CN114262702A

CN114262702A - 麦角硫因合成基因在谷氨酸棒杆菌中重建麦角硫因代谢途径中的应用及其方法

Info

Publication number: CN114262702A
Application number: CN202111674170.4A
Authority: CN
Inventors: 邹祥; 柏颖娜
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2041-12-31
Also published as: CN114262702B

Abstract

本发明公开了麦角硫因合成基因在谷氨酸棒杆菌中重建麦角硫因代谢途径中的应用及其方法，麦角硫因合成基因包括Egt1和Egt2，对Egt1和Egt2基因进行密码子优化，优化后Egt1的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，Egt2的核酸序列如SEQ ID NO.2所示；然后以高产组氨酸的谷氨酸棒杆菌为出发菌株，将Egt1和Egt2转入谷氨酸棒杆菌中，实现以葡萄糖为碳源的从头合成麦角硫因。

Description

麦角硫因合成基因在谷氨酸棒杆菌中重建麦角硫因代谢途径中的应用及其方法

技术领域

本发明涉及生物发酵领域，具体涉及麦角硫因合成基因在谷氨酸棒杆菌中重建麦角硫因代谢途径中的应用，还涉及利用所述适用于谷氨酸棒杆菌表达的粗糙脉孢菌麦角硫因合成基因在谷氨酸棒杆菌中生产麦角硫因的方法。

背景技术

麦角硫因(Ergothioneine,EGT)是一种天然的稀有氨基酸，主要在细菌和大多数真菌等微生物体内合成，植物和动物可分别通过土壤和食物获取麦角硫因，其具有超强的抗氧化能力并被称为细胞保护剂，因其特殊的生物学功能和药理作用，于2017年获得了欧盟及欧洲食品安全局的食品安全性认证，在食品、化妆品、保健品及医药行业极具应用前景。

现存的麦角硫因制备方法主要有化学合成法、提取法以及微生物发酵合成法，但麦角硫因的前体物质2-巯基咪唑较难制备而提取法中直接以生物为原料提取成本高，产量低，且原料不足。利用微生物发酵合成法生产麦角硫因成为目前研究的热点，由于天然的麦角硫因生产菌株产量低，已有的专利报道中通过基因工程改造宿主，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母等，表达外源麦角硫因合成基因簇方法合成麦角硫因，但这些宿主通常没有高效合成麦角硫因的前体组氨酸、甲硫氨酸等前体的能力，需要外加这些前体，同时酶转化效率低，造成生产成本高，工业化困难。因此急需要一种新的麦角硫因生产工艺。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供麦角硫因合成基因在谷氨酸棒杆菌中重建麦角硫因代谢途径中的应用；本发明的目的之二在于提供所述适用于谷氨酸棒杆菌表达的粗糙脉孢菌麦角硫因合成基因；本发明的目的之三在于提供含有所述适用于谷氨酸棒杆菌表达的粗糙脉孢菌麦角硫因合成基因的重组表达载体；本发明的目的之四在于提供含有所述适用于谷氨酸棒杆菌表达的粗糙脉孢菌麦角硫因合成基因的谷氨酸棒杆菌工程菌；本发明的目的之五在于提供利用所述适用于谷氨酸棒杆菌表达的粗糙脉孢菌麦角硫因合成基因在谷氨酸棒杆菌中生产麦角硫因的方法。

为达到上述目的，本发明以高产组氨酸的谷氨酸棒杆菌为出发菌株，对粗糙脉孢菌麦角硫因合成酶Egt1和Egt2进行密码子优化，在食品安全级宿主谷氨酸棒杆菌中表达Egt1和Egt2基因，实现以葡萄糖为碳源的从头合成麦角硫因，提供的具体方案如下：

1、麦角硫因合成基因在谷氨酸棒杆菌中重建麦角硫因代谢途径中的应用，所述麦角硫因合成基因包括Egt1和Egt2，所述Egt1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Egt2的核酸序列如SEQ ID NO.4所示。

