CN105062907A

CN105062907A - 木糖醇和乙醇同时高温高产工程菌株的构建及应用

Info

Publication number: CN105062907A
Application number: CN201510455949.5A
Authority: CN
Inventors: 洪泂; 张标; 张佳
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2015-07-27
Filing date: 2015-07-27
Publication date: 2015-11-18
Anticipated expiration: 2035-07-27
Also published as: CN105062907B

Abstract

本发明涉及木糖醇和乙醇同时高温高产工程菌株的构建及应用，具体通过基因工程改造的方法将酿酒酵母的半乳糖透过酶(转运半乳糖和葡萄糖的己糖的己糖转运蛋白)(Saccharomyces？cerevisiae？galactose？permease)(ScGAL2)的N376F突变体基因在耐热酵母菌株YZJ015中高效表达，同时敲除甘油-3磷酸脱氢酶(K.marxianus？glycerol-3-phosphate？dehydrogenase)(KmGPD1)基因切断甘油生产支路，使获得的菌株YZJ119获得了在较高温度(>42℃)下，高效地共利用和发酵葡萄糖和木糖生产乙醇和木糖醇的能力。在42℃条件下，YZJ119能够同时利用43.95g/l木糖和83.11g/l葡萄糖在28h内生产40.43g/l木糖醇和34.66g/l乙醇，其生产速率分别为1.44g/l/h(木糖醇)和1.24g/l/h(乙醇)，得率分别为0.92g/g(木糖醇)和0.42g/g(乙醇)。

Description

木糖醇和乙醇同时高温高产工程菌株的构建及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，构建了能够在较高温度下同时利用葡萄糖和木糖共发酵生产乙醇和木糖醇，并且生产速率大幅度提高的耐热工程酵母。涉及通过工程菌改造提高高温下利用葡萄糖和木糖共发酵生产乙醇和木糖醇的领域。

背景技术

木糖醇是一种五碳多元醇，是木糖代谢的正常中间产物(Vandeskaetal.,1996)，它的性质决定了它在食品、医药等方面具有重要的应用价值。首先，在食品行业中，木糖醇的甜味堪比蔗糖，可以作为甜味剂，同时与其它甜味剂相比，木糖醇的口感清凉，而且木糖醇不能被口腔内酵母菌和细菌利用，因此可以预防龋齿，可作为儿童防蛀食品的添加剂(Dominguezetal.,1997)。另外，由于木糖醇是微生物的不良培养基，因此可以作为食品添加剂，延长食品的保鲜期。其次，在医药方面，它被用于静脉滴注时，不需要胰岛素的促进作用，就可以透过细胞膜，促进肝糖元的增加，为细胞提供所需的能量，同时血液中的丙酮酸、乳酸以及葡萄糖的含量会有所下降，无细胞毒性，因此可以作为糖尿病患者的辅助治疗试剂(Ahmadetal.,2011；Ghindeaetal.,2010；Jeonetal.,2011；Koetal.,2011；Kumaretal.,2009；Sasakietal.,2010)。

木糖醇是木糖代谢的正常中间产物(Vandeskaetal.,1996)。目前木糖醇的生产主要是通过工业生产的方式。工业生产主要是化学加氢法，加氢需要高温高压，增加了生产成本，同时工艺复杂、收率低，限制了木糖醇的大规模生产，并且加氢需要镍的催化作用，这就带来了低食品安全和环境污染的隐患(Chengetal.,2010)。针对化学法生产木糖醇存在的问题，国际上从20世纪70年代开始研究用微生物法来生产木糖醇。微生物法的原理是利用细胞内的木糖还原酶(XR)，将木糖还原为木糖醇，而不需要镍的催化作用，保证的食品安全却又不会带来环境污染；氢来自细胞内的还原性辅酶和氢离子，不需另行制氢，反应在常温常压下进行，降低了成本。又由于酶的底物专一性，使得原料不必高度精制。因此，利用微生物来生产木糖醇将具有污染少、成本低、产品质量高并且无环境污染等优点，具有非常大的发展前景。

乙醇是醇类的一种，俗称酒精。乙醇的用途很广，在生物能源方面，由于它存在作为化石燃料的替代者的潜力，因此在近年受到了很大的关注(Chen,2011)。乙醇调入汽油可以作为车用燃料，也被称为E型汽油，这样的调和可以优化油品的性能和质量，从而降低一氧化碳、碳氢化合物等主要污染物排放。在医药方面，乙醇是一种镇静剂，也可以用于医药消毒。在食品方面，食用酒精可以用来勾兑白酒。另外，乙醇在化工行业也有重要的用途，可以用作溶剂，作为有机合成的原料，用于各种化合物的结晶，还可以作为洗涤剂和萃取剂。

