CN113801832B

CN113801832B - 一株高产阿洛酮糖差向异构酶的枯草芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN113801832B
Application number: CN202110337567.8A
Authority: CN
Inventors: 齐建
Original assignee: QINGDAO VLAND BIOTECH Inc; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: QINGDAO VLAND BIOTECH Inc; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2020-06-12
Filing date: 2021-03-30
Publication date: 2023-05-26
Anticipated expiration: 2041-03-30
Also published as: CN113801832A

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一株高产阿洛酮糖差向异构酶的枯草芽孢杆菌突变菌株及其应用。所述枯草芽孢杆菌突变菌株是通过紫外诱变方法筛选获得的，阿洛酮糖差向异构酶产量得到显著提高，保藏编号为CGMCC No.19500。所述菌株可广泛应用于阿洛酮糖差向异构酶的发酵生产，有利于降低该酶的生产成本，应用前景广阔。

Description

一株高产阿洛酮糖差向异构酶的枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高产阿洛酮糖差向异构酶的枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术

D-阿洛酮糖是D-果糖C-3位上的差向异构体属于稀少糖的一种，是一种新型的功能性甜味剂。D-阿洛酮糖的CAS号为551-68-8。美国食品药品监督管理局（U.S. Food andDrug Administration，FDA）于2014年正式批准D-阿洛酮糖为一般公认安全（GenerallyRecognized as Safe，GRAS），允许其应用于食品、膳食补充剂以及医药制剂中。

D-阿洛酮糖可以通过化学合成和生物合成两种途径获得。但化学合成存在着很多弊端，例如复杂的纯化步骤，化学废料和无价值副产物的生成。稀少糖D-阿洛酮糖在自然界中存在的含量极少，而在化学法合成的过程中存在诸多问题，因此具有高度的专一性（反应专一性和底物专一性）的生物催化法合成D-阿洛酮糖引起了广泛的关注。根据Izumoring稀有糖转化策略，酮糖3-差向异构酶在D-阿洛酮糖生物转化中起着不可替代的作用——催化D-果糖和D-阿洛酮糖在C-3位置发生可逆的差向异构化反应。目前，对于酮糖3-差向异构酶的研究已经较为广泛，包括微生物筛选鉴定、酶的分离纯化、异源重组表达、酶固定化、食品级表达、分子改造和晶体结构解析。

截至目前为止，已有文献报道确认的酮糖3-差向异构酶仅有11种。根据最适底物的不同，这11种酮糖3-差向异构酶可以分为D-塔格糖3-差向异构酶（D-tagatose3-epimerase，DTEase），D-阿洛酮糖3-差向异构酶（D-psicose 3-epimerase，DPEase）和L-核酮糖3-差向异构酶（L-Ribulose 3-epimerase，LREase）。2006年，韩国Deok-Kun Oh教授团队从微生物Agrobacterium tumefaciens ATCC33970中发现的酮糖3-差向异构酶，可以有效地催化D-果糖和D-阿洛酮糖的相互转化，因最适底物为D-阿洛酮糖，命名为D-阿洛酮糖-3-差向异构酶（以下简称为阿洛酮糖差向异构酶）。2009年张文立等年发现了最适底物为D-果糖的D-塔格糖3-差向异构酶，微生物来源为Rhodobacter sphaeroides SK011；此后，又陆续报道了其他6种D-阿洛酮糖3-差向异构酶，最适底物均为D-阿洛酮糖，微生物来源分别为：Clostridium cellulolyticum H10、Clostridium scindens ATCC 35704、Clostridiumbolteae ATCC BAA-613、Clostridium sp. BNL1100、Desmospora sp. 8437、Treponemaprimitia ZAS-1。2012年，孙媛霞教授团队报道了来源于Ruminococcus sp. 5_1_39BFAA的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，最适底物为D-阿洛酮糖。