优选的，所述麦角硫因合成基因为经过密码子优化适用于谷氨酸棒杆菌表达的序列，优化后所述Egt1的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述Egt2的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2、适用于谷氨酸棒杆菌表达的粗糙脉孢菌麦角硫因合成基因，所述麦角硫因合成基因包括Egt1和Egt2，所述Egt1的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述Egt2的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3、含有所述适用于谷氨酸棒杆菌表达的粗糙脉孢菌麦角硫因合成基因的重组表达载体。

优选的，所述含有麦角硫因合成基因的表达载体为含有Egt1和Egt2的pXMJ19重组载体。

优选的，所述重组表达载体具体构建过程如下：将SEQ ID NO.1所示序列通过SalI和NotI连入pXMJ19载体，得到pXMJ19-egt1质粒；将SEQ ID NO.2所示序列通过SalI和NotI连入pXMJ19载体，得到pXMJ19-egt2质粒；将构建的pXMJ19-egt1用NheI及NotI进行双酶切，酶切反后回收目的片段作为载体，将构建好的pXMJ19-egt2作为模板，扩增含有tac启动子的egt2基因，然后与酶切后的pXMJ19-egt1连接，得到重组表达载体pXMJ19-egt1-tac-egt2。

4、含有所述适用于谷氨酸棒杆菌表达的粗糙脉孢菌麦角硫因合成基因的谷氨酸棒杆菌工程菌。

5、利用所述适用于谷氨酸棒杆菌表达的粗糙脉孢菌麦角硫因合成基因在谷氨酸棒杆菌中生产麦角硫因的方法，构建含有麦角硫因合成基因的表达载体，然后转入谷氨酸棒杆菌中，发酵生产麦角硫因。

优选的，所述发酵培养的方法是将粗糙脉孢菌工程菌接种至种子培养基中，30℃培养12h，再按1％的接种量接种至发酵培养基中30℃，220rpm，发酵72h。

优选的，所述种子培养基各组分浓度如下：25g/L葡萄糖、5g/L硫酸铵、30g/L玉米浆、1g/L磷酸氢二钾、0.5g/L七水硫酸镁、10g/L碳酸钙；所述发酵培养基的各组分浓度如下：100g/L葡萄糖、45g/L硫酸铵、10g/L玉米浆、1g/L磷酸氢二钾、0.5g/L七水硫酸镁、10g/L碳酸钙、0.9g/L半胱氨酸、0.9g/L甲硫氨酸。

本发明的有益效果在于：本发明公开了用于谷氨酸棒杆菌表达的粗糙脉孢菌麦角硫因合成基因，通过将粗糙脉孢菌麦角硫因合成基因Egt1和Egt2进行密码子优化适合在谷氨酸棒杆菌中表达，利用谷氨酸棒杆菌为高产组氨酸的食品安全级宿主，实现以葡萄糖为碳源从头合成麦角硫因的方法，不添加外源组氨酸及甲硫氨酸、半胱氨酸等前体，同时麦角硫因分泌到胞外，谷氨酸棒杆菌重组菌5L发酵罐上麦角硫因产量达到3g/L以上。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为为pXMJ19-egt1和pXMJ19-egt2的载体结构图(A：pXMJ19-egt1载体结构图；B：pXMJ19-egt2载体结构图)；

图2为pXMJ19-egt1-tac-egt2载体结构图；

图3为构建载体过程中的转化子验证图；

图4为重组菌株发酵液高效液相检测示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明中使用的培养基如下：

