tccaagggct tctctccctc ttgtcaggtg gcacagttca caggcgacaa cccaggcact 840

atgctggctc tccccttaca ggccaatgac gtgattgtgt ctttgggaac atctacgacc 900

gccctcgtcg taacaaacaa gtacatgccc gaccccggat accatgtgtt caaccacccc 960

atggagggat acatgggcat gctgtgctac tgcaacggag gtctagcacg agagaagatc 1020

cgagacgagc ttggaggctg ggacgagttt aatgaggcgg ccgagaccac caacacagtg 1080

tctgctgacg atgtccatgt tggcatctac tttccactac gagaaatcct tcctcgagca 1140

ggtccctttg aacgacgttt catctacaac agacaaagtg aacagcttac agagatggct 1200

tctccagagg actcactggc aaccgaacac aaaccgcagg ctcaaaatct caaggacacg 1260

tggccgccac aaatggacgc cactgccatc attcaaagcc aggccctcag tatcaaaatg 1320

agactccaac gcatgatgca tggcgatatt ggaaaggtgt attttgtggg aggcgcctcg 1380

gtcaacactg ctatctgcag cgtaatgtct gccatcttaa aaccaacaaa gggcgcttgg 1440

agatgtggtc tggaaatggc aaacgcttgt gccattggaa gtgcccatca cgcctggctt 1500

tgcgacccca acaagacagg ccaggtacag gttcacgaag aagaggtcaa atacaagaat 1560

gtggacacag acgtgctact caaggcgttc aagctggccg aaaacgcctg cctggagaaa 1620

taa 1623

<210> 4

<211> 2310

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgtggaagc tgaaggtcgc ccagggtaac gacccttacc tgtactccac caacaacttc 60

gtcggccgac agtactggga gttccagccc gacgccggca cccccgagga gcgagaggag 120

gtcgagaagg cccgaaagga ttacgtcaac aacaagaagc tgcacggcat ccacccctgc 180

tctgatatgc tgatgcgacg acagctgatc aaggagtccg gcatcgacct gctgtccatc 240

ccccctctgc gactggacga gaacgagcag gttaactacg acgccgtcac caccgctgtc 300

aagaaggctc tgcgactgaa ccgagccatc caggctcatg acggtcactg gcctgctgag 360

aacgctggtt ctctgctgta caccccccct ctgatcatcg ctctgtacat ctccggcacc 420

atcgacacca tcctgaccaa gcagcacaag aaggagctga tccgattcgt ctacaaccac 480

cagaacgagg acggcggttg gggttcctac atcgagggtc attccaccat gatcggctcc 540

gtcctgtcct acgtcatgct gcgactgctg ggtgagggtc tggctgagtc cgacgacggt 600

aacggtgctg ttgagcgagg tcgaaagtgg atcttggacc acggcggtgc tgctggtatc 660

ccttcctggg gtaagaccta cctggccgtt ctgggtgtct acgagtggga gggttgcaac 720

cctctgcctc ctgagttctg gctgttccct tcctccttcc ccttccaccc tgctaagatg 780

tggatctact gccgatgcac ctacatgccc atgtcctacc tgtacggcaa gcgataccac 840

ggccctatca ccgatctggt cctgtctctg cgacaggaga tctacaacat cccctacgag 900

cagatcaagt ggaaccagca gcgacacaac tgctgcaagg aggacctgta ctacccccac 960

accctggttc aggacctggt ttgggacggt ctgcactact tctccgagcc tttcctgaag 1020

cgatggccct tcaacaagct gcgaaagcga ggcctgaagc gagtcgttga gctgatgcga 1080

tacggcgcta ccgagactcg attcatcacc accggcaacg gcgagaaggc tctgcagatt 1140

atgtcctggt gggccgagga ccctaacggt gacgagttta agcaccacct ggcccgaatc 1200

cccgactttc tgtggatcgc tgaggacggt atgaccgtcc agtccttcgg ttcccagctg 1260

tgggattgca tcctggctac ccaggctatc atcgccacca acatggtcga ggagtacggc 1320

gattccctga agaaggccca cttcttcatc aaggagtccc agatcaagga gaacccccga 1380

ggtgacttcc tgaagatgtg ccgacagttc accaagggcg cctggacctt ttccgaccag 1440

gatcatggct gcgtcgtctc tgactgcacc gctgaggctc tgaagtgcct gctgctgctg 1500

tctcagatgc cccaggatat cgtcggcgag aagcctgagg tcgagcgact gtacgaggct 1560

gttaacgtcc tgctgtacct gcagtcccga gtctctggtg gtttcgctgt ctgggagcct 1620

cctgttccta agccttacct ggagatgctg aacccctccg agatcttcgc cgacatcgtc 1680

gttgagcgag agcacatcga gtgcaccgct tctgtcatca agggcctgat ggccttcaag 1740

tgcctgcacc ctggtcaccg acagaaggag atcgaggact ccgtcgctaa ggccatccga 1800

tacctggagc gaaaccagat gcccgacggt tcttggtacg gcttctgggg tatctgcttc 1860

ctgtacggca ccttcttcac cctgtccggt ttcgcttccg ccggtcgaac ctacgataac 1920

tccgaggctg tccgaaaggg cgtcaagttc ttcctgtcca cccagaacga ggagggcggt 1980

tggggtgagt ccctggagtc ctgcccttcc gagaagttca cccctctgaa gggcaaccga 2040

accaacctgg tccagacctc ttgggctatg ctgggtctga tgttcggcgg tcaggctgag 2100

cgagatccta ctcctctgca ccgagctgct aagctgctga tcaacgccca gatggacaac 2160

ggcgacttcc ctcagcagga gatcaccggt gtctactgca agaactccat gctgcactac 2220

gccgagtacc gaaacatctt ccccctgtgg gccctgggtg agtaccgaaa gcgagtttgg 2280

ctgcccaagc accagcagct gaagatctaa 2310

<210> 5

<211> 1449

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggtcctgt tcttctccct gtccctgctg ctgctgcctc tgctgctgct gtttgcttac 60

