CN111500485B - 一株可以共利用葡萄糖和木糖的丙酮丁醇梭菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株可以共利用葡萄糖和木糖的丙酮丁醇梭菌及其应用，其分类命名为丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）,菌株号为LY4，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为（CCTCC M 20191081）。菌株LY4在4‑8天时间可基本利用50 g/L的葡萄糖和木糖的混糖（混合比例1：1），不存在CCR效应。

Description

一株可以共利用葡萄糖和木糖的丙酮丁醇梭菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株可以共利用葡萄糖和木糖的丙酮丁醇梭菌。

背景技术

正丁醇一种无色、有酒气味的液体，沸点117.7℃，稍溶于水,是多种涂料的溶剂和制增塑剂邻苯二甲酸二丁酯（见邻苯二甲酸酯）的原料，也用于制造丙烯酸丁酯、醋酸丁酯、乙二醇丁醚以及作为有机合成中间体和生物化学药的萃取剂，还用于制造表面活性剂。丁醇因其优越的燃烧性能成为目前最具研发前景的生物燃料之一。作为燃料，丁醇具有能量密度大，可直接用于内燃机，运输方便等优点。在能源危机日益严峻的今天，丁醇作为燃料有着广阔的发展前景。

目前，丁醇主要通过化学法合成，随着石油资源加速枯竭和价格飞涨，发酵法生产丁醇受到广泛重视。传统发酵法生成丁醇主要以粮食和或其他淀粉质农副产品为原料，但这些原料成本较高，同时会出现与民争粮的问题。

近年来，国内外对木质纤维素为原料发酵产丁醇的研究很多。木质纤维原料中的六碳糖主要是葡萄糖(纤维素的主要组分)，五碳糖主要是木糖以及阿拉伯糖(半纤维素的主要组分)。其中，葡萄糖是最主要成分，其次为木糖，阿拉伯糖的含量较少。微生物在利用复杂碳源过程中普遍存在CCR（Carbon catabolite repression）效应，即速效碳源的快速利用对非速效碳源的代谢产生抑制作用。这一现象在产溶剂梭菌发酵木质纤维素水解液过程中同样存在。换言之，水解液中同时存在的葡萄糖抑制了细胞对其他糖源(木糖、阿拉伯糖等五碳糖)的有效利用，降低了物料转化效率和发酵的经济性。因此，解除产溶剂梭菌中的CCR效应、实现其对五碳糖和六碳糖的同等利用是利用木质纤维素为底物进行发酵的重要问题。共用五碳糖和六碳糖是提高丙酮丁醇菌株发酵效率的一个关键科学问题。

发明内容

发明目的：为了解决现有丙酮丁醇梭菌中的CCR效应，本发明提供了一种丙酮丁醇梭菌，本发明进一步提供了丙酮丁醇梭菌在发酵生产丁醇中的应用。

技术方案：本发明所述一种丙酮丁醇梭菌，其分类命名为丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）LY4,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2019年12月20日，保藏编号为CCTCC M 20191081，保藏地址为中国湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学.邮编430072。

该菌株是发明人于2018年9月11日对南京工业大学镜湖土壤进行筛选，用葡萄糖和木糖混糖为底物添加到培养基中进行筛选，在平板上划线纯化5-7代，筛选出能够利用葡萄糖和木糖混糖的菌株，并对筛选到的菌株进行厌氧培养，并用液相检测每天对葡萄糖、木糖的消耗情况。

LY4生长及代谢特性：菌株LY4可以在37℃很好的生长，在pH5.0-6.0下生长良好。

菌株特征：一种革兰染色阳性菌、细胞呈梭状、细胞大小(0.6-0.9) μ m* (2.4-4.7) μ m, 常含细菌淀粉粒, 以周生鞭毛运动，表面菌落圆形、突起, 直径3-5mm。