LBG(g/L)：5g/L酵母浸出粉、10g/L蛋白胨、10g/L氯化钠、5g/L葡萄糖。

EPO(g/L)：10g/L蛋白胨、5g/L酵母浸出粉、10g/L氯化钠、4g/L异烟肼、30g/L甘氨酸、1ml吐温80g/L。

LBHIS(g/L)：5g/L蛋白胨、5g/L氯化钠、2.5g/L酵母浸出粉、18.5g/L牛脑心浸粉、91g/L D-山梨醇、15g/L琼脂粉。

种子培养基(g/L)：25g/L葡萄糖、5g/L硫酸铵、30g/L玉米浆、1g/L磷酸氢二钾、0.5g/L七水硫酸镁、10g/L碳酸钙。

发酵培养基(g/L)：100g/L葡萄糖、45g/L硫酸铵、10g/L玉米浆、1g/L磷酸氢二钾、0.5g/L七水硫酸镁、10g/L碳酸钙、0.9g/L半胱氨酸、0.9g/L甲硫氨酸。

实施例1、粗糙脉孢菌编码Egt1和Egt2的基因密码子优化

通过将已报道的粗糙脉孢菌中参与麦角硫因合成的Egt1和Egt2的基因进行优化，优化后的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，编码的氨基酸如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示，然后将优化的核苷酸序列送至苏州金唯智生物科技有限公司合成。

实施例2、构建含有Egt1和Egt2基因的重组载体

1)构建pXMJ19-egt1质粒

以合成的Egt1基因为模板用引物egt1-F和egt1-R(表1)扩增egt1基因切胶回收目的片段，将目的片段与经过SalI和NotI双酶切的含有谷氨酸棒杆菌RBS位点(5’-AAAGGAGGA-3’)的pXMJ19进行一步克隆重组构建pXMJ19-egt1质粒，结构如图1中A所示。

2)构建pXMJ19-egt2质粒

以合成的egt2基因为模板用引物egt2-F和egt2-R(表1)扩增egt2基因切胶回收目的片段，将目的片段与经过SalI和NotI双酶切的含有谷氨酸棒杆菌RBS位点(5’-AAAGGAGGA-3’)的pXMJ19进行一步克隆重组构建pXMJ19-egt2质粒，结构如图1中B所示。

3)构建pXMJ19-egt1-tac-egt2质粒

将之前构建的pXMJ19-egt1用NheI及NotI进行双酶切，酶切反应液回收目的片段作为载体，将构建好的pXMJ19-egt2作为模板用引物tac-egt2-F和tac-egt2-R(表1)扩增含有tac启动子的egt2基因切胶回收目的片段，与线性化载体进行一步克隆重组构建pXMJ19-egt1-tac-egt2质粒，结构如图2所示。

表1、引物序列

实施例3、谷氨酸棒杆菌合成麦角硫因工程菌株构建

将谷氨酸棒杆菌接种至LBG培养基中活化12h，转接4ml至100ml EPO培养基中使其初始OD≈0.3，30℃培养3～5h后OD≈1.0，冰欲20min，5000rpm，4℃离心10min收集菌体。用10％甘油反复洗涤4次，用2ml 10％甘油悬浮即为谷氨酸棒杆菌感受态细胞。

将上述构建好的pXMJ19-egt1-tac-egt2质粒加入100微升感受态细胞中，在0.1cm电转杯中冰欲10min，以2.5kV电压电转感受态细胞，电转完成后46℃热激6min。30℃，100rpm,孵育1h。5000rpm离心5min，收集菌体，将菌体重悬涂布与含有10mg/L的氯霉素抗性的LBHIS平板上筛选转化子。然后检测(请补充检测项目是什么得到3704bp的条带)，结构如图3所示。结果显示，pXMJ19-egt1-tac-egt2质粒成功转入谷氨酸棒杆菌(C.glutamicumCICC 20910)。

实施例4、重组菌株生产麦角硫因的鉴定

将正确的转化子接种至含有10mg/L氯霉素的LBG培养基中活化12h，以1％接种量转接至种子培养基中30℃培养12h后，1％接种量转接至5L含发酵培养基的发酵罐中发酵培养，30℃，220rpm，发酵72h结束后取样检测，HPLC检测条件为：检测波长254nm，流速0.6ml/min，流动相(甲醇:水＝3:97)，单次样品分析时间为20min，结构如图4所示。结果显示，麦角硫因在重组谷氨酸棒杆菌胞外成功合成。