ttctcctaca ccaagcgaat cccccagaag gagaacgact ccaaggcccc cctgcctcct 120

ggtcagaccg gttggcctct gattggtgag accctgaact acctgtcctg cgtcaagtcc 180

ggcgtctctg agaacttcgt caagtaccga aaggagaagt actcccccaa ggtcttccga 240

acctccctgc tgggtgagcc tatggctatc ctgtgcggtc ctgagggtaa caagttcctg 300

tactccaccg agaagaagct ggtccaggtc tggttcccct cctctgttga gaagatgttc 360

ccccgatccc acggcgagtc taacgctgac aacttctcca aggtccgagg caagatgatg 420

ttcctgctga aggtcgatgg catgaagaag tacgtcggcc tgatggaccg agtcatgaag 480

cagttcctgg agaccgactg gaaccgacag cagcagatca acgtccacaa caccgtcaag 540

aagtacaccg tcaccatgtc ctgccgagtc ttcatgtcca tcgacgacga ggagcaggtc 600

acccgactgg gttcctccat tcagaacatc gaggccggcc tgctggctgt ccctatcaac 660

attcccggca ccgctatgaa ccgagccatc aagaccgtca agctgctgac ccgagaggtc 720

gaggctgtta tcaagcagcg aaaggtcgat ctgctggaga acaagcaggc ctcccagcct 780

caggatctgc tgtcccacct gctgctgact gctaaccagg acggtcagtt cctgtccgag 840

tccgatatcg cctcccacct gatcggtctg atgcagggtg gttacaccac cctgaacggc 900

actatcacct tcgtcctgaa ctacctggcc gagttccccg atgtctacaa ccaggtcctg 960

aaggagcagg tcgagatcgc taactccaag caccccaagg agctgctgaa ctgggaggat 1020

ctgcgaaaga tgaagtactc ctggaacgtc gcccaggagg tcctgcgaat tatccctcct 1080

ggcgtcggta ctttccgaga ggctatcacc gacttcacct acgccggtta cctgatcccc 1140

aagggttgga agatgcacct gatcccccac gacacccaca agaaccctac ctacttcccc 1200

tcccccgaga agttcgaccc tactcgattc gagggcaacg gccctgctcc ttacactttc 1260

acccccttcg gcggtggtcc tcgaatgtgc cctggtattg agtacgcccg actggtcatc 1320

ctgatcttca tgcacaacgt cgtcaccaac ttccgatggg agaagctgat ccccaacgag 1380

aagatcctga ccgaccccat cccccgattc gctcacggtc tgcctatcca tctgcaccct 1440

cacaactaa 1449

<210> 6

<211> 2079

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgacctccg ctctgtacgc ttccgacctg ttcaagcagc tgaagtccat catgggcacc 60

gactccctgt ccgatgacgt tgttctggtc atcgccacca cctccctggc cctggtcgcc 120

ggcttcgtcg tcctgctgtg gaagaagacc accgctgacc gatccggtga gctgaagccc 180

ctgatgatcc ctaagtccct gatggccaag gacgaggacg acgatctgga cctgggttct 240

ggtaagaccc gagtctccat cttcttcggc acccagaccg gtactgccga gggcttcgcc 300

aaggccctgt ccgaggagat caaggcccga tacgagaagg ccgctgtcaa ggttatcgac 360

ctggacgact acgccgccga tgatgatcag tacgaggaga agctgaagaa ggagaccctg 420

gccttcttct gcgtcgctac ttacggcgac ggcgagccca ccgacaacgc cgcccgattc 480

tacaagtggt tcaccgagga gaacgagcga gacatcaagc tgcagcagct ggcttacggc 540

gtcttcgccc tgggcaaccg acagtacgag catttcaaca agatcggcat cgtcctggac 600

gaggagctgt gtaagaaggg cgctaagcga ctgatcgagg tcggtctggg tgacgatgac 660

cagtctatcg aggacgactt caacgcctgg aaggagtccc tgtggtccga gctggataag 720

ctgctgaagg acgaggacga caagtccgtc gctaccccct acactgctgt catccctgag 780

taccgagtcg tcacccacga cccccgattt actacccaga agtccatgga gtccaacgtc 840

gccaacggca acaccactat cgacatccac cacccctgcc gagtcgatgt tgctgttcag 900

aaggagctgc acacccacga gtccgatcga agctgtatcc acctggagtt cgacatctcc 960

cgaaccggta tcacctacga gaccggtgac cacgtcggtg tttacgctga gaaccacgtc 1020

gagatcgtcg aggaggctgg taagctgctg ggtcattccc tggacctggt cttctccatc 1080

cacgctgaca aggaggacgg ctctcctctg gagtctgctg ttcctcctcc cttccctggt 1140

ccttgtaccc tgggcaccgg cctggcccga tacgccgacc tgctgaaccc ccctcgaaag 1200

tccgctctgg ttgctctggc tgcttacgct accgagcctt ctgaggctga gaagctgaag 1260

cacctgacct cccctgacgg taaggacgag tactcccagt ggatcgtcgc ctctcagcga 1320

tctctgctgg aggttatggc cgctttcccc tctgctaagc cccctctggg tgttttcttc 1380

gccgctatcg cccctcgact gcagcctcga tactactcta tctcctcctc cccccgactg 1440

gctccttccc gagtccacgt cacctccgct ctggtctacg gtcctactcc taccggtcga 1500

atccacaagg gcgtctgttc cacctggatg aagaacgccg tccccgctga gaagtcccat 1560

gagtgctctg gtgcccctat cttcatccga gcctccaact tcaagctgcc ctccaaccct 1620

tccaccccta tcgttatggt cggccctggt actggcctgg ctcctttccg aggtttcctg 1680

caggagcgaa tggccctgaa ggaggatggt gaggagctgg gttcctccct gctgtttttc 1740

ggctgccgaa accgacagat ggacttcatc tacgaggacg agctgaacaa cttcgtcgat 1800

cagggcgtca tctccgagct gatcatggct ttctcccgag agggcgctca gaaggagtac 1860

gttcagcaca agatgatgga gaaggccgcc caggtctggg atctgattaa ggaggagggc 1920

tacctgtacg tctgcggtga tgctaagggc atggcccgag atgtccaccg aactctgcac 1980

actatcgtcc aggagcagga gggtgtctcc tcttctgagg ctgaggctat cgtcaagaag 2040

ctgcagaccg agggccgata cctgcgagac gtctggtaa 2079

<210> 7

<211> 1470

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgcctatcg tcattgagaa gcccagcgag aaggaggagg acacctcttc tgaagactcc 60