目前乙醇的生产包括工业生产和微生物生产两种方式。工业生产是将乙烯与水合成乙醇，而乙烯大量取自石油裂解气，所以这种方法会受到石油资源的限制。另外，还需要高温高压的条件，使乙醇的工业生产面临高成本与环境污染的压力。而利用微生物发酵糖类生产乙醇，是一种可利用再生资源的生产方法，不仅能够满足对燃料等方面的需求，还可以避免环境污染(Suetal.,2014)。因此目前越来越多的采用的是利用微生物生产的方式的生产乙醇

本专利中用来生产木糖醇的菌株为马克斯克鲁维耐热酵母K.marxianus。K.marxianus在高温下发酵有以下几个优点：1.高温下发酵可以降低发酵中的冷却费用；2.纤维素酶等的最适催化温度较高，高温会提高以淀粉、纤维素等生物质为原料的同步糖化发酵(SSF)效率，促进糖化，减少在酶上的费用(Fonsecaetal.,2008)Zhangetal.,2013)；3.能在耐热范围内生存的微生物较少，因此，高温会降低污染的风险。(Kumaretal.,2009；Zhangetal.,2013)。除此之外，K.marxianus是一种GRAS(generalregardingassafe)酵母，广泛的在乳制品、葡萄酒发酵制造中存在，对环境、动物及人类是安全的微生物。它能够在较高的温度下生长，最高的菌株可在高达52℃生长，具有很高的生长速率(0.86–0.99h^-1,40℃)(BanatandMarchant,1995)。K.marxianus有很高的代谢多样性，能利用多种工业上的底物糖类生长发酵。能利用多种廉价底物、耐热、高生长率等特点，使其被认为是替代酿酒酵母用来进行工业发酵和外源蛋白表达的候选者。由于K.marxianus有很多比酿酒酵母优秀的品质，K.marxianus被越来越多的用于生物能源的生产(Fonsecaetal.,2008)。所以利用K.marxianus发展成木糖醇生产菌株有非常重要的应用价值。

木质纤维素生物质(如农业废物玉米秸秆等)是丰富的可再生材料，同时木质纤维素可以从农业废物如玉米秸秆等中获得，不会与粮食造成竞争。因此，利用生物从可再生资源中生产有价值的产物木糖醇具有极大的经济和环境意义。葡萄糖和木糖是其水解液的最主要两个单糖成份，要建立经济的工业利用过程，需要对两种糖的高效利用和发酵(Haetal.,2011)，但目前的方法都不够高效，尤其是葡萄糖和木糖同时存在时，由于葡萄糖抑制效应，微生物利用木糖的能力常常被葡萄糖抑制而导致效率低下。各种工程菌株的构建，使利用木糖发酵生产木糖醇的能力不断提高，但是葡萄糖的抑制效应常常难以解除。在构建的马克思克鲁维酵母菌株葡萄糖的抑制效应非常明显，因此利用葡萄糖和木糖共同发酵一直是一个瓶颈。

发明内容

本专利通过基因工程改造，最终获得菌株YZJ119，可以同时利用葡萄糖和木糖共发酵，在高温下同时利用葡萄糖和木糖的混合糖溶液生产木糖醇和乙醇，并在不影响乙醇产量的前提下大幅度提高木糖醇的得率及生产速率，在利用木质纤维素生物质水解产物高效生物转化生产木糖醇和乙醇工业上有很巨大的应用前景。

本发明通过基因工程的方法，首先在耐热酵母YZJ015中高效表达酿酒酵母的半乳糖透过酶的N376F突变体(从酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeW303-1A(ATCC208352)基因组中利用带有突变位点的引物扩增并融合得到)(具体构建过程为pZJ061和pZJ063)，从而使菌株共利用和发酵葡萄糖和木糖的能力大幅度的提高。其次，敲除基因KmGPD1(GenBank，K.marxianus基因组序列AP012213，REGION:378475..379641)从而切断甘油生产支路，使甘油的积累几乎消失。构建了在较高温度(>42℃)下能够同时共利用和发酵葡萄糖和木糖的高效生产乙醇和木糖醇的耐热酵母K.marxianus菌株YZJ119。

