CN114045225B - 一种光滑假丝酵母sllsm3及其应用 - Google Patents

一种光滑假丝酵母sllsm3及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3及其应用，光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株保藏编号为CCTCC NO：M2021699。其从广西来宾甘蔗地的土壤中筛选分离得到。光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株可以发酵培养产生菊糖蔗糖酶，菊糖蔗糖酶的酶活最高可达86.82U，菊糖产量达到46.72g/L，具有酶活高，转化率高的优点。

Description

一种光滑假丝酵母SLLSM3及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种光滑假丝酵母SLLSM3及其应用。
背景技术
菊糖，又称菊粉，属于果聚糖中的一组非消化性碳水化合物，在19世纪早期由德国科学家ValentineRose发现，在1817年由Thomson命名为菊糖。菊糖的甜度水平约为蔗糖的10％，与可消化的碳水化合物相比，它仅提供25-35％的能量，现已被美国食药局认为安全的添加剂。目前酶法合成菊糖，以蔗糖为唯一底物，反应体系中仅含有果糖、葡萄糖、蔗糖、低聚果糖等成分，纯化过程简单，产物纯度高。微生物菊糖的生产研究发现L.gasseriDSM20604来源的菊糖蔗糖酶在最适条件下可产生53g/L的菊糖。另外，除了蔗糖，制糖工业的副产品如糖蜜等，也具有作为酶法生产菊糖的潜力。酶法生产菊糖不仅能降低成本，还有利于资源的综合利用。目前的菊糖蔗糖酶活低，催化转化率低本，而发明的发明人自行筛选发现光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株可以产生高酶活的菊糖蔗糖酶，而且采用光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株培养得到的菊糖蔗糖酶酶液催化蔗糖合成菊糖，具有绿色高效、反应温和的优势。因此，将菌株光滑假丝酵母(Candidaglabrata)SLLSM3专利申请保护有重要的意义。
发明内容
本发明克服了上述技术问题，提供一种光滑假丝酵母SLLSM3及其应用。
本发明的光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株，属于真菌界，子囊菌门，半知菌亚门，芽孢菌纲，假丝酵母属，光滑假丝酵母种。所述光滑假丝酵母(Candidaglabrata)SLLSM3菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2021699，保藏日期为2021年6月9日。
进一步的，所述光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株从广西来宾甘蔗地的土壤中筛选分离得到。
本发明的另一目的还在于保护含有上述光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株的微生物制剂。
其中，所述微生物制剂中，所述光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株的活菌数不低于1.0×106cfu/ml。
本发明的另一目的还在于保护上述光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株在制备菊糖蔗糖酶上的应用。
本发明的另一目的还在于保护利用上述光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株制备菊糖蔗糖酶的方法，其包括如下步骤:在无菌操作下，用灭菌接种环将光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株接种到已高温灭菌的发酵培养基中，于25-30℃下，采用120-180r/min摇床恒温发酵培养24h后，取发酵液接入新的发酵培养基中摇床恒温培养68-72h，经9000-11000r/min、15min离心机离心得到上清液即为菊糖蔗糖酶粗酶液。
优选的方案中，制备菊糖蔗糖酶的方法为：在无菌操作下，用灭菌接种环将光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株接种到已高温灭菌的发酵培养基中，于30℃下，采用180r/min摇床恒温发酵培养24h后，取发酵液接入新的发酵培养基中摇床恒温培养72h，经10000r/min、15min离心机离心得到上清液即为菊糖蔗糖酶粗酶液。
进一步的，所述发酵培养基配方为：1g酵母膏、2g蛋白胨、2g乳糖、100ml，pH值7。
本发明的另一目的还在于保护上述光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株在制备菊糖上的应用。
本发明的另一目的还在于保护利用光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株制备菊糖的方法，其包括如下步骤:将保存的光滑假丝酵母光滑假丝酵母(Candidaglabrata)SLLSM3菌活化后获得菌种悬浮液，将菌种悬浮液接种至发酵培养基培养，常温下摇床恒温发酵培养，培养后离心取其上清液；以蔗糖为底物，加入磷酸缓冲液，以上清液作为催化剂，在40℃的摇床中反应即转化制备得到菊糖。
其中，所述菌种悬浮液中，光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株的活菌数为不低于1.0×106cfu/ml。