attgagctga ctgtcggaaa gcagcccaag cccgtgaccg agacccgttc tctggacgac 120

ctagaggcta tcatgaaggc aggtaagacc aagcttctgg aggaccacga ggttgtcaag 180

ctctctctcg agggcaagct tcctttgtat gctcttgaga agcagcttgg tgacaacacc 240

cgagctgttg gcatccgacg atctatcatc tcccagcagt ctaataccaa gactttagag 300

acctcaaagc ttccttacct gcactacgac tacgaccgtg tttttggagc ctgttgcgag 360

aacgttattg gttacatgcc tctccccgtt ggtgttgctg gccccatgaa cattgatggc 420

aagaactacc acattcctat ggccaccact gagggttgtc ttgttgcctc aaccatgcga 480

ggttgcaagg ccatcaacgc cggtggcggt gttaccactg tgcttactca ggacggtatg 540

acacgaggtc cttgtgtttc cttcccctct ctcaagcggg ctggagccgc taagatctgg 600

cttgattccg aggagggtct caagtccatg cgaaaggcct tcaactccac ctctcgattt 660

gctcgtctcc agtctcttca ctctaccctt gctggtaacc tgctgtttat tcgattccga 720

accaccactg gtgatgccat gggcatgaac atgatctcca agggcgtcga acactctctg 780

gccgtcatgg tcaaggagta cggcttccct gatatggaca ttgtgtctgt ctcgggtaac 840

tactgcactg acaagaagcc cgcagcgatc aactggatcg aaggccgagg caagagtgtt 900

gttgccgaag ccaccatccc tgctcacatt gtcaagtctg ttctcaaaag tgaggttgac 960

gctcttgttg agctcaacat cagcaagaat ctgatcggta gtgccatggc tggctctgtg 1020

ggaggtttca atgcacacgc cgcaaacctg gtgaccgcca tctaccttgc cactggccag 1080

gatcctgctc agaatgtcga gtcttccaac tgcatcacgc tgatgagcaa cgtcgacggt 1140

aacctgctca tctccgtttc catgccttct atcgaggtcg gtaccattgg tggaggtact 1200

attttggagc cccagggggc tatgctggag atgcttggcg tgcgaggtcc tcacatcgag 1260

acccccggtg ccaacgccca acagcttgct cgcatcattg cttctggagt tcttgcagcg 1320

gagctttcgc tgtgttctgc tcttgctgcc ggccatcttg tgcaaagtca tatgacccac 1380

aaccggtccc aggctcctac tccggccaag cagtctcagg ccgatctgca gcgtctacaa 1440

aacggttcga atatttgcat acggtcatag 1470

<210> 8

<211> 1035

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgtccaagg cgaaattcga aagcgtgttc ccccgaatct ccgaggagct ggtgcagctg 60

ctgcgagacg agggtctgcc ccaggatgcc gtgcagtggt tttccgactc acttcagtac 120

aactgtgtgg gtggaaagct caaccgaggc ctgtctgtgg tcgacaccta ccagctactg 180

accggcaaga aggagctcga tgacgaggag tactaccgac tcgcgctgct cggctggctg 240

attgagctgc tgcaggcgtt tttcctcgtg tcggacgaca ttatggatga gtccaagacc 300

cgacgaggcc agccctgctg gtacctcaag cccaaggtcg gcatgattgc catcaacgat 360

gctttcatgc tagagagtgg catctacatt ctgcttaaga agcatttccg acaggagaag 420

tactacattg accttgtcga gctgttccac gacatttcgt tcaagaccga gctgggccag 480

ctggtggatc ttctgactgc ccccgaggat gaggttgatc tcaaccggtt ctctctggac 540

aagcactcct ttattgtgcg atacaagact gcttactact ccttctacct gcccgttgtt 600

ctagccatgt acgtggccgg cattaccaac cccaaggacc tgcagcaggc catggatgtg 660

ctgatccctc tcggagagta cttccaggtc caggacgact accttgacaa ctttggagac 720

cccgagttca ttggtaagat cggcaccgac atccaggaca acaagtgctc ctggctcgtt 780

aacaaagccc ttcagaaggc cacccccgag cagcgacaga tcctcgagga caactacggc 840

gtcaaggaca agtccaagga gctcgtcatc aagaaactgt atgatgacat gaagattgag 900

caggactacc ttgactacga ggaggaggtt gttggcgaca tcaagaagaa gatcgagcag 960

gttgacgaga gccgaggctt caagaaggag gtgctcaacg ctttcctcgc caagatttac 1020

aagcgacaga agtag 1035

<210> 9

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgggaaaac tcatcgaact gctcttgcac cctagcgaac tgtctgctgc tatccactac 60

aagctgtggc gtcagcctct gcatccccgc gatctttcca aggagtccac tgagctgcga 120

cgatgctatg agcttctaga cgtgtgctca cgatcatttg cagccgttat tcgagaactg 180

catcctgagg tgcgagacgc tgtaatgctg ttctatctga ttcttcgtgc tctcgacacg 240

attgaagacg atatgactct gtcgcgtgac atcaagatcc caattcttcg agacttcacg 300

aagtgcatga agacacctgg ctggaagttc accgactctg atcccaacga gcgagatcgt 360

gtggtgctac aggagtttcc tgtggttatg actgagttca acaagctcaa gcccaagtac 420

caggaagtaa tctacgacat taccgacaga atgggaaacg gaatggccga ttacgtcatt 480

gatgacgact tcaacaacaa cggcgtggac accattgccg cttatgatct gtactgtcat 540

catgttgccg gcatcgtggg tgagggcctt acccgaatta cgattctcgc tggttttgga 600

accgacgtgt tgcacgaaaa cccccgactt caggagtcta tgggcttgtt cttgcaaaag 660

gtcaacatca tccgagacta cagagaagac attgacgtga acagagcttt ctggcctcga 720

gaaatctggc acaagtacgc cgaagaaatg cgagatttca aggacccgaa gtattccaag 780

aaggccttgc attgcacctc cgatctggtt gcaaatgccc tcggacatgc cacagactgc 840

ctcgattacc tcgacaacgt caccgatcct tcaaccttca ctttctgcgc cattccccag 900

gtcatggcca ttgctaccct ggacttggtc taccgaaacc ccgacgtttt ccagaagaac 960

gtcaagttgc gcaagggaac tactgtcagc ctgattcttg aggccagcaa cgtttctgga 1020

gtatgtgaca ttttcactcg atacgcccgg aaggtgtaca agaagtccga ccccaatgac 1080

cccaactact tccgagtgtc tgtgctctgc ggtaagatcg agcagcatgc ggctctgatc 1140

aagagacagc gaggaccccc cgctaaaacc attgcacaac tggaaggtga acgaaaagag 1200

atggccctgt cgctaattgt ctgtttagca gttatcttct cgatgtctgg actgatggct 1260

tatatcgcct acgtgtctgg attcagatgg tcaccccgag agattttcga ctctaagatg 1320

tttcctctga gagattag 1338

<210> 10

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agagaatcgg cgttacctct ctcacaaagc ccttcagtac cgccgcctgt cgggaatcgc 60

