CN111500486B

CN111500486B - 一株可以利用菊粉作为唯一碳源直接合成丁醇的菌株及其应用

Info

Publication number: CN111500486B
Application number: CN202010197330.XA
Authority: CN
Inventors: 信丰学; 姜岷; 吕阳; 蒋羽佳; 董维亮; 章文明; 方艳; 马江锋; 周杰
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2020-03-19
Filing date: 2020-03-19
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2040-03-19
Also published as: CN111500486A

Abstract

本发明公开了一株可以利用菊粉为唯一碳源直接合成丁醇的菌株，其分类命名为丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）,菌株号为NJ4，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为（CCTCC M 20191080）。菌株NJ4在4‑8天时间可以利用90 g/L菊粉直接生产13.25 g/L的丁醇。本发明的菌株可以利用葡萄糖、果糖、低聚果糖和菊粉，更优选以菊粉为碳源。

Description

一株可以利用菊粉作为唯一碳源直接合成丁醇的菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株可以利用菊粉作为唯一碳源直接合成丁醇的菌株。

背景技术

丁醇是一种重要的大宗化工原料和生物燃料，已有一百多年的历史。丁醇具有较高的热值、较好的互溶性、较低的汽化热、较低的腐蚀性和较高的粘度。生物丁醇一般由溶剂梭菌(C. acetobutylicum,Clostridium beijerinckii等)通过传统的丙酮-丁醇-乙醇(ABE)发酵工艺生产，其典型的质量比为3:6:1。然而，这些底物的高成本成为ABE商业化发酵的主要障碍之一。

菊芋是一种丰富的饲料作物，能抵抗植物病害，在不肥沃的土地上生长良好，不与粮食作物争夺耕地。在中国甘肃和山东，菊芋的种植面积分别为4.0-20.0公顷和> 35.0公顷，报道产量可达每公顷45-90吨(地下块茎)。一般来说，除了80%的水和1-2%的蛋白质外，菊芋块茎含有大约15-20%的碳水化合物，主要的碳水化合物是菊粉。菊粉分子约由31个β-D-呋喃果糖和1-2个吡喃菊糖残基聚合而成，果糖残基之间能通过β-2，1-键连接。是由D-果糖经β（1→2）糖苷键链接而成的线性直链多糖，末端常带有一个葡萄糖残基。

一般情况下，菊粉应先经酸性或酶预处理水解，然后进行生物转化。虽然酸性水解是菊粉降解常用的预处理方法，但其成本低、易获得、水解时间短;然而，它很容易产生抑制剂，为以下发酵微生物，如5-羟甲基糠醛(HMF)。酶解可以避免这一缺点，许多从真菌中分离出的菊粉酶，如黑曲霉已被用于酶解菊粉。然而，水解酶的高成本阻碍了生物丁醇的大规模规模化生产。因此，寻找能够直接利用菊粉为碳源生产丁醇菌株越来越受到关注。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一株可以利用菊粉作为唯一碳源直接合成丁醇的菌株。

本发明还要解决的技术问题是提供上述菌株的应用。

技术方案：本发明所述一种丙酮丁醇梭菌，其分类命名为丙酮丁醇梭菌（ Clostridium acetobutylicum），菌株号为NJ4,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2019年12月20 日，保藏编号为CCTCC M 20191080，保藏地址为中国湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学.邮编430072。

该菌株是发明人于2018年4月6日对中国南京老山国家森林公园土壤进行筛选，用菊粉为底物添加到培养基中进行筛选，在平板上划线纯化5-7代，筛选出能够利用菊粉的菌株，并对筛选到的菌株进行厌氧培养，考察发酵产物和性能，发现其可以利用很多碳源进行生长，并且可以直接利用菊粉合成丁醇。

本发明所述的C. acetobutylicum NJ4可以通过果聚糖酶降解菊粉得到果糖，并在磷酸果糖激酶的作用下得到3-P-甘油醛，从而进入三羧酸循环，得到丙酮酸，在经过一系列的酶催化最终可以得到乙酸，乙醇，丁酸，丁醇等产物。

一株含有本发明所述的利用菊粉作为唯一碳源直接合成丁醇的菌株C. acetobutylicum NJ4 16S rDNA序列的克隆载体。

所述的重组克隆载体，优选出发载体为pMD19T。

含所述的菌株C. acetobutylicum NJ4 16S rDNA序列的基因工程菌Escherichia coil DH5α（pMD19T-16S）。

所述的基因工程菌E.coil DH5α的构建方法：利用引物27F：5^，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3^,和1492R：5^，-TACCTTGTTACGACTT-3^,扩增菌株的NJ4 16S rDNA，通过T/A克隆的方式连接至克隆载体pMD19T，构建重组克隆载体pMD19T-16S，将其转化到克隆宿主菌E. coil DH5α，获得重组微生物E. coil DH5α（pMD19T-16S），将所获得的重组微生物外源片段进行测序，NCBI数据库比对该16S rDNA序列，在分子水平将菌株NJ4鉴定至C. acetobutylicum菌属。