本发明与现有技术相比较具有以下有益效果：本发明的光滑假丝酵母(Candidaglabrata)SLLSM3菌株可以发酵培养产生菊糖蔗糖酶，酶活最高可达86.82U，菊糖产量达到46.72g/L，酶活高，转化率高。
附图说明
图1为本发明光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株菌落图；
图2为不同发酵时间对光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3产酶能力的影响图；
图3为不同发酵培养基pH对光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3产酶能力的影响图；
图4为菌种不同接种量对光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3产酶能力的影响图；
图5为不同发酵温度对光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3产酶能力的影响图。
具体实施方式
下面结合实施例和试验对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明的光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株，属于真菌界，子囊菌门，半知菌亚门，芽孢菌纲，假丝酵母属，光滑假丝酵母种。所述光滑假丝酵母(Candidaglabrata)SLLSM3菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2021699，保藏日期为2021年6月9日。
本发明的光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株由如下方法筛选得到：
土样取自广西来宾甘蔗地的土壤，以PS培养基形成筛选培养基筛选产菊糖蔗糖酶的菌株，具体工艺为：
菌种初筛：取土壤1g加入装有9mL的无菌生理盐水中，制成10-1浓度的样品液，震荡混匀后逐级稀释到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6浓度，静置备用。取后3个稀释度，采用涂布法在PS培养基平板上进行菌种分离，在平板上划线分离，反复纯化，从而得到分离菌株的纯培养物。平板置于4℃冰箱保存。
保藏培养基：PS琼脂斜面固体培养基；
PS培养基配方：0.5g蔗糖、0.02gKH2PO4、0.61gNa2HPO4、0.1gNH4Cl、0.01g酵母膏、0.05gMgSO4·7H2O、0.5mgCaCl2、琼脂粉1g，100mL蒸馏水,自然pH，121℃湿热灭菌。
将上述筛选分离得到的光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株进行如下检测鉴定：
1、菌落形态观察：将斜面菌点接至有PS培养基的平皿中，于30℃培养48h，培养得到的光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株菌落形态图如图1所示，观察菌落形态，观察到白色奶油样菌落，柔软、光滑、湿润，有浓厚的酵母气味，营养体细胞出芽生殖，无菌丝。
2、菌株的鉴定：将纯化好的菌株送至生工生物工程(上海)股份有限公司鉴定。通过NucleotideBLAST分析，与光滑假丝酵母菌株的26SrDNA序列同源性为100％，可初步确定SLLSM3菌株为光滑假丝酵母。
一种含有光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株的微生物制剂，并利用所述微生物制剂应用于制备菊糖蔗糖酶或者制备菊糖。其中，所述微生物制剂中的光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株的活菌数1.0×106cfu/ml。
利用上述光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株制备菊糖蔗糖酶的方法，其包括如下步骤:将保存的光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌接种于斜面培养基上，置于37℃恒温培养箱培养2天，获得活化菌种，用无菌水洗脱菌种获得菌种悬浮液，菌种悬浮液的光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌活菌数为1.0×106cfu/ml，将菌种悬浮液接入摇瓶发酵培养基；在无菌操作下，用灭菌接种环接菌到已高温灭菌的发酵培养基中，于30℃下，采用180r/min摇床恒温发酵培养24h后，取发酵液接入新的发酵培养基中摇床恒温培养72h，经10000r/min、15min离心机离心得到上清液即为菊糖蔗糖酶粗酶液。得到的菊糖蔗糖酶粗酶液酶活达到最高值86.82U。
上述中的斜面培养基为PS培养基。PS培养基配方为：0.5g蔗糖、0.02gKH2PO4、0.61gNa2HPO4、0.1gNH4Cl、0.01g酵母膏、0.05gMgSO4·7H2O、0.5mgCaCl2、琼脂粉1g，100mL蒸馏水，自然pH，121℃湿热灭菌。
上述中的发酵培养基配方为1g酵母膏，2g蛋白胨，2g乳糖，100ml，pH7.0，121℃湿热灭菌。
利用光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株制备菊糖的方法，其包括如下步骤:在上述获得菊糖蔗糖酶粗酶液的基础上，以100g的蔗糖为底物，加入100mL的磷酸缓冲液，以20mL的酶液作为催化剂，在40℃的摇床中反应8h。菊糖产量达到46.72g/L。
光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株产酶条件优化
(1)研究发酵时间对产酶的影响
