CN104164375B - 乙醇高温高产工程菌株的构建及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及乙醇高温高产工程菌株的构建及应用，具体是通过基因工程的方法将粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)来源的木糖还原酶基因，树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipitis)的木糖醇脱氢酶突变基因，以及下游的一系列基因在耐热酵母马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)中高效表达或敲除，使该菌株通过木糖代谢路径在较高温度(>42℃)下，能够高效地利用和发酵木糖，大量快速生产乙醇。所述酵母菌株可以在42℃的条件下，快速高效利用高浓度木糖发酵生产乙醇,产量和发酵速率都超过已报道的耐热菌株。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域。尤其涉及通过工程菌株改造来提高高温下利用木糖发酵生产乙醇的技术领域。具体地，本发明构建了能够在高温条件下利用木糖发酵生产乙醇且乙醇生产速率和产量大幅度提高的耐热工程酵母菌株。
背景技术
木糖是半纤维素生物质水解的主要产物，是世界上第二富集的发酵原料(Zhangetal.,2011)。作为木质半纤维素水解产物中含量最多的五碳糖，木糖无疑是从可再生生物质中生产高附加值产品的关键(Sasakietal.,2010)。
乙醇是醇类的一种，是酒的主要成份，所以也俗称酒精。乙醇的用途很广，可以用作溶剂，作为有机合成的原料，用于各种化合物的结晶，还可以作为洗涤剂和萃取剂，食用酒精可以勾兑白酒。乙醇在化工行业也有很重要的用途。生物乙醇最重要的用途是在能源领域。乙醇可以调入汽油，作为车用燃料，乙醇汽油也被称为(E型汽油)，它可以改善油品的性能和质量，降低一氧化碳、碳氢化合物等主要污染物排放。
采用耐热酵母马克思克鲁维酵母(K.marxianus)在高温下发酵有以下几个优点：1.高温下发酵可以降低发酵中的冷却费用；2.纤维素酶等的最适催化温度较高，高温会提高以淀粉、纤维素等生物质为原料的同步糖化发酵(SSF)效率，促进糖化，减少在酶上的费用(Fonsecaetal.,2008；Zhangetal.,2013)；3.能在耐热范围内生存的微生物较少，因此，高温会降低污染的风险(Kumaretal.,2009；Zhangetal.,2013)。除此之外，马克思克鲁维酵母是一种GRAS(generalregardingassafe)酵母，广泛的在乳制品、葡萄酒发酵制造中存在，对环境、动物及人类是安全的微生物。它能够在较高的温度下生长，最高达52℃，具有很高的生长速率(0.86–0.99h-1,40℃)(BanatandMarchant,1995)。马克思克鲁维酵母有很高的代谢多样性，能利用多种工业上的底物糖类生长发酵。能利用多种廉价底物、耐热、高生长率等特点，使其被认为是替代酿酒酵母用来进行工业发酵和外源蛋白表达的候选者。由于马克思克鲁维酵母有很多比酿酒酵母优秀的品质，马克思克鲁维酵母被越来越多的用于生物能源的生产(Fonsecaetal.,2008)。所以利用马克思克鲁维酵母发展成乙醇生产菌株具有非常重要的应用价值。
已经有一些关于利用耐热酵母发酵木糖生产乙醇的研究，其中，Rodrussamee等利用马克思克鲁维酵母可以在40℃利用木糖生产2.2g/的乙醇(Rodrussameeetal.,2011)。Zhang等利用树干毕赤酵母的木糖还原酶突变体替换马克思克鲁维酵母的木糖还原酶，可以利用40g/L的木糖在42℃生产4.51g/L的乙醇(Zhangetal.,2013)。Wang等构建木糖异构酶途径代替马克思克鲁维酵母本身的XYL1-XYL2系统，可以利用50g/L的木糖在42℃生产11.52g/L的乙醇(Wangetal.,2013)。Kumar等利用Kluyveromycessp.IIPE453发酵木糖在50℃产生1.75g/L乙醇(Kumaretal.,2009)。Goshima等利用基因工程改造的马克思克鲁维酵母DMB3-7可以在42℃发酵木糖产生4.9g/L乙醇，在45℃产生3.3g/L乙醇(Goshimaetal.,2013)。而Dmytruk等利用木糖异构酶途径改造的另一种酵母Hansenulapolymorpha可以在48℃发酵木糖产生1.31g/L乙醇(Dmytruketal.,2008)。Ismail等构建了一株比较耐热的利用基因工程菌Saccharomycescerevisiaesun049T可以在38℃发酵木糖产生15.2g/L乙醇(Ismailetal.,2013)。以上的这些研究还没有充分发挥耐热酵母在高温下发酵木糖生产乙醇的潜力，他们利用木糖发酵的速率、产量以及利用木糖的能力都还远远不够(表1)。我们的此发明申请中的NcXYL1-PsXYL2的ARS突变基因组合结合增加的木酮糖激酶基因(KmXYL3)的表达大幅度提高了耐热酵母在高温下发酵木糖生产乙醇，结合产生木酮糖之后的下游代谢工程改造进一步提高了木糖发酵的能力，产量和发酵速率都远超已有的菌株，证明本发明构建的方法和构建的菌株在生物质转化乙醇工业上有很巨大的应用前景。
发明内容
本发明通过在耐热酵母中高效表达粗糙脉孢霉的木糖还原酶基因，树干毕赤酵母的木糖醇脱氢酶突变基因，以及下游的KmXYL3，KmADH2，KmPDC1，KmTAL1，KmTKL1，KmRPE1，KmRKI1，KmGLN1基因的过表达和KmGPD1基因的敲除，构建了在较高温度(>42℃)下能够利用和发酵木糖的高效生产乙醇的耐热酵母马克思克鲁维酵母菌株；本发明对马克思克鲁维酵母中的木糖还原酶基因(XYL1)和木糖醇脱氢酶基因(XYL2)进行双敲除，构建工程菌株，再将粗糙脉孢霉的木糖还原酶基因，树干毕赤酵母的木糖醇脱氢酶突变基因，以及下游的一系列基因在上述基因敲除的耐热酵母中表达或敲除，构建了对利用木糖生产乙醇的能力大幅度改良，能够在较高温度下利用木糖大量生产乙醇的耐热工程酵母菌株。构建过程见图1。
具体的，本发明涉及以下各项：
1.一种乙醇高温高产工程菌株，其特征在于所述工程菌株通过在双敲除木糖还原酶基因KmXYL1和木糖醇脱氢酶基因KmXYL2的马克思克鲁维酵母(K.marxianus)中重组入粗糙脉孢霉(Neurosporacrassa)的木糖还原酶基因NcXYL1和树干毕赤酵母(Scheffersomycesstipitis)的木糖醇脱氢酶突变基因PsXYL2-ARS，以及马克思克鲁维酵母的木酮糖激酶基因KmXYL3而获得，其中所述树干毕赤酵母木糖醇脱氢酶突变基因PsXYL2-ARS为在野生型树干毕赤酵母木糖醇脱氢酶基因的基础上具有D207A/I208R/F209S突变。
2.根据1所述的乙醇高温高产工程菌株，其特征在于所述菌株含有两个拷贝的所述树干毕赤酵母木糖醇脱氢酶突变基因PsXYL2-ARS。
3.根据2所述的乙醇高温高产工程菌株，其特征在于在所述菌株中进一步转入马克思克鲁维酵母的乙醇脱氢酶基因KmADH2和马克思克鲁维酵母的丙酮酸脱羧酶基因KmPDC1。
4.根据3所述的乙醇高温高产工程菌株，其特征在于在所述菌株中进一步转入马克思克鲁维酵母的转醛酶基因KmTAL1和马克思克鲁维酵母的转酮酶基因KmTKL1。
5.根据4所述的乙醇高温高产工程菌株，其特征在于在所述菌株中进一步转入马克思克鲁维酵母的L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶基因KmRPE1。
6.根据5所述的乙醇高温高产工程菌株，其特征在于在所述菌株中进一步转入包括马克思克鲁维酵母的核糖-5-磷酸酮醇异构酶基因KmRKI1。
7.根据6所述的乙醇高温高产工程菌株，其特征在于在所述菌株中敲除马克思克鲁维酵母的甘油-3磷酸脱氢酶基因KmGPD1。
8.根据7所述的乙醇高温高产工程菌株，其特征在于在所述菌株中进一步转入马克思克鲁维酵母的谷氨酰胺合成酶基因KmGLN1。
9.一种乙醇高温高产工程菌株YZJ088，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.9387。
10.1-9任一项所述的乙醇高温高产工程菌株用于发酵木糖生产乙醇的用途。