分析发酵液中麦角硫因产量，结果显示麦角硫因发酵产量达到3g/L以上。本发明优势在于首次利用食品安全型天然氨基酸生产者谷氨酸棒状杆菌生产麦角硫因，并且能够将麦角硫因泵出细胞外，大幅度简化了下游分离纯化。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 西南大学

<120> 麦角硫因合成基因在谷氨酸棒杆菌中重建麦角硫因代谢途径中的应用及其方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2631

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgccaagcg ccgaaagcat gaccccgagt agtgcgctgg gccagctcaa agccacgggt 60

cagcatgttc tgagcaaact gcagcaacag accagtaacg ccgatatcat cgacatccgc 120

cgcgtggcgg ttgaaatcaa cctcaagacg gagatcacca gcatgttccg tccaaaagat 180

ggtccgcgtc aactgccaac gctgctgctg tataacgaac gcggtctgca gctcttcgaa 240

cgcatcacgt acctcgagga gtactatctg accaacgatg agatcaaaat cctcacgaag 300

catgcgacgg aaatggcgag ctttattcca agcggtgcga tgatcattga gctgggtagc 360

ggtaatctgc gcaaggtgaa tctgctgctg gaggcgctgg ataacgccgg caaagcgatc 420

gactattacg cgctggatct gagtcgtgaa gaactcgaac gcacgctcgc gcaagttccg 480

agctacaagc atgtgaagtg tcacggtctg ctgggcacgt atgacgacgg ccgcgattgg 540

ctgaaagccc cggagaacat caacaagcag aagtgcatcc tccatctggg tagcagcatc 600

ggtaacttca atcgcagtga cgcggccacc ttcctcaaag gttttaccga cgtgctcggt 660

ccgaatgaca agatgctgat cggcgtggac gcgtgcaatg atccggcccg tgtgtatcac 720

gcgtacaacg ataaggtggg catcacgcac gaatttattc tgaacggtct gcgcaatgcg 780

aacgagatta tcggcgagac ggcgtttatc gaaggtgatt ggcgtgtgat cggcgaatac 840

gtgtacgatg aggagggcgg tcgccatcaa gcgttctacg cgccgacccg cgacaccatg 900

gttatgggcg aactgatccg cagtcacgat cgcattcaga tcgagcagag tctcaaatac 960

agcaaggaag agagcgaacg tctgtggagc acggccggtc tcgaacaagt tagcgaatgg 1020

acctacggca atgaatacgg tctccatctg ctggcgaaga gccgcatgag tttcagtctg 1080

atcccaagtg tgtacgcccg tagtgcgctc ccaacgctcg acgattggga ggccctctgg 1140

gcgacgtggg atgttgtgac ccgccagatg ctgccacaag aagaactgct ggaaaagccg 1200

atcaagctcc gtaatgcgtg catcttttac ctcggccaca tcccgacctt tctggacatc 1260

cagctcacca aaaccaccaa acaagccccg agtgagccgg cccatttctg caagatcttt 1320

gaacgcggca tcgatccgga cgtggataat ccggaactgt gccatgcgca cagtgagatt 1380

ccagatgaat ggccaccggt tgaggagatt ctgacctacc aagagacggt tcgcagtcgc 1440

ctccgtggcc tctatgcgca cggcatcgcg aatattccgc gcaacgttgg tcgtgcgatc 1500

tgggttggct tcgagcatga gctgatgcac atcgagacgc tcctctatat gatgctgcag 1560

agcgacaaaa cgctgatccc aacccatatc ccgcgcccag acttcgacaa actggcgcgc 1620

aaggcggaaa gtgaacgcgt gccaaaccag tggttcaaga ttccagccca agaaatcacg 1680

attggtctgg atgatccgga ggacggcagt gatatcaata agcactacgg ctgggacaat 1740

gagaagccgc cgcgccgtgt tcaagttgcg gccttccaag cgcaaggtcg cccgatcacc 1800

aacgaagaat acgcgcagta tctgctggag aagaacatcg acaagctgcc agcgagctgg 1860

gcgcgtctgg ataacgagaa tatcagcaat ggtaccacga atagtgtgag cggtcaccac 1920

agcaaccgta cgagcaaaca acagctgcca agcagctttc tggagaaaac cgccgtgcgc 1980

accgtttacg gtctggttcc actgaagcac gcgctcgact ggccggtgtt tgccagctat 2040

gatgaactgg ccggctgcgc cgcctatatg ggcggtcgca tcccgacgtt cgaggaaacc 2100

cgcagcatct atgcctatgc ggatgcgctg aagaagaaga aggaggccga gcgtcagctg 2160

ggtcgtaccg ttccggccgt taacgcgcat ctgaccaata acggtgtgga gattacccca 2220

ccaagtagcc caagtagcga gaccccagcg gagagtagca gcccgagtga cagtaatacc 2280

accctcatca ccaccgaaga tctgttcagc gatctggatg gtgcgaacgt tggcttccat 2340

aactggcacc caatgccgat tacgagcaag ggcaatacgc tcgtgggtca aggcgaactg 2400

ggtggtgttt gggaatggac gagcagcgtt ctccgtaagt gggagggttt cgagccgatg 2460

gagctgtatc cgggctacac ggcggatttt ttcgacgaga agcacaacat cgtgctcggc 2520

ggtagctggg cgacccaccc acgcattgcg ggtcgcaaga gtttcgtgaa ctggtaccag 2580

cgcaactacc cgtatgcgtg ggttggtgcg cgtgtggtgc gcgatctgta a 2631

<210> 2

<211> 1422

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggttgcga ccaccgttga gctgccgctg caacagaaag ccgatgcggc gcagacggtt 60

