CN110878261A - 合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母的构建方法及其菌株 - Google Patents

合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母的构建方法及其菌株 Download PDF

Info

Publication number
CN110878261A
CN110878261A CN201911111632.4A CN201911111632A CN110878261A CN 110878261 A CN110878261 A CN 110878261A CN 201911111632 A CN201911111632 A CN 201911111632A CN 110878261 A CN110878261 A CN 110878261A
Authority
CN
China
Prior art keywords
xylitol
gene
yarrowia lipolytica
strain
glucose
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201911111632.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110878261B (zh
Inventor
程海荣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Jiaotong University
Original Assignee
Shanghai Jiaotong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Jiaotong University filed Critical Shanghai Jiaotong University
Priority to CN201911111632.4A priority Critical patent/CN110878261B/zh
Publication of CN110878261A publication Critical patent/CN110878261A/zh
Priority to PCT/CN2020/089747 priority patent/WO2021093289A1/zh
Priority to US17/737,012 priority patent/US20220259622A1/en
Application granted granted Critical
Publication of CN110878261B publication Critical patent/CN110878261B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01307—D-Xylose reductase (1.1.1.307)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1022—Transferases (2.) transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01009—D-Xylulose reductase (1.1.1.9), i.e. xylitol dehydrogenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01255—Mannitol dehydrogenase (1.1.1.255)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y106/00—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12Y106/01—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.6.1)
    • C12Y106/01002—NAD(P)+ Transhydrogenase (AB-specific) (1.6.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y202/00—Transferases transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
    • C12Y202/01—Transketolases and transaldolases (2.2.1)
    • C12Y202/01001—Transketolase (2.2.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/102—Plasmid DNA for yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Abstract

本发明公开了一种合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母的构建方法及其菌株；采用解脂耶氏酵母为合成底盘，通过代谢工程改良手段，对该酵母进行基因剪接，引入由葡萄糖、果糖、甘油、淀粉为碳源合成木糖醇的基因，阻断合成副产物的代谢途径，从而使得重组的解脂耶氏酵母能由葡萄糖、果糖、甘油、淀粉为碳源，发酵合成木糖醇，得到由葡萄糖等碳源合成木糖醇的工程菌株。发酵后，通过菌液分离，澄清的发酵液进行离子交换、脱色、浓缩、结晶等工艺得到木糖醇结晶。本发明描述的由葡萄糖等碳源合成木糖醇的工程酵母菌的构建方法以及采用该方法获得的由葡萄糖等碳源合成木糖醇的解脂耶氏酵母菌株，能够简化现有的化学合成木糖醇的方法，具有较好的应用价值。