菌株LY4的16S rDNA的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

本发明进一步提供了丙酮丁醇梭菌LY4在发酵生产丁醇中的应用。

优选地，丙酮丁醇梭菌LY4共利用葡萄糖和木糖作为碳源，发酵生产丁醇。

本发明所述的Clostridium acetobutylicum LY4可以单独利用葡萄糖，也可以单独利用木糖，当以混糖为底物时，在葡萄糖生成乙酰辅酶A进入三羧酸循环的同时，可以通过木糖异构酶和木酮糖激酶的作用得到3-P甘油醛，从而进入三羧酸循环，再经过一系列酶的催化得到乙酸、乙醇、丁酸、丁醇等产物。菌株LY4的高木糖利用能力归因于其高木糖异构酶（0.99 U/mg蛋白）和木酮糖激酶（1.15 U/mg蛋白）活性。

一种含有本发明所述的可以共利用葡萄糖和木糖生产丁醇的菌株Clostridium acetobutylicum LY4 16S rDNA序列的克隆载体。

所述重组克隆载体，优选出发载体为pMD19T。

含所述的菌株Clostridium acetobutylicum LY4 16S rDNA序列的基因组工程菌Escherich coil DH5α构建方法：利用引物27F：5^，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3^,和1492R：5^，-TACCTTGTTACGACTT-3^,扩增菌株的LY4 16S rDNA，通过T/A克隆的方式连接至克隆载体pMD19T，构建重组克隆载体pMD19T-16S，将其转化到克隆宿主菌Escherich coil DH5α，获得重组微生物Escherich coil DH5α（pMD19T-16S），将所获得的重组微生物外源片段进行测序，NCBI数据库比对该16S rDNA序列，在分子水平将菌株LY4鉴定至Clostridium acetobutylicum菌属。

本发明所述菌株LY4通过基因组测序，发现其中含有木糖异构酶和木酮糖激酶以及一系列丁醇代谢途径所需要的酶，均可以进行重组克隆，进行异源表达。木糖主要通过木糖异构酶和木酮糖激酶的作用得到3-P甘油醛，从而进入三羧酸循环，再经过一系列酶的催化得到乙酸、乙醇、丁酸、丁醇等产物。

上述菌株共利用葡萄糖和木糖发酵生产丁醇的应用也在本发明的保护范围之内。

具体的应用方法为，将菌株LY4以接种量1%-10%v/v接种到发酵培养基中，37℃震荡培养，每隔24 h，调pH至5.0-6.0（优选5.5），发酵72-168h（优选96h）。

其中所述发酵培养基配方为NaCl 1-1.5 g/L, KH₂PO4 0.5-1.0 g/L, K₂HPO₄0.5-1.0 g/L,酵母粉2-4 g/L, CaCl₂·2H₂O 0.01-0.02 g/L ,FeCl₂·4H₂O 1.0-2.0 g/L,KCl 0.1-0.4 g/L,调节pH至5.0-6.0，碳源20-90 g/L。

其中所述的碳源为葡萄糖和木糖的混糖。葡萄糖和木糖的比例关系可以为任意比例，优选为1：1，1：2，2：1。

有益效果：本发明以南京工业大学镜湖的土壤为分离材料，通过一系列的筛选分离纯化得到一株可以共利用葡萄糖、木糖混糖的菌株Clostridium acetobutylicum LY4，在中温厌氧条件下发酵生产得到丁醇。菌株LY4在4-8天时间可基本利用50 g/L的葡萄糖和木糖的混糖（混合比例1：1）。该菌不存在CCR效应，可以实现葡萄糖和木糖的共利用。为工业生产丁醇，实现对五碳糖和六碳糖的同等利用，具有重要意义。在木质纤维素制备丁醇中具有重要应用价值。

附图说明

图1为以60g/L混糖（葡萄糖和木糖1：1）为碳源条件下糖耗情况；

图2为以60g/L混糖（葡萄糖和木糖1：1）为碳源条件下不同产物的产量；

图3为以60g/L混糖（葡萄糖和木糖1：2）为碳源条件下糖耗情况；

图4为以60g/L混糖（葡萄糖和木糖1：2）为碳源条件下不同产物的产量；

图5为以60g/L混糖（葡萄糖和木糖2：1）为碳源条件下丁醇的产量；

图6为以60g/L混糖（葡萄糖和木糖2：1）为碳源条件下不同产物的产量；

图7为培养24h后在葡萄糖中添加30g/L的木糖的糖消耗；

图8为培养24h后在木糖中添加30g/L葡萄糖的糖消耗；

图9为以60 g/L木质纤维素水解液为碳源条件下不同产物的产量。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