acgggtccgc tcccgttcgg caacagcctc ctcaaagagt tcgttctgga tccggcctac 120

cgcaatctga atcatggcag ctttggcacc atcccgagcg ccatccaaca gaaactgcgc 180

agctaccaaa cggcggcgga agcccgccca tgcccatttc tgcgctacca gaccccagtt 240

ctgctcgatg aaagtcgtgc cgccgtggcg aatctgctca aagtgccggt tgaaaccgtg 300

gttttcgtgg ccaatgcgac catgggcgtg aacaccgtgc tgcgcaatat cgtttggagt 360

gccgatggca aggacgagat tctgtacttc gatacgatct acggtgcgtg cggcaagacg 420

atcgattacg tgatcgagga caagcgcggt attgtgagca gtcgctgcat cccactcatc 480

tacccagccg aagacgatga cgtggtggcg gcctttcgcg atgcgatcaa aaagagtcgc 540

gaggaaggca aacgcccacg tctggcggtg attgatgtgg ttagtagcat gccgggcgtt 600

cgtttcccgt tcgaggacat cgtgaagatc tgcaaggagg aagagatcat tagttgcgtg 660

gatggcgcgc aaggcatcgg catggtggat ctcaaaatca ccgagaccga cccggacttt 720

ctgattagca attgccacaa gtggctcttc accccgcgcg gttgtgcggt gttttacgtg 780

ccggtgcgca atcagcacct cattcgcagt acgctgccaa cgagtcacgg tttcgtgccg 840

caagttggca accgcttcaa tccgctggtg ccagccggca acaagagcgc gtttgtgagc 900

aactttgagt tcgtgggcac cgttgacaac agtccattct tctgtgttaa agatgcgatc 960

aagtggcgcg aggaagttct cggtggcgag gagcgcatca tggaatacat gaccaaactg 1020

gcccgcgagg gtggccagaa agttgcggaa attctgggta cgcgcgttct ggagaacagt 1080

acgggtacgc tgatccgctg cgccatggtg aatattgcgc tgccgtttgt ggtgggcgag 1140

gatccgaaag cgccggtgaa actcaccgag aaagaggaga aggacgttga aggcctctac 1200

gaaatcccgc acgaagaggc gaacatggcg ttcaagtgga tgtacaacgt gctgcaagat 1260

gaattcaaca cgtttgtgcc gatgaccttc caccgccgtc gcttttgggc gcgtctcagt 1320

gcccaagttt atctggaaat gagcgatttc gagtgggcgg gcaagaccct caaggaactg 1380

tgcgaacgcg ttgcgaaagg cgagtacaag gagagtgcct aa 1422

<210> 3

<211> 876

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Pro Ser Ala Glu Ser Met Thr Pro Ser Ser Ala Leu Gly Gln Leu