Description

合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母的构建方法及其菌株
技术领域
本发明属于食品生物技术领域，涉及一种合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母的构建方法及其菌株；更具体涉及以解脂耶氏酵母菌为底盘微生物，通过代谢工程、基因工程以及合成生物学的手段来构建发酵合成木糖醇的方法，利用该方法获得能以葡萄糖等碳源发酵合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母菌，以及利用该重组菌株来发酵合成木糖醇的方法。
背景技术
木糖醇(xylitol)是一种五元醇，CAS号87-99-0，分子量152.15道尔顿，是一种常见的食品添加剂，常应用于口香糖、乳制品、糖果等食品的调配中，减少蔗糖的使用量，具有良好的预防口腔疾病，降低肥胖以及预防糖尿病发生的功效。除了在食品中得到较广泛的应用外，在医药以及化工领域均得到较广泛的应用。由于木糖醇的应用广泛，因此市场需求也很大，据不完全统计，2018年预测国际市场需求在8万吨以上。
目前工业生产木糖醇仍然采用生物质水解结合化学加氢的合成方法，需要酸水解生物质、碱中和、木糖结晶再溶解、化学制氢与加氢等繁琐的步骤(如中国发明专利：CN200910018483.7，一种木糖醇制备工艺；美国发明专利：US4066711，Method forrecovering xylitol；US3586537，Process for the production of xylose)，存在步骤多、污染大、能耗大、危险系数大的缺点。虽然近年来有利用木糖或者直接以生物质水解液为原料生物发酵合成木糖醇的方法报道(如美国专利：US20040191881，Fermentationprocess for production of xylitol from Pichia sp；US20110003356，Process forproduction of xylitol；US20130217070，Production of xylitol from a mixture ofhemicellulosic sugars；Chin et al.,Analysis of NADPH supply during xylitolproduction by engineered Escherichia coli,Biotechnol.Bioeng.,2009,102,209-220)，但是由于木糖或者生物质水解液的制备仍然需要酸水解、碱中和以及木糖提取的过程，而且水解液中除了含有木糖外，还含有阿拉伯糖等杂质，生物发酵转化后除了含有目标产物木糖醇外，还含有较多的L-阿拉伯糖醇，增加了产品的分离的难度，降低木糖醇的收率，而且生物质酸水解液含有抑制物如糠醛等抑制微生物的生长与发酵。因此，直接以木糖或生物质水解液为出发原料发酵合成木糖醇这一路线难以得到实际应用。因而，寻求其它廉价易得的碳源合成木糖醇具有重要的实际应用价值。
葡萄糖是常见、易获取而且价廉的碳源，是发酵产品最常用的碳源之一。因此，若能以葡萄糖为出发原料，通过改良微生物来直接发酵葡萄糖生成木糖醇则具有重要的应用价值。第一条由葡萄糖合成木糖醇的途径是，葡萄糖经过磷酸戊糖途径合成中间体5-磷酸木酮糖(5-p xylulose)，然后去磷酸化成为木酮糖(D-xylulose)，或者还原成为磷酸木糖醇(1-p xylitol)，再去磷酸化转化为木糖醇(xylitol)。如芬兰学者Mervi H.Toivari等报道了通过在改良酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中过表达木糖醇脱氢酶(XYL2)以及2-脱氧-葡萄糖-6-磷酸磷酸酶(DOG1)基因，获得能由葡萄糖发酵合成木糖醇的重组菌，以20g/L葡萄糖为原料，获得最高290mg/L的木糖醇，同时还含有440mg/L的核糖醇以及戊糖如D-核糖(Toivari et al.,Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae forconversion of D-glucose to xylitol and other five-carbon sugars and sugaralcohols,Appl.Environ.Microbiol.,2007,73,5471-5476)。同样来自芬兰的学者Povelainen与Miasnikov报道了通过在枯草芽孢杆菌中过表达磷酸木糖醇脱氢酶(xylitol-phosphate dehydrogenase,XPDH)基因，获得能直接发酵葡萄糖合成木糖醇的重组枯草芽孢杆菌，在含100g/L葡萄糖的发酵培养基中经过300小时的发酵，得到23±1.8g/L的木糖醇，同时还产生核糖醇、D-木酮糖以及D-核酮糖副产物(Povelainen andMiasnikov,Production of xylitol by metabolically engineered strains ofBacillus subtilis,J.Biotechnol.,2007,128,24-31)。该方法发酵过程时间长，得率低，以及需要添加抗生素，限制了该方法的实际应用。
另一条由葡萄糖合成木糖醇的途径是，葡萄糖先发酵转变为D-阿拉伯糖醇，在D-阿拉伯糖醇-4-脱氢酶催化下转变为D-木酮糖，再在木糖醇脱氢酶催化下还原为木糖醇。本申请发明人程海荣等于2014年报道了以巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株为底盘微生物，将阿拉伯糖醇脱氢酶基因以及木糖醇脱氢酶基因在该酵母中异源表达，获得了能够直接发酵葡萄糖生成木糖醇的重组菌株，发酵220g/L葡萄糖生成15.2g/L木糖醇，得率7.8％(Cheng et al.,Genetically engineered Pichia pastoris yeast for conversion ofglucose to xylitol by a single-fermentation process,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2014,98,3539-3552)。得率低的原因可能是Pichiapastoris酵母本身由葡萄糖合成D-阿拉伯糖醇的能力很低。若换用合成D-阿拉伯糖醇能力高的其它耐高渗酵母很可能获得高产木糖醇的重组菌株。如美国发明专利US20170130209-A1报道了以耐高渗Pichia ohmeri酵母发酵葡萄糖合成大量的D-阿拉伯糖醇，在该酵母中同样过表达D-阿拉伯糖醇脱氢酶与木糖醇脱氢酶基因，获得能直接由葡萄糖发酵合成木糖醇的重组Pichia ohmeri菌株，其中编号为CNCM I-4981的工程菌株能在66小时内发酵250g/L一水葡萄糖生成120g/L木糖醇，得率达到48％，为目前已知文献报道的最高产量与得率。
虽然上述专利(US20170130209-A1)描述的重组Pichia ohmeri酵母菌株能由葡萄糖发酵合成较多的木糖醇，具有工业化实际使用的价值，但是葡萄糖是经过氧化磷酸戊糖途径先合成得到5-磷酸-核酮糖，然后去磷酸化成为核酮糖，再还原成D-阿拉伯糖醇，然后再在阿拉伯糖醇脱氢酶催化下氧化成D-木酮糖，再在木糖醇脱氢酶催化下生成木糖醇。整个过程需要经过D-阿拉伯糖醇的中间体，增加了合成步骤，消耗了微生物细胞的资源。若能由葡萄糖经过氧化磷酸戊糖途径直接生成D-木酮糖，再还原为木糖醇，中间不经过D-阿拉伯糖醇途径，则可能进一步增加由葡萄糖合成木糖醇的效率。另外，选择磷酸戊糖途径流量高的菌株对提高合成木糖醇的中间产物D-木酮糖的量也非常重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的由葡萄糖直接发酵合成木糖醇的菌株的不足之处，提供一种合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母的构建方法及其菌株；具体是设计能直接由葡萄糖等碳源发酵合成木糖醇的工程菌株的方法，并采用该方法构建一株高效发酵合成木糖醇的解脂耶氏酵母工程菌株，以及采用该菌株直接发酵合成与纯化木糖醇的方法。
本发明通过代谢工程、基因工程以及合成生物学的手段，将解脂耶氏酵母进行改良，使得该酵母能够利用葡萄糖等碳源合成木糖醇；更具体来说，是以解脂耶氏酵母为合成底盘，该酵母英文名为Yarrowia lipolytica，之前也称Candida lipolytica，根据翻译不同，中文名可以为：解脂耶氏酵母、解脂亚罗威酵母、解脂耶罗维亚酵母，本发明中使用的解脂酵母的中文名称可以为解脂耶氏酵母、解脂亚罗威酵母或解脂耶罗维亚酵母。通过代谢工程改良手段，对该酵母进行基因剪接，引入由葡萄糖、果糖、甘油、淀粉为碳源合成木糖醇的相关基因，阻断合成副产物的代谢途径，从而使得重组的解脂耶氏酵母能由葡萄糖、果糖、甘油、淀粉为碳源，发酵合成木糖醇，得到由葡萄糖等碳源发酵合成木糖醇的工程菌株；并从构建的菌株中优选获得一株合成木糖醇能力最高的菌株解脂耶罗维亚酵母(Yarrowialipolytica)ery959ΔTKLΔMDHΔArDHΔRPIΔXKS1 CGMCC No.18479，还提供采用该菌株由葡萄糖发酵合成与纯化木糖醇的方法。
本发明具体是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明涉及一种构建能合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株的方法，是以解脂耶氏酵母菌株(Yarrowia lipolytica，以前称为Candida lipolytica)为底盘微生物，通过代谢工程、基因工程以及合成生物学的手段，构建以葡萄糖、果糖、甘油、淀粉中的一种或几种为碳源发酵合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株的方法。
本发明中使用解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，可以是实验室常用的解脂耶氏酵母菌株，这些菌株合成多元醇如甘露醇或赤藓糖醇的效率较低，如Yarrowialipolytica CLIB122(Dujon et al.,Genome evolution in yeasts.Nature,2004,430(6995),35-44.)、Yarrowia lipolytica CLIB89/W29(Magnan et al.,Sequence Assemblyof Yarrowia lipolytica Strain W29/CLIB89 Shows Transposable ElementDiversity,PLoS One,2016,11(9),e0162363)、Yarrowia lipolytica CLIB80等，这些菌株均可以从相关菌种保存机构获取。经过试验，CLIB122、CLIB89与CLIB80菌株在含250g/L的葡萄糖培养基中于30度振荡培养(培养基成分：无水葡萄糖250g/L，酵母粉8g/L，柠檬酸铵5g/L，蛋白胨3g/L，氯化铜0.05g/L，起始pH5.5)，经过150小时发酵，检测赤藓糖醇的含量低于15g/L，甘露醇含量低于20g/L，同时还含有160-180g/L的葡萄糖残留，说明这些菌不但合成多元醇效率低，其葡萄糖利用也较慢。
作为本发明的一个实施方案，发明使用的底盘微生物解脂耶氏酵母，可以是基因组中含有与SEQ ID NO 3序列具有97％及以上同源性或相似性的DNA序列的其它解脂耶氏酵母菌株，如CGMCC 7326(Huiling Cheng et al.Identification,characterization oftwo NADPH-dependent erythrose reductases in the yeast Yarrowia lipolytica andimprovement of erythritol productivity using metabolic engineering.MicrobialCell Factories,2018,17:133.)等。
作为本发明的一个具体实施案例，本发明使用的底盘微生物解脂耶氏酵母，还可以是合成赤藓糖醇效率较高的解脂耶罗维亚酵母(也称解脂耶氏酵母)菌株(Yarrowialipolytica)ery929 CGMCC No.18478，经过分子鉴定，确定为解脂耶氏酵母，其26S rDNA序列(SEQ ID NO 3序列)与已知数据库中的解脂耶氏酵母的26S rDNA(如NCBI数据库中Yarrowia lipolytica的26S rDNA序列)具有98％及以上的同源性。
方案一、本发明的构建能发酵合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株的方法，包括在底盘微生物解脂耶氏酵母细胞中表达以下基因的一种或一种以上(使其获得相应的功能)：
(1)编码木糖醇脱氢酶(xylitol dehydrogenase，又称木酮糖还原酶Xylulosereductase)的基因；(获得由木酮糖还原为木糖醇的功能)
(2)编码5-磷酸木糖醇脱氢酶(5-P xylitol dehydrogenase，又称5-磷酸木酮糖还原酶，5-P xylulose reductase)的基因；(获得由5-磷酸木酮糖还原为5-磷酸木糖醇的功能)
(3)编码5-磷酸木酮糖磷酸酶(5-P xylulose phosphatase)的基因；(获得将5-磷酸木酮糖去磷酸化变为木酮糖的功能)
(4)编码木糖醇转运蛋白(xylitol transporter)的基因；(获得将木糖醇转运出细胞的功能)
(5)编码NADP转氢酶(NADP transhydrogenase)的基因。(获得将NADH与NADPH互为转换的功能)
方案二、本发明的构建能合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株的方法，包括在底盘微生物解脂耶氏酵母细胞中敲除破坏或下调表达其自身的以下基因中的一种或一种以上(使得解脂耶氏酵母失去相应的功能或相应功能的减弱)：
(1)甘露醇脱氢酶(mannitol dehydrogenase，MDH)基因；(敲除破坏甘露醇脱氢酶基因，使得重组菌株失去合成甘露醇的能力，从而提高木糖醇的合成效率)
(2)阿拉伯糖醇脱氢酶(arabitol dehydrogenase，ArDH)基因；(敲除破坏阿拉伯糖醇脱氢酶基因，使得重组菌株失去合成阿拉伯糖醇的能力，从而提高木糖醇的合成效率)
(3)转酮酶(transketolase，TKL)基因；(敲除破坏或下调表达转酮酶基因，使得重组菌株失去或显著降低合成赤藓糖醇的能力，从而提高木糖醇的合成效率)
(4)木酮糖激酶(xylulose kinase，XKS)基因；(敲除破坏木酮糖激酶基因，使得重组菌株失去利用木酮糖的能力，从而提高木糖醇的合成效率)
(5)5-磷酸核酮糖异构酶(5-P ribulose isomerase，RPI)基因。(敲除破坏5-磷酸核酮糖异构酶基因，使得重组菌株失去合成5-磷酸核糖的能力，提高5-磷酸木酮糖的含量，从而提高木糖醇的合成效率)
方案三、本发明的构建能合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株的方法，包括在底盘微生物解脂耶氏酵母细胞中表达以下基因的一种或一种以上：
(1)编码木糖醇脱氢酶(xylitol dehydrogenase，又称木酮糖还原酶Xylulosereductase)的基因；
(2)编码5-磷酸木糖醇脱氢酶(5-P xylitol dehydrogenase，又称5-磷酸木酮糖还原酶，5-P xylulose reductase)的基因；
(3)编码5-磷酸木酮糖磷酸酶(5-P xylulose phosphatase)的基因；
(4)编码木糖醇转运蛋白(xylitol transporter)的基因；
(5)编码NADP转氢酶(NADP transhydrogenase)的基因；
同时，敲除破坏或下调表达其自身的以下基因中的一种或一种以上：
(6)甘露醇脱氢酶(mannitol dehydrogenase，MDH)基因；
(7)阿拉伯糖醇脱氢酶(arabitol dehydrogenase，ArDH)基因；
(8)转酮酶(transketolase，TKL)基因；
(9)木酮糖激酶(xylulose kinase，XKS)基因；
(10)5-磷酸核酮糖异构酶(5-P ribulose isomerase，RPI)基因。
具体而言，以代谢工程、基因工程以及合成生物学的手段，将解脂耶氏酵母进行改良，使得重组解脂耶氏酵母能够利用葡萄糖高效地合成木糖醇，是通过以下方法实现的：
(1)使用解脂耶氏酵母作为底盘，包括以上所述的Yarrowia lipolyticaCLIB122、Yarrowia lipolytica CLIB89/W29、Yarrowia lipolytica CLIB80、Yarrowialipolytica ery929CGMCC No.18478，CGMCC No.7326等在内的任何解脂耶氏酵母或解脂假丝酵母菌株都属于本发明使用的底盘范围。本发明使用的底盘解脂耶氏酵母菌株，特征之一是其基因组中含有与SEQ ID NO 3序列具有97％及以上同源性或相似性的DNA序列。
(2)按照解脂耶氏酵母密码子偏好性优化合成木糖醇脱氢酶基因(xylitoldehydrogenase gene，又称木酮糖还原酶基因，xylulose reductase gene)，并在解脂耶氏酵母细胞中表达。
木糖醇脱氢酶基因来自但不限于以下微生物：树干毕赤酵母(Scheffersomycesstipitis，也称为Pichia stiptis，SEQ ID NO 4)、汉斯德巴氏酵母菌(DebaryomycesHansenii，SEQ ID NO 5)、农杆菌(Agrobacterium sp.，SEQ ID NO 6)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans，SEQ ID NO 7；SEQ ID NO 8)、麦芽糖假丝酵母(Candidamaltosa，SEQ ID NO9)、里氏木霉(Trichoderma reesei，SEQ ID NO10)、粗糙链孢菌(Neurospora crassa，SEQ ID NO 11)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，SEQ ID NO12)或解脂耶氏酵母本身的木糖醇脱氢酶基因(SEQ ID NO 13)。优选地，使用树干毕赤酵母、汉斯德巴氏酵母菌、氧化葡糖杆菌、麦芽糖假丝酵母与解脂耶氏酵母的木糖醇脱氢酶基因。更有选地，使用氧化葡糖杆菌与麦芽糖假丝酵母的木糖醇脱氢酶基因。
(3)在解脂耶氏酵母细胞中表达木糖醇脱氢酶基因的同时，还可以表达5-磷酸木糖醇脱氢酶(5-P Xylitol dehydrogenase，又称5-磷酸木酮糖还原酶5-P Xylulosereductase)基因。
这些基因按照解脂耶氏酵母的密码子偏好性进行优化合成，表达的酶能将磷酸戊糖途径中间产物5-磷酸木酮糖还原为5-磷酸木糖醇。该基因来自但不限于以下微生物：艰难梭菌(Clostridioides difficile，SEQ ID NO 14；SEQ ID NO 15；SEQ ID NO 16)，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus，SEQ ID NO 17)，副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei，SEQ ID NO 18)，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei，SEQ ID NO 19)，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum，SEQ ID NO 20)。优选地，使用艰难梭菌、鼠李糖乳杆菌以及植物乳杆菌的5-磷酸木糖醇脱氢酶基因。更有选地，使用艰难梭菌、鼠李糖乳杆菌的5-磷酸木糖醇脱氢酶基因。
(4)在解脂耶氏酵母细胞中还可以表达编码产物具有5-磷酸木酮糖磷酸酶活性的基因(5-P Xylulose phosphatase gene)。
5-磷酸木酮糖磷酸酶能够将5-磷酸木酮糖去磷酸化，成为木酮糖，在木糖醇脱氢酶或者木酮糖还原酶催化下转变为木糖醇。因此，在解脂耶氏酵母中增强5-磷酸木酮糖磷酸酶的活性能提高细胞内木酮糖的水平，进而提高木糖醇的转化水平。这些基因按照解脂耶氏酵母的密码子偏好性进行优化合成。该基因来自但不限于以下微生物：马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus，SEQ ID NO 21)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，SEQ ID NO 22；SEQ ID NO23)，Komagataella phaffii酵母(SEQ ID NO 24)，昆氏乳杆菌(Lactobacillus kunkeei，SEQ ID NO 25)，副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei，SEQID NO26)，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum，SEQ ID NO 27)，发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum，SEQ ID NO 28)，黑曲霉(Aspergillus niger，SEQ ID NO29)，Aspergillus japonicus曲霉菌(SEQ ID NO 30)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，SEQ ID NO 31)。优选的，使用马克斯克鲁维酵母，酿酒酵母，Komagataella phaffii酵母、植物乳杆菌与枯草芽孢杆菌的5-磷酸木酮糖磷酸酶基因。更优选地使用来自马克斯克鲁维酵母与枯草芽孢杆菌的5-磷酸木酮糖磷酸酶基因。最优选地使用枯草芽孢杆菌的5-磷酸木酮糖磷酸酶基因。
(5)在解脂耶氏酵母细胞中还可以表达木糖醇转运蛋白基因(Xylitoltransporter gene)。
细胞内合成木糖醇后需要快速将木糖醇转运到胞外，以减少胞内木糖醇的积累对酶的反馈抑制。因此本发明通过在解脂耶氏酵母细胞中表达木糖醇转运蛋白基因，编码产物木糖醇转运蛋白能将木糖醇转运到胞外，减低反馈抑制，进一步提高细胞内酶合成木糖醇的效率。这些基因按照解脂耶氏酵母的密码子偏好性进行优化合成。基因来自但不限于以下微生物：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，SEQ ID NO 32)，马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus，SEQ ID NO 33)，德布尔有孢酵母(Torulasporadelbrueckii，SEQ ID NO 34)，光滑假丝酵母(Candida glabrata strain DSY562,SEQ IDNO 35)，拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces parabailii，SEQ ID NO 36)，鲁西接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii，SEQ ID NO 37)，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis，SEQ ID NO 38)，还可以来自解脂耶氏酵母本身的木糖醇转运蛋白基因(SEQ ID NO 39；SEQID NO 40)。优选地，使用酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母、、鲁西接合酵母或解脂耶氏酵母本身的木糖醇转运蛋白基因。更优选地，使用酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母与解脂耶氏酵母本身的木糖醇转运蛋白基因。最优选地，使用解脂耶氏酵母本身的木糖醇转运蛋白基因。
(6)在解脂耶氏酵母细胞中还可以表达NADP转氢酶基因。
由于工程化改造的解脂耶氏酵母缺失或降低了合成赤藓糖醇或甘露醇的能力，而这两种合成途径都是以NADPH为辅因子合成赤藓糖醇与甘露醇的。因此，葡萄糖经过磷酸戊糖途径转变为木酮糖后，细胞内NADPH的水平可能上升，而合成木糖醇是以NADH为辅因子的，为了达到NADPH与NADH的平衡，在解脂耶氏酵母中引入NADPH转氢酶，当NADPH过量时转变为NADH，为木糖醇的合成提供足够的辅因子。NADPH转氢酶基因按照解脂耶氏酵母密码子优化合成，来自但不限于以下微生物：棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii，SEQ ID NO41)，非致病性大肠杆菌K12菌株(Escherichia coli str.K-12，SEQ ID NO 42)，米曲霉菌(Aspergillus oryzae，SEQ ID NO 43)，氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans，SEQ IDNO 44)，短双歧杆菌的转氢酶基因(Bifidobacterium breve，SEQ ID NO 45)。优选地，使用米曲霉与双歧杆菌的转氢酶基因。最优选使用米曲霉的转氢酶基因。
上述与木糖醇合成相关的基因是通过以下方式在解脂耶氏酵母中过表达的，这些方式仅是作为示例来说明目的基因是如何整合在解脂耶氏酵母细胞中，而不是对本发明的限定。
(1)基因的优化合成与克隆。
按照解脂耶氏酵母密码子的偏好性优化合成上述需要增强表达的基因，并克隆到整合表达质粒载体中。整合表达载体含有同源整合臂序列(包括左右两段)、启动子序列、终止子序列、自主复制序列、筛选标记序列等必要的DNA元件。启动子与终止子序列之间含有多克隆酶切位点，能将上述合成的基因连接在启动子与终止子之间。本发明中同源整合臂序列是一段来自解脂耶氏酵母基因组中的DNA序列，能够将左右同源臂之间的DNA序列通过同源双交换重组的方法插入到基因组中的同源DNA序列之间。启动子是一段能够诱发启动其下游基因转录的DNA序列，该序列可以是人工合成的启动子序列如UAS1B8、UAS1B16、hp4d等启动子序列(Blazeck et al.2013.Generalizing a hybrid synthetic promoterapproach in Yarrowia lipolytica.Appl Microbiol Biotechnol,97:3037-3052.)，也可以是来自解脂耶氏酵母本身基因的启动子序列如赤藓糖还原酶基因启动子序列、3-磷酸甘油脱氢酶基因的启动子序列等。终止子是一段能够终止其上游基因继续转录的DNA序列。本发明中自主复制序列是指能够在原核细菌如大肠杆菌或者在真核真菌如解脂耶氏酵母细胞中复制的DNA序列，含有该序列能使得整合表达质粒载体即能在原核细菌如大肠杆菌又能在真核真菌如解脂耶氏酵母细胞中自主复制扩增。筛选标记序列是指抗生素抗性基因如氨苄青霉素抗性基因等，或者营养选择型基因如蔗糖酶基因(Suc2，编码产物使得解脂耶氏酵母能利用蔗糖)、木糖醇脱氢酶基因(XDH，编码产物使得解脂耶氏酵母能利用木糖醇)、尿嘧啶核苷酸合成酶基因3(URA3，编码产物使得ura3缺陷型的解脂耶氏酵母能在不含尿嘧啶的基本培养基上生长)等。典型的整合表达质粒载体的示意图如图2所示：质粒含有左右同源整合臂序列、启动子序列、目的基因序列、终止子序列、解脂耶氏酵母筛选标记序列、解脂耶氏酵母自主复制序列(如ARS18等)、细菌起始复制点序列(如ori序列)以及细菌筛选标记序列等必要的DNA元件。上述必要的DNA元件，除了本发明采用的上述目的基因序列(如木糖醇脱氢酶基因、5-磷酸木酮糖磷酸酶基因等)外，其余均能在公共数据库中获取(如数据库：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
(2)含目的基因整合表达载体的转化。
用限制性内切酶(如NotI、EcoRI等)线性化含目的基因的整合表达载体，转化解脂耶氏酵母(转化方法参考本发明人程海荣发表的论文：Journal of Functional Foods,2017,32：208～217)，在含筛选标记的培养基中筛选。若整合表达载体上含有蔗糖酶筛选标记，转化后则将酵母涂布在含蔗糖的YNB基本培养基上筛选(酵母氮碱6克/升，硫酸铵5克/升，蔗糖10克/升，琼脂粉15克/升，pH6.0)。若整合表达载体上含有潮霉素抗性基因筛选标记，转化后则将酵母涂布在含潮霉素的YPD培养基上筛选(葡萄糖10克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，琼脂15克/升，潮霉素300微克/毫升，pH6.0)。提取转化子的基因组，用目的基因上的一对引物扩增，若能扩出相应大小的条带并且测序正确，说明目的基因已经整合到解脂耶氏酵母基因组中。接着采用Cre/loxP系统回收转化子中的筛选标记(原理参考文献：J.Microbiol.Methods,2003,55,727–737)，具体回收筛选方法详见实施例。第一种目的基因整合到基因组中，筛选标记回收后获得的工程菌株即可以作为宿主，继续转化第二种目的基因。验证第二种目的基因的整合、筛选标记的回收后获得的新的工程菌株又可以作为宿主用于转化其它的目的基因，依次操作，直到将全部目的基因整合到基因组中，并去除筛选标记基因。最终获得含有上述与木糖醇合成相关基因的解脂耶罗维亚酵母(也称：解脂耶氏酵母，Yarrowia lipolytica)ery959，含(1)木糖醇脱氢酶基因；(2)5-磷酸木糖醇脱氢酶基因；(3)5-磷酸木酮糖磷酸酶基因；(4)木糖醇转运蛋白基因；(5)NADP转氢酶基因。
进一步的，以代谢工程、基因工程以及合成生物学的手段，将解脂耶氏酵母进行进一步改良，使得重组解脂耶氏酵母能够利用葡萄糖高效地合成木糖醇，除了在解脂耶氏酵母中表达上述与木糖醇合成相关的基因外，还敲除或弱表达以下基因，阻断或减少旁路副产物合成，使得合成木糖醇的效果更显著。
(1)甘露醇脱氢酶基因(mannitol dehydrogenase gene，YlMDH)的敲除。
通过蛋白质序列对比，发明人在解脂耶氏酵母基因组中挖掘了两种甘露醇脱氢酶基因，分别是YlMDH1(SEQ ID NO 70)与YlMDH2(SEQ ID NO 71)。经过原核蛋白表达活性测定，这两种甘露醇脱氢酶均能以果糖为底物合成甘露醇，而甘露醇与木糖醇竞争底物葡萄糖，因此敲除甘露醇脱氢酶基因理论上能提高木糖醇的合成得率。
(2)阿拉伯糖醇脱氢酶基因(Arabitol dehydrogenase gene,YlArDH)的敲除。
通过蛋白质序列对比，发明人在解脂耶氏酵母基因组中挖掘了两种阿拉伯糖醇脱氢酶基因，分别是YlArDH1(SEQ ID NO 72)与YlArDH2(SEQ ID NO 73)。经过原核蛋白表达活性测定，这两种脱氢酶均能以木酮糖为底物合成阿拉伯糖醇。而阿拉伯糖醇与木糖醇合成的起始原料均为葡萄糖，因此敲除阿拉伯糖醇脱氢酶基因理论上能提高木糖醇的合成得率。
(3)转酮酶基因(transketolase gene，YlTKL)的敲除或弱表达(基因功能的下调)。
通过基因组功能挖掘，发明人发现解脂耶氏酵母含两种转酮酶基因，一种负责将5-磷酸核糖与5-磷酸木酮糖转酮生成3-磷酸甘油醛与7-磷酸景天庚酮糖，该酶为转酮酶1(由YlTKL1基因编码，SEQ ID NO 74)。另一种负责将3-磷酸甘油醛与6-磷酸果糖转酮生成5-磷酸木酮糖与4-磷酸赤藓糖，该酶为转酮酶2(由YlTKL2基因编码，SEQ ID NO 75)。因此，为了消除或减少赤藓糖醇的合成，就需要阻断或减弱转酮反应，敲除或减弱这两种转酮酶基因的功能。
(4)木酮糖激酶基因(xylulokinase gene,XKS1)的敲除。
通过基因组功能挖掘，发明人发现解脂耶氏酵母含有木酮糖激酶基因(SEQ ID NO76)，编码产物木酮糖激酶将木酮糖磷酸化为5-磷酸木酮糖，同时消耗ATP。由于木酮糖是合成木糖醇的直接前体，若木酮糖再被磷酸化会减少底物木酮糖的含量，从而降低木糖醇的合成效率，还消耗ATP。因此敲除XKS1基因理论上能提高合成木糖醇的效率，减少ATP的消耗。
(5)5-磷酸核酮糖异构酶基因(RPI gene)的敲除
通过基因组功能挖掘，发明人发现解脂耶氏酵母含有5-磷酸核酮糖异构酶基因(RPI gene，SEQ ID NO 77)，编码产物5-磷酸核酮糖异构酶将5-磷酸核酮糖异构为5-磷酸核糖。由于5-磷酸核酮糖异构酶与5-磷酸核酮糖差向异构酶(RPE)的底物均为5-磷酸核酮糖，因此敲除5-磷酸核酮糖异构酶基因，理论上能增加由5-磷酸核酮糖流向5-磷酸木酮糖的量，在5-磷酸木酮糖磷酸化酶的催化下转变为木酮糖，再在木糖醇脱氢酶催化下生成木糖醇。因此，敲除5-磷酸核酮糖异构酶基因理论上能增加木糖醇的合成。
第二方面，本发明还涉及一种采用上述构建能合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母的方法，获得能由葡萄糖等碳源合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株。
通过上述分子生物学的操作，获得一系列解脂耶氏酵母的突变株，其中包括过表达木糖醇脱氢酶基因(或称为木酮糖还原酶基因)、5-磷酸木糖醇脱氢酶基因(或称为5-磷酸木酮糖还原酶基因)、5-磷酸木酮糖磷酸酶基因、木糖醇转运蛋白基因与NADP转氢酶基因，同时又敲除甘露醇脱氢酶基因，敲除阿拉伯糖醇脱氢酶基因，敲除或弱表达转酮酶基因，敲除木酮糖激酶基因，敲除5-磷酸核酮糖异构酶基因的菌株。对获得的菌株进行发酵合成木糖醇试验，选取合成效果最佳的代表性菌株保存，编号为CGMCC No.18479。
因此，本发明构建得到的能合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株优选为解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)ery959ΔTKLΔMDHΔArDHΔRPIΔXKS1 CGMCCNo.18479。该菌株是对采用本发明的方法构建的不同重组菌株进行发酵优化筛选，获得的一株合成木糖醇产量最高的解脂耶氏酵母菌株。
第三方面，本发明还涉及利用能合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株发酵合成木糖醇的方法；所述方法包括如下步骤：
S1、将解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)ery959ΔTKLΔMDHΔArDHΔRPIΔXKS1CGMCC No.18479菌株培养于含碳源、氮源、无机盐、氨基酸以及水的培养基中，在起始pH值3.0～7.0，温度25～35℃条件下振荡或者搅拌发酵培养，发酵结束后菌液分离得到含木糖醇的发酵液以及酵母细胞；
S2、从所述含木糖醇的发酵液以及酵母细胞中分离纯化得到木糖醇。
上述步骤S1中，发酵培养时，每隔一段时间取样检测底物碳源的剩余量与产物木糖醇的生成量，当底物碳源利用完毕后结束发酵。
上述步骤S1中，所述培养基中的碳源可以为葡萄糖、果糖、甘油、淀粉中的一种或几种，所述碳源用量为50～350克/升。
上述步骤S1中，所述培养基中的氮源为蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、磷酸氢二铵、柠檬酸铵、氨基酸中的一种或几种的混合。所述培养基中氮源含量可以为5～20克/升。
上述步骤S1中，所述培养基中的无机盐为硫酸镁、氯化锰、氯化铜、氯化锌中的一种或一种以上。所述培养基中无机盐含量可以为0～0.44克/升。优选为0.01～0.44克/升。
上述步骤S2中，所述分离纯化包括：菌液分离得到澄清含木糖醇的发酵液、浓缩得到富含木糖醇浓缩液、一次结晶得到木糖醇粗制品、粗品重溶、离子交换去除离子、脱色、浓缩、二次结晶得到木糖醇精制品、干燥。
所述菌液分离为：发酵液离心或者膜过滤分离去除菌体，菌体加入水漂洗两次以充分回收其中的木糖醇，得到澄清含木糖醇的发酵液。
综上，为了进一步优化由葡萄糖等合成木糖醇的途径，本发明选择磷酸戊糖途径效率较高的解脂耶氏酵母菌株作为出发菌株。本发明提供一种通过代谢工程、遗传工程以及合成生物学的手段，在解脂耶氏酵母中敲除或弱表达与副产物合成的相关基因，引入与木糖醇合成的相关基因，构建能由葡萄糖等碳源直接发酵合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株的方法，并通过筛选优化得到一株合成木糖醇产量与得率最高的菌株解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)ery959ΔTKLΔMDHΔArDHΔRPIΔXKS1 CGMCC No.18479，以及采用该菌株由葡萄糖等碳源发酵合成与纯化木糖醇的方法。
本发明的解脂耶罗维亚酵母菌株(Yarrowia lipolytica)ery929，已经于2019年9月10日递交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.18478。
本发明的解脂耶罗维亚酵母菌株(Yarrowia lipolytica)ery959ΔTKLΔMDHΔArDHΔRPIΔXKS1，已经于2019年9月10日递交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.18479。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)由葡萄糖、果糖、淀粉等价廉易获取的碳源为原料，直接发酵合成木糖醇，避免了由化学法合成木糖醇的繁琐步骤；化学法合成需要采用生物质如玉米芯进行酸水解与化学加氢，需要高温高压的苛刻条件以及使用危险的易燃易爆的氢气。而本发明的方法则在常温常压下发酵合成，绿色环保安全；
2)采用本发明设计的方法构建的重组菌株，能由葡萄糖直接合成木糖醇，最高达到转化率为50.7％，基本具备应用价值。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为HPLC、GC-MS鉴定筛选的酵母合成的多元醇为赤藓糖醇的示意图；其中，A：HPLC鉴定，二者出峰时间一致(图1A中，1为赤藓糖醇标准的峰，2为筛选的酵母的发酵液的峰)；B：赤藓糖醇标准品质谱图；C：筛选的酵母发酵产生的多元醇的质谱图；D：B与C图二者合并对比；
图2为典型的解脂耶氏酵母整合表达质粒示意图；
图3为含木糖醇脱氢酶基因的整合表达载体示意图；
图4为重组菌株ery929中五种外源基因中其中三种的扩增曲线图；其中，A为木糖醇脱氢酶基因的扩增曲线；B为5-磷酸木酮糖还原酶基因的扩增曲线；C为5-磷酸木酮糖磷酸酶基因的扩增曲线；
图5为重组菌株ery929中五种外源基因中其中两种的扩增曲线图；其中，A为木糖醇转运蛋白基因的扩增曲线；B为NADP转氢酶基因的扩增曲线；
图6为转酮酶基因1与2被敲除后电泳验证；其中，M：DNA分子量标准；lane 1：对照ery929菌株的YlTKL1基因电泳验证；lane 2:对照ery929菌株的YlTKL2基因电泳验证；lane3:突变体敲除YlTKL1基因后的YlTKL1基因电泳验证；lane 4：突变体敲除YlTKL2基因后的YlTKL2基因电泳验证；
图7为甘露醇脱氢酶基因1与2被敲除后电泳验证；其中，lane 1:突变体1敲除YlMDH1基因后YlMDH1基因电泳验证；lane 2：突变体1敲除YlMDH2基因后YlMDH2基因电泳验证；lane 3:突变体2敲除YlMDH1基因后YlMDH1基因电泳验证；lane 4:突变体2敲除YlMDH2基因后YlMDH2基因电泳验证；M：DNA分子量标准；lane 5：对照ery929菌株的YlMDH1基因电泳验证；lane 6：对照ery929菌株的YlMDH2基因电泳验证；
图8为阿拉伯糖醇脱氢酶基因1与2被敲除后电泳验证；其中，M：DNA分子量标准；lane 1：对照ery929菌株的YlArDH1基因电泳验证；lane 2:对照ery929菌株的YlArDH2基因电泳验证；lane 3:突变体敲除YlArDH1基因后YlArDH1基因电泳验证；lane 4：突变体敲除YlArDH2基因后YlArDH2基因电泳验证；
图9为5-磷酸核酮糖异构酶基因(RPI)被敲除后电泳验证；其中，M：DNA分子量标准；lane 1-2：突变株敲除RPI基因后RPI基因电泳验证；lane 3：对照ery929菌株的RPI基因电泳验证；
图10为木酮糖激酶基因(XKS1)被敲除后电泳验证；其中，M：DNA分子量标准；lane1：对照ery929菌株的YlXKS1基因电泳验证；lane 2:突变体敲除YlXKS1基因后YlXKS1基因电泳验证；
图11为本发明的菌株CGMCC No.18479由葡萄糖发酵合成的木糖醇与标准木糖醇的离子碎片峰以及二者的对比；其中，A：菌株CGMCC 18479由葡萄糖发酵合成的木糖醇的离子碎片峰；B：标准木糖醇的离子碎片峰；C：二者对比。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1、解脂耶氏酵母菌ery929(CGMCC 18478菌株)的获得
取不同来源的新鲜蜜蜂蜂巢每份各5克，每份用灭菌后的剪刀剪成长度小于5mm的小块，浸泡在含有0.05％吐温40的20毫升无菌水中搅拌1小时，5000rpm离心10分钟，弃上清与蜂巢碎片，沉淀用1毫升无菌水悬浮，每200微升涂布在灭菌的高渗固体培养基中(成分：无水葡萄糖400g/L，酵母粉12g/L，柠檬酸铵5g/L，蛋白胨3g/L，琼脂15g/L，pH5.5)，在30℃培养7天。选取酵母样形态的菌落再进行纯培养，取纯培养的酵母菌落逐一进行发酵合成赤藓糖醇试验。液体培养基成分为：无水葡萄糖300g/L，酵母粉8g/L，柠檬酸铵5g/L，蛋白胨3g/L，氯化铜0.02g/L，氯化锰0.02g/L，维生素B1为0.05g/L，起始pH5.5。在30℃摇床中发酵5天，HPLC检测发酵液，与赤藓糖醇标准品对比，若出峰时间完全与标准赤藓糖醇一致则进一步气相质谱GC-MS检测。HPLC、GC-MS检测结果表明(图1)，有一株菌产生的多元醇为赤藓糖醇。经过发酵试验，能由300g/L葡萄糖在115小时内完全消耗葡萄糖，并合成162g/L的赤藓糖醇，是本次所有筛选的酵母中合成赤藓糖醇能力最高的野生型酵母菌。选取该产赤藓糖醇能力最高的菌株进行26S rDNA分子鉴定。提取基因组，用26S rDNA的一对引物进行PCR分子鉴定，分子鉴定所用的一对引物如下：
P26srDNA-F:5’-tagtgcagatcttggtggtagtagc-3’(SEQ ID NO 1)
P26srDNA-R:5’-ctgcttcggtatgataggaagagc-3’(SEQ ID NO 2)
扩增条件如下：
(1)95℃预变性5分钟
(2)94℃变性30秒
(3)55℃退火30秒
(4)72℃延伸90秒
(5)72℃最后延伸10分钟
(2)-(4)进行30个循环。
按照上述条件，以产赤藓糖醇最高的酵母基因组为模板进行PCR，能够扩出1.4kb的DNA，进行全测序，序列为SEQ ID NO.3(部分26S rDNA序列)。
将上述序列输入NCBI数据库进行序列对比，结果与Yarrowia lipolytica E122的26SrDNA序列98％以上同源，与Yarrowia lipolytica W29(CLIB89)的26S rDNA序列也有98％以上同源。因此，可以确定本发明筛选的能合成赤藓糖醇的酵母为解脂耶氏酵母Yarrowialipolytica(或解脂假丝酵母Candida lipolytica)，根据中文音译翻译不同，也可以为解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)
发明人对该酵母进行复合化学试剂诱变并结合环境适应性进化，将发酵温度从30℃提高到35℃。采用的方法如下：
将新鲜的酵母细胞用1.5％的甲基磺酸乙酯(EMS)与0.5％的硫酸二乙酯(DES)悬浮1-10小时，分别涂布在高渗YPD培养中(无水葡萄糖300g/L，酵母粉10g/L，柠檬酸铵5g/L，蛋白胨3g/L，琼脂15g/L，pH5.5)，于35℃培养10天，长出的菌落进行纯培养并在35℃进行适应性进化。经过180天的高温适应性进化，选取生长旺盛的单菌落进行35℃发酵合成赤藓糖醇试验，发酵培养基为：无水葡萄糖300g/L，酵母粉8g/L，柠檬酸铵5g/L，蛋白胨3g/L，氯化铜0.02g/L，氯化锰0.02g/L，维生素B1为0.05g/L，起始pH5.5。经过发酵试验，发现一株菌在35℃条件下仍保留与其野生菌同样的合成赤藓糖醇的效率，其余绝大部分菌虽然能在35℃生长，但合成较多的甘露醇。将能在35℃良好生长并且高效合成赤藓糖醇的新菌株命名为ery929，由300g/L的葡萄糖合成赤藓糖醇的产量达到174g/L。ery929保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.18478。
实施例2、构建能合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株
(1)在解脂耶氏酵母中过表达木糖醇脱氢酶基因。
将优化合成的麦芽糖假丝酵母的木糖醇脱氢酶基因(Candida maltosa，SEQ IDNO 9)连接到整合表达质粒载体pSWV-Int中(示意图2)。该载体是基于普通克隆载体pUC系列基础上，增加了常见的DNA元件序列，如26S rDNA左右同源臂序列、人工合成启动子hp4d序列、转录延长因子基因终止子TTTEF序列、蔗糖酶筛选标记基因序列Suc2、大肠杆菌质粒复制起始点序列ori、氨苄青霉素抗性基因序列DNA元件，这些基本的DNA元件本领域技术人员可以从NCBI数据库中查到(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。构建的含木糖醇脱氢酶基因的整合表达载体示意图如图3所示，其中的木糖醇脱氢酶基因还可以用其它的木糖醇脱氢酶基因(如氧化葡糖杆菌的木糖醇脱氢酶基因等)代替，筛选标记Suc2可以用潮霉素抗性基因代替，其它的DNA元件不变。用NotI与EcoRI线性化载体并转化合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母ery929菌株或者不合成赤藓糖醇的其它解脂耶氏酵母菌株如CLIB122，在含蔗糖的基本培养基上筛选。筛选培养基的成分为：酵母氮碱6克/升，硫酸铵5克/升，蔗糖10克/升，琼脂粉15克/升，pH6.0。由于解脂耶氏酵母ery929菌株不能利用蔗糖，因此在含蔗糖的基本培养中能生长的转化子就含有蔗糖酶，水解蔗糖成葡萄糖与果糖，从而能生长，同时还含有木糖醇脱氢酶基因，能将木酮糖还原为木糖醇。
然后将含有Cre重组酶的质粒pUB4-CRE转化表达木糖醇脱氢酶的突变体，在含有潮霉素为选择标记的YPD琼脂培养基中筛选(葡萄糖10克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，琼脂15克/升，潮霉素300微克/毫升，pH6.0)。长出的转化子转接在含有蔗糖的基本培养基中(酵母氮碱6克/升，硫酸铵5克/升，蔗糖10克/升，琼脂粉15克/升，pH6.0)，选择蔗糖酶基因丢失的突变体(即不能再利用蔗糖)。然后在不含潮霉素的液体YPD培养基中培养不能利用蔗糖的突变体，再梯度稀释涂布在不含潮霉素的固体YPD培养基上，从长出的转化子中挑取转接在含有潮霉素的YPD琼脂培养基中，选择不能再抗潮霉素的突变体，即为过表达木糖醇脱氢酶基因，同时筛选标记蔗糖酶基因也丢失的突变体，可用于过表达其它基因的宿主。提取该突变体的总RNA，并进行反转录，以反转录产物作为模板进行荧光定量PCR，检测木糖醇脱氢酶基因的表达水平，与对照ery929菌株相比，发现突变株的木糖醇脱氢酶基因有明显的扩增曲线，而对照菌株没有扩增曲线，说明木糖醇脱氢酶基因在突变株中得到表达。
将上述过表达木糖醇脱氢酶基因，同时蔗糖酶基因也丢失的突变体接种在发酵培养基中，合成木糖醇的试验。发酵培养基的成分为：葡萄糖200克/升，酵母粉8克/升，蛋白胨5克/升，柠檬酸铵3克/升，氯化锌0.05克/升，氯化锰0.01克/升，维生素B1为0.05克/升，pH6.0。定时取样检测，85小时时葡萄糖利用完全，木糖醇含量为0.2克/升，赤藓糖醇96.4克/升，甘露醇12克/升。若将氧化葡糖杆菌的木糖醇脱氢酶基因代替上述麦芽糖假丝酵母的木糖醇脱氢酶基因，转化ery929菌株，发酵试验结果为，木糖醇含量为0.3克/升，赤藓糖醇90.2克/升，甘露醇11克/升。若将汉斯德巴氏酵母的木糖醇脱氢酶基因代替上述麦芽糖假丝酵母的木糖醇脱氢酶基因，转化ery929菌株，发酵试验结果为，木糖醇含量为0.2克/升，赤藓糖醇98.6克/升，甘露醇13克/升。由发酵结果可以看出，仅仅过表达木糖醇脱氢酶基因，解脂耶氏酵母合成木糖醇的得率极低。
当用上述表达载体转化不能合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母CLIB122菌株时，在同样条件下发酵90小时，发现不能检测到木糖醇，也不能检测到赤藓糖醇，但能检测到6克/升的甘露醇，同时残留大量的葡萄糖(153克/升)。
(2)在解脂耶氏酵母中过表达5-磷酸木糖醇脱氢酶基因(又称5-磷酸木酮糖还原酶基因)。
用艰难梭菌、鼠李糖乳杆菌以及植物乳杆菌的5-磷酸木酮糖还原酶基因(序列表中的SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 20等)分别代替步骤(1)中的整合表达载体pSWV-CmXDH中的木糖醇脱氢酶基因，得到含5-磷酸木酮糖还原酶基因的整合表达载体。转化解脂耶氏酵母ery929菌株，得到含5-磷酸木酮糖还原酶基因的转化子。在与步骤(1)中相同的条件下发酵，发酵试验结果为，木糖醇含量为0.3-0.7克/升，赤藓糖醇92-98克/升，甘露醇10-12克/升。结果表明仅仅含有5-磷酸木酮糖还原酶基因，解脂耶氏酵母由葡萄糖合成木糖醇的得率仍极低。为了证明该基因在细胞中得到了表达，提取该转化子的总RNA，并进行反转录，以反转录产物作为模板进行荧光定量PCR，检测5-磷酸木酮糖还原酶基因的表达水平，与对照ery929菌株相比，发现突变株的5-磷酸木酮糖还原酶基因有明显的扩增曲线，而对照菌株没有扩增曲线，说明5-磷酸木酮糖还原酶基因在该转化子中得到表达。
(3)在解脂耶氏酵母中过表达5-磷酸木酮糖磷酸酶基因。
分别用马克斯克鲁维酵母，酿酒酵母，Komagataella phaffii酵母、植物乳杆菌与枯草芽孢杆菌的具有5-磷酸木酮糖磷酸酶活性的基因(序列表中的SEQ ID NO 21、SEQ IDNO22、SEQ ID NO 24等)分别代替步骤(1)中的整合表达载体中的木糖醇脱氢酶基因，得到含5-磷酸木酮糖磷酸酶酶基因的整合表达载体。转化解脂耶氏酵母ery929菌株，得到含5-磷酸木酮糖磷酸酶基因的转化子。在与步骤(1)中相同的条件下发酵，发酵试验结果为，液相色谱未检测到木糖醇，赤藓糖醇95-102克/升，甘露醇10-12克/升。结果表明仅仅含有5-磷酸木酮糖磷酸酶基因，解脂耶氏酵母不能由葡萄糖合成木糖醇。为了证明5-磷酸木酮糖磷酸酶基因在该转化子中是表达的，发明人进行了荧光定量PCR分析。具体操作是：提取该转化子的总RNA(采用Trizol法提取)，然后进行反转录(采用商业化反转录试剂盒)，取2微升反转录产物进行荧光定量PCR(采用商业化的荧光定量PCR试剂盒)，20微升反应体系，在荧光定量PCR仪进行。反应结束后，发现转化子具有扩增曲线，该基因得到扩增，而对照菌没有扩增，说明该基因在转化子中是得到表达的。
(4)在解脂耶氏酵母中过表达木糖醇转运蛋白基因或NADP转氢酶基因。
用木糖醇转运蛋白基因或NADP转氢酶基因分别代替步骤(1)中的整合表达载体中的木糖醇脱氢酶基因，得到含木糖醇转运蛋白基因或NADP转氢酶基因的整合表达载体。转化解脂耶氏酵母ery929菌株，得到含木糖醇转运蛋白基因或NADP转氢酶基因的转化子。在与步骤(1)中相同的条件下发酵，发酵试验结果为，未检测到木糖醇，赤藓糖醇96-104克/升，甘露醇9-12克/升。结果表明仅仅含有木糖醇转运蛋白基因或NADP转氢酶基因，解脂耶氏酵母同样不能由葡萄糖合成木糖醇。采用荧光定量PCR检测，发现该转化子具有扩增曲线，该基因得到扩增，而对照菌没有扩增，说明NADP转氢酶基因在转化子中是得到表达的。
上述结果表明，仅含有木糖醇脱氢酶或者5-磷酸木酮糖还原酶基因，重组解脂耶氏酵母仅能合成微量的木糖醇，但是仅含有5-磷酸木酮糖磷酸酶基因、木糖醇转运蛋白或者NADP转氢酶的重组菌株却检测不到木糖醇合成。为了验证这五种基因是否有协同作用，将这五种基因共同转入解脂耶氏酵母中，测试木糖醇的合成效率是否提高。
(5)同时表达木糖醇脱氢酶基因、5-磷酸木酮糖还原酶基因、5-磷酸木酮糖磷酸酶基因、木糖醇转运蛋白基因以及NADP转氢酶基因五种基因的解脂耶氏酵母菌株ery959的获得。
以步骤(1)中过表达氧化葡糖杆菌木糖醇脱氢酶基因、同时蔗糖酶标记回收的重组菌为宿主，依次将5-磷酸木糖醇脱氢酶酶基因(SEQ ID NO 14)、5-磷酸木酮糖磷酸酶基因(SEQ ID NO 31)、木糖醇转运蛋白基因(SEQ ID NO 32)以及NADP转氢酶基因(SEQID NO44)转入解脂耶氏酵母中进行表达。转化的方法与筛选标记回收的方法参考步骤(1)。获得同时表达上述五种基因的重组解脂耶氏酵母菌ery959。为了验证重组菌ery959中的五种基因均得到表达，发明人提取该菌的总RNA，进行反转录并进行荧光定量检测，发现五种基因均有典型的扩增曲线，说明这五种引入的外源基因均得到表达，扩增曲线如图4、图5所示(图4中A-C分别为木糖醇脱氢酶基因、5-磷酸木酮糖还原酶基因、5-磷酸木酮糖磷酸酶基因的扩增曲线图；图5中A-B分别为木糖醇转运蛋白基因以及NADP转氢酶基因的扩增曲线图)。用该重组菌发酵合成木糖醇的方法同步骤(1)。经过98小时发酵，葡萄糖利用完毕，结果为：木糖醇3.6克/升，赤藓糖醇82.5克/升，甘露醇7.2克/升，发酵结束时pH3.2。
由上述结果可知，仅仅通过在解脂耶氏酵母中表达与合成木糖醇相关的基因，木糖醇的产量仍然难以大幅提高，仍大量合成赤藓糖醇。原因可能是合成木糖醇的前体5-磷酸木酮糖仍主要通过转酮反应流入合成赤藓糖醇的途径。因此，进一步敲除转酮酶基因，阻断5-磷酸木酮糖进入合成赤藓糖醇的途径，可能显著提高木糖醇的合成。
(6)在ery959菌株的基础上敲除转酮酶基因，获得转酮酶基因被敲除的突变株ery959ΔTKL12。
分别构建并合成转酮酶基因1(YlTKL1)与转酮酶基因2(YlTKL2)的基因敲除盒，并转化步骤(5)获得的解脂耶氏酵母菌株，敲除这两种转酮酶基因。基因敲除盒依次包含转酮酶基因上游1KB-1.5KB碱基、可回收的选择标记(蔗糖酶基因sucrase gene，基因两端含有loxP位点，便于选择标记回收)、转酮酶基因下游1KB-1.5KB碱基。转酮酶基因敲除盒合成后，用于转化步骤(5)获得的解脂耶氏酵母，并在添加蔗糖与硫酸铵的基本培养基中筛选(酵母氮碱6克/升，硫酸铵5克/升，蔗糖10克/升，苯丙氨酸、酪氨酸与色氨酸各0.05克/升，琼脂粉15克/升，pH6.0)。由于步骤(5)获得的解脂耶氏酵母不能再利用蔗糖，因此在含蔗糖的基本培养中能生长的转化子就含有蔗糖酶，水解蔗糖成葡萄糖与果糖，从而能生长。提取突变株转化子的基因组，分别用PTKL1-F/PTKL1-R与PTKL2-F/PTKL2-R两对引物进行PCR扩增(引物序列分别为SEQ ID NO 46-49)，对照菌株的两种转酮酶基因片段均能扩出(1100bp左右的DNA片段)，而突变株的不能，表明两种转酮酶基因被敲除(图6，其中，对照ery929菌株的YlTKL1基因能扩出；对照ery929菌株的YlTKL2基因能扩出；突变体敲除YlTKL1基因后YlTKL1基因不能扩出；突变体敲除YlTKL2基因后YlTKL2基因不能扩出)。
用于扩增YlTKL1基因片段的引物序列：
PTKL1-F:5’-tgaataggagacttgacagtctggc-3’(SEQ ID NO 46)
PTKL1-R:5’-ctctgagatcatccgagcattcaag-3(SEQ ID NO 47)
用于扩增YlTKL2基因片段的引物序列：
PTKL2-F:5’-atgccccctttcaccctggcagacac-3’(SEQ ID NO 48)
PTKL2-R:5’-ctataacccggcacagagccttggcg-3’(SEQ ID NO 49)
然后将含有Cre重组酶基因的质粒pUB4-CRE转化YlArDH1与YlArDH2均被敲除的突变体，在含有潮霉素为选择标记的YPD琼脂培养基中筛选(葡萄糖10克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，苯丙氨酸、酪氨酸与色氨酸各0.05克/升，琼脂15克/升，潮霉素300微克/毫升，pH6.0)。长出的转化子转接在含有蔗糖的基本培养基中(酵母氮碱6克/升，硫酸铵5克/升，蔗糖10克/升，苯丙氨酸、酪氨酸与色氨酸各0.05克/升，琼脂粉15克/升，pH6.0)，选择蔗糖酶基因丢失的突变体(即不能再利用蔗糖)。然后在不含潮霉素的液体YPD培养基中培养不能利用蔗糖的突变体，再梯度稀释涂布在不含潮霉素的固体YPD培养基上，从长出的转化子中挑取转接在含有潮霉素的YPD琼脂培养基中，选择不能再抗潮霉素的突变体，即为转酮酶基因被敲除，同时蔗糖酶基因也丢失的突变体，该突变体同时表达木糖醇脱氢酶基因、5-磷酸木酮糖还原酶基因、5-磷酸木酮糖磷酸酶基因、木糖醇转运蛋白基因以及NADP转氢酶基因，同时敲除了转酮酶基因。可用作其它基因敲除的宿主。转酮酶基因1与2的基因敲除盒序列分别为SEQ ID NO 50与SEQ ID NO 51。
用突变株ery959ΔTKL12发酵葡萄糖合成木糖醇的试验，发酵培养基同步骤(1)中的发酵培养基，并补充苯丙氨酸、酪氨酸与色氨酸各0.05克/升。定时取样检测葡萄糖与产物的含量，发现葡萄糖利用速率明显变慢，对照菌(ery959)在90小时即能消耗完葡萄糖，细胞OD600为22.5，而ery959ΔTKL12突变菌220小时仍未利用完葡萄糖(期间补充无菌水以弥补挥发的水)，木糖醇含量23克/升，甘露醇36克/升，阿拉伯糖醇3克/升，核糖醇3克/升，残留葡萄糖84克/升，细胞OD600为6.5，未检测到赤藓糖醇，说明敲除转酮酶基因对合成木糖醇具有十分重要的作用。同时也表明，敲除TKL基因会阻碍细胞的生长，虽然添加三种芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸)，也不能完全回补到对照菌ery929的菌体密度水平。已知文献也表明，转酮酶是合成赤藓糖醇的关键酶，而且活性非常高(Sawada etal.2009.Key role for transketolase activity in erythritol production byTrichosporonoides megachiliensis SN-G42.Journal of Bioscience andBioengineering,108:385-390)。由于敲除了转酮酶基因后细胞生长受阻，并且利用葡萄糖明显变慢，因此为了适当增加细胞的生长与利用葡萄糖的速率，在转酮酶基因被敲除的菌株ery959ΔTKL12的基础上转入启动子弱化的转酮酶基因YlTKL1，以部分恢复转酮酶基因1的表达。在转酮酶YlTKL1基因(SEQ ID NO 74)的5’端融合上弱启动子序列(SEQ ID NO78)，组成新的序列SEQ ID NO 79，以此序列转化ery959ΔTKL12，在基本培养基上筛选(成份为：酵母氮碱6克/升，葡萄糖10克/升，硫酸铵5克/升，琼脂粉15克/升，pH6.5，不含苯丙氨酸、酪氨酸与色氨酸)。由于ery959ΔTKL12不能在不含苯丙氨酸、酪氨酸与色氨酸的基本培养基上生长，因此长出的转化子即含有SEQ ID NO 79(转酮酶1基因下调表达)，新的菌株命名为ery959ΔTKL。
用新突变株ery959ΔTKL发酵葡萄糖合成木糖醇，发酵培养基同步骤(1)中的发酵培养基，无苯丙氨酸、酪氨酸与色氨酸。定时取样检测发酵液的成分，发现葡萄糖利用速率明显变快，120小时即利用完葡萄糖，色谱分析，木糖醇含量58克/升，甘露醇23克/升，阿拉伯糖醇3克/升，核糖醇3克/升，赤藓糖醇5克/升，细胞OD600为18.4。
敲除或下调转酮酶基因的表达，虽然赤藓糖醇的含量明显减低，但合成了较多的甘露醇与阿拉伯糖醇。因此，进一步敲除甘露醇脱氢酶基因与阿拉伯糖醇脱氢酶基因，理论上能减少或者阻断甘露醇与阿拉伯糖醇的合成。
(7)敲除突变株ery959ΔTKL菌株的甘露醇脱氢酶基因，获得甘露醇脱氢酶基因被敲除的菌株ery959ΔTKLΔMDH。
分别构建并合成甘露醇脱氢酶基因1(YlMDH1)与甘露醇脱氢酶基因2(YlMDH2)的基因敲除盒(gene disruption cassette)，并转化解脂耶氏酵母ery959ΔTKL菌株，敲除这两种甘露醇脱氢酶基因。基因敲除盒依次包含基因上游1KB-1.5KB碱基、可回收的选择标记(如氨基环醇磷酸转移酶基因aminocyclitol phoshotransferase、蔗糖酶基因sucrasegene，基因两端含有loxP位点，便于选择标记回收)、基因下游1KB-1.5KB碱基。合成后用于转化解脂耶氏酵母ery959ΔTKL菌株，并在添加蔗糖与硫酸铵的基本培养基中筛选(酵母氮碱6克/升，硫酸铵5克/升，蔗糖10克/升，琼脂粉15克/升，pH6.0)，由于解脂耶氏酵母ery959ΔTKL不能再利用蔗糖，因此在含蔗糖的基本培养中能生长的转化子就含有蔗糖酶，水解蔗糖成葡萄糖与果糖，从而能生长。由于蔗糖酶基因是位于基因敲除盒中甘露醇脱氢酶基因上下游同源臂中间，因此转化子中就有甘露醇脱氢酶基因被敲除的突变体，此突变体中的甘露醇脱氢酶基因被蔗糖酶基因所代替。提取突变体的基因组，用上述两种甘露醇脱氢酶基因的引物进行PCR(引物序列为SEQ ID NO 52，SEQ ID NO 53，SEQ ID NO 54，SEQ ID NO55)，对照菌株的甘露醇脱氢酶基因能扩出(900bp的目的DNA片段)，而突变株的不能，显示甘露醇脱氢酶基因确实被敲除(图7，其中，其中，lane 1:突变体1敲除YlMDH1基因后YlMDH1基因片段不能扩出；lane 2：突变体1敲除YlMDH2基因后YlMDH2基因片段不能扩出；lane 3:突变体2敲除YlMDH1基因后YlMDH1基因片段不能扩出；lane 4:突变体2敲除YlMDH2基因后YlMDH2基因片段不能扩出；M：DNA分子量标准；lane 5：对照ery929菌株的YlMDH1基因片段能扩出(900bp)；lane 6：对照ery929菌株的YlMDH2基因片段能扩出(900bp))。
用于扩增YlMDH1基因片段的引物序列：
PMDH1-F:5’-ctatctccacaacaatgcctgcaccag-3’(SEQ ID NO 52)
PMDH1-R:5’-ccggttacacatgactgtaggaaac-3(SEQ ID NO 53)
用于扩增YlMDH2基片段的引物序列：
PMDH2-F:5’-ccatacacagcaccacctcaatc-3’(SEQ ID NO 54)
PMDH2-R:5’-tctatatacatcctctaaggagc-3’(SEQ ID NO 55)
然后将含有Cre重组酶的质粒(pUB4-CRE，来自文献：Fickers et al.2003.Newdisruption cassettes for rapid gene disruption and marker rescue in the yeastYarrowia lipolytica.J.Microbiol.Methods,55,727–737)转化YlMDH1与YlMDH2均被敲除的突变体，回收蔗糖酶选择标记。在含有潮霉素为选择标记的YPD琼脂培养基中筛选(葡萄糖10克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，琼脂15克/升，潮霉素300微克/毫升，pH6.0)。长出的转化子转接在含有蔗糖的基本培养基中(酵母氮碱6克/升，硫酸铵5克/升，蔗糖10克/升，琼脂粉15克/升，pH6.0)，选择蔗糖酶基因丢失的突变体(即不能再利用蔗糖)。然后在不含潮霉素的液体YPD培养基中培养不能利用蔗糖的突变体，再梯度稀释涂布在不含潮霉素的固体YPD培养基上，从长出的转化子中挑取转接在含有潮霉素的YPD琼脂培养基中，选择不能再抗潮霉素的突变体，即为甘露醇脱氢酶基因被敲除，同时蔗糖酶基因也丢失的突变体，可用于其它基因敲除的宿主。甘露醇脱氢酶基因1与2的基因敲除盒序列见SEQ ID NO56，SEQ ID NO 57。
用突变株ery959ΔTKLΔMDH发酵葡萄糖合成木糖醇的试验，发酵培养基同步骤(1)中的发酵培养基。定时取样检测，104小时时葡萄糖利用完全，木糖醇含量为86克/升，无甘露醇，无阿拉伯糖醇，赤藓糖醇5克/升，核糖醇3克/升。可见，敲除甘露醇脱氢酶基因，能同时消除副产物甘露醇与阿拉伯糖醇，但是仍有核糖醇产生。为了消除核糖醇，进行了敲除阿拉伯糖醇脱氢酶基因的实验。
(8)敲除突变株ery959ΔTKLΔMDH菌株的阿拉伯糖醇脱氢酶基因，获得阿拉伯糖醇脱氢酶基因被敲除的菌株ery959ΔTKLΔMDHΔArDH。
构建并合成阿拉伯糖醇脱氢酶基因1(YlArDH1)与阿拉伯糖醇脱氢酶基因2(YlArDH2)的基因敲除盒(gene disruption cassette)，并转化解脂耶氏酵母ery959ΔTKLΔMDH菌株，敲除这两种阿拉伯糖脱氢酶基因。基因敲除盒依次包含基因上游1KB-1.5KB碱基、可回收的选择标记(蔗糖酶基因sucrase gene，基因两端含有loxP位点，便于选择标记回收)、基因下游1KB-1.5KB碱基。阿拉伯糖醇基因敲除盒合成后，用于转化甘露醇脱氢酶基因被敲除的解脂耶氏酵母ery959ΔTKLΔMDH，并在添加蔗糖与硫酸铵的基本培养基中筛选(酵母氮碱6克/升，硫酸铵5克/升，蔗糖10克/升，琼脂粉15克/升，pH6.0)。由于阿拉伯糖醇脱氢酶基因被敲除的解脂耶氏酵母不能再利用蔗糖，因此在含蔗糖的基本培养中能生长的转化子就含有蔗糖酶，水解蔗糖成葡萄糖与果糖，从而能生长。提取突变株转化子的基因组，分别用PArDH1-F/PArDH1-R与PArDH2-F/PArDH2-R两对引物进行PCR扩增(引物序列分别为：SEQ IDNO 58，SEQ ID NO 59，SEQ ID NO 60，SEQ ID NO 61)，对照菌株的阿拉伯糖醇脱氢酶基因能扩出(900bp的DNA片段)，而突变株的不能，表明两种阿拉伯糖醇脱氢酶基因被敲除(图8，其中，lane 1：对照ery929菌株的YlArDH1基因能扩出；lane 2:对照ery929菌株的YlArDH2基因能扩出；lane 3:突变体敲除YlArDH1基因后YlArDH1基因不能扩出；lane 4：突变体敲除YlArDH2基因后YlArDH2基因不能扩出)。
用于扩增YlArDH1基因片段的引物序列：
PArDH1-F:5’-accagatggtgtaacctccatcgac-3’SEQ ID NO 58
PArDH1-R:5’-ggaagtggtggtctgggtatcgcag-3SEQ ID NO 59
用于扩增YlArDH2基因片段的引物序列：
PArDH2-F:5’-cacatacaccacaacacacacaaaatc-3’SEQ ID NO 60
PArDH2-R:5’-ttcctctgagacaatcgcgtcggatc-3’SEQ ID NO 61
然后将含有Cre重组酶的质粒pUB4-CRE转化YlArDH1与YlArDH2均被敲除的突变体，以回收蔗糖酶筛选标记。在含有潮霉素为选择标记的YPD琼脂培养基中筛选(葡萄糖10克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，琼脂15克/升，潮霉素300微克/毫升，pH6.0)。长出的转化子转接在含有蔗糖的基本培养基中(酵母氮碱6克/升，硫酸铵5克/升，蔗糖10克/升，琼脂粉15克/升，pH6.0)，选择蔗糖酶基因丢失的突变体(即不能再利用蔗糖)。然后在不含潮霉素的液体YPD培养基中培养不能利用蔗糖的突变体，再梯度稀释涂布在不含潮霉素的固体YPD培养基上，从长出的转化子中挑取转接在含有潮霉素的YPD琼脂培养基中，选择不能再抗潮霉素的突变体ery959ΔTKLΔMDHΔArDH，即为阿拉伯糖醇脱氢酶基因被敲除，同时蔗糖酶基因也丢失的突变体，可用于其它基因敲除的宿主。阿拉伯糖醇脱氢酶基因1与2的基因敲除盒序列为SEQ ID NO 62，SEQ ID NO 63。
用突变株ery959ΔTKLΔMDHΔArDH发酵葡萄糖合成木糖醇的试验，发酵培养基同步骤(1)中的发酵培养基。定时取样检测，106小时时葡萄糖利用完全，木糖醇含量为87克/升，赤藓糖醇6克/升，未检测到甘露醇、阿拉伯糖醇与核糖醇。
(9)敲除突变株ery959ΔTKLΔMDHΔArDH菌株的5-磷酸核酮糖异构酶基因，获得5-磷酸核酮糖异构酶基因被敲除的解脂耶氏酵母菌株ery959ΔTKLΔMDHΔArDHΔRPI。