以混糖（葡萄糖和木糖1：1）为碳源的Clostridium acetobutylicum LY4的分离筛选：

称取1g南京工业大学镜湖采取的土样，用生理盐水稀释，吸取200μL至混糖为唯一碳源的平板上，置于37℃厌氧培养箱5天，生长出的菌落划线纯化五代，筛选出能够利用葡萄糖和木糖混糖的菌株，并对筛选到的菌株进行厌氧培养，并用液相检测每天对葡萄糖、木糖的消耗情况，从而得到能够共利用混糖（葡萄糖和木糖1：1）的菌株。

上述平板的培养基配方为NaCl 1 g/L, KH₂PO4 0.75 g/L, K₂HPO₄ 0.75 g/L酵母粉3 g/L, CaCl₂·2H₂O 0.015 g/L, FeCl₂·4H₂O 1.5 g/L, KCl 0.3 g/L,调节pH至5.0-6.0，碳源60 g/L，固体培养基加入琼脂粉15-20 g/L,通氮气10-20min,115℃灭菌20min。

实施例2：

以混糖（葡萄糖和木糖1：1）为碳源的Clostridium acetobutylicum LY4的鉴定及其生长特性：

LY4的鉴定：

进行16S rDNA鉴定：利用引物27F：5^，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3^,和1492R：5^，-TACCTTGTTACGACTT-3^,扩增菌株的LY4 16S rDNA，通过T/A克隆的方式连接至克隆载体pMD19T，构建重组克隆载体pMD19T-16S，将其转化到克隆宿主菌Escherich coil DH5α，获得重组微生物Escherich coil DH5α（pMD19T-16S），将所获得的重组微生物外源片段进行测序，NCBI数据库比对该16S rDNA序列，在分子水平将菌株LY4鉴定至Clostridium acetobutylicum菌属。其16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

LY4生长及代谢特性：

菌株LY4可以很好的在37℃下生长，在pH至5.0-6.0（优选5.5）生长良好。LY4在24h-48h处于对数生长期，期间会产生较多的乙酸和丁酸，使pH明显下降，从而生长受到影响，启动产醇机制，开始生成乙醇和丁醇。

实施例3：

以混糖为碳源的Clostridium acetobutylicum LY4利用不同比例混糖的生长及发酵特性：

菌株Clostridium acetobutylicum LY4可以利用不同比例的混糖为碳源生长（图1，图3，图5），菌株Clostridium acetobutylicum LY4从平板上挑取菌株LY4单菌接种到发酵培养基中，37℃，120r/min震荡培养，每隔24h调节pH至5.0-6.0，72h后用GC测其各种产物的浓度。发酵120h后发酵产物浓度如图2，图4，图6。

上述发酵培养基配方为NaCl 1 g/L,KH₂PO4 0.75 g/L,K₂HPO₄ 0.75 g/L，酵母粉3g/L,CaCl₂·2H₂O 0.015 g/L,FeCl₂·4H₂O 1.5 g/L,KCl 0.3 g/L，调节pH至5.5，碳源60g/L,通氮气10-20min，120℃灭菌20min。由图1，图3，图5所示，以混糖（葡萄糖和木糖比1：1，2：1，1：2）为底物，葡萄糖和木糖可以被同时利用，不存在CCR效应，丁醇产量达到13-15 g/L（0.108-0.125g/L/h）。

实施例4：

以30 g/L葡萄糖为碳源的Clostridium acetobutylicum LY4，培养24h后，在葡萄糖中添加30g/L的木糖，如图7,可以明显看到木糖被代谢。

以30 g/L木糖为碳源的Clostridium acetobutylicum LY4，培养24h后，在木糖中添加30g/L的葡萄糖，如图8,可以明显看到葡萄糖被代谢，葡萄糖和木糖可以被同时利用，不存在CCR效应。