以发酵培养基接种光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株，在温度为30℃、pH7、装液量100ml/250ml、接种量10％，转速180r/min的条件下分别发酵36、48、60、72、84h取上清液测酶活。
所述发酵培养基为改良YPD培养基；
改良YPD培养基：1g酵母膏，2g蛋白胨，2g乳糖、100ml，pH7.0，121℃湿热灭菌。
检测得到的酶活结果如表1和图2：
表1不同发酵时间对光滑假丝酵母产酶能力
项目 36h 48h 60h 72h 84h
酶活(U/mL) 32.02 42.74 53.63 77.67 61.75
(2)研究发酵培养基pH对酶活的影响
以发酵培养基接种光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株，将发酵培养基的初始pH盐酸调为5、6、7、8、9，取上清液测酶活。配制成液体培养基在摇床上30℃，转速180r/min，发酵培养72h，取出发酵液10000rpm离心10min，取其上清液测酶活。
检测得到的酶活结果如表2和图3：
表2不同发酵培养基pH对光滑假丝酵母产酶能力
项目 pH(5) pH(6) pH(7) pH(8) pH(9)
酶活(U/mL) 41.96 63.54 73.54 66.97 51.78
(3)研究接种量对产酶的影响
以发酵培养基接种光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株，将菌种分别以6％、8％、10％、12％、14％的接种量接种。配制成液体培养基在摇床上30℃，转速180r/min，发酵培养72h，取出发酵液10000rpm离心10min，取其上清液测酶活。
检测得到的酶活结果如表3和图4：
表3菌种不同接种量对光滑假丝酵母产酶能力
项目 6％ 8％ 10％ 12％ 14％
酶活(U/mL) 67.93 80.19 65.20 51.97 41.78
(4)研究发酵温度对产酶的影响
以发酵培养基接种光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株，在pH7、装液量100ml/250ml、接种量10％，转速180r/min的条件下分别在25、28、30、35、37℃发酵72h取上清液测酶活。
检测得到的酶活结果如表4和图5：
表4菌种不同发酵温度对光滑假丝酵母产酶能力
项目 25℃ 28℃ 30℃ 35℃ 37℃
酶活(U/mL) 55.72 63.52 73.54 61.64 41.78
以上检测得到的酶活数据可以确定光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株发酵产酶的最佳条件条件为：发酵时间72h，接种量量为8％，发酵温度为30℃，酵母膏1g、蛋白胨2g、乳糖2g、100ml水，初始pH为7.0。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (9)

1.一种光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株，其特征在于，所述菌株其保藏编号为CCTCC NO：M2021699。
2.一种含有如权利要求1所述的光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株的微生物制剂。
3.如权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株的活菌数不低于1.0×106cfu/ml。
4.如权利要求1所述光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株在制备菊糖蔗糖酶上的应用。
5.利用权利要求1所述光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株制备菊糖蔗糖酶的方法，其特征在于，其包括如下步骤:在无菌操作下，用灭菌接种环将光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌接种到已高温灭菌的发酵培养基中，于25-30℃下，采用120-180r/min摇床恒温发酵培养24h后，取发酵液接入新的发酵培养基中摇床恒温培养68-72h，经9000-11000r/min、15min离心机离心得到上清液即为菊糖蔗糖酶粗酶液。
6.根据权利要求5所述的利用光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株制备菊糖蔗糖酶的方法，其特征在于，所述发酵培养基由如下组分组成：1g酵母膏、2g蛋白胨、2g乳糖、水100ml，pH值7。
7.如权利要求1所述光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株在制备菊糖上的应用。
8.利用权利要求1所述光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株制备菊糖的方法，其特征在于，其包括如下步骤:将保存的光滑假丝酵母光滑假丝酵母(Candidaglabrata)SLLSM3活化后获得菌种悬浮液，将菌种悬浮液接种至发酵培养基培养，常温下摇床恒温发酵培养，培养后离心取其上清液；以蔗糖为底物，加入磷酸缓冲液，以上清液作为催化剂，在40℃的摇床中反应即转化制备得到菊糖。
9.如权利要求8所述利用权利要求1所述光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3制备菊糖的方法，其特征在于，所述菌种悬浮液中，光滑假丝酵母(Candida glabrata)SLLSM3菌株的活菌数不低于1.0×106cfu/ml。
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