构建并合成5-磷酸核酮糖异构酶基因(RPI)的基因敲除盒，并转化解脂耶氏酵母ery959ΔTKLΔMDHΔArDH，敲除RPI。基因敲除盒依次包含5-磷酸核酮糖异构酶基因上游1KB-1.5KB碱基、可回收的选择标记(蔗糖酶基因sucrase gene，基因两端含有loxP位点，便于选择标记回收)、5-磷酸核酮糖异构酶基因下游1KB-1.5KB碱基。5-磷酸核酮糖异构酶基因敲除盒合成后，用于转化解脂耶氏酵母ery959ΔTKLΔMDHΔArDH菌株，并在添加蔗糖与硫酸铵的基本培养基中筛选(酵母氮碱6克/升，硫酸铵5克/升，蔗糖10克/升，琼脂粉15克/升，pH6.0)。由于上述转酮酶基因、甘露醇脱氢酶基因、阿拉伯糖醇脱氢酶基因被敲除的解脂耶氏酵母不能再利用蔗糖，因此在含蔗糖的基本培养中能生长的转化子就含有蔗糖酶，水解蔗糖成葡萄糖与果糖，从而能生长。提取突变株转化子的基因组，分别用PRPI-F/PRPI-R一对引物进行PCR扩增(引物序列如下SEQ ID NO 64、65)，对照菌株的5-磷酸核酮糖异构酶基因片段能扩出(600bp左右的DNA片段)，而突变株的不能，表明5-磷酸核酮糖异构酶基因被敲除(图9，其中，lane 1-2：突变株敲除RPI基因后RPI基因不能扩出；lane 3：对照ery929菌株的RPI基因能扩出)。
用于扩增YlRPI基因片段的引物序列(扩增产物大小0.6KB)：
PRPI-F:5’-aactgcctcctcttgagcaggccaag-3’(SEQ ID NO 64)
PRPI-R:5’-ggaacagcagcttgatcttgatgtgc-3(SEQ ID NO 65)
用含Cre重组酶基因的质粒pUB4-CRE转化RPI基因被敲除的突变体，用于回收蔗糖酶筛选标记的方法参考上面描述的方法。5-磷酸核酮糖异构酶基因敲除盒序列为SEQ IDNO66。
用突变株ery959ΔTKLΔMDHΔArDHΔRPI发酵葡萄糖合成木糖醇的试验，发酵培养基同步骤(1)中的发酵培养基。定时取样检测，102小时时葡萄糖利用完全，木糖醇含量为92.3克/升，赤藓糖醇6.4克/升，未检测到甘露醇、阿拉伯糖醇与核糖醇。
(10)敲除突变株ery959ΔTKLΔMDHΔArDHΔRPI的木酮糖激酶基因，获得木酮糖激酶基因被敲除的解脂耶氏酵母菌株ery959ΔTKLΔMDHΔArDHΔRPIΔXKS1。
构建并合成木酮糖激酶基因(YlXKS1)的基因敲除盒，并转化酵母ery959ΔTKLΔMDHΔArDHΔRPI，敲除木酮糖激酶基因YlXKS1。基因敲除盒依次包含木酮糖激酶基因上游1KB-1.5KB碱基、可回收的选择标记(蔗糖酶基因sucrase gene，基因两端含有loxP位点，便于选择标记回收)、木酮糖激酶基因下游1KB-1.5KB碱基。木酮糖激酶基因敲除盒合成后，用于转化ery959ΔTKLΔMDHΔArDHΔRPI解脂耶氏酵母，并在添加蔗糖与硫酸铵的基本培养基中筛选(酵母氮碱6克/升，硫酸铵5克/升，蔗糖10克/升，琼脂粉15克/升，pH6.0)。由于上述转酮酶基因被敲除的解脂耶氏酵母不能再利用蔗糖，因此在含蔗糖的基本培养中能生长的转化子就含有蔗糖酶，水解蔗糖成葡萄糖与果糖，从而能生长。提取突变株转化子的基因组，分别用PXKS1-F/PXKS1-R一对引物进行PCR扩增(引物序列为SEQ ID NO 67-68)，对照菌株的木酮糖酶激酶基因片段能扩出(800bp左右的DNA片段)，而突变株的不能，表明木酮糖激酶基因被敲除(图10，其中，lane 1：对照ery929菌株的YlXKS1基因能扩出；lane 2:突变体敲除YlXKS1基因后YlXKS1基因不能扩出)。
用于扩增YlXKS1基因片段的引物序列(扩增产物大小0.8KB)：
PXKS1-F:5’-gactggatctttcgactcaacagctc-3’(SEQ ID NO 67)
PXKS1-R:5’-ccaaagacacaatcacgtcattggcc-3(SEQ ID NO 68)
然后将含有Cre重组酶的质粒pUB4-CRE转化YlXKS1基因被敲除的突变体，在含有潮霉素为选择标记的YPD琼脂培养基中筛选(葡萄糖10克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，琼脂15克/升，潮霉素300微克/毫升，pH6.0)。长出的转化子转接在含有蔗糖的基本培养基中(酵母氮碱6克/升，硫酸铵5克/升，蔗糖10克/升，琼脂粉15克/升，pH6.0)，选择蔗糖酶基因丢失的突变体(即不能再利用蔗糖)。然后在不含潮霉素的液体YPD培养基中培养不能利用蔗糖的突变体，再梯度稀释涂布在不含潮霉素的固体YPD培养基上，从长出的转化子中挑取转接在含有潮霉素的YPD琼脂培养基中，选择不能再抗潮霉素的突变体，即为木酮糖激酶基因被敲除，同时蔗糖酶基因也丢失的突变体ery959ΔTKLΔMDHΔArDHΔRPIΔXKS1。木酮糖激酶基因敲除盒序列为SEQ ID NO 69。
用突变株ery959ΔTKLΔMDHΔArDHΔRPIΔXKS1发酵葡萄糖合成木糖醇的试验，发酵培养基同步骤(1)中的发酵培养基。定时取样检测，104小时时葡萄糖利用完全，木糖醇含量为98克/升，赤藓糖醇6.5克/升。
由上述十种实施结果可以看出，过表达五种酶基因(木糖醇脱氢酶基因、5-磷酸木酮糖还原酶基因、5-磷酸木酮糖磷酸酶基因、木糖醇转运蛋白基因以及NADP转氢酶基因)，同时敲除五种酶基因(转酮酶基因、甘露醇脱氢酶基因、阿拉伯糖醇脱氢酶基因、5-磷酸核酮糖异构酶基因以及木酮糖激酶基因)与弱表达转酮酶基因1的突变株ery959ΔTKLΔMDHΔArDHΔRPIΔXKS1发酵合成木糖醇的效果最佳，由200克的无水葡萄糖经过104小时发酵，发酵液中含有98克木糖醇。将该代表性的菌株保存，保存编号为CGMCC No.18479。下面的步骤以该代表性菌株为例，进行发酵合成木糖醇的优化试验。
(11)CGMCC No.18479菌株在温度25度，葡萄糖浓度为50克/升条件下发酵合成木糖醇的试验。
将重组酵母CGMCC No.18479菌株接种在含500毫升发酵培养基的2L三角瓶中(底部带凸起的棱，增加搅拌溶氧效果)，起始菌体密度(OD600)为0.8，发酵培养基成分为：葡萄糖50克/升，酵母粉2克/升，蛋白胨3克/升，磷酸氢二胺1克/升，起始pH5.5，在25℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖含量与木糖醇含量。至75小时时葡萄糖消耗完毕，测定木糖醇含量为12克/升，转化率为24％。
(12)CGMCC No.18479菌株在温度25度，葡萄糖浓度为200克/升条件下发酵合成木糖醇的试验。
将重组酵母CGMCC No.18479菌株接种在含500毫升发酵培养基的2L三角瓶中，起始菌体密度(OD600)为0.8，发酵培养基成分为：葡萄糖200克/升，酵母粉5克/升，蛋白胨5克/升，磷酸氢二胺3克/升，氯化锰0.01克/升，氯化铜0.01克/升，氯化锌0.01克/升，硫酸镁0.2克/升，起始pH5.5，在25℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖含量与木糖醇含量。至115小时时葡萄糖消耗完毕，测定木糖醇含量为96克/升，转化率为48％。
(13)CGMCC No.18479菌株在温度28度，葡萄糖浓度为300克/升条件下发酵合成木糖醇的试验。
将重组酵母CGMCC No.18479菌株接种在含500毫升发酵培养基的2L三角瓶中，起始菌体密度(OD600)为0.8，发酵培养基成分为：葡萄糖300克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，柠檬酸铵3克/升，氯化锰0.02克/升，氯化铜0.01克/升，氯化锌0.01克/升，硫酸镁0.2克/升，起始pH5.5，在28℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖含量与木糖醇含量。至140小时时葡萄糖消耗完毕，测定木糖醇含量为145克/升，转化率为48.3％。
(14)CGMCC No.18479菌株在温度30度，葡萄糖浓度为300克/升条件下发酵合成木糖醇的试验。
将重组酵母CGMCC No.18479菌株接种在含500毫升发酵培养基的2L三角瓶中(底部带凸起的棱，增加搅拌效果)，起始菌体密度(OD600)为0.8，发酵培养基成分为：葡萄糖300克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，柠檬酸铵3克/升，氯化锰0.02克/升，氯化铜0.01克/升，氯化锌0.01克/升，硫酸镁0.2克/升，起始pH5.5，在30℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖含量与木糖醇含量。至110小时时葡萄糖消耗完毕，测定木糖醇含量为148克/升，转化率为49.3％。
(15)CGMCC No.18479菌株在温度30度，葡萄糖浓度为350克/升条件下发酵合成木糖醇的试验。
将重组酵母CGMCC No.18479菌株接种在含500毫升发酵培养基的2L三角瓶中(底部带凸起的棱，增加搅拌效果)，起始菌体密度(OD600)为0.8，发酵培养基成分为：葡萄糖350克/升，酵母粉12克/升，蛋白胨5克/升，柠檬酸铵3克/升，氯化锰0.02克/升，氯化铜0.02克/升，硫酸镁0.4克/升，起始pH5.5，在30℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖含量与木糖醇含量。至138小时时葡萄糖消耗完毕，测定木糖醇含量为158克/升，转化率为45.1％。
(16)CGMCC No.18479菌株在温度35度，葡萄糖浓度为300克/升条件下发酵合成木糖醇的试验。
将重组酵母CGMCC No.18479菌株接种在含500毫升发酵培养基的2L三角瓶中(底部带凸起的棱，增加搅拌效果)，起始菌体密度(OD600)为0.8，发酵培养基成分为：葡萄糖300克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，柠檬酸铵3克/升，氯化锰0.02克/升，氯化铜0.01克/升，硫酸镁0.2克/升，起始pH5.5，在35℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖含量与木糖醇含量。至135小时时葡萄糖消耗完毕，测定木糖醇含量为122克/升，转化率为40.7％。
(17)CGMCC No.18479菌株在温度32度，起始pH3.0，葡萄糖浓度为300克/升条件下发酵合成木糖醇的试验。
将重组酵母CGMCC No.18479菌株接种在含500毫升发酵培养基的2L三角瓶中(底部带凸起的棱，增加搅拌效果)，起始菌体密度(OD600)为0.8，发酵培养基成分为：葡萄糖300克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，柠檬酸铵3克/升，氯化锰0.02克/升，氯化铜0.01克/升，硫酸镁0.2克/升，用柠檬酸调起始pH3.0，在32℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖含量与木糖醇含量。至115小时时葡萄糖消耗完毕，测定木糖醇含量为142克/升，转化率为47.3％。
(18)CGMCC No.18479菌株在温度33度，葡萄糖浓度为250克/升条件下发酵合成木糖醇的试验。
将重组酵母CGMCC No.18479菌株接种在含500毫升发酵培养基的2L三角瓶中(底部带凸起的棱，增加搅拌效果)，起始菌体密度(OD600)为0.8，发酵培养基成分为：葡萄糖250克/升，酵母浸膏10克/升，玉米浆干粉5克/升，柠檬酸铵3克/升，氯化锰0.02克/升，氯化铜0.01克/升，硫酸镁0.2克/升，起始pH5.5，在33℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖含量与木糖醇含量。至108小时时葡萄糖消耗完毕，测定木糖醇含量为121克/升，转化率为48.4％。
(19)CGMCC No.18479菌株在温度30度，起始pH7.0，葡萄糖浓度为300克/升条件下发酵合成木糖醇的试验。
将重组酵母CGMCC No.18479菌株接种在含500毫升发酵培养基的2L三角瓶中(底部带凸起的棱，增加搅拌效果)，起始菌体密度(OD600)为0.8，发酵培养基成分为：葡萄糖300克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，柠檬酸铵3克/升，氯化锰0.02克/升，氯化铜0.01克/升，硫酸镁0.2克/升，用氢氧化钠调起始pH7.0，在30℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖含量与木糖醇含量。至112小时时葡萄糖消耗完毕，测定木糖醇含量为132克/升，转化率为44％。
(20)CGMCC No.18479菌株在温度30度，果糖浓度为100克/升条件下发酵合成木糖醇的试验。
将重组酵母CGMCC No.18479菌株接种在含500毫升发酵培养基的2L三角瓶中(底部带凸起的棱，增加搅拌效果)，起始菌体密度(OD600)为0.8，发酵培养基成分为：果糖100克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，柠檬酸铵3克/升，氯化锰0.02克/升，氯化铜0.01克/升，硫酸镁0.2克/升，起始pH5.5，在30℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定果糖含量与木糖醇含量。至120小时时果糖仍未消耗完毕，测定木糖醇含量为13克/升，转化率为13％。
(21)CGMCC No.18479菌株在温度30度，葡萄糖浓度为200克/升，果糖浓度为100克/升条件下发酵合成木糖醇的试验。
将重组酵母CGMCC No.18479菌株接种在含500毫升发酵培养基的2L三角瓶中(底部带凸起的棱，增加搅拌效果)，起始菌体密度(OD600)为0.8，发酵培养基成分为：葡萄糖浓度为200克/升，果糖浓度为100克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，柠檬酸铵3克/升，氯化锰0.02克/升，氯化铜0.01克/升，硫酸镁0.2克/升，起始pH6.5，在30℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖、果糖与木糖醇含量。至125小时时葡萄糖与果糖均消耗完毕，测定木糖醇含量为126.6克/升，300克/升葡萄糖与果糖的混合碳源的转化率为42.2％。
(22)CGMCC No.18479菌株在温度30度，甘油浓度为100克/升条件下发酵合成木糖醇的试验。
将重组酵母CGMCC No.18479菌株接种在含50毫升发酵培养基的250毫升的三角瓶中(底部带凸起的棱，增加搅拌效果)，起始菌体密度(OD600)为0.8，发酵培养基成分为：甘油100克/升，酵母粉5克/升，蛋白胨3克/升，柠檬酸铵2克/升，氯化锰0.02克/升，氯化铜0.01克/升，硫酸镁0.2克/升，起始pH5.5，在30℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定甘油含量与木糖醇含量。至130小时时甘油仍未消耗完毕，木糖醇含量4.5克/升，原因可能是转酮酶基因被弱表达下调，利用甘油效率变慢。另外，转酮酶基因被完全敲除的菌株ery959ΔTKL12由甘油不能合成木糖醇。由于缺乏转酮，由甘油不能合成5-磷酸木酮糖，而5-磷酸木酮糖是木糖醇的前体，从而没有木糖醇的合成。
(23)以淀粉为原料，CGMCC No.18479菌株发酵合成木糖醇的试验。
100克淀粉(来自玉米)加入350毫升冷水中，边加边搅拌，直至变为淀粉乳，得415毫升淀粉乳(淀粉质量体积百分比24％，即240克/升)。煮沸，加入0.2克耐高温α-淀粉酶，搅拌直到淀粉液化变为清澈透明。降温至60度加入0.2克中温β-淀粉酶以及0.1克普鲁兰酶糖化，保温5小时后用于发酵原料，加入酵母粉3.5克，玉米浆干粉2克，柠檬酸铵1.5克，硫酸镁0.1克，108℃灭菌30分钟，冷却。将重组酵母CGMCC 18479菌株接种在此培养基中，起始菌体密度(OD600)为0.8，起始pH5.5，在30℃振荡发酵，转速每分钟250转(rpm)。定时取样测定葡萄糖与木糖醇含量。至106小时时发酵培养基中葡萄糖消耗完毕，测定木糖醇含量为86克/升，折合由淀粉合成木糖醇的转化率为35.8％。
上述各发酵合成木糖醇的实施方案中，发酵过程要定时补充蒸发的水分至发酵起始的重量。发酵起始时记下含发酵液的发酵瓶的重量，每次取样时再记下重量，用无菌水补充水至发酵起始的重量。每次取样量为0.2毫升，稀释十倍后用于HPLC液相检测碳源原料(如葡萄糖、甘油、果糖等)与木糖醇的含量。分析柱为Shodex的SP0810糖柱，示差检测器，纯水为流动相，流速为1ml/min，柱温70度。
(24)CGMCC No.18479菌株在发酵罐中发酵合成木糖醇的试验。
将重组酵母CGMCC No.18479菌株接种在含3500毫升发酵培养基的5L发酵罐中，起始菌体密度(OD600)为0.8，发酵培养基成分为：葡萄糖300克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，柠檬酸铵3克/升，氯化锰0.01克/升，氯化铜0.01克/升，硫酸镁0.1克/升，氯化锌0.02克/升，起始pH6.5，在30℃发酵，搅拌转速起始每分钟300转(rpm)，待菌体长到OD600超过3.0时提高至450rpm，待菌体长到OD600超过10.0时提高至550rpm，并补充氧气。定时取样测定葡萄糖含量与木糖醇含量。发酵过程中补充无菌水以补偿蒸发的水分，至110小时时葡萄糖消耗完毕，测定木糖醇含量为152克/升，转化率为50.7％。
上述各步骤中，所述的发酵培养基均经过灭菌处理，冷却至室温后再接种酵母菌种。
(25)从发酵液中纯化木糖醇的试验。
发酵结束后，发酵液装入500毫升离心管中，在6000g条件下离心20分钟获得澄清的含木糖醇的上清。沉淀酵母细胞再用200毫升纯净水悬浮洗涤以使胞内的木糖醇释放出来，离心得上清。将发酵上清与洗涤细胞的溶液合并，转入旋转蒸发瓶中蒸发浓缩，期间测定折光，当折光达到68时停止蒸发。将浓缩液转入球形烧瓶中，置于梯度冷却机中用磁力搅拌棒缓慢搅拌，每分钟50转。当温度降低到22℃时开始出现细小颗粒状结晶，随着温度的逐渐下降，结晶量逐渐增加，此时增加搅拌速度至每分钟80转。结晶量不再增加时，停止搅拌，离心分离晶体，得到木糖醇粗制品。重新溶解至折光45，依次进行离子交换、脱色，去除离子与色素，再进行浓缩、结晶、离心与干燥的步骤，得到木糖醇精制品。将从发酵液中分离纯化的木糖醇与标准木糖醇分别进行GC-Mass测定，图11为本发明的菌株CGMCC No.18479由葡萄糖发酵合成的木糖醇与标准木糖醇的离子碎片峰以及二者的对比，发现二者的离子碎片完全一致，说明采用本发明描述的方法构建的菌株CGMCC No.18479由葡萄糖发酵合成的为木糖醇。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母的构建方法及其菌株
<130> KAG38307
<160> 79
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tagtgcagat cttggtggta gtagc 25
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgcttcggt atgataggaa gagc 24
<210> 3
<211> 1402
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 3
tagtgcagat cttggtggta gtagcaaata ttcaaatgag aactttgaag actgaagtgg 60
ggaaaggttc cgtgtgaaca gcagttggac acgggtaagt cgatcctaag gggtggcata 120
actgtcgcgt acggcccgat aagggccttc tccaaaaggg aagccggttg aaattccggc 180
acttggatgt ggattctcca cggcaactta actgaatgtg gggacggtgg cacaagtctt 240
ggaaggagtt atcttttctt tttaacggag tcaacaccct ggaattagtt tgtctagaga 300
tagggtatcg ttcaggaaga ggggggcagc tttgtcccct ccgatgcact tgtgacgccc 360
cttgaaaacc cgcaggaagg aatagttttc acgccaagtc gcactgataa ccgcagcagg 420
tctccaaggt gaacagcctc tagttgatag aataatgtag ataagggaag tcggcaaaat 480
agatccgtaa cttcgggata aggattggct ctgggggttg gtggatggaa gcgtgggaga 540
ccccaaggga ctggcagctg ggcaactggc agccggaccc gcggcagaca ctgcgtcgct 600
ccgtccacat catcaaccgc cccagaactg gtacggacaa ggggaatctg actgtctaat 660
taaaacatag ctttgcgatg gttctaaaac aatgttgacg caaagtgatt tctgcccagt 720
gctctgaatg tcaaagtgaa gaaattcaac caagcgcgcg ggtaaacggc gggagtaact 780
atgctctctt aaggtagcca aatgcctcct catctaatta gtgacgcgca tgaatggatt 840
aacgagattc ccactgtccc tatctactat gtagcgaaac cacagccaag ggaacgggct 900
tggcagaatc agcggggaaa gaagaccctg ttgagcttga ctctagtttg acattgtgaa 960
gagacatagg gggtgtagaa taagtgggag cttcggcgcc ggtgaaatac cactaccctt 1020
atcgtttctt tacttattta gaaagtggaa gtggtttaac aaccattttc tagcattcct 1080
ttccaggctg aagacattgt caggtgggga gtttggctgg ggcggcacat ctgttaaaag 1140
ataacgcaga tgtcctaagg gggactcaat gagaccagaa atctcatgta gaacaaaagg 1200
gtaaaagtcc ccttgattat gattttcagt gtgaatacaa accatgaaag tgtggcctat 1260
cgatccttta gttgttcgga gtttgaacct agaggtgcca gaaaagttac cacagggata 1320
actggcttgt ggcagtcaag cgttcatagc gacatagctt tttgatcctt cgatgtcggc 1380
tcttcctatc ataacgaagc ag 1402
<210> 4
<211> 1092
<212> DNA
<213> 树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipitis)
<400> 4
atgactgcta acccatcttt ggttttgaac aagatcgacg acatctcttt cgaaacttac 60
gacgctccag aaatctctga accaactgac gttttggttc aagttaagaa gactggtatc 120
tgtggttctg acatccactt ctacgctcac ggtagaatcg gtaacttcgt tttgactaag 180
ccaatggttt tgggtcacga atctgctggt actgttgttc aagttggtaa gggtgttact 240
tctttgaagg ttggtgacaa cgttgctatc gaaccaggta tcccatctag attctctgac 300
gaatacaagt ctggtcacta caacttgtgt ccacacatgg ctttcgctgc tactccaaac 360
tctaaggaag gtgaaccaaa cccaccaggt actttgtgta agtacttcaa gtctccagaa 420
gacttcttgg ttaagttgcc agaccacgtt tctttggaat tgggtgcttt ggttgaacca 480
ttgtctgttg gtgttcacgc ttctaagttg ggttctgttg ctttcggtga ctacgttgct 540
gttttcggtg ctggtccagt tggtttgttg gctgctgctg ttgctaagac tttcggtgct 600
aagggtgtta tcgttgttga catcttcgac aacaagttga agatggctaa ggacatcggt 660
gctgctactc acactttcaa ctctaagact ggtggttctg aagaattgat caaggctttc 720
ggtggtaacg ttccaaacgt tgttttggaa tgtactggtg ctgaaccatg tatcaagttg 780
ggtgttgacg ctatcgctcc aggtggtaga ttcgttcaag ttggtaacgc tgctggtcca 840
gtttctttcc caatcactgt tttcgctatg aaggaattga ctttgttcgg ttctttcaga 900
tacggtttca acgactacaa gactgctgtt ggtatcttcg acactaacta ccaaaacggt 960
agagaaaacg ctccaatcga cttcgaacaa ttgatcactc acagatacaa gttcaaggac 1020
gctatcgaag cttacgactt ggttagagct ggtaagggtg ctgttaagtg tttgatcgac 1080
ggtccagaat aa 1092
<210> 5
<211> 1062
<212> DNA
<213> 汉斯德巴氏酵母菌(Debaryomyces hansenii)
<400> 5
atggctacta agcaaaacat cggtgttttc actaacccaa agcacgactt gtacgtttct 60
gaaatcgaaa ctccagacgt tggtgacttg tctgaagaag aagttttggt tcacgttaga 120
tctactggta tctgtggttc tgacgttcac ttccaaaagc acggttgtat cggtccaact 180
atggttgttg aagacgaaca catcttgggt cacgaatctg ctggtgaagt tttggctgtt 240
ggtaacaagg ttaagatctt gaaggttggt gacaaggttg ctttggaacc aggtgttcca 300
tgtcacactt gtaagccatg tttgactggt aagtacaacg gttgtgaaaa cgttgaattc 360
tactctactc caccagttca cggtttcttg agaagataca tcaagcaccc agctgctttc 420
tgtcacaaga tcaacttgtt gacttacgct caaggtgctt tgttggaacc attgtctgtt 480
gttttctgtg gtatcagaca catcaacttg atcttgggtc aatctgtttt ggttttcggt 540
gctggtccaa tcggtttcgc tactgctaag gctgctgaag ctgctggtgc ttacccaatc 600
atggttactg acatcgaaca atctaagttg gacttcatca agaaggaaat cccatctgct 660
atcactgctt tggttaacgg ttctttgaag gaaaacgttg ctaaggttac tgacgacggt 720
atcaacaact tcgacgttgc tatcgaatgt actggtgttg aacaatcttt ggaattggct 780
actcacgctt tggacttcgg tgctaagttg cacatcatcg gtgttggtaa ggaccaccaa 840
aagttcccat tcatgttgtt gtctgttaag gaaatcaaca tcactttcca atacagatac 900
gctaacactt ggccaactat catcaagttg gttgaagctg gtatcatcaa gttggacaac 960
ttggttactc acagattcaa gttggaagac gctgttgacg ctttcaagtt ggctggtaac 1020
ccaaagtctg gtgctatgaa gatcttgatc gaagactctt aa 1062
<210> 6
<211> 1038
<212> DNA
<213> 农杆菌(Agrobacterium sp.)
<400> 6
atgaaggctt tggttttgga agaaaagggt aagttgtctt tgagagaatt cgacatccca 60
ggtaagttgg gtccaaagga cgttagaatc agaactcaca ctgttggtat ctgtggttct 120
gacgttcact actacactca cggtaagatc ggtcacttcg ttgttcacgc tccaatggtt 180
ttgggtcacg aagcttctgg tactgttatc gaaactggtg ctgaagttgc tcacttgaag 240
ccaggtgaca gagtttgtat ggaaccaggt atcccagacc caacttctag agcttctaag 300
ttgggtatct acaacgttga cccagctgtt tctttctggg ctactccacc aatccacggt 360
tgtttgactc cagaagttat ccacccagct gctttcactt acaagttgcc agacaacgtt 420
tctttcgctg aaggtgctat ggttgaacca ttcgctatcg gtatgcaagc tgctttgaga 480
gctagaatcc aaccaggtga cgttgctatc gttactggtg ctggtccaat cggtatgatg 540
gttgctttgg ctgctttggc tggtggttgt gctaaggtta tcgttgctga cttggctcaa 600
ccaaagttgg acatcatcgc tgcttacgac ggtatcgaaa ctgttaacat cagagaaaga 660
gacttgtctc aagctgttgc tgacgctact gacggttggg gttgtgacgt tgttttcgaa 720
tgttctggtg ctgctccagc tgttttgggt atggctaagt tggctagacc aggtggtgct 780
atcgttttgg ttggtatgcc agttgaccca gttccagttg acatcgttgg tttgcaagct 840
aaggaattga gagttgaaac tgttttcaga tacgctaacg tttacgacag agctgttgct 900
ttgatcgctt ctggtaaggt tgacttgaag ccattgatct ctgctactat cccattcgaa 960
gactctatcg ctggtttcga cagagctgtt gaagctagag aaactgacgt taagttgcaa 1020
atcttgatgc cacaataa 1038
<210> 7
<211> 1044
<212> DNA
<213> 氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)
<400> 7
atggctcaag ctttggtttt ggaaagaaag ggtgaattgt ctttgagaga aatcgacgtt 60
ccagacgttt tgggtccaga cgacgttaga gttgctatcc acactgttgg tatctgtggt 120
tctgacgttc actactacac tcacggtaga atcggtcact tcatcgttga cgctccaatg 180
gttttgggtc acgaagcttc tggtactgtt actgaagttg gttctagagt tacttctttg 240
caagttggtg acagagtttg tatggaacca ggtatcccag acccaacttc tagagcttct 300
aagatgggta tctacaacgt tgacccagct gttactttct gggctactcc accaatccac 360
ggttgtttga ctccatctgt tgttcaccca gctgctttca cttacagatt gccagaaaac 420
gtttctttcg ctgaaggtgc tatggttgaa ccattcgcta tcggtgttca agctgctgtt 480
aaggctgctt tgaagccagg tgacacttgt ttggttactg gttgtggtcc aatcggtttg 540
atgactgctt tggctgcttt ggcttctggt gctggtactg ttttcatctc tgacatcgct 600
gctccaaagt tgcaaatcgc tggtcaatac aagggtttgg ttccattgaa cgctaaggaa 660
gttagaccaa gagacgctgt ttctcaacaa tgtggtgctg actggggtgt tgacgttgtt 720
ttcgaagctt ctggtttccc aggtgcttac gacgacgttt tctcttgtgt tagaccaggt 780
ggtactgttg ttttcgttgg tatgccagtt gaaaaggttc cattcgactt ggttgctgct 840
caagctaagg aaatcagaat ggaaactgtt ttcagatacg ctaacgttta cgaaagagct 900
atcgctttga tctcttctgg taaggttgac ttgaagccat tgatctctga aactttccca 960
ttcgctgaag gtatcgctgc tttcgaaaga gctgcttctg ctagaccaac tgacgttaag 1020
ttgcaaatca agttgccagg ttaa 1044
<210> 8
<211> 789
<212> DNA
<213> 氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)
<400> 8
atgtctaaga agttcaacgg taaggtttgt ttggttactg gtgctggtgg taacatcggt 60
ttggctactg ctttgagatt ggctgaagaa ggtactgcta tcgctttgtt ggacatgaac 120
agagaagctt tggaaaaggc tgaagcttct gttagagaaa agggtgttga agctagatct 180
tacgtttgtg acgttacttc tgaagaagct gttatcggta ctgttgactc tgttgttaga 240
gacttcggta agatcgactt cttgttcaac aacgctggtt accaaggtgc tttcgctcca 300
gttcaagact acccatctga cgacttcgct agagttttga ctatcaacgt tactggtgct 360
ttccacgttt tgaaggctgt ttctagacaa atgatcactc aaaactacgg tagaatcgtt 420
aacactgctt ctatggctgg tgttaagggt ccaccaaaca tggctgctta cggtgcttct 480
aagggtgcta tcatcgcttt gactgaaact gctgctttgg acttggctcc atacaacatc 540
agagttaacg ctatctctcc aggttacatg ggtccaggtt tcatgtggga aagacaagtt 600
gaattgcaag ctaaggttgg ttctcaatac ttctctactg acccaaaggt tgttgctcaa 660
caaatgatcg gttctgttcc aatgagaaga tacggtgaca tcaacgaaat cccaggtgtt 720
gttgctttct tgttgggtga cgactcttct ttcatgactg gtgttaactt gccaatcgct 780
ggtggttaa 789
<210> 9
<211> 1095
<212> DNA
<213> 麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)
<400> 9
atgactccaa acccatcttt ggttttgaac aagatcgacg acatcacttt cgaaaactac 60
gacgctccag aaatcacttc tccaagagac gttatcgttg aagttaagaa gactggtatc 120
tgtggttctg acatccacta ctacgctcac ggttctatcg gtccattcgt tttgagacaa 180
ccaatggttt tgggtcacga atctgctggt gttgttactg ctgttggtaa ggacgttact 240
aacttgaagg ttggtgacag agttgctatc gaaccaggtg ttccatctag attctctgac 300
gaaactaagt ctggtcacta ccacttgtgt ccacacatgg ctttcgctgc tactccacca 360
gttaacccag acgaaccaaa cccaccaggt actttgtgta agtactacaa ggctccagtt 420
gacttcttgt tcaagttgcc agaccacgtt tctttggaat tgggtgctat ggttgaacca 480
ttgactgttg gtgttcacgg ttgtaagttg gctaacttga agttcggtga agacgttgtt 540
gttttcggtg ctggtccagt tggtttgttg actgctgctg ttgctaagac tatcggtgct 600
aagagagtta tggttgttga catcttcgac aacaagttgg aaatggctaa ggaaatgggt 660
gctgctactc acgttttcaa ctctaagact gacggtgact acgaagcttt gatcaagaag 720
ttcgacggtg ttcaaccatc tgttgttttg gaatgttctg gtgctcaacc atgtatctac 780
atgggtgtta agatcttgaa ggctggtggt agattcgttc aaatcggtaa cgctggtggt 840
gacgttaagt tcccaatctc tgacttctct actagagaat tgtctttgta cggttctttc 900
agatacggtt acggtgacta ccaaacttct atcgacatct tggacaagaa ctacttgaac 960
ggtaaggaaa aggctccaat caacttcgaa ttgttgatca ctcacagatt caagttcaag 1020
gacgctatca aggcttacga cttggttaga gctggtaacg gtgctgttaa gtgtttgatc 1080
gacggtccag aataa 1095
<210> 10
<211> 1089
<212> DNA
<213> 里氏木霉(Trichoderma reesei)
<400> 10
atggctactc aaactatcaa caaggacgct atctctactt ctccatcttc ttctacttct 60
ccagctactt aaccattgag atctggtaga tctagaccat ctagaactcc aactacttct 120
tcttctccat ctactactag agcttctgct gctccaactt gtactactgg ttgtactgct 180
ccatctggta cttcttcttc tagaactaga tggtgttggg ctacttctag accagctcca 240
tcttctagat ctgctagacc atctagagct tcttctccag ctactgcttc tccatcttct 300
ccagctacta gagctggtgg tgctccatct gctgctccag ctaacactac ttgtgctaga 360
acttggtctt ctccaccaag aagaagaact actgctccat aaagagcttg tggtagaaga 420
ccaccaactt ctgctacttc ttgtagaact gcttgtagat gtagaagagc tagataatct 480
tctagatggc catggccatc tactttgtct tctagaccag cttcttctag agcttctcca 540
tcttcttctt gggctccagc tccatctgct tgttgtgctc caccatggcc aagaagaact 600
gctccaccac cattgtctgc ttctacttct tgttctccat cttctacttt gagagctgct 660
tctgctagaa gaactagaac ttctagatct gcttctagat tgagaactac tcaaagacca 720
tctagatctt ggagagcttg tccagctgct ccaacttctt aattgactcc agctgctaga 780
tctagaagat ctagaagagc tttcacttct tctgcttggg ctgctagaac ttctagagct 840
gcttgggcta gagctacttc tagatctcca tcttggccat gtgcttctag aagataaaga 900
tctggtgcta gatctgctac tgctccagct actacttctt ggagatcttc ttggtctggt 960
agaggtggtt ggacttctag atcttaattg agagctccat ctgcttcttc tagaagaaga 1020
agaagatcta agagatcttc tttgggtaga ccatctagat tctaattgcc aggtccaact 1080
agaagatgt 1089
<210> 11
<211> 1152
<212> DNA
<213> 粗糙链孢菌(Neurospora crassa)
<400> 11
atggctactg acggtaagtc taacttgtct ttcgttttga acaagccatt ggacgtttgt 60
ttccaagaca agccagttcc aaagatcaac tctccacacg acgttttggt tgctgttaac 120
tacactggta tctgtggttc tgacgttcac tactggttgc acggtgctat cggtcacttc 180
gttgttaagg acccaatggt tttgggtcac gaatctgctg gtactatcgt tgctgttggt 240
gacgctgtta agactttgtc tgttggtgac agagttgctt tggaaccagg ttacccatgt 300
agaagatgtg ttcactgttt gtctggtcac tacaacttgt gtccagaaat gagattcgct 360
gctactccac catacgacgg tactttgact ggtttctgga ctgctccagc tgacttctgt 420
tacaagttgc cagaaactgt ttctttgcaa gaaggtgctt tgatcgaacc attggctgtt 480
gctgttcaca tcactaagca agctaagatc caaccaggtc aaactgttgt tgttatgggt 540
gctggtccag ttggtttgtt gtgtgctgct gttgctaagg cttacggtgc ttctaaggtt 600
gtttctgttg acatcgttcc atctaagttg gaattcgcta agtctttcgc tgctactcac 660
acttacttgt ctcaaagagt ttctccagaa gaaaacgcta gaaacatcat cgctgctgct 720
gacttgggtg aaggtgctga cgctgttatc gacgcttctg gtgctgaacc atctatccaa 780
gctgctttgc acgttgttag acaaggtggt cactacgttc aaggtggtat gggtaaggac 840
aacatcactt tcccaatcat ggctttgtgt atcaaggaag ttactgcttc tggttctttc 900
agatacggtt ctggtgacta cagattggct atccaattgg ttgaacaagg taaggttgac 960
gttaagaagt tggttaacgg tgttgttcca ttcaagaacg ctgaagaagc tttcaagaag 1020
gttaaggaag gtgaagttat caagatcttg atcgctggtc caaacgaaga cgttgaaggt 1080
tctttggaca ctactgttga cgaaaagaag ttgaacgaag ctaaggcttg tggtggttct 1140
ggttgttgtt aa 1152
<210> 12
<211> 1071
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 12
atgactgact tgactactca agaagctatc gttttggaaa gaccaggtaa gatcactttg 60
actaacgttt ctatcccaaa gatctctgac ccaaacgaag ttatcatcca aatcaaggct 120
actggtatct gtggttctga catccactac tacactcacg gtagaatcgc taactacgtt 180
gttgaatctc caatggtttt gggtcacgaa tcttctggta tcgttgcttt gatcggtgaa 240
aacgttaaga ctttgaaggt tggtgacaga gttgctttgg aaccaggtat cccagacaga 300
ttctctccag aaatgaagga aggtagatac aacttggacc caaacttgaa gttcgctgct 360
actccaccat tcgacggtac tttgactaag tactacaaga ctatgaagga cttcgtttac 420
aagttgccag acgacgtttc tttcgaagaa ggtgctttga tcgaaccatt gtctgttgct 480
atccacgcta acaagttggc taagatcaag ttcggtgcta gatgtgttgt tttcggtgct 540
ggtccaatcg gtttgttggc tggtaaggtt gcttctgttt tcggtgctgc tgacgttgtt 600
ttcgttgact tgttggaaaa caagttggaa actgctagac aattcggtgc tactcacatc 660
gttaactctg gtgacttgcc acacggtgtt actgttgact ctgttatcaa gaaggctatc 720
ggtaagaagg gtgctgacgt tgttttcgaa tgttctggtg ctgaaccatg tgttagagct 780
ggtatcgaag tttgtaaggc tggtggtact atcgttcaag ttggtatggg tcaagaagaa 840
atccaattcc caatctctat catcccaact aaggaattga ctttccaagg ttgtttcaga 900
tactgtcaag gtgactactc tgactctatc gaattggttt cttctagaaa gttgtctttg 960
aagccattca tcactcacag atactctttc aaggacgctg ttgaagcttt cgaagaaact 1020
tctcaccacc cattgaacaa catcaagact atcatcgaag gtccagaata a 1071
<210> 13
<211> 1074
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 13
atgtcttcta acccatcttt cgttttgaga aagccattgg acttggtttt cgaagacaga 60
ccagacccaa agatccaaga cccacactct gttaaggttg ctgttaagaa gactggtgtt 120
tgtggttctg acgttcacta ctacttgcac ggtggtatcg gtgacttcat cgttaaggct 180
ccaatggttt tgggtcacga atctgctggt gaagttgttg aagttggtcc agaagttaag 240
gacttgaagg ttggtgacag agttgctttg gaaccaggtg ttccatctag attgtctcaa 300
gaatacaagg aaggtagata caacttgtgt ccatgtatgg ttttcgctgc tactccacca 360
tacgacggta ctttgtgtag acactacatc atcccagaag acttctgtgt taagttgcca 420
gaccacgttt ctttggaaga aggtgctttg gttgaaccat tgtctgttgc tgttcactgt 480
aacaagttgg ctaagactac tgctcaagac gttgttatcg ttttcggtgc tggtccagtt 540
ggtttgttgg ctgttggtgt tgctaacgct ttcggttctt ctactatcgt ttgtgttgac 600
ttggttccag aaaagttgga attggctaag aagttcggtg ctactcacac tttcgttcca 660
actaagggtg actctccaaa cgaatctgct gacaagatca gagctttgat caagggtgct 720
ggtttgtctg actctccaaa cgttgctttg gaatgtactg gtgctgaacc atctatccaa 780
actgctgttt ctgttttggc tacttctggt agattggttc aagttggtat gggtaaggac 840
gacgttaact tcccaatcac taagtgtatc gttaaggaaa tcactgtttt gggttctttc 900
agatactgtc acggtgacta cccattggct gttcaattgg ttgcttctgg taagatcgac 960
gttaagaagt tggttactaa cagattcact ttcaaggaag ctgaacaagc ttacaagact 1020
gctgctgaag gtaaggctat caagatcatc atcgacggtc cagaagaaga ataa 1074
<210> 14
<211> 1053
<212> DNA
<213> 艰难梭菌(Clostridioides difficile)
<400> 14
atgaaggctg ctgttttgca cggtactaac gacatgagat tcgaagacat cgaaatcaag 60
ccatgtgaat ctgacgaagt taagatcaag gttatggctg ctggtatctg tggttctgac 120
ccaccaagag ttttgaagca ctggaagtac ccagttccag ctatcccagg tcacgaattc 180
tctggtgtta tcgctgaagt tggtaaggac gttaagaacg ttaaggttgg tgacagagtt 240
gttgctatcc cattcatccc atgtaacgaa tgtgaatact gtaagagagg tttgttctct 300
ttgtgtgacg accacggtat gttgggtgct aagtctttcg gtgctttcgc tgaatacgtt 360
aacatcaagg ctactaacgt tttgccaatc ggtgacatgg acttcgaaga cgctgctatg 420
atcgaaccat tggctgttgc tatgcacggt gttttgaaca tcggtgttca agttggtgac 480
actgttgctg ttatgggttc tggtactatg ggtcaattgg ttatccaagg tttgaagatc 540
gctggtgctg gtactatcat cgctgttgac atctctgaca acaagttgag agaatctaag 600
gaattgggtg ctgacatcat catcaacgct aaggacatca acccagttga aaagatcaag 660
gaattgactg gtggtaaggg tgttgacatc gctttggaat gtgctggttc taagatcact 720
caagaacaat gtttgttgat cactaagaag aagtctaaga tcggtttctt gggtatcgct 780
tactctgaca tcactttgtc tgaagaagct ttcgaaaaca tcttcagaaa ggaattggaa 840
ttgaagggtt tctggaactc ttactctgct ccattcccag gtcaagaatg gactaagggt 900
atcaacttgg ttaacgaagg taagatcaag ttgaaggaaa tggtttctca cagattctct 960
ttggaagaca cttacaaggc tttcgaaatg atcagagaca gaaaggaaga attcaacaag 1020
atcttgatct tgccacaagg tgttgaaaag taa 1053
<210> 15
<211> 1053
<212> DNA
<213> 艰难梭菌(Clostridioides difficile)
<400> 15
atgaagtctg ttagattcta cggtatcaga gacactagag ttgaagacgt tgacgttcca 60
aagatcttgg aaaaggacga cgttatcatc aaggttaagg ttgctggtat ctgtggttct 120
gacatctcta agtactctaa gactggtcca cacatggttg gtgaaatctt gggtcacgaa 180
ttctctggtg aagttgctca agttggtaag gaagttagat ctttcaagat cggtgacaga 240
gttgctgttt gtccagctat gccatgtttc gaatgtgacg aatgtaagaa gggtttgtac 300
tctagatgta acaacgttgc tatcatcggt aacaaggaat tgggtggttg tttcgctgaa 360
tacactaagg ttaaggaaag aaacttgatc aagatcccag acgaaatctc ttacgaaact 420
gctgctgctt tggaaccagt ttgtatcgct ggtcacggtt tgttcagatc tgaagctaag 480
gttggtgaca ctgttgttgt tttgggtact ggtccaatcg gtttgttctc tatccaatgg 540
gctaagatct tcggttctac taagatcatc gctgttgacg ttttcgacga aaagttggac 600
ttggctaagg aattgggtgc tgacatctgt atcaacgcta aggaaaagaa catcgttgaa 660
gaaatcaaga gattgactga cggtgacggt gctgacatcg ttatcgaatc tgctggtact 720
ccattgactt gtggtcaagt tttgttgttg gctaagaagg gtggtactgt tttgtacgct 780
ggtgttccat acggtgacgt tgctttgact agagaacaat tcgaaaagat cgttagatct 840
gaattgactg ttaagggtac ttggttcggt aactctttcc cattcccagg taaggaatgg 900
tctgctggtt tgtaccacat gcaaaagggt gacatgaacg ttgaaaagtt ggttactcac 960
agaatcaact tggaagaagc tccagcttac ttcgaaaagg tttacaagag agacatcttc 1020
ttcggtaaga tcatgatcaa catcgacaac taa 1053
<210> 16
<211> 1059
<212> DNA
<213> 艰难梭菌(Clostridioides difficile)
<400> 16
atgggtaaca agatgagagc ttctgttttg tacaacgttg gtgacgttag atacgaaatg 60
gttgacatcc cagaaatcac tgacactcaa gttttggtta acgttaagta cgttggtatc 120
tgtggttctg acttgccaag atctatggtt tctggtttgt ctggtaacac taagtaccca 180
ttgatcttgg gtcacgaatt ctctggtgaa gttgttaaga tcggtgaaaa ggttaagcac 240
atcaacgttg gtgacagagt tgctgttgct ccattggttc catgtggtaa gtgtgactac 300
tgtaacgaag gtaacttcgg tttgtgtgac gactacaaca tcatcggtac tagagttaac 360
ggtgctttcg ctgaatacgt tagagttcca gaagaacaca tcttgaagtt gccagacact 420
ttggactacg aaactgctgc tggtatcgaa ccagctacta tcgcttacca cggtatctct 480
aagtctaaca tcagagttgg tgactctgtt gttgttttgg gttgtggtcc aatcggtcaa 540
ttcgttatcc aatgggctaa ggttttcggt gcttctaaga tcatcgctgt tgacatcttc 600
gacgaaaagt tggaattgtc taagttgttg ggtgctaact acatcttgaa ctctaaggaa 660
gttaacgtta tcaaggaaat caagaagatc actaacggtg gtgctgacgt tgttatcgaa 720
actgctggtt ctagattcac tcaagaacaa tctttgttcg ttgctaagaa gagaggtaac 780
atcgttttcg ttggtatctc tcacactgaa ttgccattgt ctgctgacgc tactgaatgt 840
atcttgagag gtgaattgac tttgaagggt tcttggaact cttacacttc tccataccca 900
ggtagagctt ggactgctac tttggacttc atggaaaagg gtgacatcat cttcaagcca 960
atgatctctg acaagatcgg tttgaacgaa gttggtgact tcttgtctaa gatgtctaag 1020
agagaaatca acttcaacaa gatcttggtt gaaatctaa 1059
<210> 17
<211> 1050
<212> DNA
<213> 鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)
<400> 17
atgaaggctt ctatgttgga agacttgaac aagttctctg ttaaggaaat cgacatccca 60
tctccaaaga aggacgaagt tgttgttaag gttatggctg ctggtacttg tggttctgac 120
tctcacaaga tgatctctgg ttggaagtac ggttacccag ctgttatggg tcacgaattc 180
tctggtatcg ttactcaatt gggtgaaaac gtttctaacg tttctgttgg tcaacacgtt 240
gctgttgctc cattcatccc atgtttcaag tgtcactact gtcaaatcgg tttgttccaa 300
atgtgtgaaa actactctat gttgggtcaa caaaagttcg gtggtttcga acaatacgtt 360
tctgttccag ctagaaacgt tttggacatc ggtaagatgt ctttcgaaga aggtgctttg 420
atcgaaccaa tggctgttgc tgctcacgct gttatgggta tcaagccaga attgggtgac 480
actgttgctg ttttcggttt gggtactgtt ggtgacttgg ttgttagatt gttgatctct 540
tctggtgcta ctaacgttat cggtatcgac atcgacgacc aaaagttgga aaagggtttg 600
gacgaaggtt gtactcacgt tatcaactct gctaaggaat ctttggaaga aaagatcatg 660
gaatacactg acggtttggg tgttgacatc tctatggaat gtgctggttc taagatcact 720
gaagaacaaa ctttgttggt tactaagaga agaggtaagg ttggtttcgt tggtatcgct 780
tactctgacg ttttgttgca ccaaaaggct ttcgaaaaca tcttcagaca cgaattgact 840
gttactggtt tctggaactc ttactctgct ccattcccag gtagagaatg gactaactct 900
atccaattgg ttaacagagg tagaatcaag atcaaggact tgatcactca cagattcgaa 960
ttggaagaca tgcaaaaggc tttcaacatg atcactacta gatctgaatc tttcaacaag 1020
gttatgttct tcccaaacgg tatcaactaa 1050
<210> 18
<211> 753
<212> DNA
<213> 副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)
<400> 18
atgccagaca actactctac tgactctgtt ttcttgtctt ctggttacga cggtatcgct 60
caatctgact tggttcaacc agacagagct gttgttgctt tgccagaaaa catcccagac 120
gaaatcgcta tcttgactga agtttctact gttggttacc acgcttcttc tcacgttgct 180
gacactttgg ctaagccagg ttgtagagtt gctttgttcg gtgacggtcc agttggttac 240
atggctgctg ctgttttgca ctacatcaga ggtatcgaca aggaccactt gactgttttc 300
ggtgctatcc cagacagatt gaacgaattc gacttcgcta acaaggaatt ggttactgaa 360
tacgacttcg accacgctgg tgaacaattc gacgttatct tcgaagctac tggtggtaac 420
ttctcttctt ctgctatcaa cgaaggtatc aaggttatct ctagaactgg taagttcgtt 480
ttgatgggtg tttctgaaga cttggttcca atcgacacta gagacatctt ggaaaagggt 540
ttgactttct acggtacttc tagatctact actccagact tcgaagctgt tgttaaggct 600
atgtctcaat ctcaagacta ccaagacact ttgagaaagt tgttgccaaa gaacgaaact 660
gttatcaaga acgcttctga cttgaacaag gctttcgaag ctatcgttgc ttctaaggct 720
tggtacaagg ctgttttgaa gttcgaatgg taa 753
<210> 19
<211> 1152
<212> DNA
<213> 干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)
<400> 19
atgatgagag ctatcatctg taacgttaag actgttacta agaacactga agctgacatc 60
atgttgaaga acccagacgt ttctagaaag atcgcttcta agtcttacag attgatcaag 120
ccaggtgaca tcgaagaagt taacttgcaa cacgaattga gaccaggttt ggttgacatc 180
caaccattga tggcttctgt ttgtcacgct gacgacagat acttcgctgg taagagaaga 240
ccagaagctt tggctaagaa gttgccaatg gctttgttgc acgaaggtat cggtactatc 300
aaggaatcta tgtctgacaa gttcaaggtt ggtcaaagag ttgttatcgt tccaaacgtt 360
ccaggttaca tgttgagagg tgaaaagaag actgacactg ttccagacaa ctactctact 420
gactctgttt tcttgtcttc tggttacgac ggtatcgctc aatctgactt ggttcaacca 480
gacagagctg ttgttgcttt gccagaaaac atcccagacg aaatcgctat cttgactgaa 540
gtttctactg ttggttacca cgcttcttct cacgttgctg acgctttggc taagccaggt 600
tgtagagttg ctttgttcgg tgacggtcca gttggttaca tggctgctgc tgttttgcac 660
tacatcagag gtatcgacaa ggaccacttg actgttttcg gtgctatccc agacagattg 720