本专利中的最终构建的YZJ119菌株在42℃条件下，以83.11g/l葡萄糖和43.95g/l木糖的混合糖为底物，YZJ119能在28h内生产40.43g/l木糖醇，生产速率为1.44g/l/h，生产率为0.92g/g，同时生产34.66g/l乙醇，生产速率为1.24g/l/h，生产率为0.42g/g。

本发明具体包括以下各项：

1.一种能同时利用葡萄糖和木糖共发酵生产木糖醇和乙醇的耐热工程酵母菌株，所述酵母菌株以在K.marxianus基础上转入了一个以上拷贝的脉孢霉木糖还原酶基因NcXR(Neurosporacrassaxylosereductase)的耐热酵母作为宿主，并将一个以上拷贝的酿酒酵母的半乳糖通透酶的N376F突变体基因在上述所述宿主中重组表达，和任选地敲除基因KmGPD1而获得。

2.根据1所述的酵母菌株，所述NcXR的拷贝数为四个。

3.根据1所述的酵母菌株，所述宿主为保藏号为CGMCCNo.7819的YZJ015菌株。

4.根据1所述的酵母菌株，所述半乳糖通透酶的N376F突变体基因的拷贝数为一个、两个、三个或四个。

5.根据1所述的酵母菌株，所述半乳糖通透酶的N376F突变体基因的序列为SEQIDNO：15。

6.根据1所述的酵母菌株，所述菌株为马克思克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)YZJ119，已经于2015年7月2日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会的普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo：11035。

7.一种能同时利用葡萄糖和木糖共发酵生产木糖醇和乙醇的耐热工程酵母菌株的构建方法，所述方法包括：

1)敲除在K.marxianus基础上转入了一个以上拷贝的脉孢霉木糖还原酶基因NcXR(Neurosporacrassaxylosereductase)的耐热酵母中的ScURA3基因；

2)顺序转入一份、两份、三份或四份半乳糖通透酶的N376F突变体基因；和任选地

3)敲除基因KmGPD1。

8.根据7所述的方法，所述NcXR的拷贝数为四个。

9.根据7所述的方法，所述耐热酵母为保藏号是CGMCCNo.7819的YZJ015菌株。

10.1-6任一项所述的酵母菌株用于将葡萄糖和木糖共发酵生产木糖醇和乙醇的方法。

在优选的实施方案中，本发明包括以下内容：

1).一种能同时利用葡萄糖和木糖共发酵生产木糖醇和乙醇的耐热工程酵母菌株，以在K.marxianus基础上转入了四个拷贝的NcXR的耐热酵母YZJ015菌株(CGMCCNo.7819)作为宿主，并将多拷贝的酿酒酵母的半乳糖通透酶的N376F突变体基因在上述所述宿主中重组表达。

2).第1)项中的半乳糖通透酶的N376F突变体基因的重组表达的出发载体为YEUGAP(Zhangetal.,2015)或pPICZB(invitrogen)。本专利中的各种质粒的构建为：⑴以酿酒酵母的基因组DNA为模板，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(大连宝生物)进行PCR扩增，得到的产物即为ScGAL2,并将基因连接进入YEUGAP载体中，从而构建得到质粒pZJ050。⑵以pZJ050作为模板，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(大连宝生物)进行PCR扩增，得到的产物即为ScGAL2-F1，ScGAL2-F2两个基因片段，将两个基因片段融合，并将融合的基因片段ScGAL2-N376F连接进入YEUGAP载体中，从而构建了质粒pZJ061。⑶将终止子ScGAPDHt,启动子KmGAPDHp和ScGAL2-N376F基因分别以YEGAP质粒，pMD18-T-KmGAPDHp质粒(Zhangetal.,2015)，pZJ061质粒为模板进行PCR扩增，融合，然后将融合产物KmGAPDHp-ScGAL2-N376F-ScGAPDHt基因片段插入到pPICZB质粒中，从而构建质粒pZJ063。⑷以马克思克鲁维酵母NBRC1777(购买于日本独立行政法人制品评価技术基盘机构国立生物资源中心(NBRC))基因组为模板，PCR扩增得到基因KmGPD1，然后将基因KmGPD1通过策略TA克隆插入pMD18-T载体，从而得到pMD18-T-KmGPD1载体。然后以yEUGAP为模板进行PCR扩增，得到ScURA3完整表达框。利用SmaI对ScURA3完整基因进行酶切，MscI对pMD18-T-KmGPD1进行酶切，连接，从而获得质粒pZJ034。在pZJ034中，KmGPD1的开放阅读框(ORF)被ScURA3的插入破坏。

3).第一项中的重组表达的半乳糖通透酶的N376F突变体基因来源于酿酒酵母。

4).第一项中的耐热工程酵母菌株，其原始菌株YZJ015是申请人构建并在中国微生物菌种保藏管理委员会的普通微生物中心保藏的菌株CGMCCNo.7819。

5).第1-4项中的耐热工程酵母菌株的构建方法，主要包括以下步骤：

将含有酿酒酵母来源的启动子(ScGAPDHp)控制的酿酒酵母的半乳糖通透酶的N376F突变体基因(ScGAL2-N376F)的pZJ061转化进酵母YZJ037(敲除了YZJ015中ScURA3获得)中，命名为YZJ103；将含有K.marxianus来源的启动子(KmGAPDHp)控制的酿酒酵母的半乳糖通透酶的N376F突变体基因(ScGAL2-N376F)的pZJ063转化进酵母YZJ103中，命名为YZJ109；将pZJ034转化进酵母YZJ114(敲除了YZJ109中ScURA3获得)中，命名为YZJ115；将含有酿酒酵母来源的启动子(ScGAPDHp)控制的酿酒酵母的半乳糖通透酶的N376F突变体基因(ScGAL2-N376F)的pZJ061转化进酵母YZJ116(敲除了YZJ115中ScURA3获得)中，命名为YZJ118；将含有K.marxianus来源的启动子(KmGAPDHp)控制的酿酒酵母的半乳糖通透酶的N376F突变体基因(ScGAL2-N376F)的pZJ063转化进酵母YZJ118中，分别命名为YZJ119。

6).第五项中的菌株YZJ119用于通过利用葡萄糖和木糖共发酵生产乙醇和木糖醇的应用。此菌株对于应用到木质纤维素水解液的发酵生产高附加值的乙醇和木糖醇具有非常重要的意义。

本发明的菌株马克思克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)YZJ119已经于2015年7月2日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会的普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.11035。

优点和积极效果

本发明获得的菌株YZJ119可以在42℃条件下，在28h内利用43.95g/l木糖生产40.43g/l木糖醇，生产速率为1.44g/l/h，生产率为0.92g/g；同时利用83.11g/l葡萄糖生产34.66g/l乙醇，生产速率为1.24g/l/h，生产率为0.42g/g。

这一结果说明，YZJ119可以在高温下同时共利用和发酵葡萄糖和木糖的混合糖溶液生产乙醇和木糖醇，并在不影响乙醇产量的前提下大幅度提高木糖醇的得率及生产速率，解除了马克斯克鲁维酵母本身存在的葡萄糖抑制效应，这是目前解决这一问题的首例工作，在利用木质纤维素生物质水解产物高效生物转化生产木糖醇和乙醇工业上有很巨大的应用前景。

附图说明

图1.本申请的质粒图谱：A.质粒pZJ034；B.质粒pZJ050；C.质粒pZJ061；D.质粒pZJ063。

图2.构建过程中各菌株的发酵结果比较(42℃，250rpm)。A出发菌株YZJ015,BYZJ103,CYZJ109,DYZJ115,EYZJ118,FYZJ119在42℃利用40g/l木糖和80g/l葡萄糖混合液的共发酵的结果(■,葡萄糖；●,木糖；▲,木糖醇；乙醇；▼,甘油；◆,乙酸)。

图3.本申请中的菌株构建流程图。第1份和第3份的ScGAL2-N376F基因的转入是以Amp为抗性进行菌株筛选，第2份和第4份的ScGAL2-N376F基因的转入是以Zeocin为抗性进行菌株筛选。

具体实施方式

试剂和菌株：

本发明中的所有试剂均是市场购买的试剂级以上试剂。其中，木糖，葡萄糖，甘油，酵母基本氮源，尿嘧啶，胶回收试剂盒以及所有的限制性内切酶均来源于上海生工生物工程公司。PrimeSTARHSDNA聚合酶，Ligationhigh购自TOYOBO公司，SolutionI连接酶以及pMD18-T载体购自于大连宝生物公司。大肠杆菌EscherichiacoliXL10-gold菌株作为DNA操作时使用的宿主菌(美国加利福利亚Stratagene公司)，包含100μg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基用作培养E.coli。葡萄糖合成培养基(YNB葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，尿嘧啶20mg/ml)主要用于转化。质粒YEGAP,YELGAP,YEUGAP由本实验室提供(Hongetal.,2007)。YPD培养基(10g/l酵母提取物,20g/l细菌学蛋白胨,20g/l葡萄糖)用于酵母的前培养。YPX(10g/l酵母提取物，20g/l细菌学蛋白胨，40g/l木糖，80g/l葡萄糖)用于发酵培养基。马克思克鲁维酵母YZJ015菌株保存在中国微生物菌种保藏管理委员会的普通微生物中心，菌株号CGMCCNo.7819。

实施例1菌株的制备：

1.提取酵母基因组的具体操作步骤为：

①.马克思克鲁维酵母NBRC177菌株，在YPD平板上划线，挑取单克隆，接入5ml液体YPD中，37℃，250rpm，培养24h。

②.常温下12000rpm，5sec离心收菌，弃上清。

③.500μl蒸馏水重悬菌体，12000rpm，5sec离心收菌，弃上清。

④.取200μl实验室自配1xbreaking缓冲液(TritonX-100(2％(w/v))，SDS(1％(w/v)),NaCl(100mM),Tris-Cl(10mM,pH8.0),EDTA(1mM))重悬菌体，并将菌液转入到含有0.3g玻璃珠(425-600um，sigma，美国)的EP管内。

⑤.加入200μl酚氯仿溶液后，高速震荡3min，加入200μl1xTE(10mMTris-Cl,pH8.0,1mMEDTA)。轻微震荡。

⑥.12000rpm，离心5min，取最上层清液转入新的EP管内，加入1ml预冷的无水乙醇。

⑦.12000rpm,4℃，离心10min，弃上清，室温下干燥沉淀，并用400μl1xTE重悬沉淀。

⑧.加入2μlRNase(RNA水解酶,中国上海生工生物)，2mg/ml)到EP管内，混匀，37℃，酶切1h。

⑨.取40μl3M醋酸钠(pH5.2)加入到管内，混匀并加入1ml预冷的无水乙醇。

⑩.12000rpm，4℃，离心30min，弃上清室温下干燥。用100μl无菌水重悬沉淀，此即酵母基因组DNA。

2.pZJ050的构建：

提取酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeW303-1A(ATCC208352)的基因组，并将提取的酿酒酵母的基因组稀释100倍作为模板，以SCGAL2-ECORI-F(SEQIDNO：1)和SCGAL2-NOTI-R为引物(SEQIDNO：2)，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(大连宝生物)进行PCR，得到的产物即为ScGAL2,并将ScGAL2基因和YEUGAP载体利用EcoRI和NotI双酶切，连接，从而获得质粒pZJ050(图1)。

具体的操作如下：

⑴ScGAL2的PCR体系：

PCR程序：

⑵将扩增产物ScGAL2与YEUGAP载体分别利用EcoRI和NotI进行双酶切，连接，从而构建质粒pZJ050。

①ScGAL2的酶切体系：

②YEUGAP载体的酶切体系：

③ScGAL2和YEUGAP载体的连接体系：

ScGAL2250ng

YEUGAP载体50ng

Ligationhigh(TOYOBO)5μl

16℃过夜

④将获得的插入了ScGAL2的YEUGAP质粒，命名为pZJ050。

3.pZJ061的构建：

以pZJ050作为模板，SCGAL2-ECORI-F(SEQIDNO：1),SGN376F-R(SEQIDNO：4)；SGN376F-F(SEQIDNO：3),SCGAL2-NOTI-R(SEQIDNO：2)作为引物，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(大连宝生物)进行PCR扩增，得到的产物即为ScGAL2-F1，ScGAL2-F2两个基因片段，将两个基因片段融合，并将融合的基因片段ScGAL2-N376F与YEUGAP载体分别利用EcoRI和NotI进行双酶切，连接，从而构建质粒pZJ061(图1)。具体的操作如下：

⑴以pZJ050作为模板，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶进行PCR扩增，得到的产物即为ScGAL2-F1，ScGAL2-F2两个基因片段，并将两个基因片段融合。

①ScGAL2-F1基因片段的PCR体系：

PCR程序：

②ScGAL2-F2基因片段的PCR体系：

PCR程序：

③基因片段的融合PCR体系：

PCR程序：

⑵融合的基因片段ScGAL2-N376F与YEUGAP载体分别利用EcoRI和NotI进行双酶切，连接，从而构建质粒pZJ061。

①ScGAL2-N376F基因片段的酶切体系：

②YEUGAP载体的酶切体系：

③ScGAL2-N376F基因片段和YEUGAP载体的连接体系：

ScGAL2-N376F基因片段250ng

YEUGAP载体50ng

Ligationhigh5μl

16℃过夜

④将获得的插入了ScGAL2-N376F基因片段的YEUGAP质粒，命名为pZJ061。

4.pZJ063的构建：

将启动子KmGAPDHp，ScGAL2-N376F基因和终止子ScGAPDHt分别以pMD18-T-KmGAPDHp载体(Zhangetal.,2014)，pZJ061载体，YEGAP载体为模板，KMGAP-XBALI-F(SEQIDNO：5)，KMGAP-R(SEQIDNO：6)；KMGAP-SCGAL2-F(SEQIDNO：7)，SCGAL2-R(SEQIDNO：8)；SCGAL2-TER-F(SEQIDNO：9)，TER-XBALI-R(SEQIDNO：10)为引物进行PCR扩增，融合，然后将融合产物KmGAPDHp-ScGAL2-N376F-ScGAPDHt基因与pPICZB质粒分别利用XbaI进行酶切，连接，从而构建质粒pZJ063(图1)。

具体的操作如下：

⑴将启动子KmGAPDHp，ScGAL2-N376F基因和终止子ScGAPDHt分别以pMD18-T-KmGAPDHp载体(Zhangetal.,2014)，pZJ061载体和YEGAP载体为模板进行PCR扩增，融合。

①KmGAPDHp的PCR体系：

PCR程序：

②ScGAL2-N376F基因片段的PCR体系：

PCR程序：

③ScGAPDHt的PCR体系：

PCR程序：

④融合PCR体系：

PCR程序：

⑵将融合产物KmGAPDHp-ScGAL2-N376Ft-ScGAPDHt基因与pPICZB质粒分别利用XbaI进行酶切，连接，从而构建质粒pZJ063。

①KmGAPDHp-ScGAL2-N376F-ScGAPDHt基因片段的酶切体系：

②pPICZB质粒的酶切体系：

③KmGAPDHp-ScGAL2-N376F-ScGAPDHt基因片段和pPICZB质粒的连接体系：

KmGAPDHp-ScGAL2-N376F-ScGAPDHt基因片段250ng

pPICZB质粒50ng

Ligationhigh5μl

16℃过夜

④将获得的插入了KmGAPDHp-ScGAL2-N376F-ScGAPDHt基因片段的pPICZB质粒，命名为pZJ063。

5.pZJ034的构建：

以马克思克鲁维酵母NBRC1777基因组为模板，以KMGPD1-F(SEQIDNO：11)，KMGPD1-R(SEQIDNO：12)为引物，PCR扩增得到基因KmGPD1，然后将基因KmGPD1插入pMD18-T载体，从而得到pMD18-T-KmGPD1载体。然后以yEUGAP为模板，以SCURA3-SMAI-F(SEQIDNO：13)，SCURA3-SMAI-R(SEQIDNO：14)为引物，进行PCR扩增得到ScURA3完整表达框。利用SmaI对ScURA3完整基因进行酶切，MscI对pMD18-T-KmGPD1进行酶切，连接，从而获得质粒pZJ034(图1)。具体操作如下：

⑴以马克思克鲁维酵母YHJ010基因组为模板，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶进行PCR扩增得到KmGPD1DNA片段。然后将KmGPD1插入pMD18-T载体，从而得到pMD18-T-KmGPD1载体。

①KmGPD1的PCR体系：

PCR程序

②得到KmGPD1的DNA片段后，在DNA末端分别加上“A”碱基后，插入pMD18-T载体(购自大连宝生物)中。

加A体系：

TA克隆连接体系：

③将获得了有KmGPD1的DNA片段的pMD18-T载体，命名为pMD18-T-KmGPD1载体。

⑵以yEUGAP为模板，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶进行PCR扩增，得到ScURA3完整表达框。利用SmaI对ScURA3完整表达框进行酶切，MscI对pMD18-T-KmGPD1进行酶切，然后将两者连接，从而获得质粒pZJ034。

①ScURA3完整表达框的PCR体系：

对应PCR程序：

②ScURA3完整表达框的酶切体系：

③KmGPD1-T载体的酶切体系：

④ScURA3完整表达框和KmGPD1-T载体的连接体系：

⑤将获得的ScURA3完整表达框-KmGPD1-T载体的质粒，命名为pZJ034。

6.pMD18-T-ScURA3敲除片段质粒的构建

敲除质粒为本实验室保有(Zhangetal.,2015)，是以yEUGAP为模板，通过PCR扩增出ScURA3的前322bp片段和第487bp之后的片段，再通过融合PCR获得ORF缺失了165bp的ScURA3敲除框，并将其插入pMD18-T载体构建而成。

7.将构建的载体转入改造后的耐热酵母：

1)酵母化学转化步骤:

①.各种改造菌株在YPD平板上划线，37℃培养24h。

②.取5ml液体YPD,并分别在YPD平板上挑取单克隆，37℃，250rpm，培养18h。

③.取1ml培养物转接与装入9ml液体YPD的50ml三角瓶内，37℃，250rpm，摇床培养5h。

④.取出培养物，常温下离心5000rpm，3min，弃上清液，保留菌体。

⑤.配制1ml转化缓冲液：800μl50％PEG4000；50μl4M醋酸锂；50μlddH₂O；100μl1MDTT(溶于10mM醋酸钠,pH5.2)。

⑥.使用200μl转化缓冲液重悬菌体，5000rpm，离心3min，去上清。

⑦.用100μl转化缓冲液重悬浮菌体，加入5μl(1-10μg)线性化的质粒,轻微震荡30sec。

⑧.在47℃条件下水浴15min。

⑨.将菌体涂布于含有亮氨酸(Leu)或尿嘧啶(Ura)的合成培养基，37℃培养2天。

⑩.挑取板上克隆在液体YPD中培养，提取基因组，并通过PCR鉴定转化结果。

2)本专利中构建各种耐热酵母表达菌株的具体过程:

以pMD18T-ScURA3敲除片段为模板，PCR扩增ScURA3敲除片段。将ScURA3敲除片段转化入YZJ015中，同源重组后，使菌株YZJ015内的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，琼脂15g/L)和5’-FOA的平板上筛选ScURA3敲除菌株，获得的菌株命名为YZJ037。

用SmaI酶切pZJ061载体。将酶切产物转化至YZJ037，使菌株获得Ura3基因，恢复Uracil的合成的能力，同时获得ScGAL2的N376F突变体基因表达框。在合成培养基(配方：葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，琼脂15g/l)上筛选阳性克隆，获得的菌株命名为YZJ103。

用PmeI酶切pZJ063载体。将酶切产物转化至YZJ103，使菌株获得博来霉素(Zeocin)抗性，同时获得ScGAL2的N376F突变体基因。在含有200mg/ml的博来霉素抗性的YPDS培养基(配方：葡萄糖20g/l，1M山梨醇，酵母提取物10g/l，细菌学蛋白胨20g/l)上筛选阳性克隆，获得的菌株分别命名为YZJ109。

以pMD18T-ScURA3敲除片段质粒为模板，PCR扩增ScURA3敲除片段。将ScURA3敲除片段转化入YZJ109中，同源重组后，使菌株YZJ109内的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，琼脂15g/L)和5’-FOA的平板上筛选ScURA3敲除菌株，获得的菌株命名为YZJ114。

以pZJ034质粒为模板，PCR扩增KmGPD1的敲除框。将KmGPD1的敲除框转化入YZJ114中，通过同源重组使菌株YZJ114内的KmGPD1被敲除，同时使菌株恢复URA3基因的功能。在合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，琼脂15g/L)上筛选阳性克隆，获得及酵母菌株命名为YZJ115。

以pMD18T-ScURA3敲除片段为模板，PCR扩增ScURA3敲除片段。将ScURA3敲除片段转化入YZJ115中，同源重组后，使菌株YZJ115内的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，琼脂15g/L)和5’-FOA的平板上筛选ScURA3敲除菌株，获得的菌株命名为YZJ116。

用SmaI酶切pZJ061载体。将酶切产物转化至YZJ116，使菌株获得Ura3基因，恢复Uracil的合成的能力，同时获得ScGAL2的N376F突变体基因。在合成培养基(配方：葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，琼脂15g/l)上筛选阳性克隆，获得的菌株分别命名为YZJ118。

用PmeI酶切pZJ063载体。将酶切产物转化至YZJ118，使菌株获得博来霉素抗性，同时获得ScGAL2的N376F突变体基因，在含有400mg/ml的博来霉素抗性的YPDS培养基(配方：葡萄糖20g/l，1M山梨醇，酵母提取物10g/l，细菌学蛋白胨20g/l)上筛选阳性克隆，获得的菌株分别命名为YZJ119。

3)提取基因组，通过PCR鉴定酵母转化的阳性菌株。

鉴定YZJ115酵母KmGPD1基因敲除的阳性菌株的PCR体系：

对应PCR程序：

通过PCR检测结果鉴定，只有一条约2800bp条带的为阳性菌株。只有一条约1300bp条带的为没有转入片段的菌株，而1300bp和2800bp两条带都有的为非同源重组的菌株，这两种情况均为阴性菌株。

实施例2构建的各种过程菌株发酵情况

构建各种过程菌株的发酵结果比较

该实施例用于比较构建的各种过程菌株利用木糖和葡萄糖共发酵生产木糖醇和乙醇的效果。结果表明随着ScGAL2-N376F基因过表达构建的菌株共发酵的能力逐步提高，最终的菌株几乎可以将木糖全部转化成木糖醇，葡萄糖全部转化成乙醇。另外，KmGPD1的敲除使副产物甘油几乎全部消失。

1.在YPD培养基平板上复苏菌株。对照株：YZJ015。实验株：YZJ103，YZJ109，YZJ115，YZJ118，YZJ119。37℃培养1天。

2.分别挑取单克隆，接于5ml液体YPD培养基。37℃，250rpm，过夜。

3.配制18瓶30ml木糖葡萄糖培养基分装于50ml发酵瓶中。配方：40g/l木糖，80g/l木糖，10g/l酵母提取物，20g/L细菌学蛋白胨，10g/l甘油。灭菌待用。

4.取适量过夜培养物接入30ml木糖葡萄糖培养基中，使他们的初始OD₆₀₀达到1.0,42℃,250rpm培养。

6.在0h，4h，8h，12h，16h，20h，24h，28h取样，并取上清通过HPLC检测分析(图2)。

7.从图2可知，在葡萄糖和木糖培养基的培养条件下，结果表明随着ScGAL2-N376F基因过表达构建的菌株共发酵的能力逐步提高，最终的菌株YZJ119几乎可以将木糖全部转化成木糖醇，葡萄糖全部转化成乙醇，可以共利用葡萄糖和木糖发酵生产木糖醇和乙醇。另外，KmGPD1的敲除使副产物甘油几乎全部消失。最终，本专利中的YZJ119菌株，在42℃条件下，YZJ119能在28h利用43.95g/l木糖生产40.43g/l木糖醇，生产速率为1.44g/l/h，生产率为0.92g/g。同时利用83.11g/l葡萄糖生产34.66g/l乙醇，生产速率为1.24g/l/h，生产率为0.42g/g(这里得葡萄糖和木糖浓度为实测浓度)。这个结果是已报道的高温下能够共利用木糖和葡萄糖的最佳结果。

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Claims

1.一种能同时利用葡萄糖和木糖共发酵生产木糖醇和乙醇的耐热工程酵母菌株，所述酵母菌株以在K.marxianus基础上转入了一个以上拷贝的脉孢霉木糖还原酶基因NcXR(Neurosporacrassaxylosereductase)的耐热酵母作为宿主，并将一个以上拷贝的酿酒酵母的半乳糖通透酶的N376F突变体基因在所述宿主中重组表达，和任选地敲除基因KmGPD1而获得。

2.根据权利要求1所述的酵母菌株，所述NcXR的拷贝数为四个。

3.根据权利要求1所述的酵母菌株，所述宿主为保藏号为CGMCCNo.7819的YZJ015菌株。

4.根据权利要求1所述的酵母菌株，所述半乳糖通透酶的N376F突变体基因的拷贝数为一个、两个、三个或四个。

5.根据权利要求1所述的酵母菌株，所述半乳糖通透酶的N376F突变体基因的序列为SEQIDNO：15。

6.根据权利要求1所述的酵母菌株，所述菌株为马克思克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)YZJ119，已经于2015年7月2日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会的普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo：11035。

3)敲除基因KmGPD1。

8.根据权利要求7所述的方法，所述NcXR的拷贝数为四个。

9.根据权利要求7所述的方法，步骤1）中所述耐热酵母为保藏号是CGMCCNo.7819的YZJ015菌株。

10.权利要求1-6任一项所述的酵母菌株用于将葡萄糖和木糖共发酵生产木糖醇和乙醇的方法。