CN115806886B - 粗糙脉孢菌木酮糖激酶基因敲除突变株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了粗糙脉孢菌木酮糖激酶基因敲除突变株及其应用，它是将粗糙脉孢菌菌株的木酮糖激酶基因的全部或部分编码基因敲除，替换为潮霉素B抗性基因。以粗糙脉孢菌为出发菌株利用基因改造技术将原始菌株中的木酮糖激酶基因敲除，阻断木糖醇的磷酸化，而粗糙脉孢菌的木糖醇脱氢酶活性较低，在发酵中并无大量的木酮糖的积累，从而实现了木糖醇积累的目的。与原始菌株相比，程改造后的粗糙脉孢菌菌株木糖醇的积累量明显的提高。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及粗糙脉孢菌木酮糖激酶基因敲除突变株。
背景技术
木糖醇是一种天然的五碳糖醇，在水果和蔬菜中有少量存在，因木糖醇在食用后不会引起血糖值升高，是糖尿病患者首选的甜味替代品。木糖醇还具有预防龋齿的功能，目前木糖醇被广泛应用于食品、化妆品等领域。
工业上木糖醇是由纯D-木糖在高温、高压下经镍催化加氢制得，该方法对木糖的纯度要求高，反应条件恶劣，导致生产成本高，生产安全性差，并且容易造成环境污染。生物发酵法生产木糖醇的原理是利用细胞内的木糖还原酶，将木糖还原为木糖醇，该方法不仅可以以木糖为原料生产木糖醇，还可以利用植物中的半纤维素为原料，经过水解、发酵生产木糖醇，条件温和、工艺简单、同时减轻污染，因而受到广泛关注。
目前利用木糖发酵制备木糖的微生物主要是酵母菌，其次还有大肠杆菌。酵母菌作为木糖醇生产菌株有着自己的优势，比如基因背景较清楚，能耐受较高的糖浓度等，但也存在着具有潜在的致病性、自身木糖还原酶专一性较差等问题。大肠杆菌作为生产各种高附加值化学品的理想宿主，当前研究最为透彻，利用其构建基因工程菌有着得天独厚的条件，但是大肠杆菌自身并无编码木糖还原酶的基因，要想生产木糖醇需要一些列的基因过表达，基因敲除等手段，过程较为复杂。而粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)具有催化活性很高的木糖还原酶(xr)，可以将木糖直接还原为木糖醇，但木糖醇会进一步生成木酮糖，最终经木酮糖激酶(xyk-1)磷酸化为木酮糖-5-磷酸后进入磷酸戊糖途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：提供一种提高木糖醇积累的粗糙脉孢菌基因工程菌及其构建方法。
本发明的技术方案为：粗糙脉孢菌木酮糖激酶基因敲除突变株，它是将粗糙脉孢菌菌株的木酮糖激酶基因的全部或部分编码基因敲除后得到。
进一步地，所述木酮糖激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明中敲除的木酮糖激酶基因(xyl-1)序列参考NCBI登录号NCU11353，由于不同菌株的基因可能存在差异，只要是通过敲除编码木酮糖激酶基因序列，从而阻断木糖醇磷酸化都属于本发明的保护范围，而不仅仅局限于SEQ ID No.1所示的参考序列。
进一步地，所述突变株导入了潮霉素抗性基因。
本发明还提供了上述所述粗糙脉孢菌木酮糖激酶基因敲除突变株的构建方法，包括以下步骤：
(1)首先扩增粗糙脉孢菌木酮糖激酶基因上游1.5kb的基因片段和下游1.5kb的基因片段，并扩增潮霉素抗性基因片段，利用一步克隆法将其与PCR线性化载体pUC18相连接，构成敲除载体；
(2)将步骤(1)得到的敲除载体转入大肠杆菌DH5α进行培养，挑选阳性克隆；
(3)将步骤(2)的阳性克隆电转粗糙脉孢菌，通过潮霉素B筛选阳性菌株，对阳性菌株进行鉴定，筛选得到敲除木酮糖激酶基因的粗糙脉孢菌突变株。