gttcaggtgg aacaggacca cctcccttgc acttcttggt atatcagtat aggctgatgt 120

attcatagtg gggtttttca taataaattt actaacggca ggcaacattc actcggctta 180

aacgcaaaac ggaccgtctt gatatcttct gacgcattga ccaccgagaa atagtgttag 240

ttaccgggtg agttattgtt cttctacaca ggcgacgccc atcgtctaga gttgatgtac 300

taactcagat ttcactacct accctatccc tggtacgcac aaagcact 348

<210> 11

<211> 999

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gagtttggcg cccgtttttt cgagccccac acgtttcggt gagtatgagc ggcggcagat 60

tcgagcgttt ccggtttccg cggctggacg agagcccatg atgggggctc ccaccaccag 120

caatcagggc cctgattaca cacccacctg taatgtcatg ctgttcatcg tggttaatgc 180

tgctgtgtgc tgtgtgtgtg tgttgtttgg cgctcattgt tgcgttatgc agcgtacacc 240

acaatattgg aagcttatta gcctttctat tttttcgttt gcaaggctta acaacattgc 300

tgtggagagg gatggggata tggaggccgc tggagggagt cggagaggcg ttttggagcg 360

gcttggcctg gcgcccagct cgcgaaacgc acctaggacc ctttggcacg ccgaaatgtg 420

ccacttttca gtctagtaac gccttaccta cgtcattcca tgcatgcatg tttgcgcctt 480

ttttcccttg cccttgatcg ccacacagta cagtgcactg tacagtggag gttttggggg 540

ggtcttagat gggagctaaa agcggcctag cggtacacta gtgggattgt atggagtggc 600

atggagccta ggtggagcct gacaggacgc acgaccggct agcccgtgac agacgatggg 660

tggctcctgt tgtccaccgc gtacaaatgt ttgggccaaa gtcttgtcag ccttgcttgc 720

gaacctaatt cccaattttg tcacttcgca cccccattga tcgagcccta acccctgccc 780

atcaggcaat ccaattaagc tcgcattgtc tgccttgttt agtttggctc ctgcccgttt 840

cggcgtccac ttgcacaaac acaaacaagc attatatata aggctcgtct ctccctccca 900

accacactca cttttttgcc cgtcttccct tgctaacaca aaagtcaaga acacaaacaa 960

ccaccccaac ccccttacac acaagacata tctacagca 999

<210> 12

<211> 411

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cctgtcccca cgttgccggt cttgcctcct actacctgtc catcaatgac gaggttctca 60

cccctgccca ggtcgaggct cttattactg agtccaacac cggtgttctt cccaccacca 120

acctcaaggg ctctcccaac gctgttgcct acaacggtgt tggcatttag gcaattaaca 180

gatagtttgc cggtgataat tctcttaacc tcccacactc ctttgacata acgatttatg 240

taacgaaact gaaatttgac cagatattgt tgtaaataga aaatctggct tgtaggtggc 300

aaaatcccgt ctttgttcat caattccctc tgtgactact cgtcatccct ttatgttcga 360

ctgtcgtatt tttattttcc atacatacgc aagtgagatg cccgtgtccg a 411

<210> 13

<211> 931

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgcagtagga tgtcctgcac gggtcttttt gtggggtgtg gagaaagggg tgcttggaga 60

tggaagccgg tagaaccggg ctgcttgggg ggatttgggg ccgctgggct ccaaagaggg 120

gtaggcattt cgttggggtt acgtaattgc ggcatttggg tcctgcgcgc atgtcccatt 180

ggtcagaatt agtccggata ggagacttat cagccaatca cagcgccgga tccacctgta 240

ggttgggttg ggtgggagca cccctccaca gagtagagtc aaacagcagc agcaacatga 300

tagttggggg tgtgcgtgtt aaaggaaaaa aaaagaagct tgggttatat tcccgctcta 360

tttagaggtt gcgggataga cgccgacgga gggcaatggc gccatggaac cttgcggata 420

tcgatacgcc gcggcggact gcgtccgaac cagctccagc agcgtttttt ccgggccatt 480

gagccgactg cgaccccgcc aacgtgtctt ggcccacgca ctcatgtcat gttggtgttg 540

ggaggccact ttttaagtag cacaaggcac ctagctcgca gcaaggtgtc cgaaccaaag 600

aagcggctgc agtggtgcaa acggggcgga aacggcggga aaaagccacg ggggcacgaa 660

ttgaggcacg ccctcgaatt tgagacgagt cacggcccca ttcgcccgcg caatggctcg 720

ccaacgcccg gtcttttgca ccacatcagg ttaccccaag ccaaaccttt gtgttaaaaa 780

gcttaacata ttataccgaa cgtaggtttg ggcgggcttg ctccgtctgt ccaaggcaac 840

atttatataa gggtctgcat cgccggctca attgaatctt ttttcttctt ctcttctcta 900

tattcattct tgaattaaac acacatcaac a 931

<210> 14

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gctatttatc actctttaca acttctacct caactatcta ctttaataaa tgaatatcgt 60

ttattctcta tgattactgt atatgcgttc ctctaagaca aatcgaaacc agcatgcgat 120

cgaatggcat acaaaagttt cttccgaagt tgatcaatgt cctgatagtc aggcagcttg 180

agaagattga cacaggtgga 200

<210> 15

<211> 406

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agagaccggg ttggcggcgt atttgtgtcc caaaaaacag ccccaattgc cccaattgac 60

cccaaattga cccagtagcg ggcccaaccc cggcgagagc ccccttcacc ccacatatca 120

aacctccccc ggttcccaca cttgccgtta agggcgtagg gtactgcagt ctggaatcta 180

cgcttgttca gactttgtac tagtttcttt gtctggccat ccgggtaacc catgccggac 240

gcaaaataga ctactgaaaa tttttttgct ttgtggttgg gactttagcc aagggtataa 300

aagaccaccg tccccgaatt acctttcctc ttcttttctc tctctccttg tcaactcaca 360

cccgaaatcg ttaagcattt ccttctgagt ataagaatca ttcaaa 406

<210> 16

<211> 251

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atcatgtaat tagttatgtc acgcttacat tcacgccctc ctcccacatc cgctctaacc 60

