CN115725484A - 合成d-阿洛酮糖的酶突变表达工程菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，公开了合成D‑阿洛酮糖的酶突变表达工程菌及应用，申请人以来源Thermus oshimai的葡萄糖异构酶和来源Flavonifractor plautii的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶构建的双酶体系DH5α/pHY‑P₄₃‑TogI‑P_43‑DAEase，并通过蛋白质改造，构建了葡萄糖异构酶和D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的突变体菌株BL10/pHY‑P₄₃‑TogI¹⁸²‑P₄₃‑DAEase³⁸。利用该菌株进行全细胞催化，其能够催化500 g/L葡萄糖“一锅法”转化生成185g/LD‑阿洛酮糖，其转化率可达35%，为目前从葡萄糖生产D‑阿洛酮糖的最高水平，大幅度降低了生产成本，具有显著经济效益。

Description

合成D-阿洛酮糖的酶突变表达工程菌及应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及合成D-阿洛酮糖的酶突变表达工程菌及应用，利用本发明提供的工程菌，可以葡萄糖为底物，利用双酶体系将葡萄糖直接转化为D-阿洛酮糖。

背景技术

稀有糖(Rare Sugar)是自然界中存在但含量极少的一类单糖(糖的最小单位)和糖醇，其味类似于蔗糖，但具有热量低、稳定性高、甜昧协调、无吸湿性、无致龋齿性、耐受性高等优点，可以弥补传统甜味剂的不足，对改善特殊人群的饮食起到重要作用，目前已知的稀少糖有50多种。世界上肥胖、高血脂以及糖尿病等疾病日益增多，这主要是过量摄入高脂肪、高碳水的食物及缺乏运动等造成的。一些比较稀少的单糖如D-阿洛酮糖、D-塔格糖等具有蔗糖相近的甜度，但热量较低，可作为新型的功能性甜味剂应用到保健和膳食等领域。2002年，国际稀有糖学会定义稀有糖为自然界稀有的单糖及衍生物。低热量的稀有糖引起研究者的兴趣。

D-阿洛酮糖是一种功能性稀有糖。D-阿洛酮糖，英文名称为D-allulose，旧称D-psicose2'，分子式为C₆H₁₂O6，相对分子质量为180.16g/mol，是D-果糖在C-3位的差向异构体。它为白色、无味的结晶性粉末。D-阿洛酮糖具有蔗糖70％的甜度，但热量很低，是蔗糖良好的替代品。D-阿洛酮糖在自然界中存在极少，利用化学方法合成杂质多不易分离，且成本昂贵。而利用生物转化技术研发逐渐成为国际上研究的热点。

目前以D-果糖为原料，通过D-阿洛酮糖3-差向异构酶制备D-阿洛酮糖，且D-阿洛酮糖差向异构酶为胞内酶，经简单的离心分离或膜分离、去离子水复溶、均质即可得到酶制剂，极大地降低后续D-阿洛酮糖提纯的难度和成本，显著提高D-阿洛酮糖成品的质量，节约了生产成本，降低了动力损耗。但是目前已报道的微生物，产生D-阿洛酮糖3-差向异构酶的酶活低，转化果糖的能力仍较差，增加了D-阿洛酮糖工业化生产的效率和难度，且果糖相对于葡萄糖价格较贵，极大增加了成本。

因此，构建以葡萄糖为底物利用地衣芽孢杆菌生产D-阿洛酮糖的双酶体系是大规模生产应用的关键。然而，目前从葡萄糖到D-阿洛酮糖的转化效率较低，限制了该体系的应用推广。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中以果糖为底物制备D-阿洛酮糖的D-阿洛酮糖3-差向异构酶转化成本高、效率低的问题，本发明提供了合成D-阿洛酮糖的酶突变表达工程菌。

本发明的另一个目的在于提供了利用双酶体系可直接将葡萄糖直接转化为D-阿洛酮糖。其能够催化500g/L葡萄糖“一锅法”转化生成185g/LD-阿洛酮糖，为目前从葡萄糖生产D-阿洛酮糖的最高水平，显著降低生产成本。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