进一步地，步骤(1)中，扩增上游1.5kb的基因片段的引物如SEQ ID No.2和SEQ IDNo.3所示；扩增下游1.5kb的基因片段的引物如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；扩增潮霉素抗性基因的引物如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示；扩增线性化载体pUC18的引物如SEQID No.8和SEQ ID No.9所示。
本发明还提供了上述粗糙脉孢菌木酮糖激酶基因敲除突变株在利用木糖制备木糖醇上的应用。
进一步地，所述应用为将所述突变株接入木糖培养基中，于室温振荡暗培养。
进一步地，所述木糖培养基中木糖的浓度为5-65g/L。
进一步地，所述室温为25℃，振荡频率为200rpm，培养时间为144h。
进一步地，在接入菌株的第0小时、48小时、96小时加入10g/L的蔗糖。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
以粗糙脉孢菌为出发菌株利用基因改造技术将原始菌株中的木酮糖激酶基因敲除，阻断木糖醇的磷酸，而粗糙脉孢菌的木糖醇脱氢酶活性较低，在发酵中并无大量的木酮糖的积累，从而实现了木糖醇积累的目的。与原始菌株相比，程改造后的粗糙脉孢菌菌株木糖醇的积累量明显的提高，在初始木糖浓度都为5g/L时，在发酵144h后木糖醇的积累量约增加了20倍。再通过对其发酵方法的优化，使木糖醇的积累量达到了26.63g/L。
附图说明
图1为敲除载体的构建过程，及敲除原理。
图2为发酵方案1中木糖的利用情况。
图3为发酵方案1中木糖醇的积累情况。
图4为发酵方案2中木糖的利用情况。
图5为发酵方案2中木糖醇的积累情况。
图6为发酵方案3中木糖的利用情况。
图7为发酵方案3中木糖醇的积累情况。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
FGS培养基(100mL)：葡萄糖0.05g，果糖0.05g，山梨糖2g，琼脂2.0g，50×Vogel’s盐2mL。
VM固体培养基(50mL)：50×Vogel’s盐1mL，蔗糖0.75g，琼脂0.5g。
种子培养基(50mL)：50×Vogel’s盐1mL，蔗糖1.0g。
木糖发酵培养基(50mL)50×Vogel’s盐1mL，木糖0.25-3.25g。
50×Vogel’s无机盐溶液(1L)：126.8gNa3citrate.2H2O、250g KH2PO4、100gNH4NO3、10gMgSO4.2H2O、5g CaCl2.2H2O、0.5mg biotin、0.5gCitric acid.H2O、0.5gZnSO4.7H2O、0.1g Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O、0.025g CuSO4.5H2O、0.005gMnSO4.H2O、0.005gH3BO3，以及0.005g NaMoO4.2H2O溶解在水中形成的溶液。
本发明使用的粗糙脉孢菌菌株2489购于美国FGSC，为现有商品化菌株。
本发明中敲除的木酮糖激酶基因(xyl-1)序列参见NCBI登录号NCU11353。
实施例1
1、敲除木酮糖激酶
(1)构建潮霉素敲除载体：首先扩增粗糙脉孢菌木酮糖激酶基因上游1.5kb的基因片段和下游1.5kb的基因片段，并扩增潮霉素抗性基因片段，利用一步克隆法将其与PCR线性化的载体pUC18相连接，构成敲除载体，构建载体的方法如图1所示。
表1引物序列
表2PCR体系
表3PCR程序
表4无缝克隆法体系
将以上体系在50℃条件下孵育20分钟。
将连接后的敲除载体转入DH5α感受态，然后挑取得到的转化子进行PCR验证，将验证成功的转化子接入液体培养基扩增培养，使用质粒提取试剂盒提取质粒并送入公司测序。
(2)粗糙脉孢菌的转化：将从-80℃冰箱取出的粗糙脉孢菌菌株2489感受态细胞放置在冰上约5分钟使菌体复苏融化，加入10μL需要转化的载体，再放置在冰上30分钟后，转移至冰浴好的电转杯中；在1.5KV，600ohms，25μF条件下进行电激，完成后立即加入900μL1M冰浴好的山梨醇，用枪头缓慢温和地吹吸2-3次，然后放到冰上；在超净台中加入9mL VM液体培养基至50mL离心管中，然后再加入电转杯中的感受态细胞，30℃、220rpm条件下培养1-3个小时；摇好后取出50mL离心管，2000rpm，室温离心5分钟，去上清留1mL左右悬浮孢子，混匀后加入含有潮霉素的50mL FGS培养基并倒入平板；在30℃、黑暗条件下倒置培养3天左右；提前在1.5mL离心管中加入含有潮霉素的VM固体培养基，挑取单菌落转移接种至1.5mL离心管中，放置在30℃恒温黑暗培养箱中培养，待长出菌丝后，转移至含有潮霉素的5mL VM液体培养基中，放置在220rpm、30℃摇床上震荡培养以获得更多菌丝，最后提取基因组验证，敲除原理示意图如图1所示。
(3)筛选纯合子：将验证成功的菌株接入含有25mL VM固体培养基的100mL三角烧瓶中，30℃恒温黑暗培养箱中培养3天，25℃恒温光照培养箱中培养6天，生成橘黄色孢子；将孢子用无菌水冲洗下来，取少量含有孢子的悬浮液经5um的过滤器过滤后涂布在VM平板上，在30℃培养箱中萌发，并挑取单菌落。
2、种子培养
(1)分生孢子的生成：将菌株接入含有50mL VM固体培养基的100mL三角烧瓶中，30℃恒温黑暗培养箱中培养3天，25℃恒温光照培养箱中培养6天，生成橘黄色孢子。
(2)粗糙脉孢菌孢子的洗脱：向上述含有成熟孢子的锥形瓶中加入30mL无菌水，涡旋震荡至孢子全部悬于无菌水中。用四层无菌纱布过滤孢子悬液，保存过滤后的孢子悬液于10mL无菌离心管中备用。
(3)种子培养基的接种：测量孢子悬液在600nm处的OD值，按照如下公式确定种子培养基的接种量：
接种量(mL)＝0.2/OD600的吸光度
(4)种子培养基培养：吸取相应体积的菌液加入50mL无菌的VM液体培养基中，置于25℃、200rpm摇床上震荡培养40小时。
3、木糖发酵培养
用无菌布氏漏斗抽滤长势良好的菌丝体，将抽滤得到的干燥菌丝体用镊子从无菌滤纸上揭下，接入50mL木糖培养基中。
发酵方案1：在250ml锥形瓶中配置50ml木糖浓度分别为5g/L、15g/L、35g/L、45g/L、55g/L的木糖培养基，用无菌布氏漏斗抽滤种子培养基中长势良好的菌丝体，将抽滤得到的菌丝体接入50mL木糖培养基中将木糖培养基置于25℃、200rpm的恒温震荡摇床上暗培养，分别于接种的第0小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时在超净台中进行取样。
将所取样品用高效液相色谱法(HPLC)检测发酵液中剩余的木糖浓度与产生的木糖醇的浓度，发酵结果如图2和图3所示。发酵144h后木糖醇的最高浓度9.24g/L，其木糖的初始添加量为45g/L，木糖的残余量为23.68g/L。
发酵方案2：在250ml锥形瓶中配置50ml木糖浓度分别为30g/L、45g/L的木糖培养基，用无菌布氏漏斗抽滤种子培养基中长势良好的菌丝体，将抽滤得到的菌丝体以方案1中2倍的量接入50mL木糖培养基中将木糖培养基置于25℃、200rpm的恒温震荡摇床上暗培养，分别于接种的第0小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时在超净台中进行取样。
将所取样品用高效液相色谱法(HPLC)检测发酵液中剩余的木糖浓度与产生的木糖醇的浓度，发酵结果如图3和图4所示。发酵144h后木糖醇的最高浓度16.19g/L，其木糖的初始添加量为45g/L，木糖的残余量为22.45g/L。
发酵方案3：在250ml锥形瓶中配置50ml木糖浓度分别为35g/L、50g/L、65g/L的木糖培养基，用无菌布氏漏斗抽滤种子培养基中长势良好的菌丝体，将抽滤得到的菌丝体接入50mL木糖培养基中将木糖培养基置于25℃、200rpm的恒温震荡摇床上暗培养，在接入的第0小时、48小时、96小时加入10g/L的蔗糖，并分别于第0小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时在超净台中进行取样。
将所取样品用高效液相色谱法(HPLC)检测发酵液中剩余的木糖浓度与产生的木糖醇的浓度，发酵结果如图5和图6所示。发酵144h后木糖醇的最高浓度26.63g/L，其木糖的初始添加量为65g/L，木糖的残余量为17.40g/L。
对照方案：在250ml锥形瓶中配置50ml木糖浓度为5g/L的木糖培养基，用无菌布氏漏斗抽滤种子培养基中长势良好的菌丝体，将抽滤得到的菌丝体接入50mL木糖培养基中将木糖培养基置于25℃、200rpm的恒温震荡摇床上暗培养，并分别于第0小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时在超净台中进行取样。将所取样品用高效液相色谱法(HPLC)检测发酵液中剩余的木糖浓度与产生的木糖醇的浓度，发酵144h后木糖醇的最高浓度0.07g/L。
5、菌丝干重测量：发酵结束后将菌丝放入45℃烘箱中烘干至恒重，称量其干重。
表5三种发酵方案以及菌株2489在发酵144h后的木糖醇产量比较
注：转化率＝木糖醇的生成量/木糖的消耗量
由表5可知，经过基因工程改造后的粗糙脉孢菌菌株木糖醇的积累量明显的提高，在初始木糖浓度都为5g/L时，在发酵144h后木糖醇的积累量约增加了20倍；在方案1中随着木糖初始浓度的增加，其木糖醇的积累量也在不断增加，木糖的最大消耗量约为22g/L；在方案2中增加菌丝量后，发现木糖醇的积累量也随之增加，并且在木糖初始添加量为45g/L时，木糖的转化率提高了28.46％；由于改造菌株敲除了木酮糖激酶，木糖无法进入磷酸戊糖途径，故无法为菌体的代谢生长提供能量，在方案3中进行补料发酵，定期添加一定量的蔗糖，使菌体能够继续代谢生长，从而增加了木糖醇的积累量。
Claims (2)
1.粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)木酮糖激酶基因敲除突变株在利用木糖制备木糖醇上的应用，所述突变株是将粗糙脉孢菌菌株的木酮糖激酶基因的全部编码基因敲除后得到；将所述突变株接入木糖培养基中，于室温振荡暗培养，在接入菌株的第0小时、 48 小时、96 小时加入10g/L的蔗糖，所述木糖培养基中木糖的浓度为50-65g/L；
所述木糖培养基组成为：以50ml体系计，50×Vogel’s盐 1mL，木糖0.25-3.25g；
所述50×Vogel’s盐组成为：以1L体系计，126.8g Na3citrate·2H2O、250g KH2PO4、100gNH4NO3、10gMgSO4·2H2O、5g CaCl2·2H2O、 0.5mg biotin、0.5gCitric acid·H2O、0.5gZnSO4·7H2O、0.1g Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O、0.025g CuSO4·5H2O、0.005gMnSO4·H2O、0.005gH3BO3，以及0.005g NaMoO4·2H2O溶解在水中形成的溶液。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述室温为25℃，振荡频率为200rpm，培养时间为144h。
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