aacgaattcg acttcgctaa caaggaattg gttactgaat acgacttcga ccacgctggt 780
gaacaattcg acgttatctt cgaagctact ggtggtaact tctcttcttc tgctatcaac 840
gaaggtatca aggttatctc tagaactggt aagttcgttt tgatgggtgt ttctgaagac 900
ttggttccaa tcgacactag agacatcttg gaaaagggtt tgactttcta cggtacttct 960
agatctacta ctccagactt cgaagctgtt gttaaggcta tgtctcaatc tcaaggttac 1020
caagacactt tgagaaagtt gttgccaaag aacgaaactg ttatcaagaa cgcttctgac 1080
ttgaacaagg ctttcgaagc tatcgttgct tctaaggctt ggtacaaggc tgttttgaag 1140
ttcgaatggt aa 1152
<210> 20
<211> 1026
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
<400> 20
atgttgaacc aagtttacag attggttgac ccaagacaat tcgaagttca aactgttgct 60
gaagaaatca ctaacaacga catcatcgtt agaccaagat tcttgtctgt ttgtcacgct 120
gacactagat acttcactgg tcaaagacca caagctactt tgagacaaaa gttgccaatg 180
gctttgatcc acgaaggtgt tggtgaagtt gttaaggacc cacaagacaa gttcaagcca 240
ggtactttgg ttgctatggt tccaaacact ccattcgaaa ctgacccaat catcaaggaa 300
aactacttgc catcttctaa gttcagatct tctggttacg acggtttcat gcaagaatac 360
gtttctttgc acagagacag agctatcgtt gttccagaca acttcgacca ccaaatgtct 420
gctttcatcg aaatggtttc tgttggtgtt cacgctttga ctcaattgga aggtgttatg 480
gacgctgaca gaaaggttat cggtatctgg ggtgacggta acttgggttt catcactgct 540
actttggtta agcaaatctt cccagactct caattgatga tcttcggtag acaccaatct 600
aagttggact acttctcttt cgctgacaag acttacttgg ttgacgacat cccaaacgac 660
ttgaaggttt ctcaagcttt ggaatgtact ggtggtagag gttctgaatc tgctatcgct 720
caaatcatcc aacacatcag accaatgggt actgctatct tgatgggtgt ttctgaagac 780
ccagttggta tcgacactag atctgttttg gctgaaggtt tgactttgag aggtgtttct 840
agatctggta gagctgactt ccaaagagct gttgacatct tgactgactc tccagttact 900
agagaaagat tgcaaaactt ggttggtttc actagaaagg tttctactat ccaagacatc 960
actgacttct tcgaaggtgc tttgactaac tactggggta aggctgttat ggaatgggac 1020
gtttaa 1026
<210> 21
<211> 747
<212> DNA
<213> 马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)
<400> 21
atgccattga tcactgttaa ctacttgttg ttcgacttgg acggtacttt ggtttcttct 60
actgacgctg ctgaccaaac ttggaaggac tactgtgaaa agcacggtgt ttcttacgaa 120
gaattgtcta agactgttca cggtactaga actgctgaaa ctttggctaa gtacttccca 180
aacgttgaca acactgacaa caaggctgtt aaggaattgg aatgttctat cgctaacaac 240
tacaaggaat tggtttcttt ggttccaggt gcttctgact tgttgatctc tttggacaga 300
ccaactggtt ctttgccagg tgaagttttc aagcacagaa agtgggctat cgttacttct 360
ggtactccat gggttgctga cgcttggttc gaccacatct tgaagtctgt tggtaagcca 420
gaagttttga tcactgctaa cgacgttact tctggtaagc cagctccaga cggttacttg 480
ttggctgctc aaagattgaa ggaaaagtgg caagacgaca gaaaggactt gagaactgtt 540
gttttcgaag acgctccagt tggtgttaga gctggtaagg cttctggttc tatcgttgtt 600
gctttgacta ctacttacga caaggaatct ttgttcgaag ctggtgctga ctacgttgtt 660
gaagacttga ctcaagtttg tgttagatct aacactactg cttctactgt tttgatcatc 720
actgacccaa tggaaagaga cgaataa 747
<210> 22
<211> 741
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 22
atggctgaat tctctgctga cttgtgtttg ttcgacttgg acggtactat cgtttctact 60
actgttgctg ctgaaaaggc ttggactaag ttgtgttacg aatacggtgt tgacccatct 120
gaattgttca agcactctca cggtgctaga actcaagaag ttttgagaag attcttccca 180
aagttggacg acactgacaa caagggtgtt ttggctttgg aaaaggacat cgctcactct 240
tacttggaca ctgtttcttt gatcccaggt gctgaaaact tgttgttgtc tttggacgtt 300
gacactgaaa ctcaaaagaa gttgccagaa agaaagtggg ctatcgttac ttctggttct 360
ccatacttgg ctttctcttg gttcgaaact atcttgaaga acgttggtaa gccaaaggtt 420
ttcatcactg gtttcgacgt taagaacggt aagccagacc cagaaggtta ctctagagct 480
agagacttgt tgagacaaga cttgcaattg actggtaagc aagacttgaa gtacgttgtt 540
ttcgaagacg ctccagttgg tatcaaggct ggtaaggcta tgggtgctat cactgttggt 600
atcacttctt cttacgacaa gtctgttttg ttcgacgctg gtgctgacta cgttgtttgt 660
gacttgactc aagtttctgt tgttaagaac aacgaaaacg gtatcgttat ccaagttaac 720
aacccattga ctagagctta a 741
<210> 23
<211> 741
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 23
atgccacaat tctctgttga cttgtgtttg ttcgacttgg acggtactat cgtttctact 60
actactgctg ctgaatctgc ttggaagaag ttgtgtagac aacacggtgt tgacccagtt 120
gaattgttca agcactctca cggtgctaga tctcaagaaa tgatgaagaa gttcttccca 180
aagttggaca acactgacaa caagggtgtt ttggctttgg aaaaggacat ggctgacaac 240
tacttggaca ctgtttcttt gatcccaggt gctgaaaact tgttgttgtc tttggacgtt 300
gacactgaaa ctcaaaagaa gttgccagaa agaaagtggg ctatcgttac ttctggttct 360
ccatacttgg ctttctcttg gttcgaaact atcttgaaga acgttggtaa gccaaaggtt 420
ttcatcactg gtttcgacgt taagaacggt aagccagacc cagaaggtta ctctagagct 480
agagacttgt tgagacaaga cttgcaattg actggtaagc aagacttgaa gtacgttgtt 540
ttcgaagacg ctccagttgg tatcaaggct ggtaaggcta tgggtgctat cactgttggt 600
atcacttctt cttacgacaa gtctgttttg ttcgacgctg gtgctgacta cgttgtttgt 660
gacttgactc aagtttctgt tgttaagaac aacgaaaacg gtatcgttat ccaagttaac 720
aacccattga ctagagacta a 741
<210> 24
<211> 687
<212> DNA
<213> 毕赤酵母(Komagataella phaffii)
<400> 24
atggtttcta tcccatgtga cttgtgtttg ttcgacttgg acggtacttt ggttttgtct 60
actaaggcta tcgaaaaggg ttgggaatct gttttctctg aatacaacgt taactacaac 120
atggaagaat tcttgcaaaa caaccacggt gttagaactg gtgactcttt cgacagatgg 180
ttgccacaaa tcgacaacac taactctaag gctggtgacg aattcgaaaa gagaatctct 240
atcgaatacg ctgacttggc tgaaccagtt ccaggtgctc cacaattgtt gaactctatc 300
ccaaaggacc actggttggt tgttacttct ggtactccat tgttggctaa cggttggttc 360
tctaaggttt tggctaagtt cggtgttact aagccagaaa tcttcgttac tggtcaatct 420
gtttctaacg gtaagccaca cccagaacca tacttgaagg gtttggcttt gtggactgaa 480
aagtacggta agaagccagc tcacccaatc gttttcgaag acgctccaaa cggtatcaag 540
gctggtactg cttctggttg tactgttatc ggtatcgctt cttctttcgg taaggaagtt 600
ttgcaagctg ctggtgctac ttacgttgtt caagacttgt ctcacgttaa gttccacgac 660
aacactttgg acatcgacaa cttgtaa 687
<210> 25
<211> 813
<212> DNA
<213> 昆氏乳杆菌(Lactobacillus kunkeei)
<400> 25
atgtctgaaa tcaagttgat cgctatcgac atcgacggta ctttgttgaa cgaagaaaac 60
atcttggctc aagaaactat cgacgctgtt actgaagcta gaaacaacgg tatcaaggtt 120
gttttgtgta ctggtagacc attgactggt gttaagccat acttgaagaa gttgaacatc 180
tctggtaacg acgaatacgc tatcactttc aacggtgctc aagttcaaga cgctgacgct 240
aacatcatcg aaaagttcga cttggactac aacgacttcg ttggtttgga aaagttgtct 300
cacaagttga acactaactt ccaaatcgaa actactgact acatctacac tactaacaga 360
gacttgtctc catactctgt tgctgaatct tacttggtta gaatgccaat cagagttaga 420
gaaccacaag aaatcactga cgaaactgaa atcgttaagg ctatgttgat cgctgaccca 480
gacatcatcg acaaggctat cccaaacatc ccagaaaact tcttggacca cttgactatg 540
gttagatctg aaccagtttt cttggaattc gttaaccaaa aggcttctaa gggtgctgct 600
ttgtctaagt tggctactag attgggtttc aacgctgaaa acgttatggc tatcggtgac 660
caaggtaacg acatctctat ggttacttac gctggtactg gtgttgctat gggtaacgct 720
gctgacgact tgaagaaggt tgctaacaag gttactaaga ctaacaagga aaacggtgtt 780
gcttacgcta tcagaaactt cgctttgaag taa 813
<210> 26
<211> 777
<212> DNA
<213> 副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)
<400> 26
atgaagtaca agggttacat gatcgacttg gacggtacta tctacagagg taaggaaaga 60
atcccagctg ctaaggactt cgttgaaaga ttgcaagctg ctcaaatccc attcttgttc 120
ttgactaaca acactactaa gtctccagaa gacgttgtta agaacttggc tgaaaaccac 180
gacatccacg ttcaaccagc tcaagtttac actccagctt tggctactgc tgcttacttg 240
actgacttga accacggtga cgttactggt aagtctatct acatcatcgg tgaattgggt 300
ttgaagcaag ctgttttgga cactggtttg agattgaacg aagttgaccc agactacgtt 360
gttgttggtt tggactacga cgttacttac cacaagttcg aattggctac tttggctatc 420
aagagaggtg ctaagttcat cggtactaac gctgacacta acttgccaaa cgaaagaggt 480
ttggttccag gtgctggttc tttgatcgct ttggttgaaa gatctactca acaaagagct 540
ttctacatcg gtaagccaga accaactatc atggaaaagg ctttgaagaa gatgggtttg 600
ccaaaggaag ctgttgctat ggttggtgac aactacaaca ctgacatcaa ggctggtttg 660
aacgctggta tcgacactat cttggtttac actggtgttt ctactagaga ctacgtttct 720
aagcaagttc accaaccaac tcaccaaatc gacgctttga ctgactggga agtttaa 777
<210> 27
<211> 816
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
<400> 27
atggaaaaca tcaagatgat cgctatcgac atcgacggta ctttggttaa ctctaagaag 60
caagttactt tgagagttaa gcaagctatc aagatggcta agaagaagaa gatcaaggtt 120
gttatctgta ctggtagacc attgactggt gttaaggctt tgttgcaaga attggaattg 180
gacgctcaag acgaccaata cgttgtttgt ttcggtggtg ctgctactta cactacttct 240
ggtgaattga tcgacgaaag accaatctct tacgaagact acatcgactt ggaagctttg 300
gctagaaagt tgagattgca cttccacact gtttctgaag acagattgta cactgctgac 360
agaaacatcg gtgactacac tttgtacgaa gctaacttgg tttctatggg tatctcttac 420
agaactccag aagaaatgag aaacatcaag ttgatcaagt ctatgtacgt tgacgaacca 480
gaagttttgg acgctgctat caagcaacaa aagttgttcg aaccattgaa gaagcaagtt 540
actttcacta agtctgctcc attctactac gaagctaacg ctaacggtgt ttctaagggt 600
aacgctttgc aagttttgtg tgaaaagttg tctttgactg ctgctaacgt tatggctatc 660
ggtgacgaag ctaacgactt gtctatgatc aagttcgctg gtcacggtgt tgctatgggt 720
aacgctatcc cagaagttaa gcaagttgct gacgaaatca ctgttgacaa cgaacacgac 780
ggtgttgcta aggctatcga agctatcact agataa 816
<210> 28
<211> 822
<212> DNA
<213> 发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)
<400> 28
atgtctatca agttgatcgc tatcgacatc gacggtactt tgatcaacga ccaattggaa 60
atcactgaaa agactaagga aactttgcaa aaggctactg ctcaaggtat caaggttgtt 120
ttgtgtactg gtagaccaat gactggtgtt cacaagtact tggaccaatt gggtatcaac 180
aacttggctg accaatacgt tatctctttc aacggtgctt tggctcaaac tacttctggt 240
caagttatct ctcaattcac tttgccattc gaaaagttgg ttgacttgtc tgctgttgct 300
ttgaaggctg acgttcactt gttggctgaa actgctgacg ctatgtacgt tttgaaccaa 360
gacatctctt cttacgctgt ttacgaatct tctttggttt ctttgccaat cacttacaag 420
tctatcgacc aattgaacac tatcaagaac gacttggtta tctctaagtt gatgatcact 480
gacgaaccag ctgctatcga cggtttctct gctaagttga ctgctccaat caagagagct 540
ttcaacatcg ttagatctga accatactac ttggaattcg ttaacccatc tgcttctaag 600
ggtgctgctt tggcttcttt gggtcaagaa ttgggtgttg ctagaactga aatgatggct 660
atcggtaacg ctcaaaacga cgaatctatg atcacttacg ctggtatcgg tgttgctatg 720
tctaactcta tcccatctac tatccaattg gctgacgaat tggttgctga caacaaccac 780
gacggtgttg ctgaagctgt tgaaaagttc gctttggctt aa 822
<210> 29
<211> 891
<212> DNA
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)
<400> 29
atgtctccag aaactcaaga atctggtcca ttcgcttctc acatcttcgc tggtgttttg 60
ttggacttcg acggtactat catcgactct actgaaggtg aatctactat cccaatccaa 120
aacccaaaga gaatctaaca cttgccatct gacaacagag aattggaaaa ggtttaccca 180
caccaacaca tcttgcaagc tactttgttg actactactg aatctgctat gaactaagct 240
tctactatca tgaagtcttc tgctccaaga actggtgacg gtgcttctat gtcttacaac 300
aactaaatcc cacaaagacc aactggtaac gtttgtagat tgactttgcc atctatctct 360
cacccaaagt cttaattgac ttaatctttg tctttggacg tttctgaaat ggaatctcaa 420
atcccaactt tgtctaagac tccagctgtt gaaatcccag gtgctagaaa cttgttggaa 480
tctttggcta agttccacat cccacacgct atcgttactt ctggtactaa ggctttgttg 540
tctggttggt tgaacgtttt gcaattgcca caaccacaac acgttactgt tgctgaagac 600
gttactttgg gtaagccaga cccagaaggt tacagaaagg gtaaggaaaa gatcttggct 660
ggtagagtta acgacgacaa cggttctaag gacgttttgg ttgttgaaga cgctccagct 720
ggtatcagag ctggtaaggc tgctaactgt aaggttttgg ctgttgctac tactcactct 780
gttgacgttt tgaagagagc tggtgctgac tgggttgtta gagacttgag attcgttggt 840
gttgaaagat gtgaaagagg tttcgaagtt cacttctctg gtttgttgta a 891
<210> 30
<211> 702
<212> DNA
<213> 曲霉(Aspergillus japonicus)
<400> 30
atggctcaat ctttccaatc tgctggtaga actgaaagac acgctttcgc tggtgttttg 60
ttggacttcg acggtactat catcgactct actgaagcta tcgttgaaaa ctggactaga 120
gttgctgctg aattgggttt ggaccacaga gacatcttga gagcttctca cggtagaaga 180
tctatcgacg ttttgaagga attggaccca actaaggcta actgggaata cgtttctgct 240
atggaagcta gaatcccatt gttgtcttct actccagctg ttgaaatcgc tggtgctaga 300
agattgttgg aacaattgaa ccactactct atcccacacg ctatcgttac ttctggttct 360
aaggctttgt tggacgcttg gttgtctatc ttgcaattgc caagagctat gaaggctact 420
actgctgaag acgttaagat cggtaagcca gacccagaag gttacagaat ggctaagaag 480
aagttgttgc aacacagatc tggtgaaggt gaagttttgg ttatggaaga cgctccagct 540
ggtatcgttg ctggtaaggc tgctggttgt aaggttttgg ctgttactac tactcacact 600
gttcaacaat tgaaggaagc tggtgctgac tgggttgtta gagaccacag attcgttgac 660
ttcgaagctc cagctggttc tggtgacatg gttttcagat aa 702
<210> 31
<211> 819
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 31
atgagaatca tggcttctca cgacactcca gtttctccag ctggtatctt gatcgacttg 60
gacggtactg ttttcagagg taacgaattg atcgaaggtg ctagagaagc tatcaagact 120
ttgagaagaa tgggtaagaa gatcgttttc ttgtctaaca gaggtaacat ctctagagct 180
atgtgtagaa agaagttgtt gggtgctggt atcgaaactg acgttaacga catcgttttg 240
tcttcttctg ttactgctgc tttcttgaag aagcactaca gattctctaa ggtttgggtt 300
ttgggtgaac aaggtttggt tgacgaattg agattggctg gtgttcaaaa cgcttctgaa 360
ccaaaggaag ctgactggtt ggttatctct ttgcacgaaa ctttgactta cgacgacttg 420
aaccaagctt tccaagctgc tgctggtggt gctagaatca tcgctactaa caaggacaga 480
tctttcccaa acgaagacgg taacgctatc gacgttgctg gtatgatcgg tgctatcgaa 540
acttctgctc aagctaagac tgaattggtt gttggtaagc catcttggtt gatggctgaa 600
gctgcttgta ctgctatggg tttgtctgct cacgaatgta tgatcatcgg tgactctatc 660
gaatctgaca tcgctatggg taagttgtac ggtatgaagt ctgctttggt tttgactggt 720
tctgctaagc aaggtgaaca aagattgtac actccagact acgttttgga ctctatcaag 780
gacgttacta agttggctga agaaggtatc ttgatctaa 819
<210> 32
<211> 2010
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 32
atgtctaacc cacaaaaggc tttgaacgac ttcttgtctt ctgaatctgt tcacactcac 60
gactcttcta gaaagcaatc taacaagcaa tcttctgacg aaggtagatc ttcttctcaa 120
ccatctcacc accactctgg tggtactaac aacaacaaca acaacaacaa caacaacaac 180
aactctaaca acaacaacaa cggtaacgac ggtggtaacg acgacgacta cgactacgaa 240
atgcaagact acagaccatc tccacaatct gctagaccaa ctccaactta cgttccacaa 300
tactctgttg aatctggtac tgctttccca atccaagaag ttatcccatc tgcttacatc 360
aacactcaag acatcaacca caaggacaac ggtccaccat ctgcttcttc taacagagct 420
ttcagaccaa gaggtcaaac tactgtttct gctaacgttt tgaacatcga agacttctac 480
aagaacgctg acgacgctca cactatccca gaatctcact tgtctagaag aagatctaga 540
tctagagcta cttctaacgc tggtcactct gctaacactg gtgctactaa cggtagaact 600
actggtgctc aaactaacat ggaatctaac gaatctccaa gaaacgttcc aatcatggtt 660
aagccaaaga ctttgtacca aaacccacaa actccaactg ttttgccatc tacttaccac 720
ccaatcaaca agtggtcttc tgttaagaac acttacttga aggaattctt ggctgaattc 780
atgggtacta tggttatgat catcttcggt tctgctgttg tttgtcaagt taacgttgct 840
ggtaagatcc aacaagacaa cttcaacgtt gctttggaca acttgaacgt tactggttct 900
tctgctgaaa ctatcgacgc tatgaagtct ttgacttctt tggtttcttc tgttgctggt 960
ggtactttcg acgacgttgc tttgggttgg gctgctgctg ttgttatggg ttacttctgt 1020
gctggtggtt ctgctatctc tggtgctcac ttgaacccat ctatcacttt ggctaacttg 1080
gtttacagag gtttcccatt gaagaaggtt ccatactact tcgctggtca attgatcggt 1140
gctttcactg gtgctttgat cttgttcatc tggtacaaga gagttttgca agaagcttac 1200
tctgactggt ggatgaacga atctgttgct ggtatgttct gtgttttccc aaagccatac 1260
ttgtcttctg gtagacaatt cttctctgaa ttcttgtgtg gtgctatgtt gcaagctggt 1320
actttcgctt tgactgaccc atacacttgt ttgtcttctg acgttttccc attgatgatg 1380
ttcatcttga tcttcatcat caacgcttct atggcttacc aaactggtac tgctatgaac 1440
ttggctagag acttgggtcc aagattggct ttgtacgctg ttggtttcga ccacaagatg 1500
ttgtgggttc accaccacca cttcttctgg gttccaatgg ttggtccatt catcggtgct 1560
ttgatgggtg gtttggttta cgacgtttgt atctaccaag gtcacgaatc tccagttaac 1620
tggtctttgc cagtttacaa ggaaatgatc atgagagctt ggttcagaag accaggttgg 1680
aagaagagaa acagagctag aagaacttct gacttgtctg acttctctta caacaacgac 1740
gacgacgaag aattcggtga aagaatggct ttgcaaaaga ctaagactaa gtcttctatc 1800
tctgacaacg aaaacgaagc tggtgaaaag aaggttcaat tcaagtctgt tcaaagaggt 1860
aagagaactt tcggtggtat cccaactatc ttggaagaag aagactctat cgaaactgct 1920
tctttgggtg ctactactac tgactctatc ggtttgtctg acacttcttc tgaagactct 1980
cactacggta acgctaagaa ggttacttaa 2010
<210> 33
<211> 1719
<212> DNA
<213> 马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)
<400> 33
atgtctgaaa acactcaata cgacaacact agagactctg gtggtcaatc tccagttaac 60
aacaacaacg cttggcaaga atctggtttc gctcacacta gaccaagaag atacactact 120
agatcttctg tttctgaaag acaatctggt ttgtctggtt tggaagaaga agactctgac 180
atcgacgacc aaactactgt tccagttact gcttacgttc aacaatactt ggacgaaggt 240
tcttacttcc cagttcaaga agttgttcca aacacttctt tgaacatgaa catgtacaga 300
agaaagagag gtaacactgt tacttctaac gttatcgctt ctagaccaat ggaagctaac 360
tacactggtt ctgtttcttc tccagaccca gctttgcaaa accaaaacaa cgaaggtggt 420
gttccagcta acgacccaaa cgacccaaac aacgttaaca acgctatcac tatgatggtt 480
aagccaaaga ctttgtacca aaacccacaa actccaactg ttttgccatc tacttactac 540
ccaatcaaca agtggtcttc tttcaagtac caacacatga aggaattctt cggtgaattc 600
ttgggtacta tgatcatgat gatgttcggt actgctgttg tttgtcaatc taagttgtct 660
gaacaagaca agatcaacca attcaaccaa atcttggcta tgaaccacaa gtctaacgac 720
gacatctcta tgttgcaata catcgctact ccaaacgttg ctggtaactt cgtttctatc 780
gctttcggtt gggctggtgc tgttgttatg ggttacttcg ctgctggtgg ttctgctatc 840
tctggtgctc acttgaaccc agctatcact gtttctaact tcatctacag aggtttccca 900
ttcagaaagt tgggtttcta cttcatgggt caatacgttg gttcttactt gggttctttg 960
ttgatgatct ggtactacca caaggttatc gctcacgttt acccaaactg gccacaagaa 1020
gaatctgttg ttgctatgtt ctctgttgtt ccattggact acttgtctac tccaagacaa 1080
atcatcgctg aattcgttat cggtgctatg ttgcaatgtg gtatcttctc tttgactgac 1140
ccatacactt gtttgtctac tgacttgttc ccagttatgt tgttcatctt gatcttctct 1200
ttgaacgctt ctggtgctta ccaaactggt gctgttttga acccagctag agacatgggt 1260
ccaagattgg ctttgtggac tatcggtatg gacaaggacg ttatcttcaa ctctcaccac 1320
cacttcttct gggttccaat ggttgttcca ttcttgggtt ctttcgctgg tggtttggtt 1380
tacgacttct gtatctacca aggtcacgaa tctccattga acttgccatt gtctgcttac 1440
actgactggt tcagaagaca atgggacact atcaagttga agacttcttc tggtttgaag 1500
ggtactgact tggaaactat cgactctggt cacactttgt ctcacatcga atctcacaga 1560
tctcaattgt ctgaaaacaa gcaagttcac ttcaagtctg ttttgagaaa ctctaagttg 1620
agaaacccat ctactggtgt tccaactatc ttcgaatctg aagaaactac ttactctaga 1680
ccaaacttcg aacaaaagac ttctaacggt tctatctaa 1719
<210> 34
<211> 1932
<212> DNA
<213> 德布尔有孢酵母(Torulaspora delbrueckii)
<400> 34
atgaacgact tcttggctga cccagaatct agaccagttg acatgaagaa gtctactgac 60
gacccacact tcactgaaca aagatctaga tcttctacta accactctca caagtcttct 120
aactctaacg acgaatacga ctacgaaatg caatcttact ggccaagacc atctttctct 180
agaggtcaat ctagaacttc ttacatccca caatactcta cttacaacgg tggtcaattc 240
ccaatgcacc acgttgttcc aaacactcaa atggctatgt cttcttctgc tgacacttct 300
ggtggtgcta acggtcactt gccaggtact gaaaactcta agtctgaatt gagaccaaga 360
gctactactg tttcttctaa cttcgttaac ttgggtgaat tcttcagaaa caacgacgac 420
atggaatctc accacacttc tgaccacaga tctcacagag gttctacttc taacaagtct 480
aacactgacc actcttactc taacgaagac aacgaatctg acccaagaaa cgttccaatg 540
atggttagac caaagacttt gtaccaaaac ccacaaactc caactgtttt gccatctact 600
taccacccaa tcaacaagtg gtctactgtt aagcactctt acttgaagga attcttggct 660
gaattcatgg gtactatgat catggttggt ttcggttctg ctgtttgttg tcaagttttc 720
gctgctggta agatccaaca aaaccaattc gacgacgctt tgtctttgtt gactaacgct 780
tctggtgaat tggttgaaac tgctaagact ttcaagtact tggttacttc tgttaacggt 840
ggtactttcg acgacgttgc tttcggttgg gctggtgctg ttgttatggg ttacttctgt 900
gctggtggtt ctgctatctc tggtgctcac ttgaacccat ctatcactgt tgctaactac 960
atcttcagag gtttcccatc taagaagatc ccatactaca tcgctggtca attgactggt 1020
ggtttcgttg gtgctttgat catcttcatc ttctacaaga aggttttgca agaagcttac 1080
actgaatggt ggacttctga atctgttgct tctatgttct gtgttttccc aaagccatac 1140
ttgtcttcta ctagacaatt cgtttctgaa ttcgtttgta ctgctatgtt gcaagcttct 1200
actttcgctt tgactgaccc atacacttgt ttgtcttctg acatcttccc attgttgttg 1260
ttcgttcaaa tctacgttat caacgcttct ttgtcttacc aaactggttc tgctatgaac 1320
atggctagag acttgggtcc aagattggct ttgtacgctg ttggtttcga aagatctgtt 1380
ttgtggtctt ctcacaagca cttcttctgg gttccaatcg ttgctccatt ggttggttct 1440
atgactggtg ctttggttta cgacgtttgt atctaccaag gtcacgaatc tccagttaac 1500
tggccattgt ctgtttacaa ggacatgatc ttgagagctt ggatcagaag accaggttgg 1560
aagaagagaa acagaggtag agctacttct gacttgtctg acttctctta cgacgacgac 1620
gacgacgacg acaacaacaa cgaccaagac aacgactctc aaaacagatt ggctccacca 1680
agaactagaa ctagatctac tggttctgac actgaagacc aaccaagaca aaagggtgtt 1740
caattcaagt ctatgcaagg tagagctaag agattctacg gtggtgttcc aactatcttg 1800
gaagacgaag actctatcgc tactgcttct ttgggtggtg ctgcttctga atctgttgct 1860
ttgtctgacg aatcttctac tgaaggtaac aacgaagttg acgacggtga acacgacaga 1920
aagactagat aa 1932
<210> 35
<211> 1959
<212> DNA
<213> 光滑假丝酵母(Candida glabrata)
<400> 35
atgtctcacc aacaaggtgg ttctaagaac ccaaacgcta tgtctgactt gaacgaatac 60
ttgtctaacg aagacagaaa ctctcaagaa agaaacgaca gagacgactt cgacgttgaa 120
atgcaagaat acactccaca accattcaag agaccaactg cttcttacat cccagaatac 180
atcggtactt ctaaccaatt cccaatccaa gaagttgttc caaacactaa catcccaatc 240
caccaattga ctgaaaacca ctctgctgct caatctccaa acagaccatc ttctccagtt 300
aacaactcta acatgaacaa cttgtctggt gacatgtcta ctgctgctgc tacttctgtt 360
aacgttaaca ctacttctaa cactgaccac ttgagagcta gagaccacac tactgtttct 420
gctaacgttt tgaacttggg tcacttgtac aagaacaact acggtaacaa caacgacgac 480
ggtgaccaca tctctgttca agaaggtgtt actaacgact ctgaatctaa gcaatacggt 540
actagaagag acagagctac ttctttcatc tctagattgg ctggtggtgg tgacgacggt 600
tctccaaacg acccaaaccc aggtaacgct tctgttccaa tcatcgttaa gccaaagact 660
ttgtaccaaa acccacaaac tccaactgtt ttgccatcta cttaccaccc aatcaacaga 720
tggtctttgg ttaagtctgg tgttttgaag gaattcttgg ctgaattcat gggtactatg 780
gttatgatca tcttcggttc tgctgttgtt atccaagttt tgtctggtgg taaggctcaa 840
caagactctt acttggctgc tatggacgct ttgtctcaat ctgacttgtc tgctggtgaa 900
aagatggctt tcgaaaactt gactaagttg gtttcttctg tttcttctgg tactttcgac 960
gacatcgctt tgggttgggc tgctgctgtt gttatgggtt acttctgtgc tggtggttct 1020
gctatctctg gtggtcactt gaacccaatc atcactttgg ctaacttcgt ttacagaggt 1080
ttcccagcta agaagatccc attctacttc ttcggtcaat tgttcggtgc ttacgttggt 1140
ggtttgatcg cttacggtta ctacaagaag gttatctctg aaactttccc agaccacttc 1200
aactctgaaa ctgttgtttc tatgttctgt gttgttccaa agccatactt gtcttctgct 1260
agacaattcg tttctgaatt cttgtgtggt gctatgttgg ttgcttgtac tttcgctttg 1320
actgacccat acacttcttt gtctggtgac gttttcccat tgatgttgtt cttgttgatc 1380
ttcatgtgta actctggttt gggttaccaa actggtactg ctatgaacat ggctagagac 1440
ttgggtccaa gaatggcttt gtacactgtt ggtttctcta gaaagttgtt gtggacttct 1500
caccaccact tcttctgggt tccaatctgt gctccattca tcggtgcttt gactggtggt 1560
ttggtttacg acatcttcat ctaccaaggt cacgaatctc cagttaactg gccattctct 1620
ttgtacaagg aaactttcca aagatggtgg ttcaagagac caggttggca aagaagaaac 1680
aaggctagaa gaatgtctga cttgtctgaa atctcttacg ctgaagacga agacttggac 1740
aacacttaca ctggtactag attcccaaga gttactaaga ctaagtctta ccactcttct 1800
cacaacactg acgaaaagaa ggttcaattc aagtctgttc aaagagacaa gccacacaac 1860
caaaacatgg ctgctgtttt ggacgacgaa tcttctttgg aaactgcttc tttgggtgac 1920
tcttacatcg aacaatactc ttctaagaac tctaactaa 1959
<210> 36
<211> 2061
<212> DNA
<213> 拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces parabailii)
<400> 36
atgccaccaa cttctcaaca agctatgaac gaattcttgt ctaacccaga cgctgctcca 60
ccagctcaaa ctggttctac tgctgcttct ggtgctggtt ctgaagctgg tgctgacgct 120
agagctggtg ctgctgaagg tactgaatct gaagttccag cttctgctac tggtccaatc 180
ccagttccat ctgctacttc tggtcaccac ggttcttcta tctctggtgc tccatctgct 240
agaggttctg actacgacta cgaaatgcaa gactacagac caactccatt cactactaga 300
acttctagag ctagatctaa cactccatac atcccacact acatgatggc tcaaggtcac 360
caattcccag ttcaagaagt tgttccaaac tctcaaatgg ctatcgctac tggtgttgac 420
ccaaacgctt ctagatctca catggactct atgagaggta acatgagatc tagaactcaa 480
actgttactt ctaacgtttt gaacccaggt gaagctagac catctagatc tactactaga 540
ccaggttctc acgtttctga cggtgctggt tctaagcacg gttctgaaga agacgtttct 600
cacgaagacc acggtgactc tgaagaacac gctttgaacg ttccaatgat ggttaagcca 660
aagactttgt accaaaaccc acaaactcca actgttttgc catctactta ccacccaatc 720
aacaagtggt cttctttgaa gcacggttac ttgaaggaat tcttggctga attcatgggt 780
actatggttt tgatcgtttt cggtactgct gttacttgtc aagttaacac tgctgctaag 840
atccaacaag acggtttcga ccaagctttg gctcaattga ctaacactcc aggtggtttg 900
gttcaaactg ctgaaacttt caaggaattg gtttcttcta cttctggtgg tactttcgac 960
gacgttgctt tgggttgggc tgctgcttct gttatgggtt acttcgctgc tggtggttct 1020
gctatctctg gtgctcactt gaacccatct atgactgttt ctaacttcat cttcagaggt 1080
ttcccattca agaagatcgt taactacatc gctggtcaat tgttgggtgc tttcgctggt 1140
gctttgatct tgtacatctt ctacaagaga gttatcgaag aagctttccc acacgaatgg 1200
tggaagactg aatctgttgc ttctatgttc tgtgttttcc caaaggctta cttgtctact 1260
gctagacaat tcgtttctga atacatctgt actgctatgt tgcaagttgg tatcttcgct 1320
ttgactgacc catacacttg tttgtcttct gaattgttcc cattgatgtt gttcatcttg 1380
atctacatcg ttaacgcttc tatgtcttac caaactggtt gtgctatgaa catggctaga 1440
gacttgggtc caagattggc tttgtacgct gttggtttca acagacactt gttgtggatc 1500
aagcacaagc acttcttctg ggttccaatc gttgctccat tcttgggttc tatcactggt 1560
ggtttgatct acgacatctg tatctaccaa ggtcacgaat ctccagttaa ctggccattg 1620
gctacttaca gagacatcat ctactctatg tggttgaaga gaccagactg gtctagaaga 1680
ccatggagaa gatctaacga aaaggactct ggttctgact tcaactcttt ctcttacgac 1740
gaagacgaag acgaaccagc tccataccaa caagaaaact tgccaaagtt gtctatgtct 1800
gactctggta acccagaatt gcaagaaaga ccacaatctg ttcaattcaa gtctgttcaa 1860
tctagaacta agagacactt cggtggtatc ccaccaatca ctgaagaaga cccatctttg 1920
gacggtgctt ctttggctgg tacttctatc tctttggttg gttctgctaa cgacttcgac 1980
acttctactg ctgctgctcc aggttctcaa ccaactgaag acttgttctc tccaggtgct 2040
actcaaaaga agcaagaata a 2061
<210> 37
<211> 2079
<212> DNA
<213> 鲁西接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)
<400> 37
atgccagaca ctcaagacgg taagtctaac tctcaaaagt tgttgaacga ctacttgtct 60
aacccagacc caggtccatc tccatctgct ccacaaccaa ctactgctgg tactggtgac 120
acttctacta ctgctgctga cgttaacttg caaggtaaca agaacttcga caactctggt 180
aactctggta tcgaatctag acacaagtct tcttctaact ggaacgacga cggttacgac 240
tacgaaatgc aaaactacta cccacaacca tacactcaaa gaacttctag agctagatct 300
aacactaact acatcccaca ctacatgact ggtccagact ctcaataccc aatccaagaa 360
gttgttccaa acactcaaat ggctgttgct actggttctg acccagctgc taacagagct 420
gacggtttcg gtcactctgt tagatctaga gctccaacta tcagatctaa cgttccagac 480
ttccactcta tcttgggttc tactagatct aagccacact ctcacaacgg ttctcacatc 540
agatctaact cttctggtag atcttctgct gcttctgctg ctgctgactc tgaaaaccac 600
ggtaacgaaa ctggtgacgg tgttaactct ggttcttcta accacgcttt gtctactcca 660
ttgatggtta gaccaaagac tttgcaccaa aacccacaaa ctccaactgt tttgccatct 720
gcttaccacc caatcaacaa ctggacttct ttgaagcacg gttacttgaa ggaattcttg 780
gctgaattcg ttggtactat ggttatgatc atcttcggta acgctgttaa ctgtcaagtt 840
aacgttgctt ctaagatcca acaagaaaac ttcgacaagg ctttgcaaaa ggtttctaac 900
tctccagaac aattgagaga aactgctgaa gctttcaaga acttggtttc ttctacttct 960
ggtggtactt tcgacgaagt tgctttgggt tgggctgctg ctactactat gggttacttc 1020
gctgctggtg gttctgctat ctctggtggt cacttgaacc catctatcac tgttgttaac 1080
ttcatcttca gaggtttccc attcaagaac gttttcatct acgttactgg tcaattgttg 1140
ggtgctttcg ttggtgcttt gatcttgttc atcttctaca agagagttat cgaagaaggt 1200
ttcccaggtg aatggtggaa gaacgaaact gttgctggta tcttctgtgt tttcccaaag 1260
ccatacttgt ctacttctag acaattcgtt tctgaataca tctgtactgc tttgttgcaa 1320
atcggtactt tcgctttgac tgacccatac acttctttgt cttctgactt gttcccattg 1380
atgttgttca tcttgatgta catcttgaac gcttctttgt cttaccaaac tggttctgct 1440
atgaacatgg ctagagactt gggtccaaga ttggctttgt acgctgttgg tttcaacaga 1500
cacatgttgt gggttaacca ccaccacttc ttctgggttc caatcgttgc tccattcttg 1560
ggttctatca ctggtggttt gatctacgac gtttgtatct accaaggtca cgaatctcca 1620
gttaactggc caatcgctac ttacaaggac atcttgagaa gatcttggtt gagaagaaga 1680
caatggaagg gtagatctaa ctggccagtt atcggtaaga agttgtctaa caacccagct 1740
ccatctgaat tctctgactt ctcttacgaa gacgacgacg aagacagagg taacccattc 1800
caaaacccaa agactgaccc atctaaggtt tctttggttc aagaagctga cccaggtgct 1860
gacactagat ctccagactc tgttcacttc aagtctgttc aaggtgactc tagaagattg 1920
cacggtgaaa tcccaactat catggaagaa aacccatctt tggaaactga atctttgggt 1980
tctttgactt ctttgtctat caacaacaac gacaacaacg gtccaacttc taacgacggt 2040
atcccatctt tcccaactgt tcaaaagaag caagaataa 2079
<210> 38
<211> 1692
<212> DNA
<213> 乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)
<400> 38
atgtctcaaa ctgctcaata cgaaccagtt aaggacgctg gtatctctaa cggtgactgg 60
caaaacgacg acttcgctaa cgttaaccac agatacccaa ctggttctgt tgacggtaac 120
gaatctagaa tctctggtga aggtggttac gacgacgaca acgactctgc tgacgacggt 180
gctactgttc cagttactgc ttacgttcaa caatacttgg acgaaggttc ttacttccca 240
gttcaagaag ttgttccaaa cacttctttg aacatgaaca actacagaag aatcagatct 300
aacactgtta cttctaacgt tatgccacca agaccaactg aaggtccagg ttctgttatg 360
tctagatcta ctactggtcc aaaccaaaac tctcaaactg ctgctgaccc aaacgaccca 420
tctaacgtta acggtgctgt tactatgatg gttaagccaa agactttgta ccaaaaccca 480
caaactccaa ctgttttgcc atctacttac tacccaatca acaagtggtc ttctttcaag 540
taccaacaca tgaaggaatt cttcggtgaa ttcttgggta ctatgatcat gatgatgttc 600
ggtactgctg ttaactgtca aagaaagttg tctcaacaaa accaaatcaa caagttcaac 660
caaatcatcc aattgaacaa catggaatct gaccaaatcg ctatgttgca atacttggct 720
actccagacg ttgctggtaa cttcgctact gttgctttcg gttgggctgc tgctgttgtt 780
atgggttact tcgctgctgg tggttctgct atctctggtg ctcacttgaa cccagctatc 840
actgtttcta acttcgttta cagaggtttc ccatggagaa agttgggtgt ttacttcatg 900
ggtcaatact tgggttctta catcggtact ttgttgatct tgtggtacta cagagaagtt 960
atcgaacacg tttacccaaa ctggcacttg gaagaatctg ttttggctat gttctctgtt 1020
gttccattgg actacttgtc tacttctaga caaatcatcg ctgaattctt gatcggtgct 1080
atgttgcaat gtggtatctt ctctttgact gacccataca cttgtttgtc tactgacttg 1140
ttcccaatga tgttgttcat cttgatgttc atcttgaacg ctgctggtgc ttaccaaact 1200
ggtgctgttt tgaacccagc tagagacatg ggtccaagat tggctttgtt gactatcggt 1260
atggacaagg acgttatctt caacactcac caccacttct tctgggttcc aatggttgtt 1320
ccattcgttg gttctttcac tggtggtttg gtttacgact tctgtatcta ccaaggtcac 1380
gaatctccat tgaacttgcc attgtctgct tacactgact ggttcagaag acactgggaa 1440
ttgttgaagg ttaagacttc ttctggtttc gttggttctg acttggaaac tatcggtact 1500
aacaacacta cttctaacgt tgaatctcac agatctcaaa cttctgaaaa caagcaagtt 1560
cacttcaagt ctgttttgag aaactctaag actagaaacc catctactgg tatcccaact 1620
atcttcgaat ctgaagaaac tacttactct agaccaaact tcatccaaaa gcactctgac 1680
agatctgctt aa 1692
<210> 39
<211> 1158
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 39
atgctcaacc agccgaaaaa acccctgtgg ccgaaagtca gacacttctt gcgagaaccg 60
tttgccgagt tctggggctg cgtcattctc atcgttctgg gagacggttc tgttgcccag 120
gtcactctct ccaacggcga gaagggagac taccagtcca tttcgtgggg ctggggtctg 180
ggagtaatgt ttggcgtcta cgtcagcgga ggtatctctg gaggccatct caaccccgcc 240
gtcacgcttg cttcttgcgt ctacagaggc ttcccatgga gaaaattccc cggatacatg 300
ctggcccaga ccctaggatg tatggtaggt gctgccatca tctacggaaa ctaccgatct 360
gcaatcgata cgtttgaggg ctgcaagggc tgtcgaactg tgtctggtcc caaatccaca 420
gccggagtat tctgtaccta ccctgctccc ttcatgactc gaactggcca gttcttttcc 480
gaaattgtag cctcggctgt tctgcagttt atcattttcg ctattaacga caccaaaaac 540
atacccgctg gtcctctggc tcccctggta ctcttcttcc tcattttcgc tattggagcc 600
tgtcttggat gggagactgg atatgccatt aactttgcac gagactttgg tccccgactt 660
gtgactgcca tgatcggata cggcagcgaa gtctggagcg ctggaggtta ctacttttgg 720
gtccccatcg ttgccccctt cattgggtgt ctgctgggcg gctttctcta cgactttttc 780
atgtacaccg gggacgaatc gcccatcaac tggccctgga tgggattcga ccgatttctc 840
aacccccaca agcgaatcga acatgatatg ggaactgttc agcagaacgt ggaggctccc 900
atgcttgtgg aagcccaccc caacatgggc tcagtgcagg agaaccctct gtcgacggga 960
accgacgaac ccaaggtcga tatggaccct ggcttctcgt cagatagcca gactgtgcat 1020