菌株特征：菌株NJ4细胞呈梭状，常含有淀粉粒，芽孢卵圆形，次端生。表面菌落呈圆形，光滑隆起，直径 3～5mm，边缘不规则，色灰白，半透明，严格厌氧。

所述的菌株在降解菊粉生产丁醇中的应用。

将菌株NJ4以接种量5-10%体积比接种到发酵培养基，震荡培养，每隔24 h调节pH至5.0-6.0，发酵72-168 h。

其中所述发酵培养基配方为NaCl 1-1.5 g/L、KH₂PO4 0.5-1.0 g/L、K₂HPO₄ 0.5-1.0 g/L、酵母粉2-4 g/L、CaCl₂·2H₂O 0.01-0.02 g/L、FeCl₂·4H₂O 1.0-2.0 g/L,、KCl0.1-0.4 g/L,调节pH至5.0-6.0，碳源20-90 g/L；其中所述的碳源为葡萄糖、果糖、低聚果糖、菊粉。

丁酸是丙酮丁醇梭菌发酵生产丁醇的中间产物，额外添加丁酸钠可以提高丁醇产量。添加20-40 mM丁酸钠，丁醇产量为13-15 g/L 。

有益效果：本发明以南京老山国家森林公园土壤进行筛选，用菊粉为底物添加到培养基中进行筛选得到一株可以利用菊粉为唯一碳源生长的菌株 Clostridium acetobutylicum NJ4，在中温厌氧条件下发酵生产得到丁醇，丁醇产量为13.25 g/L。此外，该菌株还可以利用葡萄糖、果糖、低聚果糖等为碳源进行生长。

附图说明

图1为菌株NJ4在含有90 g/L的葡萄糖的培养基中的发酵情况；

图2为菌株NJ4在含有90 g/L的果糖的培养基中的发酵情况；

图3为菌株NJ4在含有90 g/L的低聚果糖的培养基中的发酵情况；

图4为菌株NJ4在含有90 g/L菊芋的培养基中的发酵情况；

图5为菌株NJ4在额外添加丁酸钠的90 g/L菊芋的培养基中的发酵情况。

具体实施方式

实施例1

以菊粉（南京松冠生物科技有限公司）为碳源的C. acetobutylicum NJ4的分离筛选：

称取1g南京老山国家森林公园土壤采取的土样，用生理盐水稀释，吸取50μ至菊粉为唯一碳源的平板上，置于37℃厌氧培养箱5天，生长出的菌落划线纯化五代，筛选出能够利用菊粉的菌株，并对筛选到的菌株进行厌氧培养，从而得到能够利用菊粉的菌株。

上述平板的培养基配方为NaCl 1-1.5 g/L、KH₂PO4 0.5-1.0 g/L、K₂HPO₄ 0.5-1.0g/L、酵母粉2-4 g/L、CaCl₂·2H₂O 0.01-0.02 g/L、FeCl₂·4H₂O 1.0-2.0 g/L,、KCl 0.1-0.4 g/L,调节pH至5.0-6.0，菊粉90 g/L，固体培养基加入琼脂粉15-20 g/L,通氮气10-20min,115℃灭菌20min。

实施例2

以菊粉为碳源的C. acetobutylicum NJ4的鉴定及其生长特性：

NJ4的鉴定：

进行16S rDNA鉴定：利用引物27F：5^，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3^,和1492R：5^，-TACCTTGTTACGACTT-3^,扩增菌株的NJ4 16S rDNA，通过T/A克隆的方式连接至克隆载体pMD19T，构建重组克隆载体pMD19T-16S，将其转化到克隆宿主菌E. coil DH5α，获得重组微生物E. coil DH5α（pMD19T-16S），将所获得的重组微生物外源片段进行测序，NCBI数据库比对该16S rDNA序列，在分子水平将菌株NJ4鉴定至Clostridium acetobutylicum菌属。其16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

NJ4生长及代谢特性：

菌株NJ4可以很好的在37℃下生长，在pH至5.0-6.0（优选5.5）生长良好。NJ4在192h内基本降解90 g/L菊粉，并生成13.25 g/L丁醇。

实施例3

菌株C. acetobutylicum NJ4利用不同碳源的生长及发酵特性：

菌株C. acetobutylicum NJ4可以利用不同碳源生长（图1，图2，图3，图4），菌株C. acetobutylicum NJ4从平板上挑取菌株NJ4单菌接种到发酵培养基中，37℃，120 r/min震荡培养，每隔24 h调节pH至5.0-6.0，72 h后用气相色谱测其各种产物的浓度。