实施例5：

以木质纤维素水解液为碳源的Clostridium acetobutylicum LY4的生长及发酵特性：

菌株Clostridium acetobutylicum LY4从平板上挑取菌株LY4单菌接种到发酵培养基中，37℃，120 r/min震荡培养，每隔24 h调节pH至5.0-6.0，72 h后用GC测其各种产物的浓度。发酵120 h后发酵产物浓度如图9。

上述发酵培养基配方为NaCl 1 g/L, KH₂PO4 0.75 g/L, K₂HPO₄ 0.75 g/L酵母粉3 g/L, CaCl₂·2H₂O 0.015 g/L, FeCl₂·4H₂O 1.5 g/L, KCl 0.3 g/L，调节pH至5.5，碳源为木质纤维素水解液（39.7 g/L葡萄糖，20.6 g/L木糖）,通氮气10-20min，120℃灭菌20min。木质纤维素水解液中的葡萄糖和木糖同时被利用，丁醇产量为14.6 g/L。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一株可以共利用葡萄糖和木糖的丙酮丁醇梭菌及其应用

<141> 2020-03-19

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1367

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggggaacttc ggttcccagc ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tacctcatag 60

tggggaatag cctttcgaaa ggaagattaa taccgcataa tactcgagaa tcgcatgatt 120

cttgagccaa aggatttatt cgctatgaga tggacccgcg gcgcattagc ttgttggtga 180

ggtaacggct caccaaggct tcgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacattg 240

gaactgagac acggtccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg 300

ggaaaccctg atgcagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt cttcggatcg taaaactctg 360

tcttatggga cgataatgac ggtaccatag gaggaagcca cggctaacta cgtgccagca 420

gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggattta ctgggcgtaa aggatgtgta 480

ggcggatatt taagtgagat gtgaaatccc cgggcttaac ttgggggctg catttcaaac 540

tggatgtctg gagtgcagga gaggaaggca gaattcctag tgtagcggtg aaatgcgtag 600

agattaggaa gaataccagt ggcgaaggcg gccttctgga ctgtaactga cgctgaggca 660

tgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgaa 720

tactaggtgt aggaggtatc gactccttct gtgccgcagt taacacaata agtattccgc 780

ctgggaagta cggtcgcaag attaaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcag 840

cggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt acctagactt gacatctcct 900

gaattagtcc gtaatggatg aagtcccttc ggggacagga tgacaggtgg tgcatggttg 960

tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttatcat 1020

tagttgctaa catttagttg agcactctag tgagactgcc cgggttaacc gggaggaagg 1080

tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgtctaggg ctacacacgt gctacaatgg 1140

tggggacaaa aagatgcaat accgcaaggt ggagcaaaac tcaaaacccc atcccagttc 1200

ggattgtagg ctgaaactcg cctacatgaa gccggagttg ctagtaatcg cgaatcagaa 1260

tgtcgcggtg aatacgttcc cgggtcttgt acacaccgcc cgtcacacca tgagagtcgg 1320

caacacccga agcccgtgag gtaacctttt ggaaccagcg tcgaagg 1367

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taccttgtta cgactt 16

Claims (4)

1.一株可以共利用葡萄糖和木糖的丙酮丁醇梭菌，其分类命名为丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）LY4，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 20191081。

2.权利要求1所述的丙酮丁醇梭菌在发酵生产丁醇中的应用，其特征在于，丙酮丁醇梭菌在发酵生产丁醇中碳源为葡萄糖和木糖，所述葡萄糖和木糖的比例关系为(1~2):(1~2)。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将丙酮丁醇梭菌LY4以接种量5-10%体积比接种到发酵培养基中，震荡培养，每隔12-24h调节pH至5.0-6.0，发酵72-168h。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基配方为：NaCl 1-1.5 g/L,KH₂PO₄ 0.5-1.0 g/L,K₂HPO₄ 0.5-1.0 g/L,酵母粉2-4 g/L,CaCl₂·2H₂O 0.01-0.02 g/L,FeCl₂·4H₂O 1.0-2.0 g/L,KCl 0.1-0.4 g/L,调节pH至5.0-6.0，碳源20-90g/L，余量为水。

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