ctgggcagaa atatgcgagc cgctgaccat gaacatgtcg agcaggctca cacgcctgag 1080
tcggccactc ctccccagcc tacaggcgcc gcccagtttc tggagttcga aaacctcgac 1140
gactcggaca gtagttag 1158
<210> 40
<211> 969
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 40
atgacagacg caattgtaca ctcgcccgaa acccccctgt ggccgcgaat ccgacaccag 60
ctccgagaac cgtttgccga gttctgggga tgtctgattc tcattctgct gggagacgga 120
gtggtggccc aggtgaccct ctccggcggc aaaaacggag actaccagtc catttcctgg 180
ggctggggtc tcggagtcat gtttggcgtc tacgccgctg gtggaatttc cggcggccat 240
ctgaaccccg ccgtgactct ctgctcctgt atctaccgag gtttcccctg gcgcaagttt 300
cccatctatc tggtggccca gttgctggga tgtatgaccg gagctgctct ggtctatgga 360
aatcaccggt ctgccattga cgtttttgag ggcggcaagg gcattcgaac cgtcggattg 420
cccacttcta ccgccggaat cttctgcacc taccccgccg agtttatgag caccaccggc 480
cagtttttct ccgaggtcat tgcctcagcc gtgctccagt ttgccatttt cgccatcaac 540
gaccaaaaga acctcgccgc cggccccctg gcacccctga tcctcttttt cctcattttc 600
gccatcggcg catgcctcgg atgggaaacc ggatatgcca ttaacctggc ccgtgatttc 660
ggcccccgat tggtcaccgc aatgatcggc tacggctcca aggtctggac cacgggcaac 720
tactacttct gggtgcccat catcgcgccc ttcatcggcg ctgccctcgg cggctttttc 780
tacgacctgt tcctctacac cggcgacgag tcgcccctca actggcccta catgggattc 840
gaccgaattt tctacctgct tggaaagaag gaggctccca gaatcgaaca tgatatgggt 900
atggttgagg aggctcccag taaggaggaa attgcccatt tttccaattc ccctaatgtt 960
tctagttag 969
<210> 41
<211> 1395
<212> DNA
<213> 棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)
<400> 41
atggctgttt acaactacga cgttgttgtt atcggtactg gtccagctgg tgaaggtgct 60
gctatgaacg ctgttaaggc tggtagaaag gttgctgttg ttgacgacag accacaagtt 120
ggtggtaact gtactcactt gggtactatc ccatctaagg ctttgagaca ctctgttaga 180
caaatcatgc aatacaacaa caacccattg ttcagacaaa tcggtgaacc aagatggttc 240
tctttcgctg acgttttgaa gtctgctgaa caagttatcg ctaagcaagt ttcttctaga 300
actggttact acgctagaaa cagaatcgac actttcttcg gtactgcttc tttctgtgac 360
gaacacacta tcgaagttgt tcacttgaac ggtatggttg aaactttggt tgctaagcaa 420
ttcgttatcg ctactggttc tagaccatac agaccagctg acgttgactt cactcaccca 480
agaatctacg actctgacac tatcttgtct ttgggtcaca ctccaagaag attgatcatc 540
tacggtgctg gtgttatcgg ttgtgaatac gcttctatct tctctggttt gggtgttttg 600
gttgacttga tcgacaacag agaccaattg ttgtctttct tggacgacga aatctctgac 660
tctttgtctt accacttgag aaacaacaac gttttgatca gacacaacga agaatacgaa 720
agagttgaag gtttggacaa cggtgttatc ttgcacttga agtctggtaa gaagatcaag 780
gctgacgctt tcttgtggtc taacggtaga actggtaaca ctgacaagtt gggtttggaa 840
aacatcggtt tgaaggctaa cggtagaggt caaatccaag ttgacgaaca ctacagaact 900
gaagtttcta acatctacgc tgctggtgac gttatcggtt ggccatcttt ggcttctgct 960
gcttacgacc aaggtagatc tgctgctggt tctatcactg aaaacgactc ttggagattc 1020
gttgacgacg ttccaactgg tatctacact atcccagaaa tctcttctgt tggtaagact 1080
gaaagagaat tgactcaagc taaggttcca tacgaagttg gtaaggcttt cttcaagggt 1140
atggctagag ctcaaatcgc tgttgaaaag gctggtatgt tgaagatctt gttccacaga 1200
gaaactttgg aaatcttggg tgttcactgt ttcggttacc aagcttctga aatcgttcac 1260
atcggtcaag ctatcatgaa ccaaaagggt gaagctaaca ctttgaagta cttcatcaac 1320
actactttca actacccaac tatggctgaa gcttacagag ttgctgctta cgacggtttg 1380
aacagattgt tctaa 1395
<210> 42
<211> 1400
<212> DNA
<213> 非致病性大肠杆菌K12菌株(Escherichia coli str. K-12)
<400> 42
atgccacact cttacgacta cgacgctatc gttatcggtt ctggtccagg tggtgaaggt 60
gctgctatgg gtttggttaa gcaaggtgct agagttgctg ttatcgaaag ataccaaaac 120
gttggtggtg gttgtactca ctggggtact atcccatcta aggctttgag acacgctgtt 180
tctagaatca tcgaattcaa ccaaaaccca ttgtactctg accactctag attgttgaga 240
tcttctttcg ctgacatctt gaaccacgct gacaacgtta tcaaccaaca aactagaatg 300
agacaaggtt tctacgaaag aaaccactgt gaaatcttgc aaggtaacgc tagattcgtt 360
gacgaacaca ctttggcttt ggactgtcca gacggttctg ttgaaacttt gactgctgaa 420
aagttcgtta tcgcttgtgg ttctagacca taccacccaa ctgacgttga cttcactcac 480
ccaagaatct acgactctga ctctatcttg tctatgcacc acgaaccaag acacgttttg 540
atctacggtg ctggtgttat cggttgtgaa tacgcttcta tcttcagagg tatggacgtt 600
aaggttgact tgatcaacac tagagacaga ttgttggctt tcttggacca agaaatgtct 660
gactctttgt cttaccactt ctggaactct ggtgttgtta tcagacacaa cgaagaatac 720
gaaaagatcg aaggttgtga cgacggtgtt atcatgcact tgaagtctgg taagaagttg 780
aaggctgact gtttgttgta cgctaacggt agaactggta acactgactc tttggctttg 840
caaaacatcg gtttggaaac tgactctaga ggtcaattga aggttaactc tatgtaccaa 900
actgctcaac cacacgttta cgctgttggt gacgttatcg gttacccatc tttggcttct 960
gctgcttacg accaaggtag aatcgctgct caagctttgg ttaagggtga agctactgct 1020
cacttgatcg aagacatccc aactggtatc tacactatcc cagaaatctc ttctgttggt 1080
aagactgaac aacaattgac tgctatgaag gttccatacg aagttggtag agctcaattc 1140
aagcacttgg ctagagctca aatcgttggt atgaacgttg gtactttgaa gatcttgttc 1200
cacagagaaa ctaaggaaat cttgggtatc cactgtttcg gtgaaagagc tgctgaaatc 1260
atccacatcg gtcaagctat catggaacaa aagggtggtg gtaacactat cgaatacttc 1320
gttaacacta ctttcaacta cccaactatg gctgaagctt acagagttgc tgctttgaac 1380
ggtttgaaca gattgttcta 1400
<210> 43
<211> 654
<212> DNA
<213> 米曲霉(Aspergillus oryzae)
<400> 43
atgtctgttt ctttgacttt gagatctgct ttgggtccat gtagagctgc ttctatcgct 60
agaccaggta agtctttgtt cgctttccaa cactctgtta tccaatctag aactccatac 120
gttccatacc aaagaaacgc ttacgaaaga ccatctgttt ctagatggcc acaagttgct 180
agaagatctg cttcttcttc ttcttctcca tctccagttc cagttgttcc atactcttct 240
ttgactgttg gtgttccaag agaaacttac ccaaacgaaa gaagagttgc tatcactcca 300
caaaacgttg ctttgttgtt gagaaagggt ttctctagag ttttgatcga aagaggtgct 360
ggtgaagctg ctgaattgtt ggaccaagct tacgaacaag ctggtgctac tttggttgac 420
agagctactg tttggtctca atctaacatc atcttgaagg ttagaggtcc acaaccaggt 480
gacgaaatcg aagctttgca acaaggttct actatcatct ctttcttgta cccagctcaa 540
aacaagcaat tggttgacca attggcttct agaagagtta ctgctttcgc tatggacatg 600
gttccaagaa tctctagagc tcaaactttc gacgctttga gatgtgttgc ttaa 654
<210> 44
<211> 1422
<212> DNA
<213> 氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)
<400> 44
atgatcttgt tggcttacat cgttgctttg tctggtttga tcgcttctgg tttgttggtt 60
tacggtttga agagaatgtc ttctccagtt actgctgttt ctggtatcgt tactgctggt 120
tggggtatgt tgttcgttgt tgctgcttct ttcttgcaaa tcttctctgt ttctgacgct 180
gctcaaccac acatcgttgt taacgttatc ttggctgttt tggctttggt tatcggtggt 240
ggttgggctg gttggaaggg tagatctgtt gctatgactg ctatgccaca aatggttgct 300
ttgttcaacg gtatgggtgg tggtgctgct gctgctgttt ctgttatcgc tttgactggt 360
ccaaaggaca ctggtgttgg tcaattgttg gttactgttg ctggtggttt gatcggttct 420
atgtctttgt ctggttcttt gatcgcttgg gctaagttgg acggtagaat gaacaagcca 480
atcagattcg gtggtcaaag aatcgttaac gctgctgttt tcatgttgac tatcttgttg 540
ggtgttatgg ctgttgctca ataccaccaa ccaggtggtg gtttgttcgc tttgttgttc 600
ttcatcggtg ctttgttgtg tggtatctgt atgactgttc caatcggtgg tgctgacatg 660
ccagttgtta tctctttgta caacgctttc actggtttgg ctgttggttt ggaaggttac 720
gttatggctg acccagcttt gatgatcgct ggtatggttg ttggttctgc tggtactttg 780
ttgactgtta tgatggctaa gggtatgaac agatctatca ctaacgtttt gttctctaac 840
ttcggtgaag ctactgctgc tactgcttct ggtccacaaa aggaagctaa gtctgtttct 900
gcttctgacg ctgctactac tatgagatac gcttctactg ttatcatcgt tccaggttac 960
ggtttggctg ttgctcaagc tcaaggtaag ttgtacgaat tcgttaagtt gttgcaagct 1020
gctggtgttg acgttaagtt cgctatccac ccagttgctg gtagaatgcc aggtcacatg 1080
aacgttttgt tggctgaagc tggtgttcca tacgacatga tctacgacat ggacgacatc 1140
aacgactctt tcgctgacac tgacgttgct ttggttatcg gtgctaacga cgttgttaac 1200
ccatctgcta gaactgacaa gtcttctcca atctacggta tgccaatctt gaacgctgac 1260
aaggctagac aagttttcgt tatcaagaga ggtatgggta tgggttactc tgctgttcaa 1320
aacccattgt tcttccaaga caactgtgct atggttttcg gtgacgctca agctgttttg 1380
tctaagatgg ttgaagctgt taagggtttg tctgcttctt aa 1422
<210> 45
<211> 1425
<212> DNA
<213> 短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)
<400> 45
atgacttctg ctactgttgg tgctatcgac atcgttgctt ggttcgttta cttgttctct 60
gctgttttgt tcgttgttgg tttgcacttc atgaactctc caaagactgc tagaaagggt 120
aaccaaatct ctgctttcgg tatggttgtt gctgttttga tggctttcat cgttttgttc 180
gctaagggtt tcgttaacgt tgttgctgtt gttgttttgg ttgttggtat cttgatcggt 240
gctgttgctg gtgttgtttc tgctaagaag gttaagatga ctgacatgcc acaattggtt 300
tctgttttca acactgttgg tggtggtgct gctgctttgg ttgctttgaa cgacatcttg 360
actaaggaag gtactccaga catcgttgtt ttgatcactg ctggtttggg tatcttgatc 420
ggttctgtta ctttcactgg ttctttgatc gctgctggta agttgcaagg tatcaagtgg 480
gttaagaagt tgactatgcc aggtaagggt gtttggaaca tcttgttcat cgttttgact 540
atcgcttctt tcgttatgtt gtgtgttcaa ccagaaagaa gattgttgtg gtctatcttg 600
actactgttt tcgctttgtg ttacggtttg gttttcgtta tcccaatcgg tggtgctgac 660
atgccagttg ttatctctgt tttgaacgct tgtactggta ctgctgttgc tatgtctggt 720
ttggctatcg acaacgttgc tttgatcgtt gctggtgctt tggttggttc tgctggtgtt 780
actttgtcta tcttgatggc tcaagctatg aacagaccat tgttgtctgt tttggctggt 840
ggtttcggtg gtggttctga cgctgctgct gctggtgacg gtccagaagg tactatgaag 900
gaaactactg ctgacgactt ggctgttcaa ttggtttacg ctcaaaaggt tatcttcgtt 960
ccaggtttcg gtttggctca agctcaagct caaagagaat tggctgactt gggtgaattg 1020
ttgaagggtc acggtgttga agtttcttac gctatccacc cagttgctgg tagaatgcca 1080
ggtcacatga acgttttgtt ggctgaagct aacgttccat acgaagaatt ggttgacttg 1140
gacgaaatca acccacaatt cccacaagct aacgttgctt tggttgttgg tgctaacgac 1200
gttactaacc cagctgctag aagaccaggt actccagttt ctggtatgcc aatcttggac 1260
gttgacaagt ctcaaaacgt tgttgttatg aagagaggta gaggtatggg ttacgctggt 1320
atccaaaacg aattgtactt cgaaggtaac actcaaatgt tgttcggtga cgctaaggct 1380
tctttgcaag ctgttatcgc tgctgttaag gaattgatct cttaa 1425
<210> 46
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
tgaataggag acttgacagt ctggc 25
<210> 47
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ctctgagatc atccgagcat tcaag 25
<210> 48
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
atgccccctt tcaccctggc agacac 26
<210> 49
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ctataacccg gcacagagcc ttggcg 26
<210> 50
<211> 3707
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
agccaccaac acggacgatt tcctggttcg aatgatcaag ggatgcatcc agctgggtga 60
gattcccaac atccacaact cggtcaacat ggtgcccgtc gatcacgtgg ctcgggttgt 120
tactgccgcc tctttctggc ccaagcagcc ttccggcgtg gttgtcgccc atgtgacttc 180
ccagcctcga acacggttca acgaattcct gcagaccctc cagaagtacg gttacaaagt 240
ttctgtcgag gactacgtca cctggcgtct ggctctggag aagtttgttg ttgaggactc 300
gcaggactct gccctgtatc ctctgctaca ctttgtgctc gatgaccttc cccagtctac 360
caaggccccc gagctggatg actccaatgc tcgatctgct ctctctcgag acgctgagtg 420
gaccggagtc gatttgtccg ctggtaaggg cgttgacgag gctcaaatgg gtatctacct 480
ggcttacctg gtggctgtcg gcttcctgga tgccccccag tccaaggttg agcttgcttt 540
gccgaaggtg gagctgtctg agcagaccct tgataagctg aagagtgtcg gtggacgtgg 600
tggtaacaag taagcagtgc cgtagggagt gccttgacca taaggcgatg cgaagcattg 660
ccattttgtt atttgttacc gtgtaatggt gattattgct tgtctgtgag cagactattt 720
ttgtatgatt taattaatta tgatatatat gactaaatgt gaggtgtcgc aataattaca 780
gcatttttcg tttgagatgg tttgtattgt agccagtgct caaaaattga gcgtaaattt 840
gatagcgttt gctgatgagc aagtggaagc atgggaatct catccccaga actcgtaata 900
gttacatacg gcaatacaac tatcagtgac atcacataca tgccagttgt cacgcaaggt 960
tctacaaact catggggttc catttaaata tactctatat caatacttat atcagacggg 1020
ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatatgctt ttgcaagctt tccttttcct 1080
tttggctggt tttgcagcca aaatatctgc atcaatgaca aacgaaacta gcgatagacc 1140
tttggtccac ttcacaccca acaagggctg gatgaatgac ccaaatgggt tgtggtacga 1200
tgaaaaagat gccaaatggc atctgtactt tcaatacaac ccaaatgaca ccgtatgggg 1260
tacgccattg ttttggggcc atgctacttc cgatgatttg actcattggg aagatgaacc 1320
cattgctatc gctcccaagc gtaacgattc aggtgctttc tctggctcca tggtggttga 1380
ttacaacaac acgagtgggt ttttcaatga tactattgat ccaagacaaa gatgcgttgc 1440
gatttggact tataacactc ctgaaagtga agagcaatac attagctatt ctcttgatgg 1500
tggttacact tttactgaat accaaaagaa ccctgtttta gctgccaact ccactcaatt 1560
cagagatcca aaggtgttct ggtatgaacc ttctcaaaaa tggattatga cggctgccaa 1620
atcacaagac tacaaaattg aaatttactc ctctgatgac ttgaagtcct ggaagctaga 1680
atctgcattt gctaatgaag gtttcttagg ctaccaatat gaatgtccag gtttgattga 1740
agtcccaact gagcaagatc cttccaaatc ctattgggtc atgtttattt ctatcaatcc 1800
aggtgcacct gctggcggtt ccttcaacca atattttgtt ggatccttca atggtactca 1860
ttttgaagcg tttgacaatc aatctagagt ggtagatttt ggtaaggact actatgcctt 1920
gcaaactttc ttcaacacag acccaacgta cggttcagca ttaggtattg cctgggcttc 1980
aaactgggag tacagtgcct ttgtcccaac taacccatgg agatcatcca tgtctttggt 2040
ccgcaagttt tctttgaaca ctgaatatca agctaatcca gagactgaat tgatcaattt 2100
gaaagccgaa ccaatattga acattagtaa tgctggtccc tggtctcgtt ttgctactaa 2160
cacaactcta actaaggcca attcttacaa tgtcgatttg agcaactcga ctggtaccct 2220
agagtttgag ttggtttacg ctgttaacac cacacaaacc atatccaaat ccgtctttcc 2280
cgacttatca ctttggttca agggtttaga agatcctgaa gaatatttaa gaatgggttt 2340
tgaagccagt gcttcttcct tctttttgga ccgtggtaac tctaaggtca agtttgtcaa 2400
ggagaaccca tatttcacaa acagaatgtc tgtcaacaac caaccattca agtctgagaa 2460
cgacctaagt tactataaag tgtacggcct actggatcaa aacatcttgg aattgtactt 2520
caacgatgga gatgtggttt ctacaaatac ctacttcatg accaccggta acgctctagg 2580
atctgtgaac atgaccactg gtgtcgataa tttgttctac attgacaagt tccaagtaag 2640
ggaagtaaaa tagataactt cgtataatgt atgctatacg aagttattag cgatattcaa 2700
aaatcgagac atatcatcac atgctatgac tcagcccttg gcgtcaaaaa gcatgaattg 2760
cactgcagtg tgcagattca tgcaggacaa acaccagacc agtcaatgta attggctgtg 2820
gtgcacgtcc aaatcaatgg cacaattgcc cgtgatgcat gctccttagg agacgctgtg 2880
gggtttgtgc ataggttaca gcttccgggt catgatcaac ttccgcgcaa caattgtgtg 2940
ctaaatcagg gcagaagcaa ttgctcaatt gatcacgggt agccaccgca acattcgcac 3000
tccttctcag ttttcatact cacagccaag gttcggatgg tgttgatggc agtctcgtca 3060
gtctttgaaa attggggagc cattttgaaa gttgtccgtc tagcaagcta ccagcagggt 3120
atatatagcg gcagacccaa agttttccta gctcttccat tcggttcatc catactttgt 3180
ttcccagggt aactttccca atccagtaac tttgaggctt atacgactca agcttttcgc 3240
aacctcagac cagagagagc tacaacaagg agggtggtga cattttggaa ggcgtgggag 3300
gtggtatcgg ggcggggagt gattgtagcg tgctcaattg ggttgttaag ggcttttagt 3360
cagccatata actgccttct accatctatt cgccctcttc agctattgct ggatactaag 3420
gttgctgatg ccttatcgtg tcagtcagcg acatcggaca acttccacca tatatgaaac 3480
tacggacgga tacacagtca gcgggtagtc atattcggag gggtcttcgg agttcccaat 3540
tggggttccg ttggaagtca tctttgtgtg gccaccgttt tttcccgtcg gaacaccatc 3600
ttgaaaactc cgccacttac acccgtccta cccactctcc ctcgcactac tgtagctacg 3660
tacttttcct acttctcaga caccgtattc cctcactcac ccacctt 3707
<210> 51
<211> 3767
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
agaaacaaag ggggggagtt catgatgtgc tattgcaaga agaaaaacat ataggatatt 60
tgtgtggaaa ccccgcgcaa aaagcactcc gatccacttc ccagccacgt ctcaacccta 120
cacccccttt tcgtcgacca tcgccgtccc ctcctgcaca gatcttcacc tcccgggtta 180
ttacagatcc acactcctaa atttatgaaa cacgccgatc agcgggaaga gcccccgccc 240
ccaccatcca ttttgggcgt gcgctggaga cctccaacga ggagggcaca aagacattgt 300
ggacaatgct cgtttaggcc cttatacgag aaagtcgggg gactagtgag cgatatacgg 360
cgaataggcg ttttcccaga tgggtgaagc gtagggttgt attacagggg tgggttaagg 420
ttcttcgacc gggagaggtc gtatggccta gatgagcata tgggtcgatt cgtttcgccg 480
cggagaactc gatgccgttt tcagatttcc attggcatct atagttgtcg agatatcccc 540
tctgaaaaag ccgttgctat ttagaccctg tttttcgtgc gtcagctatg cggtccaatt 600
tgaggcagtc agggtaagtg tttcaagtgg gcgttggaaa atgacgaagt gaccgtctat 660
agccgcggcg agagctgaaa taaaccgccc tgagtgattt atcacgtgat ctgacaccag 720
cggcgttctt cccccattcc catagggttc ttagcgcatc tcgaatattg tgcattcctc 780
tgtccaccaa attagctcat gcggggaaaa agcttactcg taccttctta taatacaccc 840
tacatgtcca taaagtggtg gcactctacc aacatcacct gttataatgc cccctttcac 900
cctggcagac actacggcga tacaggtgct catgtcggcg acacaggata cccgctcgga 960
ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatatgctt ttgcaagctt tccttttcct 1020
tttggctggt tttgcagcca aaatatctgc atcaatgaca aacgaaacta gcgatagacc 1080
tttggtccac ttcacaccca acaagggctg gatgaatgac ccaaatgggt tgtggtacga 1140
tgaaaaagat gccaaatggc atctgtactt tcaatacaac ccaaatgaca ccgtatgggg 1200
tacgccattg ttttggggcc atgctacttc cgatgatttg actcattggg aagatgaacc 1260
cattgctatc gctcccaagc gtaacgattc aggtgctttc tctggctcca tggtggttga 1320
ttacaacaac acgagtgggt ttttcaatga tactattgat ccaagacaaa gatgcgttgc 1380
gatttggact tataacactc ctgaaagtga agagcaatac attagctatt ctcttgatgg 1440
tggttacact tttactgaat accaaaagaa ccctgtttta gctgccaact ccactcaatt 1500
cagagatcca aaggtgttct ggtatgaacc ttctcaaaaa tggattatga cggctgccaa 1560
atcacaagac tacaaaattg aaatttactc ctctgatgac ttgaagtcct ggaagctaga 1620
atctgcattt gctaatgaag gtttcttagg ctaccaatat gaatgtccag gtttgattga 1680
agtcccaact gagcaagatc cttccaaatc ctattgggtc atgtttattt ctatcaatcc 1740
aggtgcacct gctggcggtt ccttcaacca atattttgtt ggatccttca atggtactca 1800
ttttgaagcg tttgacaatc aatctagagt ggtagatttt ggtaaggact actatgcctt 1860
gcaaactttc ttcaacacag acccaacgta cggttcagca ttaggtattg cctgggcttc 1920
aaactgggag tacagtgcct ttgtcccaac taacccatgg agatcatcca tgtctttggt 1980
ccgcaagttt tctttgaaca ctgaatatca agctaatcca gagactgaat tgatcaattt 2040
gaaagccgaa ccaatattga acattagtaa tgctggtccc tggtctcgtt ttgctactaa 2100
cacaactcta actaaggcca attcttacaa tgtcgatttg agcaactcga ctggtaccct 2160
agagtttgag ttggtttacg ctgttaacac cacacaaacc atatccaaat ccgtctttcc 2220
cgacttatca ctttggttca agggtttaga agatcctgaa gaatatttaa gaatgggttt 2280
tgaagccagt gcttcttcct tctttttgga ccgtggtaac tctaaggtca agtttgtcaa 2340
ggagaaccca tatttcacaa acagaatgtc tgtcaacaac caaccattca agtctgagaa 2400
cgacctaagt tactataaag tgtacggcct actggatcaa aacatcttgg aattgtactt 2460
caacgatgga gatgtggttt ctacaaatac ctacttcatg accaccggta acgctctagg 2520
atctgtgaac atgaccactg gtgtcgataa tttgttctac attgacaagt tccaagtaag 2580
ggaagtaaaa tagataactt cgtataatgt atgctatacg aagttatgac ggtgcctctg 2640
gagaggagta gtcggagtac tcctagtagg acgccaaggc tctgtgccgg gttatagaca 2700
accctgaaat gttaccaaca ttgaggaagt gtctgaagca ggctgaagca tcgtagaagc 2760
cttgtcatgg tcacgtcaga cccagggaag actctggaag tgctcatgtc tgttctagac 2820
gttctttttg cactttcgca agacgtatcc gcggagtggt gactaaaact aagaggaatt 2880
cttaaaagct gggctttcgc ggattttggc aatttcggtg gacccagaga tctgacgttg 2940
ccaaggagac ggttcagacg gcctcagacc tgcacgagtc cccagagtct catctctacc 3000
cccatgatgc ggtttcccac agtcgtttca acaatcattc ggctagcagc aacctattct 3060
cttcttcaaa gggctattcc agaccagcaa atcttcgcct ttttggccga gtctcctcgt 3120
tgacgaacct gctctggaaa caaccccttc caatccttct gtactctact tttactaacc 3180
ggctctcctg agcccgagct ttcttagcca gctccaaaac gcttgcctgt cgctggtaga 3240
cgggtgattc atagtactaa tcaatgcatt taatcagagt gagtggtatg gagaacgtcg 3300
cccgagaagc tgcagtaggg acatcagaag ggacatatct gcctgaagac accctcgcgt 3360
taatcatgag tgcatatctc gtgatcagac acacgatata ctgcgcggca gtacttgcat 3420
cgtcaagtgg ttgatatcaa gggtatggca aggttccggg tatcttgggt gtgaactaca 3480
agtagttggt accgtatgta ctactgactt gtaccagata tgaaggcaca ttacggaaac 3540
ccgactcatt atctgtctcg atagcgacaa tgtcagctgg gtgaacttgt ctaccaatcc 3600
aacccattga atttttcaac attccacctc gtctggttca gtcgccatgc acctcaacct 3660
caccacctga aatcatcacg agatgatgga cttttaagaa gcccatttca ctggtgcaag 3720
agaagctggt gataaatggc agttccctct gtatctgctc tcaatgg 3767
<210> 52
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ctatctccac aacaatgcct gcaccag 27
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ccggttacac atgactgtag gaaac 25
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
ccatacacag caccacctca atc 23
<210> 55
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
tctatataca tcctctaagg agc 23
<210> 56
<211> 3770
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gaggggggag atgccccatc tctggcaacc ctatttgacg atagttgctg gaggcttgac 60
aggacttggt gacgaggggt gtttgggcgc tggaagcgta attttcgtct tgaatgggcc 120
gtcgagactt ggggttcgac cccgactaaa tggcgcaccg ctagattctc ttttggcgac 180
tttctcggga ttctagtcac ccccgcaatg ttccagctta cggtttgaga cagtacacga 240
ctggctaggc gagttgttga agtcgtagcg tagagtggga ggcatgacgt cacgggacag 300
ctgcgtgcac cacgcgagca ggtcaattga cctcatttga gtggtgtggc ttggcgttct 360
agcggtggcg gcgttgtcga gctccctcta cttgtagtga gattatgtcg acgagcgggg 420
gggacttcca ttgtgcttgc cactgctagt gcagtacaac tgaaagctaa accgcaatca 480
atcccaaact gcatgtccgc cttaactctg atatgttatc aagagagtgg tgtggtgagg 540
tgaggtgagg tgacgtggac aagttgatgg ggagttgggg cattgacaaa agggaaattg 600
cagggggatt ccgccggcta tatatatctt atgtctgctc aattcccaga cggctccaca 660
caaaaccaag ataccacacc atcatggtca caccgggtac ataactccca tccatctcat 720
cccacttgca tggcgaccgg agagagaaag cccggggaga gcacgtcggc gcggtcccca 780
gggcgacaac caaaacaaaa tcaccgagtg actccgaaag ccgcgttcca acaccccccc 840
aaaatccccc cctcaaacac gtcagccacc tgtcccccga aaattaactt cactgacatg 900
gcgcagctat taaggctaaa gtgaatgcat ggctcatctt tgtttgctgg ttgctactgt 960
gactgaggta aaaaccctcg ctcccaagtc tatatatacc tgggtgtgct ccctcgaaca 1020
gacccgtcac agtaaaacta ctacctccat acacagcacc acctcaatca taacttcgta 1080
taatgtatgc tatacgaagt tatatgcttt tgcaagcttt ccttttcctt ttggctggtt 1140
ttgcagccaa aatatctgca tcaatgacaa acgaaactag cgatagacct ttggtccact 1200
tcacacccaa caagggctgg atgaatgacc caaatgggtt gtggtacgat gaaaaagatg 1260
ccaaatggca tctgtacttt caatacaacc caaatgacac cgtatggggt acgccattgt 1320
tttggggcca tgctacttcc gatgatttga ctcattggga agatgaaccc attgctatcg 1380
ctcccaagcg taacgattca ggtgctttct ctggctccat ggtggttgat tacaacaaca 1440
cgagtgggtt tttcaatgat actattgatc caagacaaag atgcgttgcg atttggactt 1500
ataacactcc tgaaagtgaa gagcaataca ttagctattc tcttgatggt ggttacactt 1560
ttactgaata ccaaaagaac cctgttttag ctgccaactc cactcaattc agagatccaa 1620
aggtgttctg gtatgaacct tctcaaaaat ggattatgac ggctgccaaa tcacaagact 1680
acaaaattga aatttactcc tctgatgact tgaagtcctg gaagctagaa tctgcatttg 1740
ctaatgaagg tttcttaggc taccaatatg aatgtccagg tttgattgaa gtcccaactg 1800
agcaagatcc ttccaaatcc tattgggtca tgtttatttc tatcaatcca ggtgcacctg 1860
ctggcggttc cttcaaccaa tattttgttg gatccttcaa tggtactcat tttgaagcgt 1920
ttgacaatca atctagagtg gtagattttg gtaaggacta ctatgccttg caaactttct 1980
tcaacacaga cccaacgtac ggttcagcat taggtattgc ctgggcttca aactgggagt 2040
acagtgcctt tgtcccaact aacccatgga gatcatccat gtctttggtc cgcaagtttt 2100
ctttgaacac tgaatatcaa gctaatccag agactgaatt gatcaatttg aaagccgaac 2160
caatattgaa cattagtaat gctggtccct ggtctcgttt tgctactaac acaactctaa 2220
ctaaggccaa ttcttacaat gtcgatttga gcaactcgac tggtacccta gagtttgagt 2280
tggtttacgc tgttaacacc acacaaacca tatccaaatc cgtctttccc gacttatcac 2340
tttggttcaa gggtttagaa gatcctgaag aatatttaag aatgggtttt gaagccagtg 2400
cttcttcctt ctttttggac cgtggtaact ctaaggtcaa gtttgtcaag gagaacccat 2460
atttcacaaa cagaatgtct gtcaacaacc aaccattcaa gtctgagaac gacctaagtt 2520
actataaagt gtacggccta ctggatcaaa acatcttgga attgtacttc aacgatggag 2580
atgtggtttc tacaaatacc tacttcatga ccaccggtaa cgctctagga tctgtgaaca 2640
tgaccactgg tgtcgataat ttgttctaca ttgacaagtt ccaagtaagg gaagtaaaat 2700
agataacttc gtataatgta tgctatacga agttatagga tgtatataga taatgattgt 2760
ttatgattag acattgattg agtgtagttg gacattagca gtcagatagg caacgaagat 2820
catccaagtc tgaatacata cccatacaaa tcatacaagt aaatgatgga attactcata 2880
taagtatgta cttacttgta ccgaattgcc aatgaatgtc aatcagaacg cagtatgtac 2940
aagtactcgc acaatatcat aaggcactcg aatgttcaag aagtcatcat tttggtgatt 3000
cggggaaata cttgacacct ttgttgatgc aacttgactc cataagtagg aaacccatag 3060
tatatctttt tgtcgcttta tattcacctg ttcccttctt tctatggact ataagttaat 3120
ttagttgacc ttgtcaagta atacctcaac aaactgtaaa gaaataggag attattgctt 3180
ttggtttttg agaagagatc tggatagcac cacacaaata atgcgtcaaa atcagttcaa 3240
aatccaaccc acagaacaac caacactccc cgaaccgctc ataacctgta taggatgctg 3300
ctccactcac acctcttgtc cagccctaac ctgcgatcta ggttggggaa attttgtatg 3360
caggaaaaat atatgcaaga tttgggattt tatttgtgtt catcaaccac gtcgatttac 3420
acagctatca tggtccgaga acgatctgga acggtggcgt acacgcccaa aaagcagcag 3480
aagcctctgg tggacgacgc ccacttgtcc tctgctgagg aggacgattt caagacccca 3540
gagagtgcaa agagcaagaa gcctgaagcg tcacaacagg agccggcggt gtcagaaacg 3600
ccagtcaagg gcaaggccaa gaagatcacc tttgacgagg acggaatgag tgccgagccc 3660
atcgttgaga agaaaaaggt ggttgtggag gagtctgaag acgacagtga cgatgccccc 3720
gaggaggaaa cactggagga tggacaggaa aagaccctgg ccaagcaaaa 3770
<210> 57
<211> 3830
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
tataattttc gcaccaaaaa gagaccgttt atcgtggatt atgggggtgt gatgtggggg 60
gaggggggag atgccccatc tctggcaacc ctatttgacg atagttgctg gaggcttgac 120
aggacttggt gacgaggggt gtttgggcgc tggaagcgta attttcgtct tgaatgggcc 180
gtcgagactt ggggttcgac cccgactaaa tggcgcaccg ctagattctc ttttggcgac 240
tttctcggga ttctagtcac ccccgcaatg ttccagctta cggtttgaga cagtacacga 300
ctggctaggc gagttgttga agtcgtagcg tagagtggga ggcatgacgt cacgggacag 360
ctgcgtgcac cacgcgagca ggtcaattga cctcatttga gtggtgtggc ttggcgttct 420
agcggtggcg gcgttgtcga gctccctcta cttgtagtga gattatgtcg acgagcgggg 480
gggacttcca ttgtgcttgc cactgctagt gcagtacaac tgaaagctaa accgcaatca 540
atcccaaact gcatgtccgc cttaactctg atatgttatc aagagagtgg tgtggtgagg 600
tgaggtgagg tgacgtggac aagttgatgg ggagttgggg cattgacaaa agggaaattg 660
cagggggatt ccgccggcta tatatatctt atgtctgctc aattcccaga cggctccaca 720
caaaaccaag ataccacacc atcatggtca caccgggtac ataactccca tccatctcat 780
cccacttgca tggcgaccgg agagagaaag cccggggaga gcacgtcggc gcggtcccca 840
gggcgacaac caaaacaaaa tcaccgagtg actccgaaag ccgcgttcca acaccccccc 900
aaaatccccc cctcaaacac gtcagccacc tgtcccccga aaattaactt cactgacatg 960
gcgcagctat taaggctaaa gtgaatgcat ggctcatctt tgtttgctgg ttgctactgt 1020
gactgaggta aaaaccctcg ctcccaagtc tatatatacc tgggtgtgct ccctcgaaca 1080
gacccgtcac agtaaaacta ctacctccat acacagcacc acctcaatca taacttcgta 1140
taatgtatgc tatacgaagt tatatgcttt tgcaagcttt ccttttcctt ttggctggtt 1200
ttgcagccaa aatatctgca tcaatgacaa acgaaactag cgatagacct ttggtccact 1260
tcacacccaa caagggctgg atgaatgacc caaatgggtt gtggtacgat gaaaaagatg 1320
ccaaatggca tctgtacttt caatacaacc caaatgacac cgtatggggt acgccattgt 1380
tttggggcca tgctacttcc gatgatttga ctcattggga agatgaaccc attgctatcg 1440
ctcccaagcg taacgattca ggtgctttct ctggctccat ggtggttgat tacaacaaca 1500
cgagtgggtt tttcaatgat actattgatc caagacaaag atgcgttgcg atttggactt 1560
ataacactcc tgaaagtgaa gagcaataca ttagctattc tcttgatggt ggttacactt 1620
ttactgaata ccaaaagaac cctgttttag ctgccaactc cactcaattc agagatccaa 1680
aggtgttctg gtatgaacct tctcaaaaat ggattatgac ggctgccaaa tcacaagact 1740
acaaaattga aatttactcc tctgatgact tgaagtcctg gaagctagaa tctgcatttg 1800
ctaatgaagg tttcttaggc taccaatatg aatgtccagg tttgattgaa gtcccaactg 1860
agcaagatcc ttccaaatcc tattgggtca tgtttatttc tatcaatcca ggtgcacctg 1920
ctggcggttc cttcaaccaa tattttgttg gatccttcaa tggtactcat tttgaagcgt 1980
ttgacaatca atctagagtg gtagattttg gtaaggacta ctatgccttg caaactttct 2040
tcaacacaga cccaacgtac ggttcagcat taggtattgc ctgggcttca aactgggagt 2100
acagtgcctt tgtcccaact aacccatgga gatcatccat gtctttggtc cgcaagtttt 2160
ctttgaacac tgaatatcaa gctaatccag agactgaatt gatcaatttg aaagccgaac 2220
caatattgaa cattagtaat gctggtccct ggtctcgttt tgctactaac acaactctaa 2280
ctaaggccaa ttcttacaat gtcgatttga gcaactcgac tggtacccta gagtttgagt 2340
tggtttacgc tgttaacacc acacaaacca tatccaaatc cgtctttccc gacttatcac 2400
tttggttcaa gggtttagaa gatcctgaag aatatttaag aatgggtttt gaagccagtg 2460
cttcttcctt ctttttggac cgtggtaact ctaaggtcaa gtttgtcaag gagaacccat 2520
atttcacaaa cagaatgtct gtcaacaacc aaccattcaa gtctgagaac gacctaagtt 2580
actataaagt gtacggccta ctggatcaaa acatcttgga attgtacttc aacgatggag 2640
atgtggtttc tacaaatacc tacttcatga ccaccggtaa cgctctagga tctgtgaaca 2700
tgaccactgg tgtcgataat ttgttctaca ttgacaagtt ccaagtaagg gaagtaaaat 2760
agataacttc gtataatgta tgctatacga agttatagga tgtatataga taatgattgt 2820
ttatgattag acattgattg agtgtagttg gacattagca gtcagatagg caacgaagat 2880
catccaagtc tgaatacata cccatacaaa tcatacaagt aaatgatgga attactcata 2940
taagtatgta cttacttgta ccgaattgcc aatgaatgtc aatcagaacg cagtatgtac 3000
aagtactcgc acaatatcat aaggcactcg aatgttcaag aagtcatcat tttggtgatt 3060
cggggaaata cttgacacct ttgttgatgc aacttgactc cataagtagg aaacccatag 3120
tatatctttt tgtcgcttta tattcacctg ttcccttctt tctatggact ataagttaat 3180
ttagttgacc ttgtcaagta atacctcaac aaactgtaaa gaaataggag attattgctt 3240
ttggtttttg agaagagatc tggatagcac cacacaaata atgcgtcaaa atcagttcaa 3300
aatccaaccc acagaacaac caacactccc cgaaccgctc ataacctgta taggatgctg 3360
ctccactcac acctcttgtc cagccctaac ctgcgatcta ggttggggaa attttgtatg 3420
caggaaaaat atatgcaaga tttgggattt tatttgtgtt catcaaccac gtcgatttac 3480
acagctatca tggtccgaga acgatctgga acggtggcgt acacgcccaa aaagcagcag 3540
aagcctctgg tggacgacgc ccacttgtcc tctgctgagg aggacgattt caagacccca 3600
gagagtgcaa agagcaagaa gcctgaagcg tcacaacagg agccggcggt gtcagaaacg 3660
ccagtcaagg gcaaggccaa gaagatcacc tttgacgagg acggaatgag tgccgagccc 3720
atcgttgaga agaaaaaggt ggttgtggag gagtctgaag acgacagtga cgatgccccc 3780
gaggaggaaa cactggagga tggacaggaa aagaccctgg ccaagcaaaa 3830
<210> 58
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
accagatggt gtaacctcca tcgac 25
<210> 59
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
ggaagtggtg gtctgggtat cgcag 25
<210> 60
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
cacatacacc acaacacaca caaaatc 27
<210> 61
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
ttcctctgag acaatcgcgt cggatc 26
<210> 62
<211> 3647
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
acttcaagca catccccaag tttatcaccg tcatctttct gctgctcaac gtggttgcca 60
tgatcgccgg atccttcatg gtcaccgcca agaagcgaat tgaggtcggt tgcggtctgc 120
tggtcggagt cattgtcacc caggctctgg cctacggcct catctttgac tttggcttca 180
ttctgcgaaa cctgtccgtc attggcggtc ttttcatcgc tcttaacgac gcctttgtca 240
aggacaagtc caagcgaggt ctccctggtc tcccctctat tgacgacaag gaccggtcca 300
agtacgtgct cctggcaggc cgaatcctcc tggttgtcat gttcacctcc ttcatcctca 360
atatgacctg gactatgtct cgagttctgg tgtccattgt cggaattgct gcttgctcca 420
tggtcgttgt tggcttcaag gcccgagttt ccgcgttcct cctgtgcatc atcctcttca 480
tctttaacat caccgccaac tcctactggg ccttccccgc ctcttctccc gtccgagact 540
acctcaagta cgagcacttc cagaccctgt ccatcattgg cggtcttctg ctggttgtca 600
acaccggagc cggcaaaatc tccattgacg agaagaagaa ggtctactaa gctattacta 660
gtcagcaaca acactttggt agagtttgat acagacattg acatctaccg cgatgtaaaa 720
ataatgtata ctaggagagt ctgtcgttcg cgagtggcaa tgtcatgagt tacacctgat 780
tcaaatagtg aataataata taacagccac aaatgaaaga tgtatccacg ggtagatatg 840
gctttaatta ctgatgattg aatgattatc tgagtgctac agttgtaacg agtacgagtt 900
attacctgct actattgtac tcctaaatca aagtactcgt acatgcaatg aattacttgt 960
ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatatgctt ttgcaagctt tccttttcct 1020
tttggctggt tttgcagcca aaatatctgc atcaatgaca aacgaaacta gcgatagacc 1080
tttggtccac ttcacaccca acaagggctg gatgaatgac ccaaatgggt tgtggtacga 1140
tgaaaaagat gccaaatggc atctgtactt tcaatacaac ccaaatgaca ccgtatgggg 1200
tacgccattg ttttggggcc atgctacttc cgatgatttg actcattggg aagatgaacc 1260
cattgctatc gctcccaagc gtaacgattc aggtgctttc tctggctcca tggtggttga 1320
ttacaacaac acgagtgggt ttttcaatga tactattgat ccaagacaaa gatgcgttgc 1380
gatttggact tataacactc ctgaaagtga agagcaatac attagctatt ctcttgatgg 1440
tggttacact tttactgaat accaaaagaa ccctgtttta gctgccaact ccactcaatt 1500
cagagatcca aaggtgttct ggtatgaacc ttctcaaaaa tggattatga cggctgccaa 1560