上述发酵培养基配方为NaCl 1 g/L,、KH₂PO4 0.75 g/L、K₂HPO₄ 0.75 g/L酵母粉3g/L、CaCl₂·2H₂O 0.015 g/L、FeCl₂·4H₂O 1.5 g/L、KCl 0.3 g/L, 调节pH至5.5，,通氮气10-20min，115℃灭菌20min。由图1，图2，图3，图4所示，以 90 g/L葡萄糖、 90 g/L果糖、 90g/L低聚果糖、 90 g/L菊粉为底物培养C. acetobutylicum NJ4。以果糖为底物的丁醇产量最高，产量为15-16 g/L。其以90 g/L菊粉为底物时的丁醇产量是13.25 g/L。

实施例4

菌株C. acetobutylicum NJ4额外添加丁酸盐的生长及发酵特性：

菌株C. acetobutylicum NJ4从平板上挑取菌株NJ4单菌接种到5ml发酵培养基中，37℃，120 r/min震荡培养48 h，然后以接种量5% v/v接种到发酵培养基中，额外添加30mM 丁酸钠，37℃，120 r/min震荡培养，每隔24 h调节pH至5.0-6.0，192 h后用GC测其各种产物的浓度。丁醇产量为14.35 g/L, 比对照组高8.3%。此外，溶剂生产较对照提前近24h，发酵时间缩短(120 h)，丁醇产率提高(0.12 g/L/h)。

上述发酵培养基配方为NaCl 1 g/L、KH₂PO4 0.75 g/L、K₂HPO₄ 0.75 g/L酵母粉3g/L、CaCl₂·2H₂O 0.015 g/L、FeCl₂·4H₂O 1.5 g/L、KCl 0.3 g/L，调节pH至5.5，菊粉30g/L,通氮气10-20min，115℃灭菌20min。上述培养基中丁酸钠添加量为30mM。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一株可以利用菊粉作为唯一碳源直接合成丁醇的菌株及其应用

<141> 2020-03-19

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1367

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggggaacttc ggttcccagc ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tacctcatag 60

tggggaatag cctttcgaaa ggaagattaa taccgcataa tactcgagaa tcgcatgatt 120

cttgagccaa aggatttatt cgctatgaga tggacccgcg gcgcattagc ttgttggtga 180

ggtaacggct caccaaggct tcgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacattg 240

gaactgagac acggtccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg 300

ggaaaccctg atgcagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt cttcggatcg taaaactctg 360

tcttatggga cgataatgac ggtaccatag gaggaagcca cggctaacta cgtgccagca 420

gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggattta ctgggcgtaa aggatgtgta 480

ggcggatatt taagtgagat gtgaaatccc cgggcttaac ttgggggctg catttcaaac 540

tggatgtctg gagtgcagga gaggaaggca gaattcctag tgtagcggtg aaatgcgtag 600

agattaggaa gaataccagt ggcgaaggcg gccttctgga ctgtaactga cgctgaggca 660

tgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgaa 720

tactaggtgt aggaggtatc gactccttct gtgccgcagt taacacaata agtattccgc 780

ctgggaagta cggtcgcaag attaaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcag 840

cggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt acctagactt gacatctcct 900

gaattagtcc gtaatggatg aagtcccttc ggggacagga tgacaggtgg tgcatggttg 960

tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttatcat 1020

tagttgctaa catttagttg agcactctag tgagactgcc cgggttaacc gggaggaagg 1080

tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgtctaggg ctacacacgt gctacaatgg 1140

tggggacaaa aagatgcaat accgcaaggt ggagcaaaac tcaaaacccc atcccagttc 1200

ggattgtagg ctgaaactcg cctacatgaa gccggagttg ctagtaatcg cgaatcagaa 1260

tgtcgcggtg aatacgttcc cgggtcttgt acacaccgcc cgtcacacca tgagagtcgg 1320

caacacccga agcccgtgag gtaacctttt ggaaccagcg tcgaagg 1367

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taccttgtta cgactt 16

Claims

1.丙酮丁醇梭菌NJ4降解菊粉生产丁醇的方法，其特征在于，将丙酮丁醇梭菌NJ4以接种量5-10%体积比接种到发酵培养基，震荡培养，每隔24 h调节pH至5.0-6.0，发酵72-168h；

所述的发酵培养基配方为：NaCl 1-1.5 g/L、KH₂PO₄ 0.5-1.0 g/L、K₂HPO₄ 0.5-1.0 g/L、酵母粉2-4 g/L、CaCl₂·2H₂O 0.01-0.02 g/L、FeCl₂·4H₂O 1.0-2.0 g/L、 KCl 0.1-0.4g/L,调节pH至5.0-6.0，菊粉20-90 g/L，余量为水；所述发酵培养基中添加20-40 mM 丁酸钠；所述丙酮丁醇梭菌NJ4已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M20191080。