本发明获得的最优选的木糖发酵产生木糖醇的应用菌株为马克斯克鲁维酵母KluyveromycesmarxianusYZJ088。此菌株可直接利用木糖发酵生产乙醇，此菌株可以在高温条件下利用高木糖浓度高产乙醇。该菌株已于2014年06月26日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，保藏号为CGMCCNo.9387(YZJ088菌株)。
本发明中采用一种新的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶组合结合木酮糖激酶基因(KmXYL3)的过表达使得K.marxianus工程菌在42℃利用木糖发酵的能力大幅度提高；进一步对下游基因进行工程改造后所得到的菌株YZJ088在高温条件下，可以很好的利用木糖生产乙醇，有着比野生型耐热菌株更强的利用木糖生产乙醇的能力。而酿酒酵母等在这个温度下，已经不能正常生长和发酵。
本发明中将粗糙脉孢霉的XYL1和树干毕赤酵母的XYL2的ARS突变体进行组合结合木酮糖激酶基因(KmXYL3)的过表达，这种组合使得构建的工程菌在42℃利用100g/l木糖，乙醇产量达25.48g/L，生产速率为1.42g/L/h。本发明的YZJ088菌株，在42℃条件下，能在18h利用100g/L木糖生产35.94g/L乙醇，生产速率高达2.00g/L/h，产率为0.38g/g。与目前现有的耐热酵母利用木糖生产乙醇的最好水平相比，本发明的YZJ088菌株不仅在较高温度(＞42℃)条件下有利用木糖生产乙醇的能力，而且比现有的耐热酵母生产乙醇的产量(11.52g/L，(Wangetal.,2013))高，速率(0.11g/L/h，(Zhangetal.,2013))快(表1)。
表1:已发表的不同菌株和本专利中的菌株在利用木糖和生产乙醇效率的比较
发明详述
以下对本发明的技术方案做进一步详细阐述。应当指出，本发明的各实施方案可以根据需要以任何方式组合。
本发明的第一个方面提供一种能高效利用木糖发酵的耐热工程酵母菌株。在一个实施方案中，所述菌株通过下述方法得到：以敲除了木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因的耐热酵母K.marxianus菌株作为宿主，并将NcXYL1，PsXYL2-ARS，KmXYL3在所述宿主中重组表达。
在一个优选的实施方案中，所述菌株含有粗糙脉孢霉的木糖醇还原酶基因NcXYL1。
在一个优选的实施方案中，所述突变基因PsXYL2-ARS为在野生型木糖醇脱氢酶基因的基础上具有D207A/I208R/F209S突变。
在一个优选的实施方案中，所述菌株含有两个拷贝的毕赤酵母的木糖醇脱氢酶突变基因PsXYL2-ARS。
在一个优选的实施方案中，所述菌株进一步包括KmADH2和KmPDC1基因。
在一个优选的实施方案中，所述菌株进一步包括KmTAL1和KmTKL1基因。
在一个优选的实施方案中，所述菌株进一步包括KmRPE1基因。
在一个优选的实施方案中，所述菌株进一步包括KmRKI基因。
在一个优选的实施方案中，所述菌株中敲除KmGPD1基因。
在一个优选的实施方案中，所述菌株进一步包括KmGLN1基因。
在一个最优选的实施方案中，所述菌株为乙醇高温高产工程菌株YZJ088，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.9387，其可以利用木糖在42℃温度下发酵产生乙醇。
本发明的第二个方面提供本发明第一个方面中任一实施方案中所述的乙醇高温高产工程菌株用于发酵木糖生产乙醇的用途。
在更优选的实施方案中，本发明第一个方面任一实施方案所述的乙醇高温高产菌株，其中木糖还原酶和各种木糖醇脱氢酶的重组表达的出发载体为yEUGAP或yELGAP(日本鹿儿岛大学的玉置尚德教授惠赠，目前保存在本发明人所在的实验室(Zhangetal.,2014)。本发明中的各种质粒的构建方法如下(表2)：
表2:本申请中构建的质粒
(1)yEUGAP的构建：将包含ScGAPDH启动子和终止子的PScGAPDH-TScGAPDH片段用引物GAPDH-HIND-F(SEQIDNo.39)和TER-HIND-R(SEQIDNo.40)以yEGAP(Hongetal.,2007)为模板PCR扩增出来，用HindIII酶切，连接到YEplac195质粒(美国ATCC87589)的HindIII位点。
(2)yELGAP的构建：将PScGAPDH-TScGAPDH用引物GAPDH-HIND-F(SEQIDNo.39)和TER-HIND-R(SEQIDNo.40)以yEGAP(Hongetal.,2007)为模板PCR扩增出来，用HindIII酶切，连接到YEplac181(美国ATCC87588)质粒的HindIII位点。
⑶以质粒yEUGAP,pMD18T-PKmGAPDH(Zhangetal.,2014),pET-21c-KmXYL3载体(Wangetal.,2011)为模板，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(大连宝生物)和TER-NOTI-F(SEQIDNo.4)，TER-R(SEQIDNo.5)；TER-KMP-F(SEQIDNo.6),KMGAP-R(SEQIDNo.2)；KMP-KMXK-F(SEQIDNo.7),KMXK-NOTI-R(SEQIDNo.8)引物进行PCR扩增，得到的产物分别为TScGAPDH(GenBank:BK006941.2(从碱基882705到碱基882843))，PKmGAPDH(GenBank:DQ681075.1(从碱基7到碱基1061))和KmXYL3(GenBank:GU586191.1)基因。将扩增产物融合，融合产物为TScGAPDH-PKmGAPDH-KmXYL3。将融合基因TScGAPDH-PKmGAPDH-KmXYL3和载体pZJ002(Zhangetal.,2014)都进行NotI单酶切，然后连接，从而获得包含NcXYL1(GenBank:AY876382.1)和KmXYL3的质粒，命名pZJ004(即PKmGAPDH控制的NcXYL1和KmXYL3表达质粒)(图2A)，此质粒带有URA3基因，在尿嘧啶营养缺陷型中作为选择标记筛选。
⑷以树干毕赤酵母(NBRC10063)(购买于日本独立行政法人制品评価技术基盘机构国立生物资源中心(NBRC))基因组,yEUGAP,pMD18T-PKmGAPDH,pET-21c-Kmxyl3载体(Wangetal.,2011)为模板，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(大连宝生物)和引物PSXDH-SMAI-F(SEQIDNo.9)，PSXDH-PSTI-R(SEQIDNo.10),TER-NOTI-F(SEQIDNo.4)，TER-R(SEQIDNo.5)；TER-KMP-F(SEQIDNo.6),KMGAP-R(SEQIDNo.序列2)；KMP-KMXK-F(SEQIDNo.7),KMXK-NOTI-R(SEQIDNo.8)进行PCR扩增，得到的产物即为PsXYL2(GenBank:HM769332.1),TScGAPDH(GenBank:BK006941.2(从碱基882705到碱基882843))，PKmGAPDH(GenBank:DQ681075.1(从碱基7到碱基1061))和KmXYL3(GenBank:GU586191.1)基因。
将PKmGAPDH，PsXYL2,TScGAPDH利用引物KMGAP-F(SEQIDNo.1),TER-HINDIII-R(SEQIDNo.3)进行融合，融合产物PKmGAPDH-PsXYL2-TScGAPDH与yELGAP载体分别利用HindIII进行单酶切，载体去磷酸化，连接，从而获得包含PKmGAPDH控制的PsXYL2的质粒，命名PsXYL2-yELGAP。
再将扩增产物TScGAPDH，PKmGAPDH，KmXYL3利用引物TER-NOTI-F(SEQIDNo.4),KMXK-NOTI-R(SEQIDNo.8)进行融合，融合产物为TScGAPDH-PKmGAPDH-KmXYL3。将基因TScGAPDH-PKmGAPDH-KmXYL3和载体PsXYL2-yELGAP利用NotI进行单酶切，连接，从而获得包含PsXYL2和KmXYL3基因的质粒，命名pZJ006(即PKmGAPDH控制的PsXYL2和KmXYL3表达质粒)(图2D)。
