CN112574920B

CN112574920B - 纤维化纤维微细菌px02及其产右旋糖酐酶的方法和应用

Info

Publication number: CN112574920B
Application number: CN202011533460.2A
Authority: CN
Inventors: 王淑军; 宁哲; 吕明生; 卢静; 田小鹏; 祖航天; 王藏; 丁延帅
Original assignee: Jiangsu Ocean University
Current assignee: Jiangsu Ocean University
Priority date: 2020-12-23
Filing date: 2020-12-23
Publication date: 2022-05-20
Anticipated expiration: 2040-12-23
Also published as: CN112574920A

Abstract

本发明公开了一种来自于海洋的纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans.)PX02，其保藏号为CGMCC No.20952。本发明还公开了纤维化纤维微细菌PX02产右旋糖酐酶的方法，将菌株PX02接种于2216E培养基中，装液量为20％，180rpm，35℃，培养15h，以3％的接种量加入产酶培养基中，180rpm，35℃，装液量20％，培养48h后，10000rpm离心10min，取上清即为右旋糖酐酶。本发明所产右旋糖酐酶可以作有效成份在制备抑制变异链球菌形成生物膜与/或清除变异链球菌已形成的生物膜的抑制剂中的用途。本发明是新的能产右旋糖酐酶的细菌，丰富了产右旋糖酐酶的海洋细菌品种。本发明产酶方法简单，可操作性强，所产右旋糖酐酶的适合作用低，稳定性好。

Description

纤维化纤维微细菌PX02及其产右旋糖酐酶的方法和应用

技术领域

本发明涉及一种微生物，该微生物为分离于中国山东省日照海域海滩淤泥的海洋细菌纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans.)PX02，其菌种保藏号：CGMCCNo.20952。本发明还涉及一种该菌株产右旋糖酐酶的方法，以及酶的用途。

背景技术

右旋糖酐酶(Dextranase)是一种特异性水解α-1,6糖苷键的水解酶，水解产物一般为低聚右旋糖酐和异麦芽寡糖。产右旋糖酐酶的细菌相比于真菌，其优势是生产周期短，产酶效率高。海洋独特的低温、高盐、高压和无光等环境和进化机制导致了海洋微生物产生独特的产物，产物特性和结构与陆源微生物产物存在较大差异。从陆源微生物筛选的菌株产右旋糖酐酶的酶学性质与海洋来源的有较大差异。从海洋样品中筛选出耐低温、耐高温、耐盐以及耐碱的产右旋糖酐酶的细菌具有重要意义。右旋糖酐酶在口腔护理产品、制糖工业、食品加工上有广泛应用。在口腔护理产品中，牙菌斑生物膜结构主要由α-1,6糖苷键键与α-1,3糖苷键连接而成，右旋糖酐酶水解α-1,6糖苷键使得生物膜脱落，可以预防龋齿的发生。在制糖工业中，右旋糖酐的存在使得糖汁粘度增加，从而导致制糖设备的堵塞、产量降低等，添加一定量的右旋糖酐酶可以很好地解决这类问题。右旋糖酐酶在益生元-异麦芽寡糖-的生产上亦具有重要作用。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中产右旋糖酐酶新颖菌株少及新的酶学性质的右旋糖酐酶缺乏的问题，提供一种新的能产右旋糖酐酶的纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans.)PX02。

本发明的另一个目的在于提供纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobiumcellulans.)PX02产右旋糖酐酶的方法及该右旋糖酐酶的应用。

本发明所涉及的纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans.)PX02是从中国山东日照海域海滩淤泥筛选、分离得到的海洋细菌。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明公开了一种一种来自于海洋的纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans.)PX02，其保藏号为CGMCC No.20952。