gaaaaggaag gagttagaca acctgaagtc taggtcccta tttatttttt ttaatagtta 120

tgttagtatt aagaacgtta tttatatttc aaatttttct tttttttctg tacaaacgcg 180

tgtacgcatg taacattata ctgaaaacct tgcttgagaa ggttttggga cgctcgaagg 240

ctttaatttg c 251

<210> 17

<211> 353

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tgtaacactc gctctggaga gttagtcatc cgacagggta actctaatct cccaacacct 60

tattaactct gcgtaactgt aactcttctt gccacgtcga tcttactcaa ttttcctgct 120

catcatctgc tggattgttg tctatcgtct ggctctaata catttattgt ttattgccca 180

aacaactttc attgcacgta agtgaattgt tttataacag cgttcgccaa ttgctgcgcc 240

atcgtcgtcc ggctgtccta ccgttagggg tagtgtgtct cacactaccg aggttactag 300

agttgggaaa gcgatactgc ctcggacaca ccacctgggt cttacgactg cag 353

<210> 18

<211> 2347

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gaattccgtc gtcgcctgag tcatcattta tttaccagtt ggccacaaac ccttgacgat 60

ctcgtatgtc ccctccgaca tactcccggc cggctggggt acgttcgata gcgctatcgg 120

catcgacaag gtttgggtcc ctagccgata ccgcactacc tgagtcacaa tcttcggagg 180

tttagtcttc cacatagcac gggcaaaagt gcgtatatat acaagagcgt ttgccagcca 240

cagattttca ctccacacac cacatcacac atacaaccac acacatccac aatggaaccc 300

gaaactaaga agaccaagac tgactccaag aagattgttc ttctcggcgg cgacttctgt 360

ggccccgagg tgattgccga ggccgtcaag gtgctcaagt ctgttgctga ggcctccggc 420

accgagtttg tgtttgagga ccgactcatt ggaggagctg ccattgagaa ggagggcgag 480

cccatcaccg acgctactct cgacatctgc cgaaaggctg actctattat gctcggtgct 540

gtcggaggcg ctgccaacac cgtatggacc actcccgacg gacgaaccga cgtgcgaccc 600

gagcagggtc tcctcaagct gcgaaaggac ctgaacctgt acgccaacct gcgaccctgc 660

cagctgctgt cgcccaagct cgccgatctc tcccccatcc gaaacgttga gggcaccgac 720

ttcatcattg tccgagagct cgtcggaggt atctactttg gagagcgaaa ggaggatgac 780

ggatctggcg tcgcttccga caccgagacc tactccgttc ctgaggttga gcgaattgcc 840

cgaatggccg ccttcctggc ccttcagcac aacccccctc ttcccgtgtg gtctcttgac 900

aaggccaacg tgctggcctc ctctcgactt tggcgaaaga ctgtcactcg agtcctcaag 960

gacgaattcc cccagctcga gctcaaccac cagctgatcg actcggccgc catgatcctc 1020

atcaagcagc cctccaagat gaatggtatc atcatcacca ccaacatgtt tggcgatatc 1080

atctccgacg aggcctccgt catccccggt tctctgggtc tgctgccctc cgcctctctg 1140

gcttctctgc ccgacaccaa cgaggcgttc ggtctgtacg agccctgtca cggatctgcc 1200

cccgatctcg gcaagcagaa ggtcaacccc attgccacca ttctgtctgc cgccatgatg 1260

ctcaagttct ctcttaacat gaagcccgcc ggtgacgctg ttgaggctgc cgtcaaggag 1320

tccgtcgagg ctggtatcac taccgccgat atcggaggct cttcctccac ctccgaggtc 1380

ggagactttg ttgccaacaa ggtcaaggag ctgctcaaga aggagtaagt cgtttctacg 1440

acgcattgat ggaaggagca aactgacgcg cctgcgggtt ggtctaccgg cagggtccgc 1500

tagtgtataa gactctataa aaagggccca gccctgctaa tgaaatgatg atttataatt 1560

taccggtgta gcaaccttga ctagaagaag cagattgggt gtgtttgtag tggaggacag 1620

tggtacgttt tggaaacagt cttcttgaaa gtgtcttgtc tacagtatat tcactcataa 1680

cctcaatagc caagggtgta gtcggtttat taaaggaagg gagttgtggc tgatgtggat 1740

agatatcttt aaagctggcg actgcaccca acgagtgtgg tggtagcttg ttactgtata 1800

ttcggtaaga tatattttgt ggggttttta gtggtgtttg gtaggttagt gtctggtata 1860

tgagttgtag gcatgacaat ttggaaaggg gtggactttg ggaatattgt gggatttcaa 1920

taccttagtt tgtacagggt aattgttaca aatgatacaa agaactgtat ttcttttcat 1980

ttgttttaat tggttgtata tcaagtccgt tagacgagct cagtgccatg gcttttggca 2040

ctgtatttca tttttagagg tacactacat ccagtgaggt atggtaaggt tgagggcata 2100

atgaaggcac cttgtactga cagtcacaga cctctcaccg agaattttat gagatatact 2160

cgggttcatt ttaggctccg attcgattca aattattact gtcgaaatcg gttgagcatc 2220

cgttgatttc cgaacagatc tcggcagtct ctcggatgta gaattaggtt tccttgaggc 2280

gagatgagac ggtaagttgg aggggtttga gaagagatag agatcggttt gtgtgacatg 2340

aattctt 2347

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

agagaatcgg cgttacctct ctcaca 26

<210> 20

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggcgccaaac tcagtgcttt gtgcgtacca ggg 33

<210> 21

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tggtacgcac aaagcactga gtttggcgcc cgttttttc 39

<210> 22

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ttcagcttga tagagggcat tgctgtagat atgtcttgtg t 41

<210> 23

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

atatctacag caatgccctc tatcaagctg aac 33

<210> 24

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

caacgtgggg acaggttaca cgaagatggg gatctt 36

<210> 25

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cccatcttcg tgtaacctgt ccccacgttg ccggtc 36

<210> 26

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ggacatccta ctgcgtcgga cacgggcatc tcactt 36

<210> 27

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gatgcccgtg tccgacgcag taggatgtcc tgcacg 36

<210> 28

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ggggttagca gtcattgttg atgtgtgttt aattca 36

<210> 29

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

aaacacacat caacaatgac tgctaacccc tctctg 36

<210> 30

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

agagtgataa atagcttact cggggccgtc gatcag 36

<210> 31

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gacggccccg agtaagctat ttatcactct ttacaa 36