atcacaagac tacaaaattg aaatttactc ctctgatgac ttgaagtcct ggaagctaga 1620
atctgcattt gctaatgaag gtttcttagg ctaccaatat gaatgtccag gtttgattga 1680
agtcccaact gagcaagatc cttccaaatc ctattgggtc atgtttattt ctatcaatcc 1740
aggtgcacct gctggcggtt ccttcaacca atattttgtt ggatccttca atggtactca 1800
ttttgaagcg tttgacaatc aatctagagt ggtagatttt ggtaaggact actatgcctt 1860
gcaaactttc ttcaacacag acccaacgta cggttcagca ttaggtattg cctgggcttc 1920
aaactgggag tacagtgcct ttgtcccaac taacccatgg agatcatcca tgtctttggt 1980
ccgcaagttt tctttgaaca ctgaatatca agctaatcca gagactgaat tgatcaattt 2040
gaaagccgaa ccaatattga acattagtaa tgctggtccc tggtctcgtt ttgctactaa 2100
cacaactcta actaaggcca attcttacaa tgtcgatttg agcaactcga ctggtaccct 2160
agagtttgag ttggtttacg ctgttaacac cacacaaacc atatccaaat ccgtctttcc 2220
cgacttatca ctttggttca agggtttaga agatcctgaa gaatatttaa gaatgggttt 2280
tgaagccagt gcttcttcct tctttttgga ccgtggtaac tctaaggtca agtttgtcaa 2340
ggagaaccca tatttcacaa acagaatgtc tgtcaacaac caaccattca agtctgagaa 2400
cgacctaagt tactataaag tgtacggcct actggatcaa aacatcttgg aattgtactt 2460
caacgatgga gatgtggttt ctacaaatac ctacttcatg accaccggta acgctctagg 2520
atctgtgaac atgaccactg gtgtcgataa tttgttctac attgacaagt tccaagtaag 2580
ggaagtaaaa tagataactt cgtataatgt atgctatacg aagttatatt gtccaatgca 2640
gctggtatgc gatgtgtatg cttaacagat atatacatac gcctgggttg ctgttcgagg 2700
gatttcagga gtgtaagttg ggtttctgct ggggggtgtg acgaattggc agtgtcagta 2760
cttgtactgg tacgactgat gtgtatgtaa gctcaatgag cagcgtgctc ctcggtctac 2820
tatatggcga catatctctt cgcttctgtt taccctttac atacggtaca gctcttacaa 2880
tgacatttat ccactggcgt cgatccataa accacacgaa ccctgttttg ttagtcacca 2940
tgaccggggc gtgtcgtgtt acgttccacc gtttcacctc agccggttac gattcaactt 3000
gccgcgtcat tctgcgttgc tagcggagcg agtacgagta actagacttt cgataagctg 3060
aatgacttca gggtgcatga gaggcgcaga tcgatatttt cggacttgtt cttctagaag 3120
actggtttga gagcaatcgc ggaagagttg ggaaccgctg gagagcagaa tgggttagta 3180
cagagactat ctgatctccc ccgcttgtgt ctagccccac tttatactct atttggcagt 3240
tgttgcttgt tattcaagca cagcatgtct gctcgtatca ctttggagac atccctaacc 3300
tctaaacctt tatagatgcc ttaccttctg agcttgcaga gagcattcca cagcgaaccc 3360
agttgacatt atcagttgac atcttacgct cacaccacat tacgcatctc acacacaatc 3420
acacgcacaa gtacacacgc aagcacatca tacaatggtc aagggaattc tgaaacataa 3480
gacgccggag gccgaggttg cccccaaccc tgaaatcgac cgacagaagg tcctggaaaa 3540
cacacgagcg aacgcccagt tgtatagcca aaactcggaa aaaatcagac gagctagcac 3600
gggcaaggtc cgagtcgacg aggcgtcgtc gggcaccacg gagttcc 3647
<210> 63
<211> 3707
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
ttatgcgagt gagtgacgtc atggaaagac gggcatttca gcttagtaag cacgttcggg 60
ggaaatgcgg agtagaaaat ggaagaaaca agaaattgat gaaaaccact tttgaggatg 120
attcccaacg atcccggaaa aacggaaaat ctgcaaactt ttcaaaaaac accgttaaaa 180
ctttccaatg gctccaatgg cttcccaaat aaagacagag gtaaatccac cgtattagtc 240
accttaccct cgttctatcg agcccaaaca cggcccattt agcttaggat catggccgat 300
tgtgcggtac aggggaaaat attttccata ctcacatccc tacaactcta atgacccggc 360
atgacgaact tggtaatcga tccggataat aaagaggaaa gatcaggaga atgaggacag 420
tgaaattagt ggtatgtgcg gggtacaagg gtcatttgcg gatgctagag gagcgtgggg 480
tattccgatt ggctcgattg acccgtttca cgccccgatc aagcacttgt tccacatgtt 540
tctatactct gcgtctgcgg agacgtcatt ttgcatgtct gaagtgggtt tggggtttgt 600
atggctgtcg agtaaagagc gcatggagat ttttgtaaaa ttctagaaaa aatacttgta 660
gtttcctcgc tcatcatagt tatcatcctg gactctcacg ttccaccccc ccacgctcac 720
tactagcact tgctgtagtc ccctctctcg tctatctacc gccctaatgc cgactgcact 780
atgcgatgtc cagataaggt agcaatccac acttctaggt ttgtgaggtg gtgttgaggt 840
accgacttga ttgagacgac tgaaaggacc tccagctaca tctaaaatcc cagaggacgt 900
gcgaagaagg tctttaagcc cctttgtctt ctagcgacca aacccaaccc gtcaaggcga 960
catacatcac gtcgacctcg tcccattgct gaacctaaac ccacgcactc cttgtataac 1020
ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatatgctt ttgcaagctt tccttttcct 1080
tttggctggt tttgcagcca aaatatctgc atcaatgaca aacgaaacta gcgatagacc 1140
tttggtccac ttcacaccca acaagggctg gatgaatgac ccaaatgggt tgtggtacga 1200
tgaaaaagat gccaaatggc atctgtactt tcaatacaac ccaaatgaca ccgtatgggg 1260
tacgccattg ttttggggcc atgctacttc cgatgatttg actcattggg aagatgaacc 1320
cattgctatc gctcccaagc gtaacgattc aggtgctttc tctggctcca tggtggttga 1380
ttacaacaac acgagtgggt ttttcaatga tactattgat ccaagacaaa gatgcgttgc 1440
gatttggact tataacactc ctgaaagtga agagcaatac attagctatt ctcttgatgg 1500
tggttacact tttactgaat accaaaagaa ccctgtttta gctgccaact ccactcaatt 1560
cagagatcca aaggtgttct ggtatgaacc ttctcaaaaa tggattatga cggctgccaa 1620
atcacaagac tacaaaattg aaatttactc ctctgatgac ttgaagtcct ggaagctaga 1680
atctgcattt gctaatgaag gtttcttagg ctaccaatat gaatgtccag gtttgattga 1740
agtcccaact gagcaagatc cttccaaatc ctattgggtc atgtttattt ctatcaatcc 1800
aggtgcacct gctggcggtt ccttcaacca atattttgtt ggatccttca atggtactca 1860
ttttgaagcg tttgacaatc aatctagagt ggtagatttt ggtaaggact actatgcctt 1920
gcaaactttc ttcaacacag acccaacgta cggttcagca ttaggtattg cctgggcttc 1980
aaactgggag tacagtgcct ttgtcccaac taacccatgg agatcatcca tgtctttggt 2040
ccgcaagttt tctttgaaca ctgaatatca agctaatcca gagactgaat tgatcaattt 2100
gaaagccgaa ccaatattga acattagtaa tgctggtccc tggtctcgtt ttgctactaa 2160
cacaactcta actaaggcca attcttacaa tgtcgatttg agcaactcga ctggtaccct 2220
agagtttgag ttggtttacg ctgttaacac cacacaaacc atatccaaat ccgtctttcc 2280
cgacttatca ctttggttca agggtttaga agatcctgaa gaatatttaa gaatgggttt 2340
tgaagccagt gcttcttcct tctttttgga ccgtggtaac tctaaggtca agtttgtcaa 2400
ggagaaccca tatttcacaa acagaatgtc tgtcaacaac caaccattca agtctgagaa 2460
cgacctaagt tactataaag tgtacggcct actggatcaa aacatcttgg aattgtactt 2520
caacgatgga gatgtggttt ctacaaatac ctacttcatg accaccggta acgctctagg 2580
atctgtgaac atgaccactg gtgtcgataa tttgttctac attgacaagt tccaagtaag 2640
ggaagtaaaa tagataactt cgtataatgt atgctatacg aagttatacg aataaattaa 2700
atctattgta ttttactgaa cgcgacatgt accgtatatg ctaagtagta gctgctgtgt 2760
aatggaaccg tacgctaaag tatcgatgcg ccaagctggt acacgtgcac cggttgcgat 2820
ctgagtgtgt gttgtttccg tggtaacggg tgtgaaaagg gagcgtggtt ggaaatggga 2880
atggggtttg ataatttgtt tgtgactgtt gtgtggattt gtatcgagtg tttatgatcg 2940
atgacgttgg taaggggtat cgagaggagc cagaattgga cgtggcaaac tatttgacaa 3000
acggacgcat gggaacggaa cagagtgttg agtgtcgagt acaataattg agatgtagag 3060
ctgaaagtgt ttcagcttat cagcatctgt tgtcgtggta gtttcctgat tacaatgtat 3120
gtacggtagg tgatccccag tcgtgctaca gcgtcacgat cgatggggcg caacaccaca 3180
cactagatcc taaagctcgt gagcatggat gtagtttctg gagttggaat ttcgcaatcc 3240
cttttgccca aacagatctc aactacagtc gcagctagtg agtgtgtgct attggcctgc 3300
tgagtggcgt aaggagacgt catgaaaagt cctcatattg aagcagttta ggggtgatca 3360
gggcagtcga gaagataaat gtgacaagct tggatgtatc aacttcatga ttaactgttg 3420
gggacagcca ctcgaatgtg gaagttgcta atggactcac tcgactcagg cagatgacat 3480
tatgatagaa agtggggtag tttcagttgg atgcactacc aagagagcat tatgttctat 3540
aagtggtgct tgcgaaacat tccgtaaact ccacggaagt tctcagactt tcaatgagtc 3600
tatatctcaa cttctccggt cccgatatct tgtttttgta ttgaggtaca ggtatcgcac 3660
aaaggcggtt cctcggcaat acggggaacg tcattgacgc aaccatg 3707
<210> 64
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
aactgcctcc tcttgagcag gccaag 26
<210> 65
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
ggaacagcag cttgatcttg atgtgc 26
<210> 66
<211> 3809
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
tcacgtgaca gatcctgatg gccccgcgcc ccgcgcccat gcagctcact cacggcttcc 60
cgactctgac ggtatggtgc aaccccacat tagactcaac cgaacgctta gcgagatatt 120
gagcattgtt gactgagaca agagagacag gcaagggagg cgcaaaaata tgtcgaatga 180
ttgaaaaatt gcccagtggg gcaattggta ctcagcggag taagttttta cccagaatcc 240
attggaatat ccgtgatttg aatggtttga agatgtggat ctggatgctc aggctatttg 300
ttatatgaga tagtacgaat acgactctaa gttgactata agtacgacta tcgctgaaaa 360
aattacacca ttggatttgt ctggctgaga gctctctaat ggtgtgttta tttttcacac 420
aacttggata tttcggccaa taaccgatgg ccatggataa ttatagtagg tacaactaat 480
tagcggttat tgtacagaaa acaaagaaac taagcatcta aggtctccca aacacttgta 540
ttaggtcagc agaagagctt ctacgatgac cacgatgtca acctctcaat catgtcaacc 600
tctcagtcaa ctcagcacct atcctccttc catttttccc attttcatca ttttttcatt 660
tccgagagta tccgaaaatt tgtcatgcat attgctcctg tttttcccgc cgcagccatg 720
cctttggcga atggactact ttccgccccg tatcttagta atcacccgtt gtgtcgtctt 780
agtcatccag caactgagag atataattga aaagccacac gccgttgcgc aaattcaatc 840
gcctcaactc tactgatctg attactaacc cccccgtctc tcgcaccctc tatgaacatg 900
caccctgcaa gccaacctta aaaatgcaca gtaactgtca acctgcatat actgcccact 960
atctccaacc aacctttcaa agtgttttcc cggcttcttt tgcgaccgtt ccaccgactc 1020
cacttcacgc ccccagctct acgaagcgcc aacatacaca caataacttc gtataatgta 1080
tgctatacga agttatatgc ttttgcaagc tttccttttc cttttggctg gttttgcagc 1140
caaaatatct gcatcaatga caaacgaaac tagcgataga cctttggtcc acttcacacc 1200
caacaagggc tggatgaatg acccaaatgg gttgtggtac gatgaaaaag atgccaaatg 1260
gcatctgtac tttcaataca acccaaatga caccgtatgg ggtacgccat tgttttgggg 1320
ccatgctact tccgatgatt tgactcattg ggaagatgaa cccattgcta tcgctcccaa 1380
gcgtaacgat tcaggtgctt tctctggctc catggtggtt gattacaaca acacgagtgg 1440
gtttttcaat gatactattg atccaagaca aagatgcgtt gcgatttgga cttataacac 1500
tcctgaaagt gaagagcaat acattagcta ttctcttgat ggtggttaca cttttactga 1560
ataccaaaag aaccctgttt tagctgccaa ctccactcaa ttcagagatc caaaggtgtt 1620
ctggtatgaa ccttctcaaa aatggattat gacggctgcc aaatcacaag actacaaaat 1680
tgaaatttac tcctctgatg acttgaagtc ctggaagcta gaatctgcat ttgctaatga 1740
aggtttctta ggctaccaat atgaatgtcc aggtttgatt gaagtcccaa ctgagcaaga 1800
tccttccaaa tcctattggg tcatgtttat ttctatcaat ccaggtgcac ctgctggcgg 1860
ttccttcaac caatattttg ttggatcctt caatggtact cattttgaag cgtttgacaa 1920
tcaatctaga gtggtagatt ttggtaagga ctactatgcc ttgcaaactt tcttcaacac 1980
agacccaacg tacggttcag cattaggtat tgcctgggct tcaaactggg agtacagtgc 2040
ctttgtccca actaacccat ggagatcatc catgtctttg gtccgcaagt tttctttgaa 2100
cactgaatat caagctaatc cagagactga attgatcaat ttgaaagccg aaccaatatt 2160
gaacattagt aatgctggtc cctggtctcg ttttgctact aacacaactc taactaaggc 2220
caattcttac aatgtcgatt tgagcaactc gactggtacc ctagagtttg agttggttta 2280
cgctgttaac accacacaaa ccatatccaa atccgtcttt cccgacttat cactttggtt 2340
caagggttta gaagatcctg aagaatattt aagaatgggt tttgaagcca gtgcttcttc 2400
cttctttttg gaccgtggta actctaaggt caagtttgtc aaggagaacc catatttcac 2460
aaacagaatg tctgtcaaca accaaccatt caagtctgag aacgacctaa gttactataa 2520
agtgtacggc ctactggatc aaaacatctt ggaattgtac ttcaacgatg gagatgtggt 2580
ttctacaaat acctacttca tgaccaccgg taacgctcta ggatctgtga acatgaccac 2640
tggtgtcgat aatttgttct acattgacaa gttccaagta agggaagtaa aatagataac 2700
ttcgtataat gtatgctata cgaagttatc tgaaacatag caattgatag acaagatttc 2760
gtacacacat tccacattct atggacaccc ccgctgttca acaccatctt tttattcaaa 2820
ttattcagca cttagcagca actcattttt tttctcagtt gcgtctccga accatcttcc 2880
catgcatggc aataatgagc agtctggtgg ggagacgacc atcgtcgcta gagaaagcca 2940
cagcccgctt ttttctgtcc aactttccac gtgtaggcac actagcagac cgtttgaggg 3000
catacggcgg cttaacatac tcatacccgt cctcaggagt ggtcatggga gtgtcgtact 3060
cagactcaag cttgatgctg atctcctcgg cctcctcgag cggccggtcg tatgagtcct 3120
gctcgtcaga cgcatcatgg aacgattcat tatcagatga gtctgaagat gcggccgact 3180
cgtcaatcgc agagttgcca cactccacag aggtcgtggt gccttgaggt gatccatggt 3240
cgtcatctga gtcggccttg tcatcaaact tcagggcttc agttttgaca gcaggtgact 3300
cggcttcatt gacaggggta gtgggctttg ctgggcaagc cgggccagcc gggccagccg 3360
gatcagaatg cttagacgga gccgcgttgg atgcttcagc gaccaactca gtagggtcaa 3420
cagtctccac cgcagcagtc tccgactcag cagtgtctga agccgacttc gaaacagcaa 3480
cggaaccaaa agcgtctact gactccgcag atgacccaga agcagtcgca ggctcaggcg 3540
agtcagaggg ggtcttgggt gttagagctt tagctgaggt agagggctcg tcagactcga 3600
cctggggttc agaaaactcg atctggggtt tagaagtttc gacctggggt tcagaagact 3660
cgacctggag tctagaagac tcaacctgac gctcagaaga ctcaacctgg ggttcagaaa 3720
actcggccac ctgacgctca ggagactcga tctggggttc agaagactcg accaccgcgg 3780
gcccagaaga ctcatcaatc cgagcctct 3809
<210> 67
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gactggatct ttcgactcaa cagctc 26
<210> 68
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
ccaaagacac aatcacgtca ttggcc 26
<210> 69
<211> 3900
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
agcatcccca tctacaacaa ggatacatct ctggagatcc tgcaggtgct gacgtcgcac 60
actaccaacc ctaataccgc cgtggactac tacaagaacc tccgcgactc tctgggcttt 120
tcaggtctcg tttgtctcac ggagcctctt tctcgagtcg atccgtccac tgcaacctcc 180
atggtcccta aacttcttgc tctggttaac agtgaggtgc ccctggagta tctcaccgag 240
ctcatgaagt acgctccgga ccgggtgttt gaatttgcat gcgaaactcg gcagaagaat 300
actctgcaag acatgtctgt ggagtcagta gaggcgtttg tggtggcgag tctcaacagc 360
ggcatcgccc cttatttggt gttccggttc ctcatgaacc tgagatccgt ggccacctct 420
tgcatctccg tgtcggctct aaagacagtg ctgctggaaa tggaccccga agacgccaag 480
aaggagtacc gggagtttgt cgaagacatc tccaggggaa acatttgcat cgacaagctg 540
tgggtcgcca agcacttgca tcacgagacg tacggctgcg atctccagcc gtactttgat 600
cccgctcgtc tggacgacat ctccgccaag ggcgagtatc tgatccccaa catttttgac 660
ggtctctacg ccggtgcaga gatcccctgc cattctgtgt tttacaacta caccacgttc 720
gacaaggacc tgcgaactga gggaactggg gtggaactga gcacccgctt cgacggcaag 780
ctcaaggagg agtacactaa aaagtacacg gaagctttca cttgtaaata gtaatttatg 840
catttcttat gataggacaa ggtagttaga gctcctcgtt cttgtacata ggttgctatc 900
cctacttgta gttattggta gaggtgggtt agacaaaaca aaaggatagc aatactcacc 960
agtgaacctc attgaatact acaaatttat ttttctggtt tttcccccgt tactaggaaa 1020
tttccccttg cagaaatgtt cgtcagcatt cgacacccca tgcattaagt ctgcgcgcgt 1080
gcatatatag caacgcactc aaaccttgga cttgtacttg tactctctca tcacctcgtt 1140
ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatatgctt ttgcaagctt tccttttcct 1200
tttggctggt tttgcagcca aaatatctgc atcaatgaca aacgaaacta gcgatagacc 1260
tttggtccac ttcacaccca acaagggctg gatgaatgac ccaaatgggt tgtggtacga 1320
tgaaaaagat gccaaatggc atctgtactt tcaatacaac ccaaatgaca ccgtatgggg 1380
tacgccattg ttttggggcc atgctacttc cgatgatttg actcattggg aagatgaacc 1440
cattgctatc gctcccaagc gtaacgattc aggtgctttc tctggctcca tggtggttga 1500
ttacaacaac acgagtgggt ttttcaatga tactattgat ccaagacaaa gatgcgttgc 1560
gatttggact tataacactc ctgaaagtga agagcaatac attagctatt ctcttgatgg 1620
tggttacact tttactgaat accaaaagaa ccctgtttta gctgccaact ccactcaatt 1680
cagagatcca aaggtgttct ggtatgaacc ttctcaaaaa tggattatga cggctgccaa 1740
atcacaagac tacaaaattg aaatttactc ctctgatgac ttgaagtcct ggaagctaga 1800
atctgcattt gctaatgaag gtttcttagg ctaccaatat gaatgtccag gtttgattga 1860
agtcccaact gagcaagatc cttccaaatc ctattgggtc atgtttattt ctatcaatcc 1920
aggtgcacct gctggcggtt ccttcaacca atattttgtt ggatccttca atggtactca 1980
ttttgaagcg tttgacaatc aatctagagt ggtagatttt ggtaaggact actatgcctt 2040
gcaaactttc ttcaacacag acccaacgta cggttcagca ttaggtattg cctgggcttc 2100
aaactgggag tacagtgcct ttgtcccaac taacccatgg agatcatcca tgtctttggt 2160
ccgcaagttt tctttgaaca ctgaatatca agctaatcca gagactgaat tgatcaattt 2220
gaaagccgaa ccaatattga acattagtaa tgctggtccc tggtctcgtt ttgctactaa 2280
cacaactcta actaaggcca attcttacaa tgtcgatttg agcaactcga ctggtaccct 2340
agagtttgag ttggtttacg ctgttaacac cacacaaacc atatccaaat ccgtctttcc 2400
cgacttatca ctttggttca agggtttaga agatcctgaa gaatatttaa gaatgggttt 2460
tgaagccagt gcttcttcct tctttttgga ccgtggtaac tctaaggtca agtttgtcaa 2520
ggagaaccca tatttcacaa acagaatgtc tgtcaacaac caaccattca agtctgagaa 2580
cgacctaagt tactataaag tgtacggcct actggatcaa aacatcttgg aattgtactt 2640
caacgatgga gatgtggttt ctacaaatac ctacttcatg accaccggta acgctctagg 2700
atctgtgaac atgaccactg gtgtcgataa tttgttctac attgacaagt tccaagtaag 2760
ggaagtaaaa tagataactt cgtataatgt atgctatacg aagttataga aataactaac 2820
taccacacca acacatgaaa tagatggaaa ttacatacat ggtaaactaa accagcatgg 2880
ccaaaagagg agcaaggacc agagcaccca ccttcatctt agtagcagag ttggcctggg 2940
gagtctcagg ctcagggccg ggggtgacag gggactcagg agtaggctct tcaggtctag 3000
gagcaggagt ctcgggctca gggccggggg tcacggggac ctcaggagta ggctcttcag 3060
gtctgggagc aggagtctcg ggctcagggc cgggggtgac gggggcctca ggagtaggct 3120
cttcaggtct gggagcagga gtctcgggct cagggccggg ggtaacgggg acctcaggag 3180
taggctcagg cttaacgaca ggctcctcag gcttggaaag cgtctcggga gtaggctcgg 3240
gcttaacgat gggcttctca ggagtgggct cgggcttaac gatgggcttc tcagaggtgg 3300
gctctggctt aacaacaggc ttctcaggag tgggctcggg cttaaccacg ggcttctcag 3360
gagaaggctg gggcttggta accagggtgg taggcttagg ctggggctta ggagtagact 3420
cgactggaat atcggtgggg tcacaaggga gaacaacggt aatagtcttg ttgtcaatca 3480
cagtgacgac agtggtggtg atatggttag tggggacaac ggtggtgaga gtcacagggg 3540
tctcagagca agtgtccatc tcgcagacag tgacggtctg ggtaaccacg gtggtgatat 3600
tggatgtaat ggtctcagta tcgcagccgt catcgcaaac agtctcggtc tgagtggcaa 3660
cagggatggg ggtagcaggt ccacagtcgt catcacaatc agtgacggtc ttcgtaacaa 3720
ccacacagcc accatcatca cactcggtta cagtcacagt tacaactggg atggaggtgg 3780
caggctcaca gccgtcatca cagtcagtga tagtctgggt aataacgggt tcggatgtga 3840
ctgcagggga agactgagaa atggaggagg tctctgcagt gacagttggc tcagaggagg 3900
<210> 70
<211> 837
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 70
atgcctgcac cagcaaccta cgctactggc ttgacgcccc ttcccacccc cgtccctaag 60
gtatccaaga acatcatgga gcgattctct ctgaagggaa aggttgcctc tatcaccggt 120
tcttcttctg gaatcggatt cgctgttgct gaggcatttg cccaggctgg tgccgatgtc 180
gcgatctggt acaactccaa gccttccgat gagaaggctg agtatctgtc caagacatac 240
ggagtccgat ctaaggctta caaatgtgct gtgaccaacg ccaagcaggt cgagaccact 300
atccaaacca tcgaaaagga ctttggaaag attgacatct tcatcgccaa cgcgggtatc 360
ccatggactg ctggtccaat gatcgatgtc cctaacaacg aggagtggga caaggttgtt 420
gacctggatc tcaacggtgc ctattattgc gccaagtacg ccggccagat cttcaagaag 480
cagggctacg gctccttcat cttcaccgcc tccatgtctg gccatattgt caatatcccc 540
cagatgcagg cctgctacaa cgcagctaag tgtgctgtcc tccatctgtc ccgatctctg 600
gccgtggagt gggctggatt cgctcgatgt aatacagtgt cccctggtta catggctacc 660
gagatttctg acttcatccc acgagacaca aaggagaagt ggtggcagct catccccatg 720
ggccgagagg gagatccttc tgagcttgct ggagcctata tttacctggc ttcggatgcc 780
tcaacttata ccactggtgc agacattctg gttgatggcg gctactgttg tccttga 837
<210> 71
<211> 771
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 71
atgtctggac cttccaccct cgccacggga ctgcaccctc tccccacaga gaccccaaag 60
ttccccacca acatcatgga ccgattctcc ctcaagggta aggttgcctc cgtcaccggc 120
tcctcgtcag gtatcggcta ctgcgtggcc gaggcctacg cccaggccgg tgccgacgtg 180
gccatctggt acaactccca ccccgccgac gcaaaggctg agcacctcgc taagacctac 240
ggcgtcaagg ccaaggccta caagtgccct gtcaccgacg ccgccgccgt ggagtccacc 300
atccagcaga tcgagaagga ctttggcacc attgacatct tcgtcgccaa cgctggtgtc 360
ccctggaccg ccggccccat gatcgacgtg cccgacaaca aggagtggga caaggtcatc 420
aacctggatc tcaacggtgc ctactactgc gccaagtacg ccggccagat cttcaagaag 480
aagggcaagg gatccttcat cttcaccgcc tccatgtccg gccacattgt caacatcccc 540
cagatgcagg cctgctacaa cgccgccaag gccgctctgc tgcacctgtc tcgatcgctg 600
gccgtcgagt gggccggctt tgcccgatgc aacacagtct cccctggcta catggccacc 660
gagatctccg actttgtccc caaggagacc aaggagaagt ggtggcagct cattcccatg 720
ggccgagagg gagacccctc cgagctctac ctacctctac cttgcctctg a 771
<210> 72
<211> 1032
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 72
atgtctctct tttcactcgc caagaaaacc gccgtcatca ccggaggaag tggtggtctg 60
ggtatcgcag ctgccaagca gcttcttcga gccggagcct ctgttgctct ggtcgacaac 120
aacctgcctc gaatccagcc tgctgccgag cagcttctag agtggtacaa gaccgccaac 180
gaggctcatc ataacgtccg accaaccccc atctatgcct ctcctactgg cacacacaag 240
gtttctgaaa cagaaacaga atcaacaact gggggcttga acgagcactc tccacacgat 300
atcaccaagc ctgacatctc tctggatgct tctgcagact ccagtcagtc gtctgttgcc 360
cacgacgctg ctcgagccca cgaagctgca ggaatacctc ctggaaaggg caagaacttt 420
ccccagcaac gaatctctgc ctgggcatgc gatgtatctg acgtccacca ggtctccgat 480
accgtcaagg ccattcgaga gcaccacaag agccccctcg atattttggt caactgtgcc 540
ggattctgcg agaatatgac tgcctttgat tatcccaacc cccaggtcaa gcgactgctg 600
gacgtcaacc tcatgggatc ctacaacttc gctaccgagg tggccaagtc gcttgtcctg 660
gacgagtctc ctggatctct gattctggtt gcatccatga gtggctccat tgtcaacgac 720
ccccagcccc agacccccta caacatgtcc aaggcaggtg tcatccacat ggccaagtct 780
ctggctgccg agtgggccca gtacaacatc cgagtcaaca ctctgtctcc cggctacatt 840
cttactcctc tgacccgtca catcatcgag actgacggag agctccgaaa cgactgggag 900
cgacgaattc ctttccgacg aatggctgag cccgaggagt ttggaggccc tattgtcttc 960
atggcttccg acgcctccag ctacatgacc ggccacgatc tcattgtcga tggaggttac 1020
accatctggt aa 1032
<210> 73
<211> 876
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 73
atgtccaact ccgccaaagc cgctgtcgtg ccccccgccc ccaccgccga agatatcgcc 60
cgagccaacg ccggatccaa ggaagagccc gttttccagg ctaagaactt tctgtccaag 120
ttccgactcg atggcaaggt agccattgtg actggtggag ctcgaggact cggattctcc 180
atggccgagg gtctgtgttc ggtcggcctc aagggcattg ccattctgga tgtgcagcag 240
gacctgggtc tggatgccat tgagaagctg cacaaggcct acggagtgca ggcccagttc 300
tacaaggccg acgtccgaga cgaggagtcc gtcaacgaga tcatcgaccg agttgtgcac 360
gatctcgggt ccgtcgacgt tgtggtcaac tccgccggtg ttgctgacct tgttcacgca 420
gctgagtacc ccgcagacaa gttccgacga gtcatcgaca tcaaccttaa cggatccttc 480
ttggtgaccc aggccgccgc ccgacacatg atcaagcagg gcaccggcgg aaccgtggtg 540
ttcatcgcct ccatgtccgg atccattgtc aactggcccc agcctcagag cgcttacaac 600
gcctccaagg ctgccgtcaa gcacctgtct aagtcgctgg ccgccgagtg ggccgtccac 660
aacatccgat gcaactccat ctcgcctgga tacatggata ccgctcttaa ccgagcctac 720
aacactctgt ttgaggagtg gaaggaccga acccccctcg gccgactcgg agaccccgac 780
gagctcaccg gcgcctgcat ctacctggct tccgatgcct cttcgtacgt gaccggatcc 840
gacattatca ttgatggtgg ttacactatt atttaa 876
<210> 74
<211> 2085
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 74
atggctcccc aattttcaaa gactgacgag actgccatca acaccatccg aaccttggct 60
attgatgctg tggccaaggc taactccggc caccccggtg cccccatggg tctggctcct 120
gttgcccacg ttctgtggaa ctactacatg aacttcacct cctccaaccc cgagtggatc 180
aaccgagacc gattcattct ctccaacgga cacgcctgca tgctgcacta ctccctgttg 240
cacctgtttg gctacgacat cactatcgat gatctcaaga acttccgaca gctcaactcc 300
aagactcccg gccaccccga ggctgagact cccggtatcg aggtcaccac cggtcccctg 360
ggtcagggtg tctccaacgc tgttggtttc gccattgccc aggcccacct tggcgccacc 420
tacaacaagc ctggctacga catcatcaac aactacactt actgcatctt cggagatggt 480
tgcatgatgg agggtgttgc ctccgaggct atgtctcttg ccggacatct gcagctcggt 540
aacctcatca ccttctacga tgataaccac atttccattg acggtgacac caacgtggcc 600
ttcaccgagg acgtcagcca gcgacttgag gcctacggat gggaggtcat ctgggtcaag 660
gacggtaaca acgatctggc cggcatggct gctgccatcg agcaggccaa gaagtccaag 720
gacaagccca cttgtatccg actcaccacc atcattggtt acggctctct gcagcagggt 780
acccacggtg ttcacggctc tcctctcaag cctgatgata tcaagcagtt caaggagaag 840
gttggcttca accccgagga gacctttgcc gtccccaagg agaccactga tctctacgcc 900
aagactattg accgaggcgc caacgccgag aaggagtgga acgagctctt cgccaagtac 960
ggtaaggagt atcccaagga gcactctgag atcatccgac gattcaagcg agagctgccc 1020
gagggatggg agaaggctct gcctacctac acccccgccg acaatgccgt tgcttctcga 1080
aagctgtccg agattgtcct caccaagatc cacgaggtcc tccccgagct tgttggtggt 1140
tccgccgatc tgaccggctc aaacctgacc cgatggaagg acgctgttga tttccagcct 1200
cctgtcaccc accttggtga ctactccggc cgatatatcc gatacggtgt tcgagagcac 1260
ggcatgggcg ctatcatgaa cggtatgaac gcttacggag gtatcatccc ctacggaggt 1320
actttcctta acttcgtctc ctacgccgct ggtgccgtcc gactgtctgc cctgtctggc 1380
caccacgtta tctgggttgc tacccatgac tccattggtc tgggtgagga tggccctacc 1440
catcagccca ttgagactgt cgcctggctc cgagccaccc ccaacctctc tgtgtggcga 1500
cctgccgacg gtaacgagac ctccgctgct tactacaagg ccatcaccaa ctaccacact 1560
ccctctgtcc tgtctctgac ccgacagaac ctgcctcagc ttgagggctc ttccatcgag 1620
aaggcctcca agggtggtta ccagctcatc tccgaggaca agggtgacat ctaccttgtg 1680
tccactggtt ctgaggttgc catctgtgtt gctgccgcca agctcctcaa ggagaagaag 1740
ggtatcactg ccggtgtcat ctctctgccc gactggttca ccttcgagca gcagtctctc 1800
gagtaccgaa agtctgtttt ccccgatggc atccccatgc tttccgtcga ggtctactcc 1860
gactttggct ggtctcgata ctctcaccag cagtttggtc tggaccgatt cggtgcttct 1920
gctcccttcc agcaggtcta cgatgccttt gagttcaatg ccgagggtgt cgccaagcga 1980
gctgaggcca ccattaacta ctacaagggc cagactgtca agtctcctat tcagcgagcc 2040
ttcgacccca ttgacgtcaa cacccgaccc ggccacggtg tctaa 2085
<210> 75
<211> 1044
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 75
atgccccctt tcaccctggc agacactacg gcgatacagg tgctcatgtc ggcgacacag 60
gatacccgct cggacttcac gcacaagctg gcgccgctgc tgcacctgct gtacacccgg 120
tttgtgcagt gcaaccacat gaaccccatg tggatcaacg gcgacaagat tctcttttcg 180
tgtggcgaca tgacaacgat ccagagtcac gtgttgcgct actccgggta caacgtcgac 240
gaccgggagc ttgaactgag caaatatgga gctgaggcgt ttttcaatca gtttcaggag 300
agcggaaatg gctacaaacc caaggtggtg gtgggcgata ccgggtctgg gtttgtggag 360
gccgtgggag tggctctgga cacgcaggag cttgcggaga acttcaacaa gccgaatttc 420
cctctgatca cggcaaaaac atgggtcgtg ttcgacgagg aggctgctct atcgtcggac 480
gcaactaagg ccgcagaagc agctgtcgaa gcggaactca ataatctgat tggtattctt 540
gtggctgcat ctccccaaac agtgcggttt taccatatga tgggctggcg gctgctggag 600
gttgtggatc tcagtgatct ggcgcaactc gaggcagtca tcgtggaggc gcttcaggag 660
cctcacatgc ctgtggttgt gcatatcaga agcattgagc ggtccttgga gagtgatgtg 720
agcgataaca cgctggtgga cgagtatcat agatggggcg atgtgccggt tgagagtgac 780
cagagcgtta ccacaagtct gtatacccgt tttgccatta tcaacgcgtc gcgtgagctt 840
gcatggaatc atctgaggga agggtacaag gcattctttc ctgcagattc ggctgctctg 900
gaggaggtta agagggagct tgaggagtgt tattatgatg agagggaaca agagggaggg 960
tcaaaggagg ggctgacggt gcctctggag aggagtagtc ggagtactcc tagtaggacg 1020
ccaaggctct gtgccgggtt atag 1044
<210> 76
<211> 1623
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 76
atgtatctcg gactggatct ttcgactcaa cagctcaagg gcatcattct ggacacaaaa 60
acgctggaca cggtcacaca agtccatgtg gactttgagg acgacttgcc gcagttcaac 120
accgaaaagg gcgtctttca cagctctaca gtggccggag aaatcaatgc tcctgtggca 180
atgtgggggg cagctgtgga cttgctgata gagcgtctgt caaaggaaat agacctttcc 240
acgatcaagt ttgtgtcggg ctcgtgccag caacacggct ctgtttatct caacagcagc 300
tacaaggagg gcctgggttc tctggacaaa cacaaagact tgtctacagg agtgtcatcc 360
ttactggcgc tcgaagtcag ccccaattgg caggatgcaa gcacggagaa ggagtgtgcg 420
cagtttgagg ctgcagtcgg cggtcccgag cagctggctg agatcactgg ctctcgagca 480
catactcgtt tcaccgggcc ccagattctc aaggtcaagg aacgcaaccc caaggtattc 540
aaggccacgt cacgggtcca gctcatatcc aactttctag catctctgtt tgccggcaag 600
gcgtgcccct ttgatcttgc tgacgcctgt ggaatgaatc tgtgggacat ccagaatggc 660
cagtggtgca agaaactcac agatctcatc accgatgaca cccactcggt cgagtccctc 720
cttggagacg tggaaacaga ccccaaggct ctactgggca aaatctcgcc ctatttcgtc 780
tccaagggct tctctccctc ttgtcaggtg gcacagttca caggcgacaa cccaggcact 840
atgctggctc tccccttaca ggccaatgac gtgattgtgt ctttgggaac atctacgacc 900
gccctcgtcg taacaaacaa gtacatgccc gaccccggat accatgtgtt caaccacccc 960
atggagggat acatgggcat gctgtgctac tgcaacggag gtctagcacg agagaagatc 1020
cgagacgagc ttggaggctg ggacgagttt aatgaggcgg ccgagaccac caacacagtg 1080
tctgctgacg atgtccatgt tggcatctac tttccactac gagaaatcct tcctcgagca 1140
ggtccctttg aacgacgttt catctacaac agacaaagtg aacagcttac agagatggct 1200
tctccagagg actcactggc aaccgaacac aaaccgcagg ctcaaaatct caaggacacg 1260
tggccgccac aaatggacgc cactgccatc attcaaagcc aggccctcag tatcaaaatg 1320
agactccaac gcatgatgca tggcgatatt ggaaaggtgt attttgtggg aggcgcctcg 1380
gtcaacactg ctatctgcag cgtaatgtct gccatcttaa aaccaacaaa gggcgcttgg 1440
agatgtggtc tggaaatggc aaacgcttgt gccattggaa gtgcccatca cgcctggctt 1500
tgcgacccca acaagacagg ccaggtacag gttcacgaag aagaggtcaa atacaagaat 1560
gtggacacag acgtgctact caaggcgttc aagctggccg aaaacgcctg cctggagaaa 1620
taa 1623
<210> 77
<211> 732
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 77
atgtcctccg aactgcctcc tcttgagcag gccaagcgaa tcgccgccca ccaggccgtg 60
gagcaacact accccaagga cgccaaggtc gtgggcattg gctcaggatc caccgtggtc 120
tacgttgccg agaagattgc gtcgttgccc aaggagctca ccaaggacac cgtgttcatt 180
tctacgggtt tccagagcaa gcagctgatc cagaacgccg ggttgcgact gggatgcatc 240
gaccagtact ccaacggaga tctggacgtg gcgtttgacg gcgccgacga gaccgaccct 300
cagctcaact gcatcaaggg cggaggagca tgcctcttcc aggaaaagat tgtcgccgag 360
tgtgcccgca agtttgtcgt ggtggccgac taccgaaaac agtccaaggc tctgggcacc 420
gtgtggatcc agggtatccc cattgaggtg gtgcccgacg cctacaacaa ggtaattgct 480
gatctcaaga agatgggcgc ccagtccgcg gtgctgcgac ccggctctcc cggaaaggcg 540
ggccccatca tcaccgacaa tggcaacttc attgtcgacg cctactttgg cgagatccaa 600
cccgacgccg tcaaggacct gcacatcaag atcaagctgc tgttgggcgt cgttgagacc 660
ggcctcttca ctaacgcgga cgtagcgtac tttggaaacg ccgacggaac catctccacc 720
attaccaagt aa 732
<210> 78
<211> 41
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 78
ctgcagacta aatttatttc agtctcctct tcaccaccaa a 41
<210> 79
<211> 2126
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 79
ctgcagacta aatttatttc agtctcctct tcaccaccaa aatggctccc caattttcaa 60
agactgacga gactgccatc aacaccatcc gaaccttggc tattgatgct gtggccaagg 120
ctaactccgg ccaccccggt gcccccatgg gtctggctcc tgttgcccac gttctgtgga 180
actactacat gaacttcacc tcctccaacc ccgagtggat caaccgagac cgattcattc 240
tctccaacgg acacgcctgc atgctgcact actccctgtt gcacctgttt ggctacgaca 300
tcactatcga tgatctcaag aacttccgac agctcaactc caagactccc ggccaccccg 360
aggctgagac tcccggtatc gaggtcacca ccggtcccct gggtcagggt gtctccaacg 420
ctgttggttt cgccattgcc caggcccacc ttggcgccac ctacaacaag cctggctacg 480
acatcatcaa caactacact tactgcatct tcggagatgg ttgcatgatg gagggtgttg 540
cctccgaggc tatgtctctt gccggacatc tgcagctcgg taacctcatc accttctacg 600
atgataacca catttccatt gacggtgaca ccaacgtggc cttcaccgag gacgtcagcc 660
agcgacttga ggcctacgga tgggaggtca tctgggtcaa ggacggtaac aacgatctgg 720
ccggcatggc tgctgccatc gagcaggcca agaagtccaa ggacaagccc acttgtatcc 780
gactcaccac catcattggt tacggctctc tgcagcaggg tacccacggt gttcacggct 840
ctcctctcaa gcctgatgat atcaagcagt tcaaggagaa ggttggcttc aaccccgagg 900
agacctttgc cgtccccaag gagaccactg atctctacgc caagactatt gaccgaggcg 960
ccaacgccga gaaggagtgg aacgagctct tcgccaagta cggtaaggag tatcccaagg 1020
agcactctga gatcatccga cgattcaagc gagagctgcc cgagggatgg gagaaggctc 1080
tgcctaccta cacccccgcc gacaatgccg ttgcttctcg aaagctgtcc gagattgtcc 1140
tcaccaagat ccacgaggtc ctccccgagc ttgttggtgg ttccgccgat ctgaccggct 1200
caaacctgac ccgatggaag gacgctgttg atttccagcc tcctgtcacc caccttggtg 1260
actactccgg ccgatatatc cgatacggtg ttcgagagca cggcatgggc gctatcatga 1320
acggtatgaa cgcttacgga ggtatcatcc cctacggagg tactttcctt aacttcgtct 1380
cctacgccgc tggtgccgtc cgactgtctg ccctgtctgg ccaccacgtt atctgggttg 1440
ctacccatga ctccattggt ctgggtgagg atggccctac ccatcagccc attgagactg 1500
tcgcctggct ccgagccacc cccaacctct ctgtgtggcg acctgccgac ggtaacgaga 1560
cctccgctgc ttactacaag gccatcacca actaccacac tccctctgtc ctgtctctga 1620
cccgacagaa cctgcctcag cttgagggct cttccatcga gaaggcctcc aagggtggtt 1680
accagctcat ctccgaggac aagggtgaca tctaccttgt gtccactggt tctgaggttg 1740
ccatctgtgt tgctgccgcc aagctcctca aggagaagaa gggtatcact gccggtgtca 1800
tctctctgcc cgactggttc accttcgagc agcagtctct cgagtaccga aagtctgttt 1860
tccccgatgg catccccatg ctttccgtcg aggtctactc cgactttggc tggtctcgat 1920
actctcacca gcagtttggt ctggaccgat tcggtgcttc tgctcccttc cagcaggtct 1980
acgatgcctt tgagttcaat gccgagggtg tcgccaagcg agctgaggcc accattaact 2040
actacaaggg ccagactgtc aagtctccta ttcagcgagc cttcgacccc attgacgtca 2100
acacccgacc cggccacggt gtctaa 2126