⑸以pZJ006为模板，PSXDH-ARS-F(SEQIDNo.11)，PSXDH-ARS-R(SEQIDNo.12)为引物，进行PCR扩增，得到的片段即为含有PsXYL2-ARS(D207A/I208R/F209S)突变体基因的线性的载体。将得到的PCR扩增产物用DpnI酶切去除模板转入XL10-Gold，测序验证得到包含PsXYL2-ARS(D207A/I208R/F209S)突变体的质粒，分别命名为pZJ014(图2B)。此质粒带有URA3基因，在尿嘧啶营养缺陷型中作为选择标记筛选
⑹以马克思克鲁维酵母YHJ010基因组(Hongetal.,2007)为模板，分别以KMTAL1-ECORI-F(SEQIDNo.13),KMTAL1-NOTI-R(SEQIDNo.14)；KMRPE1-ECORI-F(SEQIDNo.15),KMRPE1-NOTI-R(SEQIDNo.16)；KMADH2-ECORI-F(SEQIDNo.17),KMADH2-NOTI-R(SEQIDNo.18)；KMRKI1-ECORI-F(SEQIDNo.19),KMRKI1-NOTI-R(SEQIDNo.20)为引物对KmTAL1，KmRPE1，KmADH2，KmRKI1基因进行PCR扩增。分别得到基因KmTAL1(GenBank:AP012215.1(从1367559到1368563))，KmRPE1(GenBank:AP012218.1(从64301到65011))，KmADH2(GenBank:AF225206.1(从2091到3137))，KmRKI1(GenBank:AP012220.1(从506118到506936))。扩增产物与yEUGAP载体分别利用EcoRI和NotI进行双酶切，连接，将KmTAL1，KmRPE1，KmADH2，KmRKI1编码序列分别插入到yEUGAP载体中，获得质粒pZJ021，pZJ022(图2C)，pZJ025，pZJ027(图2E)。这些质粒带有URA3基因，在尿嘧啶营养缺陷型中作为选择标记筛选
⑺以马克思克鲁维酵母YHJ010(发明人构建的尿嘧啶、色氨酸和亮氨酸缺陷型菌株，见(Hongetal.,2007))基因组为模板，分别以KMGAP-KMTKL1-F(SEQIDNo.21),KMTKL1-NOTI-R(SEQIDNo.22)；KMGAP-KMPDC1-F(SEQIDNo.23),KMPDC1-NOTI-R(SEQIDNo.24)为引物对KmTKL1，KmPDC1基因进行PCR扩增，分别得到基因KmTKL1(GenBank:AP012220.1(从667466到669505))，KmPDC1(GenBank:L09727.1)。将扩增产物KmTKL1，KmPDC1基因分别与TScGAPDH，PKmGAPDH基因进行融合。融合产物与pZJ021，pZJ025载体分别利用NotI进行酶切，连接，将KmTKL1，KmPDC1编码序列分别插入到pZJ021，pZJ025载体中，获得质粒pZJ026(图2D)，pZJ028(图2F)。此质粒带有URA3基因，在尿嘧啶营养缺陷型中作为选择标记筛选
⑻以马克思克鲁维酵母YHJ010基因组为模板，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(大连宝生物)和引物KMGPD1-F(SEQIDNo.25)，KMGPD1-R(SEQIDNo.26)进行PCR扩增，得到基因KmGPD1(GenBank:AP012213.1(从378475到379641))。然后将基因KmGPD1插入pMD18-T载体，从而得到pMD18-T-KmGPD1载体。然后以yEUGAP为模板，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(大连宝生物)和引物SCURA3-SMAI-FULL-F(SEQIDNo.27)，SCURA3-SMAI-FULL-R(SEQIDNo.28)进行PCR扩增，得到ScURA3完整表达框(GenBank:AM697670.1(从2062到3158))。利用SmaI对ScURA3完整基因进行酶切，MscI对pMD18-T-KmGPD1进行酶切，连接，从而获得质粒pZJ034(图2G)。此质粒带有URA3基因，在尿嘧啶营养缺陷型中作为选择标记筛选
⑼以pZJ014为模板，KMGAP-PSXDH-F(SEQIDNo.29)，PSXDH-NOT-R(SEQIDNo.30)为引物，进行PCR扩增，得到的产物即为PsXYL2-ARS基因。利用EcoRI，NotI对PsXYL2-ARS基因和yEUGAP载体进行酶切，连接，从而获得质粒pZJ035(图2)。此质粒带有URA3基因，在尿嘧啶营养缺陷型中作为选择标记筛选
⑽分别以TScGAPDH，PKmGAPDH，PsXYL2-ARS基因为模板，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(大连宝生物)和引物TER-NOTI-F(SEQIDNo.4)，PSXDH-NOTI-R(SEQIDNo.30)进行融合PCR扩增，融合产物分别为TScGAPDH-PKmGAPDH-PsXYL2-ARS。将基因TScGAPDH-PKmGAPDH-PsXYL2-ARS和载体pZJ035利用NotI进行单酶切，连接，从而获得质粒pZJ036(图2H)。此质粒带有URA3基因，在尿嘧啶营养缺陷型中作为选择标记筛选
⑾以马克思克鲁维酵母YHJ010基因组DNA为模板，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(大连宝生物)和引物KMPGK-SPHI-F(SEQIDNo.31)，KMPGK-ECORI-R(SEQIDNo.32)进行PCR扩增，得到PKmPGK启动子(GenBank:AP012213.1(从1135852到1136884))。将扩增产物PKmPGK启动子片段和yEUGAP载体利用SphI,EcoRI进行双酶切，连接，从而获得质粒，命名为pZJ042。
⑿以马克思克鲁维酵母YHJ010基因组为模板，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(大连宝生物)和引物KMGLN1-NOTI-F(SEQIDNo.33)，KMGLN1-NOTI-R(SEQIDNo.34)进行PCR扩增，得到扩增产物KmGLN1(GenBank:AP012219.1(从246884到247993))。将扩增产物KmGLN1，和pZJ042载体利用NotI进行单酶切，连接，从而获得质粒，命名为pZJ043(图2I)。
⒀以yEUGAP为模板，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(大连宝生物)和引物SCURA3-F1(SEQIDNo.35)，SCURA3-R1-322(SEQIDNo.36)；SCURA3-F2-487(SEQIDNo.37)，SCURA3-R2(SEQIDNo.38)进行PCR扩增，得到ScURA3的前322bp片段和第487bp之后的片段。然后以ScURA3的前322bp片段和第487bp之后的片段为模板，SCURA3-F1和SCURA3-R2为引物，进行融合PCR，得到中间缺失165bp的ScURA3基因DNA，即ScURA3敲除片段基因。然后将此ScURA3敲除片段基因插入pMD18-T载体，从得到pMD18-T-ScURA3敲除片段载体。此载体包含一个破坏的来自酿酒酵母的URA3基因，可用于敲除酵母中地ScURA3，回复该酵母的尿嘧啶营养缺陷型。
在另一个优选的实施方案中，所述的耐热工程酵母菌株，其宿主为将马克思克鲁维酵母YHJ010(发明人构建的尿嘧啶、色氨酸和亮氨酸缺陷型菌株，构建方法见(Hongetal.,2007))中的XYL1基因(木糖还原酶基因，木糖代谢路径中的一个关键酶，敲除后菌株将丧失木糖还原的能力)和XYL2基因(木糖醇脱氢酶基因，木糖代谢路径中的另一个关键酶，双敲除后菌株将丧失木糖醇利用的能力)敲除后得到的菌株，所述宿主被命名为YRL002(本实验室保存，构建过程见Wangetal.,2013)。
本发明的第三个方面提供本发明第一个方面任一项所述的乙醇高温高产工程菌株的方法，参见表3：
表3:本专利中构建的菌株
在一个实施方案中，将含有耐热酵母来源的启动子(PKmGAPDH)控制的粗糙脉孢霉FGSC2489(购买于美国真菌遗传学库存中心(FGSC)的木糖还原酶基因(NcXYL1)和马克思克鲁维酵母的木酮糖激酶基因(KmXYL3)的pZJ004重组载体，转化进马克思克鲁维酵母的XYL1和XYL2双敲除株(YRL002)中。所得到的转化菌株被命名为：YZJ004。
在一个进一步的实施方案中，将含有耐热酵母来源的启动子(PKmGAPDH)控制的树干毕赤酵母的木糖醇脱氢酶基因的突变体(PsXYL2-ARS)和马克思克鲁维酵母的木酮糖激酶基因(KmXYL3)的pZJ014重组载体转化进YZJ004中，命名为：YZJ020。
在一个进一步的实施方案中，将ScURA3敲除片段转化入含有树干毕赤酵母的木糖醇脱氢酶基因的突变体(PsXYL2-ARS)的YZJ020中，从而敲除YZJ020菌株内的ScURA3，命名为YZJ036。再将含有两个拷贝的PsXYL2-ARS突变基因的pZJ036转入YZJ036，命名为YZJ051。
在一个进一步的实施方案中，将由pZJ036质粒带入的ScURA3从YZJ051再次敲除后获得菌株YZJ057。再将含有KmADH2和KmPDC1基因的pZJ028转入YZJ057，命名为YZJ061。
在一个进一步的实施方案中，将由pZJ028质粒带入的ScURA3再次从YZJ061敲除获得菌株YZJ066。再将含有KmTAL1和KmTKL1基因的pZJ026转入YZJ066，命名为YZJ069。
在一个进一步的实施方案中，将由pZJ026质粒带入的ScURA3再次从YZJ069敲除获得菌株YZJ070。再将含有KmRPE11基因的pZJ022转入YZJ070，命名为YZJ071。
在一个进一步的实施方案中，将由pZJ022质粒带入的ScURA3再次从YZJ071敲除获得菌株YZJ076。再将含有KmRKI1基因的pZJ027转入YZJ076，命名为YZJ077。
在一个进一步的实施方案中，将由pZJ027质粒带入的ScURA3再次从YZJ077敲除获得菌株YZJ085。再将pZJ034中的KmGPD1-T-ScURA3基因片段转入YZJ085，从而敲除YZJ085菌株内的KmGPD1，命名为YZJ086。
在一个进一步的实施方案中，将由pZJ034质粒带入的ScURA3再次从YZJ086敲除获得菌株YZJ087。再将含有KmGLN1的pZJ043转入YZJ087，命名为YZJ088。
附图说明
图1.本发明中菌株的构建过程；
图2.本发明中构建的质粒图；
A.质粒pZJ004；B.质粒pZJ014；C.质粒pZJ022；
D.质粒pZJ026；E.质粒pZJ027；F.质粒pZJ028；
G.质粒pZJ034；H.质粒pZJ036；I.质粒pZJ043；
图3.本发明中构建的菌株利用100g/L木糖在42℃条件下发酵生产乙醇的结果。(■,YZJ020；●,YZJ051；▲,YZJ061；▼,YZJ069；,YZJ071；,YZJ077；◆,YZJ086；,YZJ088.)
A.菌株在含有100g/L木糖的发酵培养基中的木糖利用曲线；
B.菌株在含有100g/L木糖的发酵培养基中的乙醇生产曲线。
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。
试剂和菌株：
本发明中的所有试剂均是市场购买的试剂级以上的试剂。其中，木糖，葡萄糖，甘油，酵母基本氮源，酪氨酸，亮氨酸，尿嘧啶，胶回收试剂盒以及所有的限制性内切酶均来源于上海生工生物工程公司。PrimeSTARHSDNA聚合酶，SolutionI连接酶以及pMD18-T载体购自于大连宝生物公司。大肠杆菌EscherichiacoliXL10-gold菌株作为DNA操作时使用的宿主菌(美国加利福利亚Stratagene公司)，包含100μg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基用作培养E.coli。木糖合成培养基(YNB木糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，亮氨酸30mg/ml，尿嘧啶20mg/ml，酪氨酸20mg/ml)主要用于转化。质粒yELGAP,yEUGAP(Zhangetal.,2014)由日本鹿儿岛大学的玉置尚德教授惠赠，目前保存在本发明人所在的实验室。YPD培养基(10g/L酵母提取物,20g/L蛋白胨,20g/L葡萄糖)用于酵母的前培养。YPX(10g/L酵母提取物，20g/L细菌学蛋白胨，20g/L(或更高)木糖)用于发酵培养基。
实施例1.菌株的制备：
1.构建本发明中的各种质粒载体的构建：
1).pZJ004质粒的获得：
分别从质粒yEUGAP,pMD18T-PKmGAPDH载体,pET-21c-KmXYL3载体(Wangetal.,2011)中扩增出基因TScGAPDH(GenBank:BK006941.2(从882705至882843))，PKmGAPDH(GenBank:DQ681075.1(从7至1061))和KmXYL3(GenBank:GU586191.1)。将扩增产物融合，融合产物为TScGAPDH-PKmGAPDH-KmXYL3。再将融合基因TScGAPDH-PKmGAPDH-KmXYL3插入到pZJ002载体(Zhangetal.,2014)的NotI位点，构建包含NcXYL1(GenBank:AY876382.1)和KmXYL3的质粒pZJ004(即PKmGAPDH控制的NcXYL1和KmXYL3表达质粒)(图2A)。
具体操作步骤为：
⑴以质粒yEUGAP,pMD18T-PKmGAPDH载体(本实验室构建和保存，Zhangetal.,2014),pET-21c-KmXYL3载体(本实验室构建和保存，Wangetal.,2011)为模板，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(大连宝生物)和TER-NOTI-F(SEQIDNo.4)，TER-R(SEQIDNo.5)；TER-KMP-F(SEQIDNo.6),KMGAP-R(SEQIDNo.2)；KMP-KMXK-F(SEQIDNo.7),KMXK-NOTI-R(SEQIDNo.8)引物进行PCR扩增，得到的产物分别为TScGAPDH，PKmGAPDH和KmXYL3。
①TScGAPDH基因的PCR体系：
PCR程序
②PKmGAPDH基因的PCR体系：
PCR程序
③KmXYL3基因的PCR体系：
PCR程序
⑵将扩增产物TScGAPDH，PKmGAPDH，KmXYL3进行融合，融合产物为TScGAPDH-PKmGAPDH-KmXYL3。
TScGAPDH-PKmGAPDH-KmXYL3基因融合PCR体系:
PCR程序
⑶将融合基因TScGAPDH-PKmGAPDH-KmXYL3插入到质粒pZJ002(本实验室构建和保存，见Zhangetal.,2014)获得质粒pZJ004(即PKmGAPDH控制的NcXYL1和KmXYL3表达质粒)。
①TScGAPDH-PKmGAPDH-KmXYL3基因的酶切体系：
②pZJ002载体的酶切体系：
③TScGAPDH-PKmGAPDH-KmXYL3基因和pZJ002载体的连接体系：
④将获得的插入了KmXYL3编码序列的pZJ002质粒，命名为pZJ004。
2).pZJ006的构建：
分别从树干毕赤酵母(NBRC10063)基因组,yEUGAP,pMD18T-PKmGAPDH,pET-21c-Kmxyl3载体(Wangetal.,2011)中，扩增出PsXYL2(GenBank:HM769332.1),TScGAPDH(GenBank:BK006941.2(从碱基882705到碱基882843))，PKmGAPDH(GenBank:DQ681075.1(从碱基7到碱基1061))和KmXYL3(GenBank:GU586191.1)基因。
将PKmGAPDH，PsXYL2,TScGAPDH融合，融合产物PKmGAPDH-PsXYL2-TScGAPDH与yELGAP载体分别利用HindIII进行单酶切，载体去磷酸化，连接，从而获得包含PKmGAPDH控制的PsXYL2的质粒，命名PsXYL2-yELGAP。
再将扩增产物TScGAPDH，PKmGAPDH，KmXYL3融合，融合产物为TScGAPDH-PKmGAPDH-KmXYL3。将基因TScGAPDH-PKmGAPDH-KmXYL3和载体PsXYL2-yELGAP利用NotI进行单酶切，连接，从而获得包含PsXYL2和KmXYL3基因的质粒，命名pZJ006(即PKmGAPDH控制的PsXYL2和KmXYL3表达质粒)(图2D)。
具体操作如下：
⑴首先，提取树干毕赤酵母的基因组，其提取步骤为：
①.挑取单克隆，接入5ml液体YPD中，37℃，250rpm，培养24h。
②.常温下12000rpm，5sec离心收菌，弃上清。
③.500μl蒸馏水重悬菌体，12000rpm，5sec离心收菌，弃上清。
④.取200μl实验室自配的1xbreaking缓冲液(TritonX-100(2％(w/v))，SDS(1％(w/v)),NaCl(100mM),Tris-Cl(10mM,pH8.0),EDTA(1mM))重悬菌体，并将菌液转入到含有0.3g玻璃珠(425-600um，sigma，美国)的EP管内。
⑤.加入200μl酚氯仿溶液后，高速震荡3min，加入200μl1xTE(10mMTris-Cl,pH8.0,1mMEDTA)。轻微震荡。
⑥.12000rpm，离心5min，取最上层清液转入新的EP管内，加入1ml预冷的无水乙醇。
⑦.12000rpm,4℃，离心10min，弃上清，室温下干燥沉淀，并用400μl1xTE重悬沉淀。
⑧.加入2μlRNase(RNA水解酶,中国上海生工生物)，2mg/ml)到EP管内，混匀，37℃，酶切1h。
⑨.取40μl3M醋酸钠(pH5.2)加入到管内，混匀并加入1ml预冷的无水乙醇。
⑩.12000rpm，4℃，离心30min，弃上清室温下干燥。用100μl无菌水重悬沉淀，此即酵母基因组DNA。
⑵以树干毕赤酵母(NBRC10063)基因组,yEUGAP,pMD18T-PKmGAPDH,pET-21c-Kmxyl3载体(Wangetal.,2011)为模板，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(大连宝生物)和引物PSXDH-SMAI-F(SEQIDNo.9)，PSXDH-PSTI-R(SEQIDNo.10),TER-NOTI-F(SEQIDNo.4)，TER-R(SEQIDNo.5)；TER-KMP-F(SEQIDNo.6),KMGAP-R(SEQIDNo.2)；KMP-KMXK-F(SEQIDNo.7),KMXK-NOTI-R(SEQIDNo.8)进行PCR扩增，得到的产物即为PsXYL2,TScGAPDH，PKmGAPDH和KmXYL3基因。
①PsXYL2的PCR体系：
PCR程序
②TScGAPDH基因的PCR体系：
PCR程序
③PKmGAPDH基因的PCR体系：
PCR程序
④KmXYL3基因的PCR体系：
PCR程序
⑶将PKmGAPDH，PsXYL2,TScGAPDH利用引物KMGAP-F(SEQIDNo.1),TER-HINDIII-R(SEQIDNo.3)进行融合，融合产物PKmGAPDH-PsXYL2-TScGAPDH与yELGAP载体分别利用HindIII进行单酶切，载体去磷酸化，连接，从而获得包含PKmGAPDH控制的PsXYL2的质粒，命名PsXYL2-yELGAP。
①PKmGAPDH-PsXYL2-TScGAPDH基因融合PCR体系:
PCR程序
②PKmGAPDH-PsXYL2-TScGAPDH基因的酶切体系：
③yELGAP载体的酶切体系：
④PKmGAPDH-PsXYL2-TScGAPDH基因和yELGAP载体的连接体系：
⑤将获得的插入了PsXYL2编码序列的yELGAP质粒，命名为PsXYL2-yELGAP。
⑷再将扩增产物TScGAPDH，PKmGAPDH，KmXYL3利用引物TER-NOTI-F(SEQIDNo.4),KMXK-NOTI-R(SEQIDNo.8)进行融合，融合产物为TScGAPDH-PKmGAPDH-KmXYL3。将基因TScGAPDH-PKmGAPDH-KmXYL3和载体PsXYL2-yELGAP利用NotI进行单酶切，连接，从而获得包含PsXYL2和KmXYL3基因的质粒，命名pZJ006(即PKmGAPDH控制的PsXYL2和KmXYL3表达质粒)(图2D)。
①TScGAPDH-PKmGAPDH-KmXYL3基因融合PCR体系:
PCR程序
②TScGAPDH-PKmGAPDH-KmXYL3基因的酶切体系：
③PsXYL2-yELGAP载体的酶切体系：
④TScGAPDH-PKmGAPDH-KmXYL3基因和PsXYL2-yELGAP载体的连接体系：
⑤将获得的插入了KmXYL3编码序列的PsXYL2-yELGAP质粒，命名为pZJ006。
3).包含PsXYL2-ARS(D207A/I208R/F209S)突变体基因的pZJ014质粒的构建：
以pZJ006为模板通过PCR扩增，利用引物导入突变得到的片段即为含有PsXYL2-ARS(D207A/I208R/F209S)突变体基因的质粒pZJ014(图2B)。
具体操作如下：
①包含PsXYL2-ARS(D207A/I208R/F209S)突变体基因的质粒的PCR体系：
PCR程序
②将得到的PCR扩增产物用DpnI酶切去除模板转入XL10-Gold，测序验证得到包含PsXYL2-ARS突变体基因的质粒，命名为pZJ014。
PsXYL2-ARS突变体基因的酶切体系：
4).pZJ021，pZJ022，pZJ025，pZJ027质粒的构建：
以马克思克鲁维酵母YHJ010(发明人构建并保存在发明人实验室，见Hongetal.,2007)基因组为模板，通过PCR对KmTAL1，KmRPE1，KmADH2，KmRKI1基因DNA进行扩增。分别得到基因KmTAL1(GenBank:AP012215.1(从1367559至1368563))，KmRPE1(GenBank:AP012218.1(从64301至65011))，KmADH2(GenBank:AF225206.1(从2091至3137))，KmRKI1(GenBank:AP012220.1(从506118至506936))。扩增产物插入到yEUGAP载体的EcoRI和NotI位点，获得质粒pZJ021，pZJ022(图2C)，pZJ025，pZJ027(图2E)。
具体操作如下：
⑴以马克思克鲁维酵母YHJ010基因组为模板，分别以引物对KMTAL1-ECORI-F(SEQIDNo.13)和KMTAL1-NOTI-R(SEQIDNo.14)；KMRPE1-ECORI-F(SEQIDNo.15)和KMRPE1-NOTI-R(SEQIDNo.16)；KMADH2-ECORI-F(SEQIDNo.17)和KMADH2-NOTI-R(SEQIDNo.18)；KMRKI1-ECORI-F(SEQIDNo.19)和KMRKI1-NOTI-R(SEQIDNo.20)为引物对KmTAL1，KmRPE1，KmADH2，KmRKI1基因进行PCR扩增。分别得到基因KmTAL1，KmRPE1，KmADH2，KmRKI1。
以马克思克鲁维酵母YHJ010基因组为模板扩增KmTAL1，KmRPE1，KmADH2或KmRKI1编码序列的PCR体系：
PCR程序
⑵扩增产物与yEUGAP载体分别利用EcoRI和NotI进行双酶切，连接，将KmTAL1，KmRPE1，KmADH2或KmRKI1编码序列分别插入到yEUGAP载体中，从而获得质粒pZJ021，pZJ022，pZJ025，pZJ027。
扩增基因的酶切体系：
②yEUGAP载体的酶切体系：
③KmTAL1，KmRPE1，KmADH2或KmRKI1编码序列和yEUGAP载体的连接体系：
④将获得的分别插入了KmTAL1，KmRPE1，KmADH2，KmRKI1编码序列的yEUGAP质粒，命名为pZJ021，pZJ022，pZJ025，pZJ027。
5).pZJ026，pZJ028质粒的构建：
从马克思克鲁维酵母YHJ010基因组中通过PCR扩增出基因KmTKL1(GenBank:AP012220.1(从667466至669505))和KmPDC1(GenBank:L09727.1)。将扩增产物KmTKL1，KmPDC1基因分别与TScGAPDH，PKmGAPDH基因进行融合。融合产物分别插入到pZJ021，pZJ025载体的NotI位点，获得质粒pZJ026(图2D)，pZJ028(图2F)。
具体操作如下：
⑴以马克思克鲁维酵母YHJ010基因组为模板，分别以KMGAP-KMTKL1-F(SEQIDNo.21),KMTKL1-NOTI-R(SEQIDNo.22)；KMGAP-KMPDC1-F(SEQIDNo.23),KMPDC1-NOTI-R(SEQIDNo.24)为引物对KmTKL1，KmPDC1基因进行PCR扩增，分别得到KmTKL1，KmPDC1。并将扩增产物KmTKL1，KmPDC1分别利用引物TER-NOTI-F(SEQIDNo.4)，KMTKL1-NOTI-R(SEQIDNo.22)和引物TER-NOTI-F(SEQIDNo.4)，KMPDC1-NOTI-R(SEQIDNo.24)与TScGAPDH，PKmGAPDH基因进行融合。
①KmTKL1和KmPDC1的PCR体系：
PCR程序
②TScGAPDH终止子片段,PKmGAPDH启动子片段分别与KmTKL1和KmPDC1基因融合的PCR体系：
PCR程序
⑵融合产物与pZJ021，pZJ025载体分别利用EcoRI和NotI进行双酶切，连接，将KmTKL1，KmPDC1编码序列分别插入到pZJ021，pZJ025载体中，获得质粒pZJ026，pZJ028。
①TScGAPDH-PKmGAPDH-KmTKL1基因酶切体系：
②TScGAPDH-PKmGAPDH-KmPDC1基因酶切体系：
③pZJ021质粒和pZJ025质粒酶切体系：
④TScGAPDH-PKmGAPDH-KmTKL1基因和pZJ021质粒的连接体系：
⑤TScGAPDH-PKmGAPDH-KmPDC1基因和pZJ025质粒的连接体系：
⑥将获得的插入了TScGAPDH-PKmGAPDH-KmTKL1基因的pZJ021质粒，命名为pZJ026。将获得的插入了TScGAPDH-PKmGAPDH-KmPDC1基因的pZJ025质粒，命名为pZJ028。
6).pZJ034质粒的构建：
从马克思克鲁维酵母YHJ010基因组通过PCR获得基因KmGPD1(GenBank:AP012213.1(从378475至379641))DNA。然后将基因KmGPD1插入pMD18-T载体，得到pMD18-T-KmGPD1载体。随后将从yEUGAP中扩增出来的ScURA3完整表达框(GenBank:AM697670.1(从2062至3158))用SmaI酶切后插入pMD18-T-KmGPD1的MscI位点，获得质粒pZJ034(图2G)。
具体操作如下：
⑴以马克思克鲁维酵母YHJ010基因组为模板，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(大连宝生物)和引物KMGPD1-F(SEQIDNo.25)，KMGPD1-R(SEQIDNo.26)进行PCR扩增，得到KmGPD1。然后将KmGPD1插入pMD18-T载体，从而得到pMD18-T-KmGPD1载体。
①KmGPD1的PCR体系：
PCR程序
②得到KmGPD1后，在DNA末端分别加上“A”碱基后，插入pMD18-T载体(购自大连宝生物)中。
加A体系：
TA克隆连接体系：
⑵以yEUGAP为模板，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(大连宝生物)和引物SCURA3-SMAI-FULL-F(SEQIDNo.27)，SCURA3-SMAI-FULL-R(SEQIDNo.28)进行PCR扩增，得到ScURA3完整表达框。利用SmaI对ScURA3完整表达框进行酶切，MscI对pMD18-T-KmGPD1进行酶切，连接，从而获得质粒pZJ034。
①ScURA3完整表达框的PCR体系：
PCR程序
②ScURA3完整表达框的酶切体系：
③KmGPD1-T载体的酶切体系：
④ScURA3完整表达框和KmGPD1-T载体的连接体系：
⑤将获得的ScURA3完整表达框-KmGPD1-T载体的质粒，命名为pZJ034。
7).pZJ035质粒的构建：
从pZJ014中通过PCR扩增，得到PsXYL2-ARS基因，插入到yEUGAP载体的EcoRI，NotI位点从而获得质粒pZJ035。
具体操作如下：
⑴以pZJ014为模板，KMGAP-PSXDH-F(SEQIDNo.29)，PSXDH-NOTI-R(SEQIDNo.30)为引物，进行PCR扩增，得到的产物即为PsXYL2-ARS基因。
①PsXYL2-ARS突变体基因的PCR体系：
PCR程序
⑵利用EcoRI，NotI对PsXYL2-ARS基因和yEUGAP载体进行酶切，连接，从而获得质粒pZJ035。
①PsXYL2-ARS基因和yEUGAP载体的酶切体系：
②PsXYL2-ARS基因和yEUGAP载体的连接体系：
③将获得的插入了PsXYL2-ARS基因的yEUGAP质粒，命名为pZJ035。
8).pZJ036质粒的构建：
分别以TScGAPDH，PKmGAPDH，PsXYL2-ARS基因为模板通过PCR进行融合获得TScGAPDH-PKmGAPDH-PsXYL2-ARS。然后插入载体pZJ035的NotI位点从而获得质粒pZJ036(图2H)。
具体操作如下：
⑴分别以TScGAPDH，PKmGAPDH，PsXYL2-ARS基因为模板，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(大连宝生物)和引物TER-NOTI-F(SEQIDNo.4)，PSXDH-NOTI-R(SEQIDNo.30)进行融合PCR扩增，融合产物为TScGAPDH-PKmGAPDH-PsXYL2-ARS。
①TScGAPDH，PKmGAPDH，PsXYL2-ARS基因的融合PCR体系：
PCR程序
⑵将基因TScGAPDH-PKmGAPDH-PsXYL2-ARS和载体pZJ035利用NotI进行单酶切，连接，从而获得质粒pZJ036。
①TScGAPDH-PKmGAPDH-PsXYL2-ARS基因和pZJ035载体的酶切体系：
②TScGAPDH-PKmGAPDH-PsXYL2-ARS基因和pZJ035载体的连接体系：
③将获得的插入了两份PsXYL2-ARS基因的yEUGAP质粒，命名为pZJ036。
9).pZJ042质粒的构建：
从马克思克鲁维酵母YHJ010基因组中通过PCR扩增，得到PKmPGK启动子(GenBank:AP012213.1(从1135852至1136884))。将扩增产物PKmPGK启动子片段插入到yEUGAP载体SphI和EcoRI位点，从而获得质粒pZJ042。
具体操作如下：
⑴以马克思克鲁维酵母YHJ010基因组DNA为模板，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(大连宝生物)和引物KMPGK-SPHI-F(SEQIDNo.31)，KMPGK-ECORI-R(SEQIDNo.32)进行PCR扩增，得到PKmPGK启动子片段。
①PKmPGK启动子片段的PCR体系：
PCR程序
⑵将扩增产物PKmPGK启动子片段和yEUGAP载体利用SphI,EcoRI进行双酶切，连接，从而获得质粒，命名为pZJ042。
①PKmPGK启动子片段和yEUGAP载体的酶切体系：
②PKmPGK启动子片段和yEUGAP载体的连接体系：
③将获得的插入了PKmPGK编码序列的yEUGAP质粒，命名为pZJ042。
10).pZJ043质粒的构建：
从马克思克鲁维酵母YHJ010基因组中通过PCR扩增得到KmGLN1(GenBank:AP012219.1(从246884至247993))。将扩增产物KmGLN1插入pZJ042载体的NotI位点获得质粒pZJ043(图2I)。
具体操作如下：
⑴以马克思克鲁维酵母YHJ010基因组为模板，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(大连宝生物)和引物KMGLN1-NOTI-F(SEQIDNo.33)，KMGLN1-NOTI-R(SEQIDNo.34)进行PCR扩增，得到扩增产物KmGLN1(GenBank:AP012219.1(从246884至247993))。
①KmGLN1的PCR体系：
PCR程序
⑵将扩增产物KmGLN1和pZJ042载体利用NotI进行单酶切，连接，从而获得质粒，分别命名为pZJ043。
①KmGLN1和pZJ042载体的酶切体系：
②KmGLN1与pZJ042载体的连接体系：
③将获得的插入了PKmPGK控制的KmGLN1编码序列的yEUGAP质粒，命名为pZJ043。
11).pMD18-T-ScURA3敲除片段质粒的构建：
以yEUGAP为模板，通过PCR扩增出SCURA3的前322bp片段和第487bp之后的片段，再通过融合PCR获得缺失了165bp的ScURA3敲除框，并将其插入pMD18-T载体。
具体操作如下：
⑴以yEUGAP为模板，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(大连宝生物)和引物SCURA3-F1(SEQIDNo.35)，SCURA3-R1-322(SEQIDNo.36)；SCURA3-F2-487(SEQIDNo.37)，SCURA3-R2(SEQIDNo.38)进行PCR扩增，得到ScURA3的前322bp片段和第487bp之后的片段。然后以ScURA3的前322bp片段和第487bp之后的片段为模板，SCURA3-F1和SCURA3-R2为引物，进行融合PCR，得到中间缺失165bp的ScURA3基因DNA，即ScURA3敲除片段基因。
①ScURA3的前322bp片段和第487bp之后的片段的扩增PCR体系：
PCR程序
②ScURA3敲除基因片段的融合PCR体系：
PCR程序
⑵将ScURA3敲除框插入pMD18-T载体中，从而得到pMD18-T-ScURA3敲除片段载体。
①加A体系：
②TA克隆连接体系：
③将ScURA3敲除基因片段插入pMD18-T载体中得到的质粒，命名为pMD18-T-ScURA3质粒。
2.利用木糖高效发酵的耐热酵母菌株的构建：
以马克思克鲁维酵母YHJ010的木糖还原酶基因(XYL1)和木糖醇脱氢酶(XYL2)基因双敲除的YRL002宿主菌株为出发菌株(具体可参见wangetal.,2011)，将上述克隆到载体中的基因依次转入此菌株或对对应基因进行敲除。
1)酵母化学转化步骤:
①.各种改造菌株在YPD平板上划线，37℃培养24h。
②.在YPD平板上挑取单克隆，分别接种到5ml液体YPD，37℃，250rpm，培养18h。
③.取1ml培养物转接到装有9ml液体YPD的50ml三角瓶内，37℃，250rpm，摇床培养5h。
④.取出培养物，常温下离心5000rpm，3min，弃上清液，保留菌体。
⑤.配制1ml转化缓冲液：800μl50％PEG4000；50μl4M醋酸锂；50μlddH2O；100μl1MDTT(溶于10mM醋酸钠,pH5.2)。
⑥.使用200μl转化缓冲液重悬菌体，5000rpm，离心3min，去上清。
⑦.用100μl转化缓冲液重悬浮菌体，加入5μl(1-10μg)线性化的质粒,
轻微震荡30sec。
⑧.在47℃条件下水浴15min。
⑨.将菌体涂布于含有亮氨酸(Leu)或尿嘧啶(Ura)的合成培养基，37℃培养2天。
⑩.挑取板上克隆在液体YPD中培养，提取基因组，并通过PCR鉴定转化结果。
2)构建本专利耐热酵母各表达菌株的具体过程(表3):
用SmaI酶切pZJ004载体。将酶切产物转化至KmXYL1和KmXYL2双敲除株(YRL002)中，通过使菌株获得URA3基因，恢复尿嘧啶的合成能力进行筛选，同时该菌株也获得NcXYL1和KmXYL3。在仅含有亮氨酸的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，亮氨酸30mg/ml，琼脂15g/L)上筛选阳性克隆，获得的菌株命名为YZJ004。
用AatII酶切pZJ014载体。将酶切产物转化至YZJ004，非同源重组后，将使菌株恢复LEU2基因的功能，并新增PsXYL2-ARS突变基因和KmXYL3的功能。在仅含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，琼脂15g/L)上筛选阳性克隆，获得的菌株命名为YZJ020。
以pMD18T-ScURA3敲除片段为模板，PCR扩增ScURA3敲除片段。将ScURA3敲除片段转化入含有树干毕赤酵母的木糖醇脱氢酶基因的突变体(PsXYL2-ARS)的YZJ020中，同源重组后，使菌株YZJ020内的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，琼脂15g/L)和5’-FOA的平板上筛选ScURA3敲除菌株，获得的菌株命名为YZJ036。
用SmaI酶切pZJ036载体。将酶切产物转化至YZJ036，非同源重组后，将使菌株恢复URA3基因的功能，并新增两份PsXYL2-ARS突变基因的功能。在合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，琼脂15g/L)上筛选阳性克隆，命名为YZJ051。
以pMD18T-ScURA3敲除片段为模板，PCR扩增ScURA3敲除片段。将ScURA3敲除片段转化入YZJ051中，同源重组后，使菌株YZJ051内的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，琼脂15g/L)和5’-FOA的平板上筛选ScURA3敲除菌株，获得的菌株命名为YZJ057。
用SmaI酶切pZJ028载体。将酶切产物转化至YZJ057，非同源重组后，将使菌株恢复URA3基因的功能，并新增KmADH2和KmPDC1基因的功能。在合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，琼脂15g/L)上筛选阳性克隆，命名为YZJ061。
以pMD18T-ScURA3敲除片段为模板，PCR扩增ScURA3敲除片段。将ScURA3敲除片段转化入YZJ061中，同源重组后，使菌株YZJ061内的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，琼脂15g/L)和5’-FOA的平板上筛选ScURA3敲除菌株，获得的菌株命名为YZJ066。
用SmaI酶切pZJ026载体。将酶切产物转化至YZJ066，非同源重组后，将使菌株恢复URA3基因的功能，并新增KmTAL1和KmTKL1的功能。在合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，琼脂15g/L)上筛选阳性克隆，命名为YZJ069。
以pMD18T-ScURA3敲除片段为模板，PCR扩增ScURA3敲除片段。将ScURA3敲除片段转化入YZJ069中，同源重组后，使菌株YZJ069内的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，琼脂15g/L)和5’-FOA的平板上筛选ScURA3敲除菌株，获得的菌株命名为YZJ070。
用SmaI酶切pZJ022载体。将酶切产物转化至YZJ070，非同源重组后，将使菌株恢复URA3基因的功能，并新增KmRPE11的功能。在合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，琼脂15g/L)上筛选阳性克隆，命名为YZJ071。
以pMD18T-ScURA3敲除片段为模板，PCR扩增ScURA3敲除片段。将ScURA3敲除片段转化入YZJ071中，同源重组后，使菌株YZJ071内的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，琼脂15g/L)和5’-FOA的平板上筛选ScURA3敲除菌株，获得的菌株命名为YZJ076。
用SmaI酶切pZJ027载体。将酶切产物转化至YZJ076，非同源重组后，将使菌株恢复URA3基因的功能，并新增KmRKI1的功能。在合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，琼脂15g/L)上筛选阳性克隆，命名为YZJ077。
以pMD18T-ScURA3敲除片段为模板，PCR扩增ScURA3敲除片段。将ScURA3敲除片段转化入YZJ077中，同源重组后，使菌株YZJ077内的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，琼脂15g/L)和5’-FOA的平板上筛选ScURA3敲除菌株，获得的菌株命名为YZJ081。
PCR扩增ScURA3敲除片段。将ScURA3敲除片段转化入YZJ081中，同源重组后，使菌株YZJ081内的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，琼脂15g/L)和5’-FOA的平板上筛选阳性克隆，获得的菌株命名为YZJ085。
以pZJ034敲除片段为模板，PCR扩增KmGPD1-T-ScURA3基因。将KmGPD1-T-ScURA3基因片段转化入YZJ085中，同源重组后，使菌株YZJ085内的KmGPD1被敲除，同时使菌株恢复URA3基因的功能。在合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，琼脂15g/L)上筛选阳性克隆，命名为YZJ086。
以pMD18T-ScURA3敲除片段为模板，PCR扩增ScURA3敲除片段。将ScURA3敲除片段转化入YZJ086中，同源重组后，使菌株YZJ086内的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，琼脂15g/L)和5’-FOA的平板上筛选ScURA3敲除菌株，获得的菌株命名为YZJ087。
用SmaI酶切pZJ043载体。将酶切产物转化至YZJ087，非同源重组后，使菌株恢复URA3基因的功能，并新增KmGLN1的功能。在合成培养基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，琼脂15g/L)上筛选阳性克隆，命名为YZJ088。
3)提取基因组，通过PCR鉴定酵母转化的阳性菌株。
⑴耐热酵母基因组提取步骤:
①.挑取单克隆，接入5ml液体YPD中，37℃，250rpm，培养24h。
②.常温下12000rpm，5sec离心收菌，弃上清。
③.500μl蒸馏水重悬菌体，12000rpm，5sec离心收菌，弃上清。
④.取200μl实验室自配1xbreaking缓冲液(TritonX-100(2％(w/v))，SDS(1％(w/v)),NaCl(100mM),Tris-Cl(10mM,pH8.0),EDTA(1mM))重悬菌体，并将菌液转入到含有0.3g玻璃珠(425-600um，sigma，美国)的EP管内。
⑤.加入200μl酚氯仿溶液后，高速震荡3min，加入200μl1xTE(10mMTris-Cl,pH8.0,1mMEDTA)。轻微震荡。
⑥.12000rpm，5min，离心，取最上层清液转入新的EP管内，加入1ml预冷的无水乙醇。
⑦.12000rpm,4℃，离心10min，弃上清，室温下干燥沉淀，并用400μl1xTE重悬沉淀。
⑧.加入2μlRNase(RNA水解酶，2mg/ml)到EP管内，混匀，37℃，酶切1h。
⑨.取40μl3M醋酸钠(pH5.2)加入到管内，混匀并加入1ml预冷的无水乙醇。
⑩.12000rpm，4℃，30min，离心，弃上清室温下干燥。用合适体积重悬沉淀，此即酵母基因组DNA。
⑵鉴定酵母转化的阳性菌株的PCR体系：
①YZJ004的基因组中NcXYL1基因的PCR体系：
PCR程序
②其他酵母转化的阳性菌株的基因组检测同上体系。如上所述，分别以基因的特异性引物作为引物，以基因组为模板，PCR扩增后，能特异性的扩增出对应基因长度条带的菌株，即为阳性菌株，并进行下一步实验。
实施例2.含有不同工程基因的菌株在42℃条件下的发酵情况
该实施例用于比较分别转入含有不同工程基因的菌株对于利用木糖生产乙醇产量的效果。结果表明所有工程基因都转入的菌株YZJ088利用木糖生产乙醇的效果最好。
1.在YPD培养基平板上复苏菌株。对照株：YZJ020。实验株：YZJ051，YZJ061，YZJ069，YZJ071，YZJ077，YZJ086，YZJ088。37℃培养1天。
2.分别挑取单克隆，接于5ml液体YPD培养基。37℃，250rpm，过夜。
3.分别转接于50ml液体YPD培养基。37℃，250rpm，过夜。
4.配制30瓶30ml木糖合成培养基分装于50ml厌氧发酵瓶中。配方：100g/L木糖，10g/L酵母提取物，20g/L细菌学蛋白胨。灭菌待用。
5.取适量过夜培养物接入50ml木糖合成培养基中，使他们的初始OD600达到15,42℃,250rpm培养。
6.在0h，6h，12h，18h，21h，24h取样，并取上清通过HPLC检测分析(图3)。
7.从图3可知，在42℃木糖为碳源培养基的培养条件下：
YZJ020的乙醇产量为25.48g/L，生产速率为1.42g/L/h，
YZJ051的乙醇产量为29.73g/L，生产速率为1.65g/L/h，
YZJ061的乙醇产量为31.99g/L，生产速率为1.78g/L/h，
YZJ069的乙醇产量为27.97g/L，生产速率为1.55g/L/h，
YZJ071的乙醇产量为28.07g/L，生产速率为1.56g/L/h，
YZJ077的乙醇产量为31.38g/L，生产速率为1.74g/L/h，
YZJ086的乙醇产量为33.78g/L，生产速率为1.88g/L/h，
YZJ088的乙醇产量为35.94g/L，生产速率为2.00g/L/h。
结果说明结果表明所有工程基因都转入的菌株YZJ088利用木糖生产乙醇的效果最好。
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Claims (10)
1.一种乙醇高温高产工程菌株，其特征在于所述工程菌株通过在双敲除木糖还原酶基因KmXYL1和木糖醇脱氢酶基因KmXYL2的马克思克鲁维酵母(K.marxianus)中重组入粗糙脉孢霉(Neurosporacrassa)的木糖还原酶基因NcXYL1和树干毕赤酵母(Scheffersomycesstipitis)的木糖醇脱氢酶突变基因PsXYL2-ARS，以及马克思克鲁维酵母的木酮糖激酶基因KmXYL3而获得，其中所述树干毕赤酵母木糖醇脱氢酶突变基因PsXYL2-ARS为在野生型树干毕赤酵母木糖醇脱氢酶基因的基础上具有D207A/I208R/F209S突变。
2.根据权利要求1所述的乙醇高温高产工程菌株，其特征在于所述菌株含有两个拷贝的所述树干毕赤酵母木糖醇脱氢酶突变基因PsXYL2-ARS。
3.根据权利要求2所述的乙醇高温高产工程菌株，其特征在于在所述菌株中进一步转入马克思克鲁维酵母的乙醇脱氢酶基因KmADH2和马克思克鲁维酵母的丙酮酸脱羧酶基因KmPDC1。
4.根据权利要求3所述的乙醇高温高产工程菌株，其特征在于在所述菌株中进一步转入马克思克鲁维酵母的转醛酶基因KmTAL1和马克思克鲁维酵母的转酮酶基因KmTKL1。
5.根据权利要求4所述的乙醇高温高产工程菌株，其特征在于在所述菌株中进一步转入马克思克鲁维酵母的L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶基因KmRPE1。
6.根据权利要求5所述的乙醇高温高产工程菌株，其特征在于在所述菌株中进一步转入马克思克鲁维酵母的核糖-5-磷酸酮醇异构酶基因KmRKI1。
7.根据权利要求6所述的乙醇高温高产工程菌株，其特征在于在所述菌株中敲除马克思克鲁维酵母的甘油-3磷酸脱氢酶基因KmGPD1。
8.根据权利要求7所述的乙醇高温高产工程菌株，其特征在于在所述菌株中进一步转入马克思克鲁维酵母的谷氨酰胺合成酶基因KmGLN1。
9.一种乙醇高温高产工程菌株YZJ088，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.9387。
10.权利要求1-9任一项所述的乙醇高温高产工程菌株用于发酵木糖生产乙醇的用途。
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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Granted publication date: 20160713 |