<210> 32

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

caacccggtc tcttccacct gtgtcaatct tctc 34

<210> 33

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

agaagattga cacaggtgga agagaccggg ttggcggcgt a 41

<210> 34

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

tttgaatgat tcttatactc agaaggaaat 30

<210> 35

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

atttccttct gagtataaga atcattcaaa atgtatctcg gactggatct t 51

<210> 36

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

aactaattac atgatttatt tctccaggca ggcgtt 36

<210> 37

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

tgcctggaga aataaatcat gtaattagtt atgtca 36

<210> 38

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

gacggaattc gcaaattaaa gccttcgagc 30

<210> 39

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

ctttaatttg cgaattccgt cgtcgcctga g 31

<210> 40

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gagtgttaca aagaattcat gtcacacaaa ccg 33

<210> 41

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

catgaattct ttgtaacact cgctctggag agttagtcat 40

<210> 42

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

ctgcagtcgt aagacccagg tggtgtgt 28

<210> 43

<211> 700

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

tcgatcctaa ggggtggcat aactgtcgcg tacggcccga taagggcctt ctccaaaagg 60

gaagccggtt gaaattccgg cacttggatg tggattctcc acggcaacgt aactgaatgt 120

ggggacggtg gcacaagtct tggaaggagt tatcttttct ttttaacgga gtcaacaccc 180

tggaattagt ttgtctagag atagggtatc gttccggaag aggggggcag ctttgtcccc 240

tccgatgcac ttgtgacgcc ccttgaaaac ccgcaggaag gaatagtttt cacgccaagt 300

cgtactgata accgcagcag gtctccaagg tgaacagcct ctagttgata gaataatgta 360

gataagggaa gtcggcaaaa tagatccgta acttcgggat aaggattggc tctgggggtt 420

ggtggatgga agcgtgggag accccaaggg actggcggct gggcaactgg cagccggacc 480

cgcggcagac actgcgtcgc tccgtccaca tcatcaaccg ccccagaact ggtacggaca 540

aggggaatct gactgtctaa ttaaaacata gctttgcgat ggttgtaaaa caatgttgac 600

gcaaagtgat ttctgcccag tgctctgaat gtcaaagtga agaaattcaa ccaagcgcgg 660

gtaaacggcg ggagtaacta tgactctctt aaggtagcca 700

<210> 44

<211> 502

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

cactggccgg tcgataattt aacgtgctga gctcagcaca cgcattgccc attggctgta 60

tatagatgaa tgtaatgata ccgtaagaga atgagagcac ggtattgtat tacaggggat 120

taagtacaca ttacttggag ttctgtacca gaagacacta ctatacatgg tatcacttac 180

attagagtcg gtgaccgtat tcgtctcgta tagacataat attttcctac cccacattgt 240

tcctgggcct tcggagcaca tctacagtga gtgactgttt cagttgagct tgaggggtta 300

agtaagtggg ggaagggttt gcgattctga aaaagagcat gactaatctc tctgtggagg 360

agcaatgaag tcacgtgatg caatcatacc ggtgtatcgg atctgcctgg gtgtctgatt 420

actaatcatt tactcacctg ttttccccag ctatctcatc catctcagag cctcggccca 480

gccttcggcc cttttgggtt tc 502

<210> 45

<211> 599

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

aatgcctcgt catctaatta gtgacgcgca tgaatggatt aacgagattc ccactgtccc 60

tatctactat ctagcgaaac cacagccaag ggaacgggct tggcagaatc agcggggaaa 120

gaagaccctg ttgagcttga ctctagtttg acattgtgaa gagacatagg gggtgtagaa 180

taagtgggag cttcggcgcc ggtgaaatac cactaccctt atcgtttctt tacttattta 240

gtaagtggaa gtggtttaac aaccattttc tagcattcct ttccaggctg aagacattgt 300

caggtgggga gtttggctgg ggcggcacat ctgttaaaag ataacgcaga tgtcctaagg 360

gggactcaat gagaacagaa atctcatgta gaacaaaagg gtaaaagtcc ccttgatttt 420

gattttcagt gtgaatacaa accatgaaag tgtggcctat cgatccttta gttgttcgga 480

gtttgaacct agaggtgcca gaaaagttac cacagggata actggcttgt ggcagtcaag 540

cgttcatagc gacattgctt tttgatcctt cgatgtcggc tcttcctatc ataccgaag 599

<210> 46

<211> 1907

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

ggtgtgttct gtggagcatt ctcacttttg gtaaacgaca ttgcttcaag tgcagcggaa 60

tcaaaaagta taaagtgggc agcgagtata cctgtacaga ctgtaggcga taactcaatc 120

caattacccc ccacaacatg actggccaaa ctgatctcaa gactttattg aaatcagcaa 180

caccgattct caatgaaggc acatacttct tctgcaacat tcacttgacg cctaaagttg 240

gtgagaaatg gaccgacaag acatattctg ctatccacgg actgttgcct gtgtcggtgg 300

ctacaatacg tgagtcagaa gggctgacgg tggtggttcc caaggaaaag gtcgacgagt 360

atctgtctga ctcgtcattg ccgcctttgg agtacgactc caactatgag tgtgcttgga 420

tcactttgac gatacattct tcgttggagg ctgtgggtct gacagctgcg ttttcggcgc 480

ggttggccga caacaatatc agctgcaacg tcattgctgg ctttcatcat gatcacattt 540

ttgtcggcaa aggcgacgcc cagagagcca ttgacgttct ttctaatttg gaccgatagc 600

cgtatagtcc agtctatcta taagttcaac taactcgtaa ctattaccat aacatatact 660

tcactgcccc agataaggtt ccgataaaaa gttctgcaga ctaaatttat ttcagtctcc 720

tcttcaccac caaaatgccc tcctacgaag ctcgagctaa cgtccacaag tccgcctttg 780

ccgctcgagt gctcaagctc gtggcagcca agaaaaccaa cctgtgtgct tctctggatg 840

ttaccaccac caaggagctc attgagcttg ccgataaggt cggaccttat gtgtgcatga 900

tcaagaccca tatcgacatc attgacgact tcacctacgc cggcactgtg ctccccctca 960

aggaacttgc tcttaagcac ggtttcttcc tgttcgagga cagaaagttc gcagatattg 1020

gcaacactgt caagcaccag tacaagaacg gtgtctaccg aatcgccgag tggtccgata 1080

tcaccaacgc ccacggtgta cccggaaccg gaatcattgc tggcctgcga gctggtgccg 1140

aggaaactgt ctctgaacag aagaaggagg acgtctctga ctacgagaac tcccagtaca 1200

aggagttcct ggtcccctct cccaacgaga agctggccag aggtctgctc atgctggccg 1260

agctgtcttg caagggctct ctggccactg gcgagtactc caagcagacc attgagcttg 1320

cccgatccga ccccgagttt gtggttggct tcattgccca gaaccgacct aagggcgact 1380

ctgaggactg gcttattctg acccccgggg tgggtcttga cgacaaggga gacgctctcg 1440

gacagcagta ccgaactgtt gaggatgtca tgtctaccgg aacggatatc ataattgtcg 1500

gccgaggtct gtacggccag aaccgagatc ctattgagga ggccaagcga taccagaagg 1560

ctggctggga ggcttaccag aagattaact gttagaggtt agactatgga tatgtaattt 1620

aactgtgtat atagagagcg tgcaagtatg gagcgcttgt tcagcttgta tgatggtcag 1680

acgacctgtc tgatcgagta tgtatgatac tgcacaacct gtgtatccgc atgatctgtc 1740

caatggggca tgttgttgtg tttctcgata cggagatgct gggtacaagt agctaatacg 1800

attgaactac ttatacttat atgaggcttg aagaaagctg acttgtgtat gacttattct 1860

caactacatc cccagtcaca ataccaccac tgcactacca ctacacc 1907

<210> 47

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

tcgatcctaa ggggtggcat aactgtcgc 29

<210> 48

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

acgccgccaa cccggtctct tggctacctt aagagagtca t 41

<210> 49

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

atgactctct taaggtagcc aagagaccgg gttggcggcg ta 42

<210> 50

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

gcgaccttca gcttccacat tttgaatgat tcttatactc a 41

<210> 51

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

gagtataaga atcattcaaa atgtggaagc tgaaggtcgc c 41

<210> 52

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

accggcaacg tggggacagg ttagatcttc agctgctggt g 41

<210> 53

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

accagcagct gaagatctaa cctgtcccca cgttgccggt c 41

<210> 54

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

tcaccgaaac gtgtggggct cgaaaaaacg ggcgccaaac tctcggacac gggcatctca 60

cttgc 65

<210> 55

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

tatttttatt ttccatacat acgcaagtga gatgcccgtg tccgagagtt tggcgcccgt 60

tttttc 66

<210> 56

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

agggagaaga acaggaccat tgctgtagat atgtcttgtg t 41

<210> 57

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

cacaagacat atctacagca atggtcctgt tcttctccct g 41

<210> 58

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

taaattatcg accggccagt gttagttgtg agggtgcaga tg 42

<210> 59

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

tctgcaccct cacaactaac actggccggt cgataattta 40

<210> 60

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

tccacacccc acaaaaagac ccgtgcagga catcctactg cgaaacccaa aagggccgaa 60

gg 62

<210> 61

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

tccatctcag agcctcggcc cagccttcgg cccttttggg tttcgcagta ggatgtcctg 60

cac 63

<210> 62

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

gcgtacagag cggaggtcat tgttgatgtg tgtttaattc a 41

<210> 63

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

gaattaaaca cacatcaaca atgacctccg ctctgtacgc t 41

<210> 64

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

tgtaaagagt gataaatagc ttaccagacg tctcgcaggt a 41

<210> 65

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

tacctgcgag acgtctggta agctatttat cactctttac aa 42

<210> 66

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

actggccgtc gttttacaac tccacctgtg tcaatcttct c 41

<210> 67

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

taacttcgta tagcatacat tatacgaagt tatc 34

<210> 68

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

attgacacag gtggagttgt aaaacgacgg ccagtg 36

<210> 69

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

taattagatg acgaggcatt gcacgtgatg aattcgagct c 41

<210> 70

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

ctcgaattca tcacgtgcaa tgcctcgtca tctaattag 39

<210> 71

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

cttcggtatg ataggaagag ccgacatcg 29

<210> 72

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

tgagtataat ccgtctccgt tcccacttga ggggaggact ttggacgggt ttcggtgcaa 60

cctcgtcagg tgaataatca tgattcattt gcgtgatctg gctgggacaa aatacaagtg 120

cttgtatatg gtataccagg aggaccactt atgagaatgc caaagaaaat tgaaggggaa 180

aataaatgct gccacccgat actcgaaata taccattgga cgtgttttcc acataggtaa 240

tcgccactcc atacccgaga tctgaagtga aacattcgtg ttctgtagcc gttagcccac 300

ccccacacac tgagacactc ggctgatgtt tcgaaattca tgctactgta cggtacggac 360

ttaacactta tccccattgt cctgggacta ctacattgta gtatactcta cacatccaac 420

aagcaatact ttttcgtaca agtaggtagt tgtgcgagta ctcgtacaat ggaaaaacat 480

tatacatgaa gcagggcgtg cgtcggtctg tagggtgaaa tagggagccg acagtgcatt 540

tccagcattc tagattgatc tgaatcaata atttgtgggg gaaattggca ctagtgcttt 600

gtttattagc tatttgacag tctgatgatg agaaagtcgt tcttcggctt agcccaaccc 660

cacactcact acgcacctgg cacagggtgg tgcatataat atgcaagtac ggagatgtac 720

taacgctagc caggagagag tgacgaaacg tagccatccg ttgagcgggc agacgtggga 780

gtaatatagt cgtttagggc acgtgattgc gaccccagtg gtatcatctt tgtctcccaa 840

actcttcgta atgcccaccc aggacgatcc tctctgaact ttactacccc acattcccga 900

gactataaag tatagacggc tcctacaaaa gagagcaggt ggaataacac actattgacc 960

gacaatgaca accaacacat tcaccgatcc tcctgtggag 1000

<210> 73

<211> 998

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

aacagtgtac gcagtactat agaggaacaa ttgccccgga gaagacggcc aggccgccta 60

gatgacaaat tcaacaactc acagctgact ttctgccatt gccactaggg gggggccttt 120

ttatatggcc aagccaagct ctccacgtcg gttgggctgc acccaacaat aaatgggtag 180

ggttgcacca acaaagggat gggatggggg gtagaagata cgaggataac ggggctcaat 240

ggcacaaata agaacgaata ctgccattaa gactcgtgat ccagcgactg acaccattgc 300

atcatctaag ggcctcaaaa ctacctcgga actgctgcgc tgatctggac accacagagg 360

ttccgagcac tttaggttgc accaaatgtc ccaccaggtg caggcagaaa acgctggaac 420

agcgtgtaca gtttgtctta gcaaaaagtg aaggcgctga ggtcgagcag ggtggtgtga 480

cttgttatag cctttagagc tgcgaaagcg cgtatggatt tggctcatca ggccagattg 540

agggtctgtg gacacatgtc atgttagtgt acttcaatcg ccccctggat atagccccga 600

caataggccg tggcctcatt tttttgcctt ccgcacattt ccattgctcg gtacccacac 660