本发明还公开了一种如以上所述的来自海洋的纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans.)PX02产右旋糖酐酶的方法：将菌株PX02接种于2216E培养基中，装液量为20％，180rpm，35℃，培养15h，以3％的接种量加入产酶培养基中，180rpm，35℃，装液量20％，培养48h后，10000rpm离心10min，取上清即为右旋糖酐酶；产酶培养基为：0.5％酵母粉、0.5％胰蛋白胨、0.5％米糠、1％右旋糖酐20000、陈海水配制，pH8.0，121℃灭菌20min。

本发明还公开了如上所述方法所产右旋糖酐酶的用途，所述的用途为以右旋糖酐酶作有效成份在制备抑制变异链球菌形成生物膜与/或清除变异链球菌已形成的生物膜的抑制剂中的用途。

进一步地，所产右旋糖酐酶用途为以右旋糖酐酶作有效成份在制备清除牙菌斑用清除剂中的用途。当添加酶液为12U/mL时，对已形成生物膜的降解率为78.55％，当添加酶液为15U/mL时降解率为93.10％。该酶水解3％右旋糖酐20000的产物：使用HPLC分析，水解产物主要是异麦芽三糖、麦芽五糖和低聚麦芽糖。对其水解产物进行抗氧化测定，该水解产物具有抗氧化活性。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供了一种新的能产右旋糖酐酶的纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans.)PX02，丰富了产右旋糖酐酶的海洋细菌品种。该菌株为革兰氏阳性、短杆状菌，在含蓝色葡聚糖的2216E固体培养基菌落特征为：有光泽，表面光滑湿润、隆起，边缘整齐，黄色不透明的圆形菌落。该菌株硝酸盐还原反应为阳性，鸟氨酸脱羟酶、赖氨酸脱羟酶、苯丙氨酸脱羟酶实验为阴性，能利用尿素、木糖、麦芽糖、蔗糖、纤维二糖、葡萄糖、阿拉伯糖。该菌株最适生长温度为40℃，4℃以下不生长；最适生长初始pH为7.0，生长初始pH范围为4.0-10.0；最适生长NaCl质量分数为1％。

2、本发明产酶方法简单，可操作性强，所产右旋糖酐酶的适合作用温度为40℃，在40℃以下温度稳定性极好，5h后酶活依然保持100％，在45℃保存5h后酶活力在70％以上；该右旋糖酐酶的最佳作用pH为7.5(Tris-HCl缓冲液配制)，在pH7.0-9.0范围内稳定性很好。

附图说明

图1为菌株PX02扫描电镜形态(10000x)；

图2为菌株PX02在蓝色葡聚糖平板上形成的透明圈；

图3为菌株PX02系统发育树；

图4为NaCl质量分数对菌株PX02生长的影响；

图5为初始pH对菌株PX02生长的影响；

图6为温度对菌株PX02生长的影响；

图7为碳源对菌株PX02产右旋糖酐酶的影响；

图8为氮源对菌株PX02产右旋糖酐酶的影响；

图9为初始pH对菌株PX02产右旋糖酐酶的影响；

图10为温度对菌株PX02产右旋糖酐酶的影响；

图11为温度对该酶作用的影响；

图12为该酶作用的温度稳定性；

图13为pH对该酶作用的影响■乙酸乙酸钠缓冲液，◆磷酸钠缓冲液，▲Tris-HCl缓冲液；

图14为该酶作用的pH稳定性■乙酸乙酸钠缓冲液，●磷酸钠缓冲液，▲Tris-HCl缓冲液；

图15为该酶水解产物HPLC分析图：G1-G7分别为葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖麦和芽七糖混合样；a：寡糖标准品、b：底物、c-e：10min、30min、1h、6h水解时间；

图16为该酶水解产物的抗氧化活性测定；a：DPPH清除率、b：超氧阴离子清除率、c：羟自由基清除率、d：还原能力，VC对照；

图17为该酶清除变异链球菌形成的生物膜的扫描电镜图。

本发明的纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans.)PX02已于2020年10月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC,保藏编号为CGMCCNo.20952。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，联系电话：010-64807355。

具体实施方式

以下参照附图，进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步的理解本发明，而不构成对其权利的限制。

实施例1，一种来自海洋的纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans.)PX02：

其保藏号为CGMCC NO.20952。该菌株具有以下的特征：该菌株为革兰氏阳性、短杆状菌，在含蓝色葡聚糖的2216E固体培养基菌落特征为：有光泽，表面光滑湿润、隆起，边缘整齐，黄色不透明的圆形菌落。该菌株硝酸盐还原反应为阳性，鸟氨酸脱羟酶、赖氨酸脱羟酶、苯丙氨酸脱羟酶实验为阴性，能利用尿素、木糖、麦芽糖、蔗糖、纤维二糖、葡萄糖、阿拉伯糖。该菌最适生长温度为40℃，4℃以下不生长；最适生长初始pH为7.0，生长初始pH范围为4.0-10.0；最适生长NaCl质量分数为1％，无NaCl可以生长。

纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans.)PX02产右旋糖酐酶的方法，其步骤如下：将菌株PX02种子液以3％的接种量接种于产酶培养基中，180rpm，35℃培养48h，10000rpm离心10min，取上清液即为菌株PX02所产的右旋糖酐酶粗酶液。所产右旋糖酐酶具有以下特征：右旋糖酐酶的最佳作用温度为40℃，在40℃以下温度稳定性极好，5h后酶活依然保持100％，在45℃保存5h后酶活力在70％以上；该右旋糖酐酶的最佳作用pH为7.5(Tris-HCl缓冲液配制)，在pH7.0-9.0范围内稳定性很好。金属离子Si²⁺、Mg²⁺、K⁺、Na⁺、NH⁴⁺对该酶活几乎没有什么影响，而Zn²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺、Fe³⁺都对该酶活抑制作用比较大。

实施例2，实施例1所产右旋糖酐酶的应用：

实施例1所产右旋糖酐酶水解3％右旋糖酐20000的水解产物：使用HPLC分析水解产物，寡糖标品为葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖和麦芽七糖混合样。该右旋糖酐酶水解产物主要是异麦芽三糖、麦芽五糖和低聚麦芽糖。对其水解产物多糖进行抗氧化测定，该水解产物多糖具有一定的抗氧化活性。利用药物降解最低浓度(MBRC)来测定该酶降解已形成生物膜的作用：结果发现当添加酶液为12U/mL时，降解率为78.55％，当添加酶液为15U/mL时，降解率为93.10％，所以该酶的MBRC70为12U/mL，MBRC90为15U/mL；结合扫描电镜观察，不同梯度浓度该酶对生物膜有不同程度的抑制作用。

实施例3，纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans.)PX02的实验

1、本菌株的筛选方法：

1.1取海滩日照淤泥样品加入1mL无菌水稀释，按照10^-1-10^-6的稀释倍数涂布于初筛培养基中，30℃培养箱中培养2-7d，每天观察菌落周围是否出现透明圈，挑选出现透明圈的菌株接于2216E培养基中，30℃培养24h，三区划线于2216E固体培养基中培养至长出单菌落，纯化单菌落二次后，接于2216E培养基中，30℃培养24h，取1mL菌液甘油保藏，甘油终浓度为30％，-80℃保藏。

1.2涉及的培养基：2216E培养基：0.1％酵母粉、0.5％鱼粉蛋白胨、陈海水配制、pH8.0、121℃灭菌20min。初筛培养基：0.5％胰蛋白胨、0.5％酵母粉、0.5％米糠、1％右旋糖酐20000、陈海水配制、pH 8.0、121℃灭菌20min。发酵培养基：0.1％酵母粉、0.5％鱼粉蛋白胨、1％右旋糖酐20000、陈海水配制、pH 8.0、121℃灭菌20min。产酶培养基为：0.5％酵母粉、0.5％胰蛋白胨、0.5％米糠、1％右旋糖酐20000、陈海水配制，pH 8.0，121℃灭菌20min。

2、本发明菌株PX02的形态特征和生理生化特征。

2.1形态特征：菌株PX02为革兰氏阳性短杆菌(参见图1)，在含蓝色葡聚糖的2216E固体培养基中菌落有光泽，表面光滑湿润、隆起，边缘整齐，成黄色不透明的圆形，能产生透明圈(参见图2)。

2.2生理生化特征：菌株PX02在4℃以下不能生长，能利用尿素、木糖、麦芽糖、蔗糖、纤维二糖、葡萄糖、阿拉伯糖，不能利用核糖、棉子糖、硫化氢、鼠李糖；硝酸盐还原反应为阳性，鸟氨酸脱羟酶、赖氨酸脱羟酶、精氨酸脱羟酶、苯丙氨酸实验为阴性(部分生理生化结果见表1)。

表1.菌株PX02的生理生化特征

注：﹢表示阳性，-表示阴性

2.3菌株PX02分子学鉴定：用Takara细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的基因组作为DNA模板，利用通用16S rDNA扩增引物(27F、1492R)，扩增出PCR产物寄往上海生工生物工程公司进行测序，将测得序列互补反向拼接，获得1379bp的碱基片段序列。将得到的菌株16rDNA序列提交NCBI数据库进行同源性比对分析，初步确定该菌株为纤维单胞菌(Cellulosimicrobium sp.)。采用软件MEGA 7.0进行Neibor-joing method构建系统进化树，系统发育树中菌株PX02发育地位和Cellulosimicrobium cellulans在同一分支上，亲缘关系最近(参见图3)。

3、本发明菌株PX02的生长特性

3.1菌株PX02种子液制备：将菌株PX02接种菌株于2216E培养基中，装液量20％，30℃、180rpm，培养15h。

3.2 NaCl质量分数对菌株PX02生长的影响：将种子液以3％的接种量加入含不同质量分数NaCl(0％-10％)的2216E培养基中(添加微量矿物盐作为矿物质)，30℃，180rpm，培养12h，用酶标仪在600nm处测定吸光光度，该菌株的最佳生长NaCl质量分数为1％，无NaCl可以生长(参见图4)。

3.3 pH对菌株PX02生长的影响：将种子液以3％的接种量加入不同初始pH(4.0-10.0)的2216E培养基中，其他条件同3.1，该菌株的最佳生长pH为7.0(参见图5)。

3.4温度对菌株PX02生长的影响：将种子液以3％的接种量加入pH7.0的2216E培养中，在不同温度下(25-45℃)，180rpm，培养12h，用酶标仪在600nm处测定吸光光度，该菌株的最佳生长温度为40℃(参见图6)。

4、菌株PX02产右旋糖酐酶的方法

4.1碳氮源对菌株PX02产酶的影响：用0.5％不同碳源(麦芽糖、乳糖、马铃薯淀粉、糊精、可溶性淀粉、玉米淀粉、大麦粉、麸皮、米糠)和0.5％不同氮源(胰蛋白胨、氯化铵、干酪素、豆粕、鱼粉蛋白胨、硫酸铵、尿素、花生粕、大豆蛋白胨)分别代替发酵培养基中的碳氮源，将种子液以3％的接种量加入不同碳氮源培养基中，30℃，180rpm，培养48h后，取上清液测定酶活力。结果发现，碳源中的米糠和氮源中的胰蛋白胨对菌株PX02产右旋糖酐酶的促进作用最大(参见图7-8)，因此，选用0.5％酵母粉、0.5％米糠、0.5％胰蛋白胨作为培养基的碳氮源。

4.2初始pH对菌株PX02产酶的影响：将种子液以3％的接种量加入不同pH(5.0-10.0)的产酶培养基中，其他条件同4.1，结果发现，该菌株最佳产酶初始pH为8.0(参见图9)。

4.3温度对菌株PX02产酶的影响：将种子液以3％生物接种量加入产酶培养基，在不同温度下(25-45℃)发酵，其他条件同4.1，结果发现该菌株的最佳产酶温度为35℃(参见图10)。

5、菌株PX02产右旋糖酐酶的酶学性质

5.1该菌株产右旋糖酐酶粗酶液制取：将种子液以3％的接种量接种于产酶培养基中，35℃、180rpm、发酵培养48h后，取上清液即为粗酶液。

5.2酶作用活力测定：取10μL酶液与190μL 3％右旋糖酐20000(pH 7.0的PBS缓冲液配制)底物混合，40℃水浴反应30min，加入200μL配制的3-5二硝基水杨酸终止反应，煮沸5min，加入3mL蒸馏水稀释、混匀，取200μL点样于96孔酶标板，酶标仪测量540nm处的吸光度，对照组在加入配制的3-5二硝基水杨酸终止反应后加入3％右旋糖酐T20，其他同实验组。

5.3该菌株产右旋糖酐酶的酶作用温度和温度稳定性：取粗酶液在不同温度(25-45℃)水浴30min，测定酶活力，取粗酶液在不同温度(35-50℃)水浴1-5h，每隔1h取样一次，测定酶活力。结果表明，该菌株产右旋糖酐酶的最佳作用温度为40℃，在40℃以下温度稳定性极好，5h后酶活依然保持100％，在45℃保存5h后酶活力在70％以上(参见图11-12)。

5.4该菌株产右旋糖酐酶的酶作用pH和pH稳定性：不同缓冲液配制成不同pH的3％右旋糖酐T20底物(乙酸钠pH 3.0-5.5，磷酸钠pH 5.5-7.5，Tris-HCl 7.5-9.0)，取粗酶液和不同pH底物测定酶活力，不同pH缓冲液与粗酶液混合，使缓冲液终浓度为50mM，在30℃水浴1h取出，测定酶活力。该右旋糖酐酶的最适作用pH为7.5(Tris-HCl缓冲液配制)，在pH7.0-9.0范围内稳定性很好(参见图13-14)。

5.5金属离子对右旋糖酐酶活力的影响：用Tris-HCl 7.5缓冲液与不同金属离子配制成3％右旋糖酐20000底物，使金属离子终浓度分别为1mM、5mM、10mM，取粗酶液与底物混合测定酶活力，未处理的右旋糖酐酶酶作用活力为100％。结果表明Si²⁺、Mg²⁺、K⁺、Na⁺、NH⁴⁺对该酶几乎没有什么影响，低浓度的Ba²⁺、Ca²⁺、Li⁺对该酶的影响较小，随着离子浓度增加，对该酶有轻微的抑制作用，Mn²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Cd²⁺、Fe³⁺对该酶的抑制效果较大，所有阶梯浓度的Zn²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺、Fe³⁺都使该酶完全失去酶活(表2)。

表2.金属离子对酶作用的影响

5.6菌株PX02产右旋糖酐酶的底物特异性：将不同底物(右旋糖酐20000、40000、70000、500000、2000000、壳聚糖、可溶性淀粉、普鲁兰多糖)与Tris-HCl 7.5缓冲液配制成3％的底物，取粗酶液与不同底物反应测定酶活力，以最高酶活力为100％。该右旋糖酐酶的最佳底物为右旋糖酐20000，特异性水解α-1,6糖苷键，对α-1,4和α-1,6组成的可溶性淀粉的水解活力有4.77％(表3)。

表3.菌株PX02产右旋糖酐酶的底物特异性

6、菌株PX02产右旋糖酐酶的应用

6.1该右旋糖酐酶的水解产物及其产物抗氧化能力：粗酶液与Tris-HCl pH 7.5缓冲液配制的3％右旋糖酐20000底物混合，40℃水浴，30min、1h、6h各取一次样，沸水浴3min，离心过滤膜，使用高效液相色谱(HPLC)分析水解产物，糖标品为葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖和麦芽七糖混合样。将酶液与底物混合在40℃水浴作用1h后，煮沸3min使酶液失活，利用硫酸苯酚法测得多糖含量，稀释成梯度浓度多糖，测定该多糖的DPPH清除率、羟自由基清除率、超氧阴离子清除率及还原力能力，以维生素C作为对照。该右旋糖酐酶水解产物主要是异麦芽三糖、麦芽五糖和麦芽低聚糖(参见图15)，当该多糖浓度为10mg/mL时，DPPH、羟自由基的清除率分别为57.6％、19.4％，当该多糖浓度为6mg/mL超氧阴离子的清除率为52.3％，多糖浓度为25mg/mL相当于0.02mg/mL维生素C的抗氧化能力(参见图16)。

6.2该右旋糖酐酶对生物膜的影响：利用药物降解最低浓度(MBRC)来测定该酶降解已形成生物膜的作用。具体方法：将变异链球菌接种于BHI培养基，37℃，无氧培养12h，为变异链球菌种子液；加入200μL BHI培养基与20μL种子液至96孔酶标板，37℃无氧培养24h至牙菌生物膜形成，缓慢吸出菌液，加入200μL不同梯度的酶(0U、3U、6U、9U、12U、15U)，37℃放置4h，吸出酶液，用无菌水轻轻洗涤未粘附的生物膜，自然晾干用结晶紫方法检测生物膜的降解率。扫描电镜观察酶降解已形成牙菌斑生物膜的影响：将无菌载玻片放入24孔板中，向24孔板中加入1mL BHI培养基和100μL种子液，加入不同终浓度为0、3、6、9、12、15(U/mL)的酶，37℃培养24h，用无菌水轻轻洗涤未粘附的生物膜，自然晾干，用2.5％低温固定过夜，之后用不同梯度酒精(50％、70％、80％、90％、100％)脱水，每个梯度脱水30min，将样品扫描电镜观察。结果发现当添加酶液为12U/mL时，降解率位78.55％，当添加酶液为15U/mL时，降解率为93.10％，所以该酶的MBRC70为12U/mL，MBRC90为15U/mL(表4)。扫描电镜结果显示未添加右旋糖酐酶的变异链球菌结合的非常紧密，菌体之间相互包裹，内部充斥着一定的通道，随着酶浓度添加增加，菌体之间的通道越来越稀疏，当添加酶浓度为15U/mL时，粘附在载玻片上的变异链球菌生物量很少，没有生物膜的存在(参见图17)，该酶对变异链球菌的生物膜具有较好的清除作用。

表4.右旋糖酐酶降解已形成牙菌斑生物膜的有效浓度

Claims

1.一种来自于海洋的纤维化纤维微细菌（Cellulosimicrobiumcellulans.）PX02，其特征在于：其保藏号为CGMCC No. 20952。

2.一种如权利要求1所述的来自海洋的纤维化纤维微细菌 (Cellulosimicrobium cellulans.) PX02 产右旋糖酐酶的方法，其特征在于：将菌株PX02接种于2216E培养基中，装液量为20%，180 rpm，35℃，培养15 h，以3%的接种量加入产酶培养基中，180 rpm，35℃，装液量20%，培养48 h后，10000 rpm离心10 min，取上清即为右旋糖酐酶；产酶培养基为：0.5%酵母粉、0.5%胰蛋白胨、0.5%米糠、1%右旋糖酐20000、陈海水配制，pH8.0，121℃灭菌20min。

3.一种如权利要求2所述方法所产右旋糖酐酶的用途，其特征在于：所述的用途为以右旋糖酐酶作有效成分在制备抑制变异链球菌形成生物膜与/或清除变异链球菌已形成的生物膜的抑制剂中的用途。

4.一种如权利要求2所述方法所产右旋糖酐酶的用途，其特征在于：所述的用途为以右旋糖酐酶作有效成分在制备清除牙菌斑用清除剂中的用途。