Claims (10)

1.一种能合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株的构建方法，其特征在于，以解脂耶氏酵母菌株为底盘微生物，通过代谢工程或基因工程手段，构建以葡萄糖、果糖、甘油、淀粉中的一种或几种为碳源发酵合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株的方法。
2.如权利要求1所述的构建能合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株的方法，其特征在于，所述底盘微生物为基因组中含有与SEQ ID NO.3序列具有97％及以上同源性的DNA序列的解脂耶氏酵母菌株。
3.如权利要求2所述的构建能合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株的方法，其特征在于，所述底盘微生物为能合成赤藓糖醇的解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)ery929 CGMCC No.18478。
4.如权利要求1或3所述的构建能合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株的方法，其特征在于，在底盘微生物解脂耶氏酵母细胞中表达以下基因的一种或一种以上：
(1)编码木糖醇脱氢酶的基因；
(2)编码5-磷酸木糖醇脱氢酶的基因；
(3)编码5-磷酸木酮糖磷酸酶的基因；
(4)编码木糖醇转运蛋白的基因；
(5)编码NADP转氢酶的基因。
5.如权利要求1或4所述的构建能合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株的方法，其特征在于，包括在底盘微生物解脂耶氏酵母细胞中敲除或下调表达其自身的以下基因中的一种或一种以上：
(1)甘露醇脱氢酶基因；
(2)阿拉伯糖醇脱氢酶基因；
(3)转酮酶基因；
(4)木酮糖激酶基因；
(5)5-磷酸核酮糖异构酶基因。
6.一种如权利要求1-5中任一项所述的构建能合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株的方法构建得到的能合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株。
7.如权利要求6所述的能合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株，其特征在于，所述菌株为解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)ery959ΔTKLΔMDHΔArDHΔRPIΔXKS1CGMCCNo.18479。
8.一种利用如权利要求6或7所述的能合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株发酵合成木糖醇的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、将解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)ery959ΔTKLΔMDHΔArDHΔRPIΔXKS1CGMCC No.18479菌株培养于含碳源、氮源、无机盐以及水的培养基中，在起始pH值3.0～7.0，温度25～35℃条件下振荡或者搅拌发酵培养，发酵结束后菌液分离得到含木糖醇的发酵液以及酵母细胞；
S2、从所述含木糖醇的发酵液以及酵母细胞中分离纯化得到木糖醇。
9.如权利要求8所述的利用能合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株发酵合成木糖醇的方法，其特征在于，步骤S1中，所述培养基中的碳源为葡萄糖、果糖、甘油、淀粉中的一种或几种混合，所述培养基中碳源含量为50～350克/升；所述培养基中的氮源为蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、磷酸氢二铵、柠檬酸铵、氨基酸中的一种或几种的混合；所述培养基中的无机盐为硫酸镁、氯化锰、氯化铜、氯化锌中的一种或一种以上。
10.如权利要求8所述的能合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母菌株发酵合成木糖醇的方法，其特征在于，步骤S2中，所述分离纯化包括：菌液分离得到澄清含木糖醇的发酵液、浓缩得到富含木糖醇浓缩液、一次结晶得到木糖醇粗制品、粗制品重溶、离子交换去除离子、脱色、浓缩、二次结晶得到木糖醇精制品、干燥。
CN201911111632.4A 2019-11-14 2019-11-14 合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母的构建方法及其菌株 Active CN110878261B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911111632.4A CN110878261B (zh) 2019-11-14 2019-11-14 合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母的构建方法及其菌株
PCT/CN2020/089747 WO2021093289A1 (zh) 2019-11-14 2020-05-12 合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母的构建方法及其菌株
US17/737,012 US20220259622A1 (en) 2019-11-14 2022-05-04 Construction method and recombinant yeast stain yarrowia lipolytica for xylitol synthesis