cttgcttctc ctgcacttgc caaccttaat actggtttac attgaccaac atcttacaag 720

cggggggctt gtctagggta tatataaaca gtggctctcc caatcggttg ccagtctctt 780

ttttcctttc tttccccaca gattcgaaat ctaaactaca catcacacaa tgcctgttac 840

tgacgtcctt aagcgaaagt ccggtgtcat cgtcggcgac gatgtccgag ccgtgagtat 900

ccacgacaag atcagtgtcg agacgacgcg ttttgtgtaa tgacacaatc cgaaagtcgc 960

tagcaacaca cactctctac acaaactaac ccagctct 998

<210> 74

<211> 999

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

tgttagtaat tatgagatac attctttgca atgatgaggg ctcttgtaga gtattctgct 60

gtaaaggaga tcttgaattt tgttgttgaa tttgtgtaat tgtcttatga ttattgtctt 120

gtgtagcgct tttcaagcct gcaggaaaag tgaaatgaac atgttattgc catatcatcc 180

gttattggtg tttagttcct attgggcttg attaccaacg atccgggtcg aaagacccct 240

ccgtttaggg gtggtaagtc tcaagtggct gaacacgtgc atgcactgta catcgccgag 300

accactcaac accatcaagg gctactgtat tcgtagagca tacggcgttc aaggcttcac 360

cgataattag agctcagcgc aatcaattat ttgaaggctt aatggcactg tcagctgctt 420

gatcttgcac gcaattacta caatatatag tccaacataa taacataatt agaattatga 480

tcatccgtat caatcataca caaaatcctt acacctaatc tcgtagctcc tccacaaatc 540

ccacaacgcg tcctgcctcc acaattctaa gctcctcatc tgcagactcg tgcagaccaa 600

gccaggtagc gtcctgaaca ggcagttcat ttgtccaggt ctggaaatca gccacacgcg 660

agccagtagt cagcttgcat ggaccgagag cacgcgactc gttgtcaaaa taatccacct 720

gcatcacctg ttggaccatc tcttgtaatc gagccaggtc agcagcgatg tcaatcttgg 780

cgctgtaaat gtcagacagc accgagacta cagcatgcca aggaatggaa tggggagcaa 840

tattgtctct ctgaccactc acatgacgaa cccatccttc aatagctcgc aaactggcag 900

ccaggtctcc ctcatggaag ccataatcct tggcaaagcc cagaggcaca aaacgagcca 960

ggtcaacaat gcagacatgc agccaactgg ccaggaagt 999

<210> 75

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

tgagtataat ccgtctccgt tcccact 27

<210> 76

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

tactgcgtac actgttatcg gtgaatgtgt tggttgtcat tgt 43

<210> 77

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

aaccaacaca ttcaccgata acagtgtacg cagtactata gaggaa 46

<210> 78

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 78

aatgacgata ggcatagagc tgggttagtt tgtgtagaga gt 42

<210> 79

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 79

actctctaca caaactaacc cagctctatg cctatcgtca ttgagaag 48

<210> 80

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 80

aacgtgggga caggctatga ccgtatgcaa atattcgaac c 41

<210> 81

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 81

ttcgaatatt tgcatacggt catagcctgt ccccacgttg ccggtc 46

<210> 82

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 82

ttccatctcc aagcactcgg acacgggcat ctcacttgcg tat 43

<210> 83

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 83

tgagatgccc gtgtccgagt gcttggagat ggaagccggt agaac 45

<210> 84

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 84

caagagcagt tcgatgagtt ttcccattgt tgatgtgtgt ttaattcaag 50

<210> 85

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 85

ttgaattaaa cacacatcaa caatgggaaa actcatcgaa ctgct 45

<210> 86

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 86

gtaagcgtga cataactaat tacatgatct aatctctcag aggaaacatc t 51

<210> 87

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 87

aagatgtttc ctctgagaga ttagatcatg taattagtta tgtcacg 47

<210> 88

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 88

tctccaataa ttataattag ttgccggtca gctgggttct tct 43

<210> 89

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 89

caaattaaag ccttaacaca ttctatgcct atcggtta 38

<210> 90

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 90

aatttcgcct tggacattgt tgatgtgtgt ttaattcaag 40

<210> 91

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 91

ttcttgaatt aaacacacat caacaatgtc caaggcgaaa ttcgaaag 48

<210> 92

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 92

acataactaa ttacatgatc tacttctgtc gcttgtaaat ct 42

<210> 93

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 93

caagatttac aagcgacagt aattaagatc atgtaattag ttatgtcacg ctta 54

<210> 94

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 94

gttttacaac gcaaattaaa gccttcgagc gtcccaa 37

<210> 95

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 95

ctcgaattca tcacgtgctg ttagtaatta tgagatacat tcttt 45

<210> 96

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 96

attgttgacc tggctcgttt tgtgcctctg 30

<210> 97

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 97

gttttacaac gcaaattaaa gccttcgagc gtcccaa 37

<210> 98

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 98

aatgtatctc ataattacta acagcacgtg atgaattcga gctcggtacc 50

Claims

1.一种利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法；其特征是包括如下步骤：

(1)将优化的木糖代谢基因木糖还原酶基因XYL1表达盒和木糖醇脱氢酶基因XYL2表达盒，以及内源的木酮糖激酶基因XKS表达盒，同时导入解脂耶氏酵母，得到重组菌1；

木糖还原酶基因XYL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

木糖醇脱氢酶基因XYL2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

木酮糖激酶基因XKS的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述优化的达玛烯二醇合酶编码基因DS的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述优化的原人参二醇合酶编码基因PPDS的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述优化的细胞色素-NADPH-还原酶1编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述编码截短5'端1500个核苷酸的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述法呢基焦磷酸合酶基因ERG20的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

所述鲨烯合酶基因ERG9的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

2.利用权利要求1的方法构建的利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏菌。

3.利用权利要求2构建的重组解脂耶氏菌发酵生产原人参二醇的应用。