目前，不同微生物来源的D-阿洛酮糖3-差向异构酶已在大肠杆菌中表达。大肠杆菌本身不属于GRAS菌株，不能用于食品工业。所以选择食品级安全的菌株来表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶具有重要意义，也是本领域的研究重点。

发明内容

本发明的目的是提供一株高产D-阿洛酮糖-3-差向异构酶（以下简称为阿洛酮糖差向异构酶）的枯草芽孢杆菌菌株，并提供了其在该酶生产中的应用。申请人首先构建得到重组表达来源于解纤维梭菌（Clostridium cellulolyticum）的阿洛酮糖差向异构酶的枯草芽孢杆菌菌株，然后进一步对其进行紫外诱变，筛选获得阿洛酮糖差向异构酶产量显著提高的突变菌株，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其广泛应用。

本发明一方面提供了一种枯草芽孢杆菌工程菌株，其携带有表达阿洛酮糖差向异构酶的重组质粒。

所述阿洛酮糖差向异构酶的基因序列为SEQ ID NO:1，其编码的氨基酸序列为SEQID NO:2。

本发明一方面提供了一种突变菌株，是以上述枯草芽孢杆菌工程菌株为出发菌，通过紫外诱变方法筛选获得的。

所述突变菌株为枯草芽孢杆菌QJDPE（Bacillus subtilis QJDPE），已于2020年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 19500。

本发明一方面提供了所述枯草芽孢杆菌在生产阿洛酮糖差向异构酶中的应用。

本发明还提供了一种生产阿洛酮糖差向异构酶的方法，是以所述枯草芽孢杆菌为发酵菌株。

本发明还提供了一种阿洛酮糖差向异构酶，是由所述枯草芽孢杆菌发酵获得的。

有益效果

本发明首先将阿洛酮糖差向异构酶基因在枯草芽孢杆菌宿主中表达，构建得到重组表达该酶的工程菌株枯草芽孢杆菌DPE。该菌株摇瓶发酵和20L罐发酵上清液中阿洛酮糖差向异构酶酶活分别达到98.9 U/mL和145.8 U/mL。

为了提高阿洛酮糖差向异构酶的产量，申请人以枯草芽孢杆菌DPE为出发菌株，进一步通过紫外诱变的方法筛选获得一株突变菌枯草芽孢杆菌QJDPE。该突变菌株摇瓶发酵上清液中阿洛酮糖差向异构酶酶活高达129.2U/ml，比出发菌提高的30.6%；其20 L罐发酵粗酶液中阿洛酮糖差向异构酶酶活高达203.3U/ml，比出发菌提高了39.3%，取得了意料不到的技术效果。

使用本发明提供的突变菌株枯草芽孢杆菌QJDPE发酵上清液处理果葡糖浆底物，D-阿洛酮糖的转化效率可以达到31.1%。从而说明，本发明提供的枯草芽孢杆菌突变菌株实现了D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的胞外高效分泌表达，不仅大大简化了该酶的生产过程，而且该突变菌株所产D-阿洛酮糖-3-差向异构酶可广泛应用于D-阿洛酮糖的生产，转化效率高，具有很高的工业化应用价值。

附图说明

图1为pDG1662质粒图谱；

图2为pUC19-cat质粒图谱；

图3为pPaprE-DPE质粒图谱；

图4为枯草芽孢杆菌宿主和重组菌株枯草芽孢杆菌DPE发酵上清液及胞内粗酶液SDS-PAGE电泳分析图；

图5为枯草芽孢杆菌DPE 20L罐发酵上清液及胞内粗酶液SDS-PAGE电泳分析图。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，实现本发明的方法不应限于本发明实施例所记载的具体方法步骤。

GM I配制方法为：1×最低盐溶液96 mL，20%葡萄糖2.5 mL，5%水解酪蛋白0.4 mL，10%酵母粉汁1 mL；其中1×最低盐溶液的配制方法为：K₂HPO₄ 14 g/L，KH₂PO₄ 6 g/L，(NH₄)₂SO₄ 2 g/L，柠檬酸三钠1 g/L，MgSO₄•7H₂O 0.2 g/L，在蒸馏水中依次溶解；

GM II配制方法为：1×最低盐溶液97 mL，20%葡萄糖2.5 mL，5%水解酪蛋白0.08mL，10%酵母粉汁0.04 mL，1 M MgCl₂ 0.25 mL，1 M CaCl₂ 0.05 mL；

LB平板：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，琼脂粉1.5%；

种子培养基：酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，K₂HPO₄ 1.8%，氯霉素5 μg/mL；

发酵培养基：20 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母粉、10 g/L氯化钠、50 g/L麦芽糖、0.0075 g/L硫酸锰。

实施例1 阿洛酮糖差向异构酶整合表达质粒pPaprE-DPE构建

申请人将合成的来源于解纤维梭菌（Clostridium cellulolyticum）的阿洛酮糖差向异构酶基因的DNA序列SEQ ID NO：1（其编码氨基酸序列为SEQ ID NO：2）克隆到pUC57质粒中，命名为pUC57-DPE。

挑取新活化的枯草芽孢杆菌168（Bacillus subtilis 168）单菌落接种于5mL LB液体培养基中，37℃摇床200 rpm振荡培养过夜，按照TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒的说明提取枯草芽孢杆菌168的基因组。该基因组中含aprE启动子（PaprE）的DNA序列（SEQ IDNO：3）。

设计克隆引物：

cat-F：5'-ACATGCATGCCTGTAATATAAAAACCTTCTTC-3'；

cat-Re：5'-ACGCGTCGACTTTATTCTTCAACTAAAGCAC-3'；

PaprE-F：5'-ACGCGTCGACTGACACAGAAGAAAACGTTGG-3'；

PaprE-Re：5'-CATAATAGATGCCATGTTTCATTCTTTACCCTCTCCTTTTAAA-3'；

DPE-F：5'-TTTAAAAGGAGAGGGTAAAGAATGAAACATGGCATCTATTATG-3'；

DPE-Re：5'-CGCGGATCCCAAACAACAGATAAAACGAAAGG-3'。

以pDG1662质粒（图谱如图1所示）为模板，采用cat-F、cat-Re引物，用NEB公司的Phusion保真酶进行PCR扩增。OMEGA凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，命名为cat，大小约0.93 kb。

将pUC19质粒用SphI及SalI内切酶进行双酶切，OMEGA凝胶回收试剂盒回收酶切产物pUC19/SphI/SalI，大小约2.7 kb。将cat片段用SphI及SalI内切酶进行双酶切，OMEGA凝胶回收试剂盒回收酶切产物cat/SphI/SalI，大小约0.93 kb。用T4 DNA Ligase对pUC19/SphI/SalI片段及cat/SphI/SalI片段进行连接反应，连接产物转化E. coli DH5α感受态细胞，涂布含100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板，对转化子进行菌落PCR验证，对插入cat基因的转化子提取质粒，并将质粒送往苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，测序正确的质粒命名为pUC19-cat（图谱如图2所示）。

以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，采用PaprE-F、PaprE-Re引物，用NEB公司的Phusion保真酶进行PCR扩增。OMEGA凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，命名为PaprE，大小约0.65 kb。

以pUC57-DPE为模板，采用DPE-F、DPE-Re引物，用NEB公司的Phusion保真酶进行PCR扩增。OMEGA凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，命名为DPE，大小约1 kb。

对PaprE及DPE片段进行融合PCR，融合PCR过程如下：第一轮，PCR反应体系中各加入200 ng的PaprE、DPE片段，不加引物，用NEB公司的Phusion保真酶PCR扩增。第二轮，取10μl第一轮PCR产物作为模板，加入PaprE-F、DPE-Re引物，用NEB公司的Phusion保真酶PCR扩增。OMEGA凝胶回收试剂盒回收约1.64 kb的PCR产物，命名为PaprE-DPE。

将pUC19-cat质粒用SalI及BamHI内切酶进行双酶切，OMEGA凝胶回收试剂盒回收酶切产物pUC19-cat/SalI/BamHI，大小约3.6 kb。将PaprE-DPE片段用SalI及BamHI内切酶进行双酶切，OMEGA凝胶回收试剂盒回收酶切产物PaprE-DPE/SalI/BamHI，大小约1.64 kb。用T4 DNA Ligase对pUC19-cat/SalI/BamHI片段及PaprE-DPE/SalI/BamHI片段进行连接反应，连接产物转化E. coli DH5α感受态细胞，涂布含100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板，对转化子进行菌落PCR验证，对插入PaprE-DPE片段的转化子提取质粒，并将质粒送往苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，测序正确的质粒命名为pPaprE-DPE，其质粒图谱如图3所示。阿洛酮糖差向异构酶整合表达质粒构建完成。

实施例2 重组表达阿洛酮糖差向异构酶的基因工程菌株的构建及发酵验证

2.1 宿主菌感受态细胞制备

（1）将枯草芽孢杆菌1A751（Bacillus subtilis 1A751 (apr ^-, his ^-, npr ^-, eglSΔ102, bglT/bglSΔEV)）（Wolf M, et al. Microbiology. 1995 141:281-90）宿主划线LB平板，37℃培养过夜。

（2）第二天挑取1个单菌落接种到5 mL GMⅠ溶液，在30℃、125 rpm振荡培养过夜。

（3）第三天取1 mL过夜培养液转接到9 mL GMⅠ中，37℃、250 rpm培养3.5 h。

（4）再取5 mL上一步骤的培养液转接到45 mL GMⅡ中，37℃、125 rpm培养90 min后，5000 g、10 min离心收集菌体。用5 mL原培养液上清液轻轻悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞。

2.2 阿洛酮糖差向异构酶整合菌株构建

（1）在0.2 mL枯草芽孢杆菌1A751宿主感受态细胞中加入约1 μg pPaprE-DPE重组质粒，37℃、200 rpm振荡培养1 h后涂布含5 μg/mL氯霉素的LB平板，37℃培养过夜；

（2）次日选取20个单菌落在含5 μg/mL氯霉素的LB平板上划线纯化，然后每个平板选取一个单菌落接种于20 mL种子培养基中，37℃、220 rpm振荡培养8~9 h。然后分别取2.5mL种子培养物接种到50 mL发酵培养基中，34℃、220rpm振荡培养48 h；4000 rpm离心10min取上清液；用pH 7.0的PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎细胞，制备胞内粗酶液。将发酵上清液及胞内粗酶液进行SDS-PAGE电泳，检测阿洛酮糖差向异构酶表达情况。选取的20株重组菌均成功表达了阿洛酮糖差向异构酶，且胞内及胞外均有表达，目的条带大小约33 kDa。其中一株重组菌阿洛酮糖差向异构酶胞外分泌表达量显著高于另外19株重组菌，该菌株命名为枯草芽孢杆菌DPE（Bacillus subtilis DPE）。该菌株发酵上清液和胞内粗酶液SDS-PAGE电泳检测分析如图4所示，箭头所指处即为该菌重组表达的阿洛酮糖差向异构酶。该菌株摇瓶发酵上清液中阿洛酮糖差向异构酶酶活达到98.9U/ml。

阿洛酮糖差向异构酶酶活检测方法：

取4ml的5% （质量体积比）D-果糖作为底物，加入1ml稀释一定倍数的发酵液，恒温水浴45℃下反应30min，于沸水中煮沸10min终止反应。用10000r/min的转速进行离心，离心后取上清液，用高效液相色谱仪检测D-阿洛酮糖含量，以每毫升发酵液每分钟内产生1μmol的D-阿洛酮糖定义为一个酶活单位。

2.3 阿洛酮糖差向异构酶菌株20L罐发酵验证

将枯草芽孢杆菌DPE接种于含500 mL种子培养基中，37℃、220 rpm振荡培养约12h；

将种子液全部转入20 L发酵罐（发酵罐培养基成分：胰蛋白胨4%、酵母粉2%、麦芽糊精5%、Na₂HPO₄ 0.78%、KH₂PO₄ 0.05%、氯化锰0.03%，发酵罐消后体积12 L）,温度控制37℃，发酵初始pH 7.2，发酵过程中氨水控制pH不低于7.0；风量1~1.5 vvm，转速300~700rpm，控制发酵过程中DO不低于20%；发酵20~24 h，DO、pH均回升后停培。

参照2.2所述方法制备发酵上清液及胞内粗酶液，分别进行SDS-PAGE电泳，检测阿洛酮糖差向异构酶表达情况。结果如图5所示，枯草芽孢杆菌DPE菌株20L罐发酵胞外上清中有显著的阿洛酮糖差向异构酶目的条带的表达。此外，酶活检测结果显示，该菌株20L罐发酵上清中阿洛酮糖差向异构酶酶活高达145.8U/ml。从而说明，本发明构建的重组工程菌株枯草芽孢杆菌DPE能实现阿洛酮糖差向异构酶在枯草芽孢杆菌中高效的胞外分泌表达。这样后处理过程中就不需要细胞破壁等操作，大大节省了生产成本。

实施例3 阿洛酮糖差向异构酶高产菌株的诱变筛选

紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。

申请人以实施例2构建得到的重组菌株枯草芽孢杆菌DPE为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高阿洛酮糖差向异构酶的胞外分泌表达量。

3.1菌悬液制备

将出发菌枯草芽孢杆菌DPE在LB斜面上划线接种，37℃培养24 h；加入5 mL 0.85%的无菌生理盐水，将斜面上的菌体全部冲洗下来，转入无菌的含有玻璃珠的试管中，涡旋振荡10 min，完全打成单细胞菌体；将菌悬液全部转入15 mL离心管，6000 rpm离心3 min收集菌体，取上清，用10 mL生理盐水悬浮菌体；洗涤细胞两次，最后调整细胞浓度至10⁸个/mL。

3.2 紫外诱变处理及诱变剂量确定

打开9 W紫外灯开关，预热约30 min；取直径9 cm无菌平皿，加入上述细胞浓度为10⁸个/mL的菌悬液10 mL，加入一根无菌磁力搅拌转子，打开磁力搅拌器，打开皿盖，在垂直距离为15 cm处，分别搅拌照射0.5 min、1 min、1.5 min、2 min、2.5 min、3 min；盖上平皿盖，关闭紫外灯，黑暗中孵育30 min。

将照射后的菌悬液用0.85%生理盐水梯度稀释至10^-1~10^-6；取10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度的菌悬液各100 μL，涂布LB平板，每个稀释度涂布三个平板；以同样的操作，取未经紫外线照射处理的菌液稀释涂平板作对照。将上述涂布均匀的平板，用黑布或报纸包好后，置于37℃过夜培养。

统计不同照射时间下每个稀释度下平板上长出的单菌落数，若在某个稀释度下长出的单菌落数在30~300个之间，则认为改稀释度合适。将该稀释度下三个平板上长出的单菌落数求平均值，按下列公式计算菌悬液浓度：

菌悬液浓度（CFU/mL）=某个稀释度下的菌落平均数×稀释倍数×10

按下列公式计算某个紫外处理剂量下的致死率：

致死率（%）=（1－某剂量处理后的菌悬液浓度/处理前菌悬液浓度）×100%

经计算，不同紫外诱变剂量下枯草芽孢杆菌DPE的致死率如表1所示。

表

枯草芽孢杆菌DPE紫外诱变致死率

时间/min	0.5	1	1.5	2	2.5	3
							致死率/%	84.1	92.2	96.6	98.1	99.5	99.9

从表1可以看出，菌悬液经紫外照射1.5 min后致死率达到95%以上，因此确定最终诱变时间为1.5 min。

3.3 摇瓶筛选

从紫外诱变1.5 min的LB平板上挑取100个菌落，同时以出发菌株枯草芽孢杆菌DPE作为对照，分别接种于50 mL摇瓶发酵培养基中，34℃，220 rpm发酵培养48 h后，取发酵液上清液及菌悬液超声破壁粗酶液进行SDS-PAGE，比较胞外及胞内阿洛酮糖差向异构酶表达量，选择摇瓶发酵阿洛酮糖差向异构酶胞外分泌表达量较出发菌株提高最显著的2~3个突变株进行第二轮紫外诱变筛选。

申请人按照上述方法继续进行了5轮紫外诱变筛选，最终获得1株阿洛酮糖差向异构酶胞外分泌表达量显著高于出发菌的突变菌株，命名为枯草芽孢杆菌QJDPE（Bacillus subtilis QJDPE）。采用实施例2所述方法分别进行摇瓶发酵和20L罐发酵，该突变菌株发酵上清液中阿洛酮糖差向异构酶酶活分别达到129.2U/ml和203.3U/ml，比出发菌分别提高了30.6%和39.3%，取得了意料不到的技术效果。

申请人已于2020年3月20日将所述突变菌株枯草芽孢杆菌QJDPE（Bacillus subtilis QJDPE）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 19500。

实施例4 阿洛酮糖差向异构酶在D-阿洛酮糖生产中的应用

在pH 8.0的100 mmol/L的Tris-HCl缓冲液中，以果糖含量为300 g/L的果葡糖浆为底物，加入枯草芽孢杆菌QJDPE发酵上清液（每1 g果糖添加0.05 mL发酵上清液），在60℃下100 rpm水浴振荡反应3 h。煮沸10 min以终止酶反应，然后用HPLC检测D-阿洛酮糖的生成量。

结果表明，使用枯草芽孢杆菌QJDPE发酵上清液处理果葡糖浆底物，D-阿洛酮糖的转化效率可以达到31.1%。从而说明，本发明提供的枯草芽孢杆菌突变菌株实现了D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的胞外高效分泌表达，不仅大大简化了该酶的生产过程，而且该突变菌株所产D-阿洛酮糖-3-差向异构酶可广泛应用于D-阿洛酮糖的生产，转化效率高，具有很高的工业化应用价值。

序列表

<110> 青岛蔚蓝生物股份有限公司

青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一株高产阿洛酮糖差向异构酶的枯草芽孢杆菌及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 882

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaaacatg gcatctatta tgcgtattgg gaacaagaat gggaagcgga ttataagtat 60

tatatcgaaa aagtcgcgaa actgggcttt gatatacttg aaattgcagc gagcccttta 120

ccgttttatt cagacatcca aatcaacgag cttaaagcgt gcgcacatgg caatggcatt 180

acactgacag tgggacacgg acctagcgca gaacaaaatc tgtcatcacc tgatccggat 240

atacgcaaaa atgcgaaagc attttatact gaccttctta aacgcctgta caagctggat 300

gtccatctga tcggaggcgc gctgtatagc tattggccga tcgattatac gaaaacgatt 360

gataaaaaag gcgattggga acgctctgtg gaatcagttc gtgaagttgc gaaagtcgcg 420

gaagcgtgcg gagttgattt ttgccttgaa gtgcttaatc gctttgaaaa ttatctgatc 480

aatacagcac aagaaggcgt cgattttgtc aaacaagtcg atcataataa cgtcaaagtc 540

atgctggata cgtttcacat gaatatcgaa gaagatagca ttgggggtgc aattcgtacg 600

gcaggcagct accttggaca tcttcataca ggcgaatgca atcgtaaagt tccgggacgg 660

ggccgcatcc cgtgggttga aatcggcgaa gcacttgcag atattggcta taatggctca 720

gtggttatgg aaccgtttgt tcgtatggga ggcacggtcg gctctaatat caaagtctgg 780

agagatattt ctaatggcgc ggatgaaaaa atgttagata gagaagcaca agcagcgtta 840

gattttagcc ggtatgtgtt agaatgccat aaacattctt aa 882

<210> 2

<211> 293

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ala Tyr Trp Glu Gln Glu Trp Glu Ala

1 5 10 15

Asp Tyr Lys Tyr Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile

20 25 30

Leu Glu Ile Ala Ala Ser Pro Leu Pro Phe Tyr Ser Asp Ile Gln Ile

35 40 45

Asn Glu Leu Lys Ala Cys Ala His Gly Asn Gly Ile Thr Leu Thr Val

50 55 60

Gly His Gly Pro Ser Ala Glu Gln Asn Leu Ser Ser Pro Asp Pro Asp

65 70 75 80

Ile Arg Lys Asn Ala Lys Ala Phe Tyr Thr Asp Leu Leu Lys Arg Leu

85 90 95

Tyr Lys Leu Asp Val His Leu Ile Gly Gly Ala Leu Tyr Ser Tyr Trp

100 105 110

Pro Ile Asp Tyr Thr Lys Thr Ile Asp Lys Lys Gly Asp Trp Glu Arg

115 120 125

Ser Val Glu Ser Val Arg Glu Val Ala Lys Val Ala Glu Ala Cys Gly

130 135 140

Val Asp Phe Cys Leu Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn Tyr Leu Ile

145 150 155 160

Asn Thr Ala Gln Glu Gly Val Asp Phe Val Lys Gln Val Asp His Asn

165 170 175

Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp

180 185 190

Ser Ile Gly Gly Ala Ile Arg Thr Ala Gly Ser Tyr Leu Gly His Leu

195 200 205

His Thr Gly Glu Cys Asn Arg Lys Val Pro Gly Arg Gly Arg Ile Pro

210 215 220

Trp Val Glu Ile Gly Glu Ala Leu Ala Asp Ile Gly Tyr Asn Gly Ser

225 230 235 240

Val Val Met Glu Pro Phe Val Arg Met Gly Gly Thr Val Gly Ser Asn

245 250 255

Ile Lys Val Trp Arg Asp Ile Ser Asn Gly Ala Asp Glu Lys Met Leu

260 265 270

Asp Arg Glu Ala Gln Ala Ala Leu Asp Phe Ser Arg Tyr Val Leu Glu

275 280 285

Cys His Lys His Ser

290

<210> 3

<211> 650

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgacacagaa gaaaacgttg gatagagctg ggtaaagcct atgaattctc cattttcttc 60

tgctatcaaa ataacagact cgtgattttc caaacgagct ttcaaaaaag cctctgcccc 120

ttgcaaatcg gatgcctgtc tataaaattc ccgatattgg ttaaacagcg gcgcaatggc 180

ggccgcatct gatgtctttg cttggcgaat gttcatctta tttcttcctc cctctcaata 240

attttttcat tctatccctt ttctgtaaag tttatttttc agaatacttt tatcatcatg 300

ctttgaaaaa atatcacgat aatatccatt gttctcacgg aagcacacgc aggtcatttg 360

aacgaatttt ttcgacagga atttgccggg actcaggagc atttaaccta aaaaagcatg 420

acatttcagc ataatgaaca tttactcatg tctattttcg ttcttttctg tatgaaaata 480

gttatttcga gtctctacgg aaatagcgag agatgatata cctaaataga gataaaatca 540

tctcaaaaaa atgggtctac taaaatatta ttccatctat tacaataaat tcacagaata 600

gtcttttaag taagtctact ctgaattttt ttaaaaggag agggtaaaga 650

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌突变菌株，其特征在于，所述突变菌株的保藏编号为CGMCC No.19500。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌突变菌株在生产阿洛酮糖差向异构酶中的应用。

3.一种生产阿洛酮糖差向异构酶的方法，是以权利要求1所述的枯草芽孢杆菌突变菌株为发酵菌株。