合成D-阿洛酮糖的酶突变表达工程菌，所述菌株含有可表达SEQ ID NO.5和SEQID NO.6所示的蛋白的重组地衣芽胞杆菌；

以上所述的菌株，优选的，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌BL10。

本发明的保护范围还包括：上述酶突变表达工程菌在合成D-阿洛酮糖中的应用。

以上所述的应用，具体的，是将直接将葡萄糖作为底物利用上述重组地衣芽胞杆菌进行催化，即可制备得到D-阿洛酮糖。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明以来源Thermus oshimai的葡萄糖异构酶和来源Flavonifractor plautii的D-阿洛酮糖3-差向异构酶构建的双酶体系DH5α/pHY-P₄₃-TogI-P_43-DAEase，并通过蛋白质改造，构建了葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体菌株BL10/pHY-P₄₃-TogI¹⁸²-P₄₃-DAEase³⁸。利用该菌株进行全细胞催化，其能够催化500g/L葡萄糖“一锅法”转化生成185g/LD-阿洛酮糖，其转化率可达35％，相比传统的单酶体系转化率更高，且可直接将葡萄糖转化成D-阿洛酮糖，为目前从葡萄糖生产D-阿洛酮糖的最高水平，大幅度降低了生产成本，具有显著经济效益。

附图说明

图1为双酶原始表达菌与突变菌株转化生成D-阿洛酮糖的产量差异示意图。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

构建葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶的双酶表达载体

以PHY300PLK质粒作为模板，使用引物(Amp-PHY-GJ-F、Amp-PHY-GJ-R)PCR扩增载体DNA序列，从而获得待克隆的载体骨架序列。

以栖热菌Thermus oshimai基因组DNA(NC_019386.1)作为模板，使用引物(togI-F、togI-R)PCR扩增TogI完整基因核苷酸序列(SEQ ID NO.1所示)，从而获得葡萄糖异构酶完整序列，利用重组克隆试剂盒将表达框和载体骨架进行同源重组，并转化到大肠杆菌DH5α中，将菌体涂布在含有Tet抗性的培养平板上进行筛选，置于37℃培养箱中培养；对转化子进行菌落PCR验证，所用引物为Amp-pHY-F与Amp-pHY-R，如目的大小正确，则可进行下一步测序，载体核苷酸序列测定由武汉擎科生物技术有限公司完成；分析测序结果，如序列与设计相符，得到游离表达载体DH5α/Amp-pHY-P₄₃-TogI。使用的引物如下：

Amp-pHY-F：tattgaaaaaggaagagt

Amp-pHY-R：tatgagtaaacttggtctgacag

AMP-PHY-GJ-F：CCTTTTAGGGGTTCGGGGATGAAAGAGCAGAGAGGACGGATTTCC

AMP-PHY-GJ-R：CGGTTTAGGTTCGTACATTGATCCTTCCTCCTTTAG

togI-F：ATGTACGAACCTAAACCG

togI-R：TCATCCCCGAACCCCTAAAAGG

以载体DH5α/pHY-P₄₃-TogI为模板，使用引物(PHY-GJ-F、PHY-GJ-R)PCR扩增载体DNA序列，从而获得待克隆的载体骨架序列。以Dorea sp.基因组DNA(NZ_ASTD01000000)作为模板，使用引物(DAEase-F、DAEase-R)PCR扩增DAEase完整基因核苷酸序列(SEQ ID NO.2所示)，从而获得D-阿洛酮糖3-差向异构酶完整序列，利用重组克隆试剂盒将表达框和载体骨架进行同源重组，并转化到大肠杆菌DH5α中，将菌体涂布在含有Tet抗性的培养平板上进行筛选，置于37℃培养箱中培养；对转化子进行菌落PCR验证，所用引物为pHY-F与pHY-R，如目的大小正确，则可进行下一步测序，载体核苷酸序列测定由武汉擎科生物技术有限公司完成；分析测序结果，如序列与设计相符，得到双酶游离表达载体DH5α/pHY-P₄₃-TogI-P_43-DAEase。使用的引物如下：

pHY-F：gtttattatccatacccttac

pHY-R：cagatttcgtgatgcttgtc

PHY-GJ-F：AAGAGCAGAGAGGACGGATTTCCTG

PHY-GJ-R：TATATATTCCTCCTTTCT

DAEase-F：AGAAAGGAGGAATATATAATGAAACACGGAATTTAC

DAEase-R：TCAGGAAATCCGTCCTCTCTGCTCTTTTATTTCCAATCCAACAT

实施例2：

构建双酶突变表达载体

以载体pHY-P₄₃-TogI-P₄₃-DAEase为模板，使用设计的突变引物，扩增出突变体的骨架。设计的突变引物序列如下：

K182P-TogI-F:GCCCTCGAGCCACCGCCGAACGAACCAAGGGGGGATATC

K182P-TogI-R:GGTTCGTTCGGCGGTGGCTCGAGGGCAAAACGATAGCCG

脂糖凝胶电泳分离出目的骨架DNA，使用OMEGA的Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化，随后将少量突变体骨架DNA加入到大肠杆菌DH5α感受态中，利用菌株自身修复系统，完成突变载体的环化。将菌体涂布在含有Tet抗性的培养平板上进行筛选，置于37℃培养箱中培养；对转化子进行菌落PCR验证，所用引物为Amp-pHY-F与Amp-pHY-R，如目的大小正确，则可进行下一步测序，载体核苷酸序列测定由北京擎科生物技术有限公司武汉分公司完成；分析测序结果，如序列与设计相符，即突变载体DH5α/pHY-P₄₃-TogI¹⁸²-P₄₃-DAEase构建成功，该表达载体表达葡萄糖异构酶突变体(SEQ ID NO.5所示)。

以载体DH5α/pHY-P₄₃-TogI¹⁸²-P₄₃-DAEase为模板，使用设计的突变引物，扩增出突变体的骨架。设计的突变引物序列如下：

A38E-DAEase-F:GGAAATCGGGGCTGAACCATTGCCGGAGTATAGC

A38E-DAEase-R:CCGGCAATGGTTCAGCCCCGATTTCCAGAAG

琼脂糖凝胶电泳分离出目的骨架DNA，使用OMEGA的Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化，随后将少量突变体骨架DNA加入到大肠杆菌DH5α感受态中，利用菌株自身修复系统，完成突变载体的环化。将菌体涂布在含有Tet抗性的培养平板上进行筛选，置于37℃培养箱中培养；对转化子进行菌落PCR验证，所用引物为pHY-F与pHY-R，如目的大小正确，则可进行下一步测序，载体核苷酸序列测定由北京擎科生物技术有限公司武汉分公司完成；分析测序结果，如序列与设计相符，即D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变载体DH5α/pHY-P₄₃-TogI¹⁸²-P₄₃-DAEase³⁸构建成功，该双酶突变表达载体表达葡萄糖异构酶突变体(SEQ IDNO.5所示)和D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体(SEQ ID NO.6所示)。

实施例3：

酶表达工程菌和酶突变表达工程菌的构建

将测序验证正确的载体pHY-P₄₃-TogI¹⁸²-P₄₃-DAEase³⁸和原始表达载体pHY-P₄₃-TogI-P₄₃-DAEase电转化到地衣芽胞杆菌BL10(CN104630124A)。接种地衣芽胞杆菌BL10于5mLLB培养基，37℃,230r/min过夜培养。转接至50mL地衣芽胞杆菌的电转化生长培养基中,230r/min，37℃3h(OD为0.8～0.9)，将摇瓶置冰浴10min，7500r/min离心7min后收集菌体,用地衣芽胞杆菌的电转化洗涤培养基洗涤菌体3次(30mL洗涤液/次)，最后重悬于1mL洗涤培养基中,并迅速分装于1.5mL离心管中，每管100uL，-80℃保存，即为感受态细胞。取一管感受态细胞加入5uL质粒DNA(50ng/uL),将细胞转至预冷的电转化杯(0.2cm)中，冰浴1～1.5min，用电脉冲转化仪2.4kV电击1次，电击完后迅速加800u L地衣芽胞杆菌的电转化恢复培养基，37℃，再在摇床上110r/min恢复培养3h,涂含有20u g/mL的四环素抗性平板，37℃培养过夜,筛选转化子。

挑取转化子单菌落在含抗生素的平板上划线，过夜培养，挑适量的菌落于装有30uL的1.5mLEP管中，混匀，沸水浴中20min。取出后在离心机中10000r/min离心30sec，吸取上清作为菌落PCR的模板。PCR和测序验证阳性克隆,即得到双酶表达工程菌BL10/pHY-P₄₃-TogI-P₄₃-DAEase(该菌株含有SEQ ID NO.1和2所示序列)、双酶突变工程菌BL10/pHY-P₄₃-TogI¹⁸²-P₄₃-DAEase³⁸(该菌株含有SEQ ID NO.3和4所示序列，编码SEQ ID NO.5和6所示蛋白)。

实施例4：

双酶表达工程菌和双酶突变工程菌摇瓶发酵

1、菌株活化

将上述构建的双酶表达工程菌BL10/pHY-P₄₃-TogI-P₄₃-DAEase与双酶突变工程菌BL10/pHY-P₄₃-TogI¹⁸²-P₄₃-DAEase³⁸，划线于四环素抗性平板上，37℃培养12-14h。挑取单菌落接种于5mL(有四环素抗性的)LB培养基中，37℃、220r/min，摇床培养12-14h。随后将培养好的菌液转接到20mL(有四环素抗性的)种子液培养基中，37℃、220r/min，摇床培养12-14h。

种子培养基为LB培养基：10g/L蛋白胨；5g/L酵母浸出粉；10g/L氯化钠；pH7.0-7.2。

种子培养：250mL三角瓶，装液量20mL，培养温度37℃，摇床转速220r/min，培养到OD₆₀₀为1.0。

2、液体发酵培养

液体发酵培养基:酵母粉24g/L、蛋白胨12g/L、甘油5g/L、K₂HPO₄·3H₂O 16.43g/L、KH₂PO₄2.31g/L

液体发酵培养条件：250mL三角瓶,装液量50mL，发酵温度37℃，摇床转速230r/min，发酵时间24h，离心取湿细胞，用于以下实施例。

实施例5：

全细胞催化葡萄糖生成D-阿洛酮糖

以500g/L葡萄糖为底物，40g/L湿细胞，磷酸缓冲液pH 6.5进行全细胞反应8小时，产物离心过膜，稀释到一定浓度后使用高效液相色谱检测。检测条件：Waters 2695型HPLC，Waters Sugar-PakⅠ糖柱，Waters示差折光检测器，柱温30℃，流动相75％乙腈，流速0.8mL/min。进行测定D-阿洛酮糖，可以看到双酶表达对照菌株BL10/pHY-P₄₃-TogI-P₄₃-DAEas，通过液相计算葡萄糖转化生成D-阿洛酮糖的转化率达25％，而双酶突变工程菌BL10/pHY-P₄₃-TogI¹⁸²-P₄₃-DAEase³⁸的D-阿洛酮糖生成量为185g/L，转化率可达35％，相比对照菌株提高了10个百分点(具体数据见图1)，为目前从葡萄糖直接转化生产D-阿洛酮糖的最高水平，说明该方案在提高D-阿洛酮糖转化生成效率方面具有显著应用前景。

Claims (4)

1.一株合成D-阿洛酮糖的酶突变表达工程菌，所述菌株为表达SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示的蛋白的重组地衣芽胞杆菌。

2.根据权利要求1所述的工程菌，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌BL10。

3.权利要求1所述的工程菌在合成D-阿洛酮糖中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其应用过程是将葡萄糖作为底物利用权利要求1所述重组地衣芽胞杆菌进行催化，即可制备得到D-阿洛酮糖。

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