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911111632.4A CN110878261B (zh) 2019-11-14 2019-11-14 合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母的构建方法及其菌株

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110878261A true CN110878261A (zh) 2020-03-13
CN110878261B CN110878261B (zh) 2022-05-06

Family

ID=69729501

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911111632.4A Active CN110878261B (zh) 2019-11-14 2019-11-14 合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母的构建方法及其菌株

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20220259622A1 (zh)
CN (1) CN110878261B (zh)
WO (1) WO2021093289A1 (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111690549A (zh) * 2020-05-18 2020-09-22 天津大学 利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌株及构建方法和应用
CN112365920A (zh) * 2020-09-30 2021-02-12 中国农业科学院蜜蜂研究所 一种鉴定蜜蜂分化关键基因的方法及鉴定得到的基因和应用
WO2021093289A1 (zh) * 2019-11-14 2021-05-20 上海交通大学 合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母的构建方法及其菌株
CN113444750A (zh) * 2021-08-19 2021-09-28 河北工程大学 一种恒流弱电场胁迫下海水非灭菌高渗发酵甘油生产d-阿拉伯糖醇的方法
CN113801896A (zh) * 2021-10-11 2021-12-17 上海交通大学 发酵产泡沫能力降低的解脂耶氏酵母菌的构建方法和应用
CN114045225A (zh) * 2021-11-22 2022-02-15 广西科技师范学院 一种光滑假丝酵母sllsm3及其应用
CN114774447A (zh) * 2022-02-21 2022-07-22 上海交通大学 提高解脂耶氏酵母耐热性的方法及用于发酵合成甘露醇

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107164249A (zh) * 2017-07-05 2017-09-15 江南大学 一株亚罗解脂酵母及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MY169799A (en) * 2011-12-22 2019-05-16 Xyleco Inc Processing biomass for use in fuel cells related applications
CN110878261B (zh) * 2019-11-14 2022-05-06 上海交通大学 合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母的构建方法及其菌株

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107164249A (zh) * 2017-07-05 2017-09-15 江南大学 一株亚罗解脂酵母及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RAKICKA M等: "Polyol production from waste materials by genetically modified Yarrowia lipolytica", 《BIORESOUR TECHNOL》 *
WU Y等: "Enhanced protopanaxadiol production from xylose by engineered Yarrowia lipolytica", 《MICROB CELL FACT》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021093289A1 (zh) * 2019-11-14 2021-05-20 上海交通大学 合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母的构建方法及其菌株
CN111690549A (zh) * 2020-05-18 2020-09-22 天津大学 利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌株及构建方法和应用
CN112365920A (zh) * 2020-09-30 2021-02-12 中国农业科学院蜜蜂研究所 一种鉴定蜜蜂分化关键基因的方法及鉴定得到的基因和应用
CN112365920B (zh) * 2020-09-30 2024-04-02 中国农业科学院蜜蜂研究所 一种鉴定蜜蜂分化关键基因的方法及鉴定得到的基因和应用
CN113444750A (zh) * 2021-08-19 2021-09-28 河北工程大学 一种恒流弱电场胁迫下海水非灭菌高渗发酵甘油生产d-阿拉伯糖醇的方法
CN113801896A (zh) * 2021-10-11 2021-12-17 上海交通大学 发酵产泡沫能力降低的解脂耶氏酵母菌的构建方法和应用
CN114045225A (zh) * 2021-11-22 2022-02-15 广西科技师范学院 一种光滑假丝酵母sllsm3及其应用
CN114045225B (zh) * 2021-11-22 2023-03-10 广西科技师范学院 一种光滑假丝酵母sllsm3及其应用
CN114774447A (zh) * 2022-02-21 2022-07-22 上海交通大学 提高解脂耶氏酵母耐热性的方法及用于发酵合成甘露醇
CN114774447B (zh) * 2022-02-21 2024-05-07 上海交通大学 提高解脂耶氏酵母耐热性的方法及用于发酵合成甘露醇

Also Published As

Publication number Publication date
US20220259622A1 (en) 2022-08-18
CN110878261B (zh) 2022-05-06
WO2021093289A1 (zh) 2021-05-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110878261B (zh) 合成木糖醇的重组解脂耶氏酵母的构建方法及其菌株
EP1513923B1 (en) Methods and materials for the production of d-lactic acid in yeast
US7109010B2 (en) Methods and materials for the synthesis of organic products
CN110914435B (zh) 产依克多因酵母
CN111363759B (zh) 合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法及其菌株
CN107406821B (zh) 用于生产3-羟基丙酸的突变宿主细胞
KR102281701B1 (ko) 아세토인을 제조하는 방법
KR20170025315A (ko) 3-hp를 생산할 수 있는 재조합 효모 및 이를 이용한 3-hp의 제조방법
DK2697252T3 (en) Configurations and methods for increased ethanol production from biomass
CN110651034A (zh) 用于制备fdca的fdca-脱羧单加氧酶-缺陷的宿主细胞
CN110869488B (zh) 增强型代谢物生产酵母
JP5496356B2 (ja) アラビノース代謝経路が導入されたキシリトール生産菌株及びそれを用いたキシリトール生産方法
KR20220139351A (ko) 엑토인의 개선된 생산을 위한 변형된 미생물 및 방법
CN110892073B (zh) 增强型代谢物生产酵母
US9273328B2 (en) Yeast mutant of kluyveromyces and method for ethanol production using the same
CN109136119B (zh) 微生物及其用途
CN109136120B (zh) 微生物及其用途
CN110499259B (zh) 一种解酯耶氏酵母yw100-1及其应用
KR102306725B1 (ko) 아세토인 생산능을 갖는 유전적으로 조작된 효모 및 이를 이용한 아세토인 생산방법
CN111548946B (zh) 一种生产次丹参酮二烯的重组酵母工程菌
EP2643466B1 (en) Yeast cells and process for converting acetaldehyde to ethanol
CN114517164A (zh) 一种脂肪酸延长酶基因在酵母合成神经酸中的应用
CN110914434A (zh) 苏氨酸生产酵母
AU2008201598A1 (en) Methods and materials for the production of D-lactic acid in yeast

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant