JP2023538160A - Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ及びその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、β-シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼを生成するＢａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８、及び前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓを用いてβ-シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼを調製する方法を提供する。また、本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８に由来するβ-シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼを提供する。そのアミノ酸配列は配列番号１で示され、当該アミノ酸配列をコードする遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号２で示される。
Description
本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ及びその使用に関し、微生物の技術分野に属する。
シクロデキストリンは、６個以上のグルコースユニットがα－１，４－グリコシド結合により結合してなる環状ポリマーであり、やや円錐形の中空円柱形を示す。中でも、最も一般的にみられるα－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン及びγ－シクロデキストリンは、それぞれ６個、７個及び８個のグルコースユニットが互いに結合することで形成されたものであり、工業的に最も広く使用され、特にβ-シクロデキストリンが広く使用されている。シクロデキストリンは、その外周を取り囲むグルコースの水酸基－ＯＨ、及びその内周を取り囲むエーテル結合Ｃ－Ｏ－Ｃにより、親水性の表面及び疎水性の空洞構造を有しているため、これを利用し、疎水性のゲスト分子をカプセル化して当該ゲスト分子の溶解性、揮発性及び化学的特性などの物理化学的特性を改善するためによく用いられており、食品、医薬品、化粧品などの業界で広く使用されている。
現在、シクロデキストリンの生産では、主に、デンプン又はその関連誘導体への、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）による作用に基づく酵素法を用い、合成を行う。その主な生成物は、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン及びγ－シクロデキストリンの混合物であるが、反応の初期段階での主な生成物の違いに応じて、それぞれ、α－ＣＧＴａｓｅ、β－ＣＧＴａｓｅ及びγ－ＣＧＴａｓｅと命名されている。中でも、β－ＣＧＴａｓｅに関する研究が最も多くなされている。ＣＧＴａｓｅは、野生の菌や遺伝子工学の菌で発現した後、酵素液中に大量のその他の酵素が存在することが多いため、以下の問題を引き起こす。（１）その他の酵素が多いため、酵素を分離、精製する必要があるが、プロセスはしばしば面倒で複雑であり、その酵素学的特性及び生成物の分析や研究に、大きな困難をもたらす。（２）シクロデキストリンの生産過程において、副生成物が多いため、シクロデキストリンの生産効率及び生成物の分離・精製へ一定の影響を与える。Ｒｏｓｓｏらは、スクリーニングによる分離を行い、β－ＣＧＴａｓｅを高収量で生成する菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ ＤＦ９Ｒを得ている。その発酵液は、酵素活性が５．８Ｕ／ｍＬであり、電気泳動図に複数のさまざまなバンドが存在しているが、そのいずれの場合も、発酵周期が長く、特定の発酵条件が必要であり、細胞外で生成できる酵素が少なく且つその純度が低く、分離・精製が難しく、熱安定性が悪いという欠陥があるため、工業的応用においては制限される。したがって、純度が高く且つ安定性が強い高活性β－シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼのスクリーニングは、幅広い応用が見込まれる。
本発明の目的は、研究・生産上の課題を解決し、高純度のβ－シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼを得ることにある。本発明は、分離・精製ステップを省くことができ、シクロデキストリンの調製に有利である。
本発明は、中国微生物株保存管理委員会総合微生物センターに保存された、番号がＳＴＢ０８、受託番号がＣＧＭＣＣ ＮＯ．２２６２５、受託日付が２０２１年５月２８日であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓを提供する。
また、本発明は、上記Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓを含む微生物製剤を提供する。
また、本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓに由来するβ－シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼであって、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するβ－シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼを提供する。
また、本発明は、前記β－シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であって、配列番号２で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子を提供する。
また、本発明は、β-シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼの調製における、上記Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ又は上記微生物製剤の使用を提供する。
また、本発明は、上記Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓを、２５～３０℃下で少なくとも７２時間発酵させ、β-シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼを調製する方法を提供する。
本発明の一実施形態において、発酵のための培地は、酵母粉末を炭素源とする。
本発明の一実施形態において、発酵のための培地は、魚のペプトンを窒素源とする。
本発明の一実施形態において、発酵のための発酵培地は、コーンシロップパウダー、Ｎａ２ＣＯ３、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＫＨ２ＰＯ４及びタピオカデンプンを含む。
また、本発明は、シクロデキストリンの調製における、上記Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓの使用を提供する。
また、本発明は、上記Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓを用いてβ-シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼを調製し、さらに、前記β-シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼを２Ｕ／ｇ（マルトデキストリンドライベース）の量でマルトデキストリン含有系に加え、４５℃下で２４時間反応させ、１０分間煮沸して酵素を消滅させた後、２Ｕ／ｇ（マルトデキストリンドライベース）のグルコアミラーゼを加え、３０℃下で１時間糖化し、シクロデキストリンを調製する方法を提供する。
また、本発明は、食品分野でのマルトデキストリン分解における、上記Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓの使用を提供する。
（本発明の有利な効果）
（１）本発明が提供するＢａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８は、純度が高いβ－シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼを分泌することができ、当該酵素は、熱安定性がよく、５０℃以下で２時間保温した場合、その酵素活性が８０％以上に維持され、６０℃及び６５℃下での半減期がそれぞれ４２分間及び９分間である。そのため、産業上の応用において潜在価値を有し、シクロデキストリンの調製に有利である。また、マルトデキストリンを分解して得られるβ－シクロデキストリンが１１．６ｇ／Ｌに達し、総シクロデキストリンの７４．３％を占め、比較的に高いβ－シクロデキストリン生成特異性を有する。
（２）本発明は、平板培養の条件及び種子培養の条件の最適化により、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８の迅速かつ正常な増殖を実現し、菌の保存とその後の利用に有利である。
（３）本発明は、発酵培養の条件の最適化により、β－シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼの高分泌性及び高純度の発現性を実現する。
（１）本発明が提供するＢａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８は、純度が高いβ－シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼを分泌することができ、当該酵素は、熱安定性がよく、５０℃以下で２時間保温した場合、その酵素活性が８０％以上に維持され、６０℃及び６５℃下での半減期がそれぞれ４２分間及び９分間である。そのため、産業上の応用において潜在価値を有し、シクロデキストリンの調製に有利である。また、マルトデキストリンを分解して得られるβ－シクロデキストリンが１１．６ｇ／Ｌに達し、総シクロデキストリンの７４．３％を占め、比較的に高いβ－シクロデキストリン生成特異性を有する。
（２）本発明は、平板培養の条件及び種子培養の条件の最適化により、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８の迅速かつ正常な増殖を実現し、菌の保存とその後の利用に有利である。
（３）本発明は、発酵培養の条件の最適化により、β－シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼの高分泌性及び高純度の発現性を実現する。
（生物材料の保存）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８は、分類されてＢａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓと命名され、２０２１年５月２８日に中国微生物株保存管理委員会総合微生物センターに保存された。その受託番号がＣＧＭＣＣ ＮＯ．２２６２５であり、保存所の住所は北京市朝陽区北辰西路１号院３番である。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８は、分類されてＢａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓと命名され、２０２１年５月２８日に中国微生物株保存管理委員会総合微生物センターに保存された。その受託番号がＣＧＭＣＣ ＮＯ．２２６２５であり、保存所の住所は北京市朝陽区北辰西路１号院３番である。
（酵素活性の測定方法）
適切に希釈した酵素溶液０．１ｍＬを取り、予め１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用いて調製した１％（ｗ／ｖ）のマルトデキストリン（ＤＥ＝４）溶液を０．９ｍＬ入れた試験管に加え、５０℃下で１０分間反応させた後、３０ｍＭのＮａＯＨを３．５ｍＬ加えて反応を停止させ、５ｍＭのＮａ２ＣＯ３溶液を用いて調製した０．０２％（ｗ／ｖ）のフェノールフタレイン溶液をさらに０．５ｍＬ加え、室温下で２０分間発色させ、５５０ｎｍにおける吸光度を測定する。失活した酵素をブランクとする。酵素活性単位は、上記の条件下で１分間当たり１μｍｏｌのβ－シクロデキストリンを生成するのに必要な酵素量を酵素活性単位と定義する。
適切に希釈した酵素溶液０．１ｍＬを取り、予め１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用いて調製した１％（ｗ／ｖ）のマルトデキストリン（ＤＥ＝４）溶液を０．９ｍＬ入れた試験管に加え、５０℃下で１０分間反応させた後、３０ｍＭのＮａＯＨを３．５ｍＬ加えて反応を停止させ、５ｍＭのＮａ２ＣＯ３溶液を用いて調製した０．０２％（ｗ／ｖ）のフェノールフタレイン溶液をさらに０．５ｍＬ加え、室温下で２０分間発色させ、５５０ｎｍにおける吸光度を測定する。失活した酵素をブランクとする。酵素活性単位は、上記の条件下で１分間当たり１μｍｏｌのβ－シクロデキストリンを生成するのに必要な酵素量を酵素活性単位と定義する。
（β－シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼの純度の測定方法）
シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼの純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動により測定する。Ｂｅｙｏｔｉｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製のＳＤＳ－ＰＡＧＥ Ｇｅｌ Ｒａｐｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔの説明書を参考してＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを調製し、電気泳動に供する。ここで、用いられる濃縮ゲルの濃度は５％であり、用いられる分離ゲルの濃度は１０％であり、また、０．１２５％のＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｇ－２５０を用いて染色を行う。最後に、ゲルイメージングアナライザーを用いて電気泳動解析を行う。
シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼの純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動により測定する。Ｂｅｙｏｔｉｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製のＳＤＳ－ＰＡＧＥ Ｇｅｌ Ｒａｐｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔの説明書を参考してＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを調製し、電気泳動に供する。ここで、用いられる濃縮ゲルの濃度は５％であり、用いられる分離ゲルの濃度は１０％であり、また、０．１２５％のＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｇ－２５０を用いて染色を行う。最後に、ゲルイメージングアナライザーを用いて電気泳動解析を行う。
（実施例１ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓの分離及び同定）
１．分離：澱粉工場の周辺の土壌を採取して無菌瓶に入れ、常法により平皿から菌株を１５株分離した。
１．分離：澱粉工場の周辺の土壌を採取して無菌瓶に入れ、常法により平皿から菌株を１５株分離した。
２．同定：分離した菌株について、菌株の同定及び物理化学的性質の解析を行った。
（１）物理化学的性質の解析
プレート上の菌株を種子培地に接種して活性化させた後、活性化液を発酵培地に添加して発酵させた。当該発酵液を遠心分離により収集して酵素活性を測定し、酵素活性が最も高い菌株を選別して菌株の同定を行った。
（２）菌株の同定方法
ＰＣＲにより１６Ｓ ｒＲＮＡの遺伝子配列を増幅し、菌株の同定を行った。菌株１６Ｓ ｒＲＮＡのＰＣＲ増幅プライマーは、２７Ｆ（５’－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３’、配列番号３で示される）；１４９２Ｒ（５－ＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧＴＡＡＣＣ－３’、配列番号３で示される）である。
（１）物理化学的性質の解析
プレート上の菌株を種子培地に接種して活性化させた後、活性化液を発酵培地に添加して発酵させた。当該発酵液を遠心分離により収集して酵素活性を測定し、酵素活性が最も高い菌株を選別して菌株の同定を行った。
（２）菌株の同定方法
ＰＣＲにより１６Ｓ ｒＲＮＡの遺伝子配列を増幅し、菌株の同定を行った。菌株１６Ｓ ｒＲＮＡのＰＣＲ増幅プライマーは、２７Ｆ（５’－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３’、配列番号３で示される）；１４９２Ｒ（５－ＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧＴＡＡＣＣ－３’、配列番号３で示される）である。
ＰＣＲを行う前に、活性化された菌液を８０００×ｇで３分間遠心分離して濃集させ、上清を廃棄し、蒸留水を１ｍＬ加えて懸濁させた。再び遠心分離して濃集し、上清を廃棄し、蒸留水をさらに５００μＬ加えて懸濁させておいた。ＰＣＲ反応系（２５μＬ）：２×Ｔａｑ Ｐｌｕｓ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ （Ｄｙｅ） １２．５μＬ、ｄｄＨ２Ｏ １０．５μＬ、プライマー２７Ｆ（１００μＭ） ０．５μＬ、プライマー１４９２Ｒ（１００μＭ） ０．５μＬ、テンプレート（菌液） １μＬ。ＰＣＲ反応におけるパラメータは、以下の通りである：９５℃下で１０分間予変性させ、９５℃下で３０秒間変性させ、５５℃下で３０秒間アニールし、７２℃下で３０秒間伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）し、３４回サイクル行い、７２℃下で１０分間伸長させる。ＰＣＲ産物をサンプリングしてその配列を測定した結果、ＰＣＲ増幅断片は約１５００ｂｐであった。なお、配列決定はＢＧＩにより行われた。
（結果及び解析）
Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を用いて、測定された菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列をデータベース中の既知菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡと比較して解析した。配列決定の結果によると、当該菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列は、合計で１４１３ｂｐであった。なお、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列は、配列番号５で示されるとおりである。また、最も相同性の高い５つの菌種を表１に列挙している。表１からわかるように、Ｂｌａｓｔを用いて比較・同定を行った結果、これは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列と最も相同性が高く、６個の塩基という差しかないと、確認された。同時に、何らかの基準株又は非基準株との配列相同性が９９％以上であることを満たし、且つ他の菌種よりも０．８％高かった。そのため、同定の結果に基づき、当該菌株は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓに由来するものと断定し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８と命名した。
Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を用いて、測定された菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列をデータベース中の既知菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡと比較して解析した。配列決定の結果によると、当該菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列は、合計で１４１３ｂｐであった。なお、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列は、配列番号５で示されるとおりである。また、最も相同性の高い５つの菌種を表１に列挙している。表１からわかるように、Ｂｌａｓｔを用いて比較・同定を行った結果、これは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列と最も相同性が高く、６個の塩基という差しかないと、確認された。同時に、何らかの基準株又は非基準株との配列相同性が９９％以上であることを満たし、且つ他の菌種よりも０．８％高かった。そのため、同定の結果に基づき、当該菌株は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓに由来するものと断定し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８と命名した。
３．（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８の培養に最適なｐＨ）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８は、以下の方法で培養した。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８は、以下の方法で培養した。
（１）プレートスクライビング
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８の菌液を接種用ループで着けて取り、用意しておいたプレート培地（酵母粉末 ６ｇ／Ｌ、魚のペプトン ６ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、タピオカでん粉 １２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／Ｌ、寒天 １５ｇ／Ｌからなり、ＮａＯＨでｐＨ１０．０に調整した）上でスクライビングし、３０℃のインキュベーターに入れて１２時間培養した。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８の菌液を接種用ループで着けて取り、用意しておいたプレート培地（酵母粉末 ６ｇ／Ｌ、魚のペプトン ６ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、タピオカでん粉 １２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／Ｌ、寒天 １５ｇ／Ｌからなり、ＮａＯＨでｐＨ１０．０に調整した）上でスクライビングし、３０℃のインキュベーターに入れて１２時間培養した。
（２）種子培養
プレート上からシングルコロニーをピックアップして種子培地に接種し、３０℃、２００ｒｐｍで培養した。
プレート上からシングルコロニーをピックアップして種子培地に接種し、３０℃、２００ｒｐｍで培養した。
種子培地の配合は、以下の通りである。酵母粉末 ６ｇ／Ｌ、魚のペプトン ６ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、タピオカでん粉 １２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／Ｌを配合し、ＮａＯＨでｐＨ７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０、１２．０にそれぞれ調整した。
それぞれのｐＨの種子培地を用いて種子培養を行った。菌液の増殖状況は表２に示した。表２によれば、ｐＨ１０．０～１１．０がＢａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８の増殖に適すると、分かった。そしてｐＨ１０．０の種子培地においては、１２時間後、菌液が濁るまで増殖していた。これは、菌液の増殖に最適なｐＨは１０．０であることを意味する。
（実施例２ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓが分泌するβ－シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８は、以下の方法で培養する。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８は、以下の方法で培養する。
（１）プレートスクライビング
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８の菌液を接種用ループで着けて取り、用意しておいたプレート培地（酵母粉末 ６ｇ／Ｌ、魚のペプトン ６ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、タピオカでん粉 １２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／Ｌ、寒天 １５ｇ／Ｌからなり、ＮａＯＨでｐＨ１０．０に調整した）上でスクライビングし、３０℃のインキュベーターに入れて１２時間培養した。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８の菌液を接種用ループで着けて取り、用意しておいたプレート培地（酵母粉末 ６ｇ／Ｌ、魚のペプトン ６ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、タピオカでん粉 １２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／Ｌ、寒天 １５ｇ／Ｌからなり、ＮａＯＨでｐＨ１０．０に調整した）上でスクライビングし、３０℃のインキュベーターに入れて１２時間培養した。
（２）種子培養
プレート上からシングルコロニーをピックアップして種子培地（酵母粉末 ６ｇ／Ｌ、魚のペプトン ６ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、タピオカでん粉 １２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／Ｌからなり、ＮａＯＨでｐＨ１０．０に調整した）に接種し、３０℃下、２００ｒｐｍで１２時間培養した。
プレート上からシングルコロニーをピックアップして種子培地（酵母粉末 ６ｇ／Ｌ、魚のペプトン ６ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、タピオカでん粉 １２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／Ｌからなり、ＮａＯＨでｐＨ１０．０に調整した）に接種し、３０℃下、２００ｒｐｍで１２時間培養した。
（３）発酵培養
種子培養液を４％（ｖ／ｖ）の接種量で、５０ｍＬの発酵培地を入れた２５０ｍＬの三角フラスコに接種し、２５℃下、２００ｒｐｍで７２時間培養した。
種子培養液を４％（ｖ／ｖ）の接種量で、５０ｍＬの発酵培地を入れた２５０ｍＬの三角フラスコに接種し、２５℃下、２００ｒｐｍで７２時間培養した。
発酵培地の配合は、以下の通りである。コーンシロップパウダー２６．６ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＣＯ３ ４．１４ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２１ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １．６３ｇ／Ｌ、タピオカでん粉 １２ｇ／Ｌを配合し、ＮａＯＨで初期のｐＨ７．０、８．０、９．０、１０．０及び１１．０にそれぞれ調整した。
それぞれのｐＨの発酵培地を用いて発酵を行い、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼを生成させた。その結果は表３に示す。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８は、２５℃、ｐＨ９．０という条件下では、その酵素活性が１０．７Ｕ／ｍＬに達した。当該分泌レベルは、野生の菌によるシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼの生成においては、相対的に高いレベルに位置付けられる。
（４）酵素液の収集
（３）で得られた培養済の菌液を４℃、１００００×ｇで１５分間遠心分離し、β－シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼである上清を得た。前記発酵培地の配合のとしては、コーンシロップパウダー２６．６ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＣＯ３ ４．１４ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２１ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １．６３ｇ／Ｌ、タピオカでん粉 １２ｇ／Ｌであり、ｐＨは９であった。
（３）で得られた培養済の菌液を４℃、１００００×ｇで１５分間遠心分離し、β－シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼである上清を得た。前記発酵培地の配合のとしては、コーンシロップパウダー２６．６ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＣＯ３ ４．１４ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２１ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １．６３ｇ／Ｌ、タピオカでん粉 １２ｇ／Ｌであり、ｐＨは９であった。
（５）酵素活性の測定
遠心分離して得られたシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼについて、純度測定及び性質の解析を行った。その結果は図１、２に示した。図１から分かるように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８から調製したβ－シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより解析した結果、単一バンドを示し、純度が高いと分かった。また、当該酵素の熱安定性は比較的に良い。５０℃以下で２時間保温したとき、図２に示されているように、酵素活性は８０％以上に維持され、６０℃及び６５℃下での半減期は、それぞれ４２分間及び９分間であった。本発明のシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼでは、１つのバンドにつき、１つの酵素タンパク質がそれと対応している。バンドが単一であることは、この酵素だけが存在し、純度が高いことを意味する。
遠心分離して得られたシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼについて、純度測定及び性質の解析を行った。その結果は図１、２に示した。図１から分かるように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８から調製したβ－シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより解析した結果、単一バンドを示し、純度が高いと分かった。また、当該酵素の熱安定性は比較的に良い。５０℃以下で２時間保温したとき、図２に示されているように、酵素活性は８０％以上に維持され、６０℃及び６５℃下での半減期は、それぞれ４２分間及び９分間であった。本発明のシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼでは、１つのバンドにつき、１つの酵素タンパク質がそれと対応している。バンドが単一であることは、この酵素だけが存在し、純度が高いことを意味する。
（実施例３ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓに由来するβ－シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼの同定）
実施例１で選別したＢａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓについて、全ゲノム配列決定を行って解析することで、β-シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼをコードする配列番号２で示される遺伝子の配列を得た。解析した結果、当該遺伝子により転写、翻訳されたβ-シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、配列番号１で示されているとおりであった。
実施例１で選別したＢａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓについて、全ゲノム配列決定を行って解析することで、β-シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼをコードする配列番号２で示される遺伝子の配列を得た。解析した結果、当該遺伝子により転写、翻訳されたβ-シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、配列番号１で示されているとおりであった。
（実施例４ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓが分泌するβ－シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼの、マルトデキストリンの分解への使用）
５％（ドライベース、ｗ／ｖで、５ｇ／１００ｍＬ）のマルトデキストリン（ＤＥ＝４）を基質とし、実施例２で得られたβ－シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼを２Ｕ／ｇ（マルトデキストリンドライベース）の量で添加し、４５℃下で静置して反応させた。それぞれの時点（０、１、２、３、６、９、１２、２４時間目）でサンプルをそれぞれ取り、１０分間煮沸して酵素を消滅させた後、２Ｕ／ｇ（マルトデキストリンドライベース）のグルコアミラーゼを加えて３０℃下で１時間糖化させた。続いて１０分間煮沸して酵素を消滅させ、１００００ｒ／ｍｉｎで２０分間遠心分離した後、上清を取ってそれを０．４５μｍの限外ろ過膜でろ過し、生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析した。
５％（ドライベース、ｗ／ｖで、５ｇ／１００ｍＬ）のマルトデキストリン（ＤＥ＝４）を基質とし、実施例２で得られたβ－シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼを２Ｕ／ｇ（マルトデキストリンドライベース）の量で添加し、４５℃下で静置して反応させた。それぞれの時点（０、１、２、３、６、９、１２、２４時間目）でサンプルをそれぞれ取り、１０分間煮沸して酵素を消滅させた後、２Ｕ／ｇ（マルトデキストリンドライベース）のグルコアミラーゼを加えて３０℃下で１時間糖化させた。続いて１０分間煮沸して酵素を消滅させ、１００００ｒ／ｍｉｎで２０分間遠心分離した後、上清を取ってそれを０．４５μｍの限外ろ過膜でろ過し、生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析した。
ＨＰＬＣの測定条件：Ｗａｔｅｒｓ６００高速液体クロマトグラフィー（示差屈折検出器付き）、カラムはＬｉｃｈｒｏｓｏｒｂ ＮＨ２（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）であり、移動相はアセトニトリル－水（６８％－３２％）であり、カラム温度は３０℃であり、流速は１ｍＬ／ｍｉｎである。
結果：実施例２で得られたβ－シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼをマルトデキストリン（ＤＥ＝４）に２４時間作用させた後、図３に示すように、主な生成物であるβ－シクロデキストリンは１１．６ｇ／Ｌに達し、総シクロデキストリンの７４．３％を占め、β－シクロデキストリン生成物の比較的に高い特異性を有する。
（実施例５ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓの発酵によるβ－シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼの生成）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８を、以下の方法で培養した。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８を、以下の方法で培養した。
（１）プレートスクライビング
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８の菌液を接種用ループで着けて取り、用意しておいたプレート培地（酵母粉末 ６ｇ／Ｌ、魚のペプトン ６ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、タピオカでん粉 １２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／Ｌ、寒天 １５ｇ／Ｌからなり、ＮａＯＨでｐＨ１０．０に調整した）上でスクライビングし、３０℃のインキュベーターに入れて１２時間培養した。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８の菌液を接種用ループで着けて取り、用意しておいたプレート培地（酵母粉末 ６ｇ／Ｌ、魚のペプトン ６ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、タピオカでん粉 １２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／Ｌ、寒天 １５ｇ／Ｌからなり、ＮａＯＨでｐＨ１０．０に調整した）上でスクライビングし、３０℃のインキュベーターに入れて１２時間培養した。
（２）種子培養
プレート上からシングルコロニーをピックアップして種子培地に接種し、３０℃下、２００ｒｐｍで１２時間培養した。
プレート上からシングルコロニーをピックアップして種子培地に接種し、３０℃下、２００ｒｐｍで１２時間培養した。
種子培地の配合は、以下の通りである。
種子培地Ａ：酵母粉末 ６ｇ／Ｌ、魚のペプトン ６ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、タピオカでん粉 １２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／Ｌからなり、ＮａＯＨでｐＨ１０．０に調整したものである。
種子培地Ｂ：酵母粉末 ６ｇ／Ｌ、大豆ペプトン ６ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、タピオカでん粉 １２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／Ｌからなり、ＮａＯＨでｐＨ１０．０に調整したものである。
種子培地Ｃ：酵母粉末 ６ｇ／Ｌ、トリプトン ６ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、タピオカでん粉 １２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／Ｌからなり、ＮａＯＨでｐＨ１０．０に調整したものである。
種子培地Ｄ：酵母粉末 ６ｇ／Ｌ、カゼインペプトン ６ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、タピオカでん粉 １２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／Ｌからなり、ＮａＯＨでｐＨ１０．０に調整したものである。
種子培地Ｅ：酵母粉末 ６ｇ／Ｌ、牛骨のペプトン ６ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、タピオカでん粉 １２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／Ｌからなり、ＮａＯＨでｐＨ１０．０に調整したものである。
それぞれの種子培地において種子培養を行った。菌液の増殖状況は表４に示した。その結果、魚のペプトンがＢａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８の正常な増殖に非常に重要であると、分かった。
（実施例６ β－Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓの発酵によるβ－シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼの生成）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８を、以下の方法で培養した。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８を、以下の方法で培養した。
（１）プレートスクライビング
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８の菌液を接種用ループで着けて取り、用意しておいたプレート培地（酵母粉末 ６ｇ／Ｌ、魚のペプトン ６ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、タピオカでん粉 １２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／Ｌ、寒天 １５ｇ／Ｌからなり、ＮａＯＨでｐＨ１０．０に調整した）上でスクライビングし、３０℃のインキュベーターに入れて１２時間培養した。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ ＳＴＢ０８の菌液を接種用ループで着けて取り、用意しておいたプレート培地（酵母粉末 ６ｇ／Ｌ、魚のペプトン ６ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、タピオカでん粉 １２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／Ｌ、寒天 １５ｇ／Ｌからなり、ＮａＯＨでｐＨ１０．０に調整した）上でスクライビングし、３０℃のインキュベーターに入れて１２時間培養した。
（２）種子培養
プレート上からシングルコロニーをピックアップして種子培地に接種し、３０℃下、２００ｒｐｍで１２時間培養する。
プレート上からシングルコロニーをピックアップして種子培地に接種し、３０℃下、２００ｒｐｍで１２時間培養する。
種子培地の配合は、以下の通りである。
Ａ：酵母粉末 ６ｇ／Ｌ、魚のペプトン ６ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、タピオカでん粉 １２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／Ｌからなり、ＮａＯＨでｐＨ１０．０に調整したものである。
Ｂ：酵母エキス ６ｇ／Ｌ、魚のペプトン ６ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、タピオカでん粉 １２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／Ｌからなり、ＮａＯＨでｐＨ１０．０に調整したものである。
この２つの種子培地において種子培養を行った結果、酵母粉末を含んだ種子培地は、１２時間培養した時点で、すでに濁った状態となっていたが、酵母エキスを含んだ種子培地は、濁る状態となるまで、２４時間の培養が必要であったことが分かった。したがって、酵母粉末は菌株の迅速な増殖に重要な役割を果たし、産業上における、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼの効率的な生成に有利である。
Claims (12)
- ２０２１年５月２８日に中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センターに寄託された、受託番号がＣＧＭＣＣ ＮＯ．２２６２５である、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ。
- 請求項１に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓを含む微生物製剤。
- β-シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼの調製における、請求項１に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ又は請求項２に記載の微生物製剤の使用。
- 請求項１に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓを、２５～３０℃下で少なくとも７２時間発酵させることを特徴とする、β-シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼを調製する方法。
- 発酵のための培地は、酵母粉末を炭素源とすることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
- 発酵のための培地は、魚のペプトンを窒素源とすることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
- 発酵のための発酵培地は、コーンシロップパウダー、Ｎａ２ＣＯ３、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＫＨ２ＰＯ４及びタピオカデンプンを含むことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
- 配列番号１で示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓに由来するβ-シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ。
- 配列番号２で示されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項８に記載のβ-シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子。
- シクロデキストリンの調製における、請求項１に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ又は請求項８に記載のβ-シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼの使用。
- 請求項１に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓを用いてβ-シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼを調製し、さらに、前記β-シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼを２Ｕ／ｇ（マルトデキストリンドライベース）の量でマルトデキストリン含有系に加え、４５℃下で２４時間反応させ、１０分間煮沸して酵素を消滅させた後、２Ｕ／ｇ（マルトデキストリンドライベース）のグルコアミラーゼを加え、３０℃下で１時間糖化させることを特徴とする、シクロデキストリンを調製する方法。
- 食品分野でのマルトデキストリン分解における、請求項１に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ又は請求項８に記載のβ-シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼの使用。
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