1 5 10 15

Lys Ala Thr Gly Gln His Val Leu Ser Lys Leu Gln Gln Gln Thr Ser

20 25 30

Asn Ala Asp Ile Ile Asp Ile Arg Arg Val Ala Val Glu Ile Asn Leu

35 40 45

Lys Thr Glu Ile Thr Ser Met Phe Arg Pro Lys Asp Gly Pro Arg Gln

50 55 60

Leu Pro Thr Leu Leu Leu Tyr Asn Glu Arg Gly Leu Gln Leu Phe Glu

65 70 75 80

Arg Ile Thr Tyr Leu Glu Glu Tyr Tyr Leu Thr Asn Asp Glu Ile Lys

85 90 95

Ile Leu Thr Lys His Ala Thr Glu Met Ala Ser Phe Ile Pro Ser Gly

100 105 110

Ala Met Ile Ile Glu Leu Gly Ser Gly Asn Leu Arg Lys Val Asn Leu

115 120 125

Leu Leu Glu Ala Leu Asp Asn Ala Gly Lys Ala Ile Asp Tyr Tyr Ala

130 135 140

Leu Asp Leu Ser Arg Glu Glu Leu Glu Arg Thr Leu Ala Gln Val Pro

145 150 155 160

Ser Tyr Lys His Val Lys Cys His Gly Leu Leu Gly Thr Tyr Asp Asp

165 170 175

Gly Arg Asp Trp Leu Lys Ala Pro Glu Asn Ile Asn Lys Gln Lys Cys

180 185 190

Ile Leu His Leu Gly Ser Ser Ile Gly Asn Phe Asn Arg Ser Asp Ala

195 200 205

Ala Thr Phe Leu Lys Gly Phe Thr Asp Val Leu Gly Pro Asn Asp Lys

210 215 220

Met Leu Ile Gly Val Asp Ala Cys Asn Asp Pro Ala Arg Val Tyr His

225 230 235 240

Ala Tyr Asn Asp Lys Val Gly Ile Thr His Glu Phe Ile Leu Asn Gly

245 250 255

Leu Arg Asn Ala Asn Glu Ile Ile Gly Glu Thr Ala Phe Ile Glu Gly

260 265 270

Asp Trp Arg Val Ile Gly Glu Tyr Val Tyr Asp Glu Glu Gly Gly Arg

275 280 285

His Gln Ala Phe Tyr Ala Pro Thr Arg Asp Thr Met Val Met Gly Glu

290 295 300

Leu Ile Arg Ser His Asp Arg Ile Gln Ile Glu Gln Ser Leu Lys Tyr

305 310 315 320

Ser Lys Glu Glu Ser Glu Arg Leu Trp Ser Thr Ala Gly Leu Glu Gln

325 330 335

Val Ser Glu Trp Thr Tyr Gly Asn Glu Tyr Gly Leu His Leu Leu Ala

340 345 350

Lys Ser Arg Met Ser Phe Ser Leu Ile Pro Ser Val Tyr Ala Arg Ser

355 360 365

Ala Leu Pro Thr Leu Asp Asp Trp Glu Ala Leu Trp Ala Thr Trp Asp

370 375 380

Val Val Thr Arg Gln Met Leu Pro Gln Glu Glu Leu Leu Glu Lys Pro

385 390 395 400

Ile Lys Leu Arg Asn Ala Cys Ile Phe Tyr Leu Gly His Ile Pro Thr

405 410 415

Phe Leu Asp Ile Gln Leu Thr Lys Thr Thr Lys Gln Ala Pro Ser Glu

420 425 430

Pro Ala His Phe Cys Lys Ile Phe Glu Arg Gly Ile Asp Pro Asp Val

435 440 445

Asp Asn Pro Glu Leu Cys His Ala His Ser Glu Ile Pro Asp Glu Trp

450 455 460

Pro Pro Val Glu Glu Ile Leu Thr Tyr Gln Glu Thr Val Arg Ser Arg

465 470 475 480

Leu Arg Gly Leu Tyr Ala His Gly Ile Ala Asn Ile Pro Arg Asn Val

485 490 495

Gly Arg Ala Ile Trp Val Gly Phe Glu His Glu Leu Met His Ile Glu

500 505 510

Thr Leu Leu Tyr Met Met Leu Gln Ser Asp Lys Thr Leu Ile Pro Thr

515 520 525

His Ile Pro Arg Pro Asp Phe Asp Lys Leu Ala Arg Lys Ala Glu Ser

530 535 540

Glu Arg Val Pro Asn Gln Trp Phe Lys Ile Pro Ala Gln Glu Ile Thr

545 550 555 560

Ile Gly Leu Asp Asp Pro Glu Asp Gly Ser Asp Ile Asn Lys His Tyr

565 570 575

Gly Trp Asp Asn Glu Lys Pro Pro Arg Arg Val Gln Val Ala Ala Phe

580 585 590

Gln Ala Gln Gly Arg Pro Ile Thr Asn Glu Glu Tyr Ala Gln Tyr Leu

595 600 605

Leu Glu Lys Asn Ile Asp Lys Leu Pro Ala Ser Trp Ala Arg Leu Asp

610 615 620

Asn Glu Asn Ile Ser Asn Gly Thr Thr Asn Ser Val Ser Gly His His

625 630 635 640

Ser Asn Arg Thr Ser Lys Gln Gln Leu Pro Ser Ser Phe Leu Glu Lys

645 650 655

Thr Ala Val Arg Thr Val Tyr Gly Leu Val Pro Leu Lys His Ala Leu

660 665 670

Asp Trp Pro Val Phe Ala Ser Tyr Asp Glu Leu Ala Gly Cys Ala Ala

675 680 685

Tyr Met Gly Gly Arg Ile Pro Thr Phe Glu Glu Thr Arg Ser Ile Tyr

690 695 700

Ala Tyr Ala Asp Ala Leu Lys Lys Lys Lys Glu Ala Glu Arg Gln Leu

705 710 715 720

Gly Arg Thr Val Pro Ala Val Asn Ala His Leu Thr Asn Asn Gly Val

725 730 735

Glu Ile Thr Pro Pro Ser Ser Pro Ser Ser Glu Thr Pro Ala Glu Ser

740 745 750

Ser Ser Pro Ser Asp Ser Asn Thr Thr Leu Ile Thr Thr Glu Asp Leu

755 760 765

Phe Ser Asp Leu Asp Gly Ala Asn Val Gly Phe His Asn Trp His Pro

770 775 780

Met Pro Ile Thr Ser Lys Gly Asn Thr Leu Val Gly Gln Gly Glu Leu

785 790 795 800

Gly Gly Val Trp Glu Trp Thr Ser Ser Val Leu Arg Lys Trp Glu Gly

805 810 815

Phe Glu Pro Met Glu Leu Tyr Pro Gly Tyr Thr Ala Asp Phe Phe Asp

820 825 830

Glu Lys His Asn Ile Val Leu Gly Gly Ser Trp Ala Thr His Pro Arg

835 840 845

Ile Ala Gly Arg Lys Ser Phe Val Asn Trp Tyr Gln Arg Asn Tyr Pro

850 855 860

Tyr Ala Trp Val Gly Ala Arg Val Val Arg Asp Leu

865 870 875

<210> 4

<211> 473

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Val Ala Thr Thr Val Glu Leu Pro Leu Gln Gln Lys Ala Asp Ala

1 5 10 15

Ala Gln Thr Val Thr Gly Pro Leu Pro Phe Gly Asn Ser Leu Leu Lys

20 25 30

Glu Phe Val Leu Asp Pro Ala Tyr Arg Asn Leu Asn His Gly Ser Phe

35 40 45

Gly Thr Ile Pro Ser Ala Ile Gln Gln Lys Leu Arg Ser Tyr Gln Thr

50 55 60

Ala Ala Glu Ala Arg Pro Cys Pro Phe Leu Arg Tyr Gln Thr Pro Val

65 70 75 80

Leu Leu Asp Glu Ser Arg Ala Ala Val Ala Asn Leu Leu Lys Val Pro

85 90 95

Val Glu Thr Val Val Phe Val Ala Asn Ala Thr Met Gly Val Asn Thr

100 105 110

Val Leu Arg Asn Ile Val Trp Ser Ala Asp Gly Lys Asp Glu Ile Leu

115 120 125

Tyr Phe Asp Thr Ile Tyr Gly Ala Cys Gly Lys Thr Ile Asp Tyr Val

130 135 140

Ile Glu Asp Lys Arg Gly Ile Val Ser Ser Arg Cys Ile Pro Leu Ile

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Glu Asp Asp Asp Val Val Ala Ala Phe Arg Asp Ala Ile

165 170 175

Lys Lys Ser Arg Glu Glu Gly Lys Arg Pro Arg Leu Ala Val Ile Asp

180 185 190

Val Val Ser Ser Met Pro Gly Val Arg Phe Pro Phe Glu Asp Ile Val

195 200 205

Lys Ile Cys Lys Glu Glu Glu Ile Ile Ser Cys Val Asp Gly Ala Gln

210 215 220

Gly Ile Gly Met Val Asp Leu Lys Ile Thr Glu Thr Asp Pro Asp Phe

225 230 235 240

Leu Ile Ser Asn Cys His Lys Trp Leu Phe Thr Pro Arg Gly Cys Ala

245 250 255

Val Phe Tyr Val Pro Val Arg Asn Gln His Leu Ile Arg Ser Thr Leu

260 265 270

Pro Thr Ser His Gly Phe Val Pro Gln Val Gly Asn Arg Phe Asn Pro

275 280 285

Leu Val Pro Ala Gly Asn Lys Ser Ala Phe Val Ser Asn Phe Glu Phe

290 295 300

Val Gly Thr Val Asp Asn Ser Pro Phe Phe Cys Val Lys Asp Ala Ile

305 310 315 320

Lys Trp Arg Glu Glu Val Leu Gly Gly Glu Glu Arg Ile Met Glu Tyr

325 330 335

Met Thr Lys Leu Ala Arg Glu Gly Gly Gln Lys Val Ala Glu Ile Leu

340 345 350

Gly Thr Arg Val Leu Glu Asn Ser Thr Gly Thr Leu Ile Arg Cys Ala

355 360 365

Met Val Asn Ile Ala Leu Pro Phe Val Val Gly Glu Asp Pro Lys Ala

370 375 380

Pro Val Lys Leu Thr Glu Lys Glu Glu Lys Asp Val Glu Gly Leu Tyr

385 390 395 400

Glu Ile Pro His Glu Glu Ala Asn Met Ala Phe Lys Trp Met Tyr Asn

405 410 415

Val Leu Gln Asp Glu Phe Asn Thr Phe Val Pro Met Thr Phe His Arg

420 425 430

Arg Arg Phe Trp Ala Arg Leu Ser Ala Gln Val Tyr Leu Glu Met Ser

435 440 445

Asp Phe Glu Trp Ala Gly Lys Thr Leu Lys Glu Leu Cys Glu Arg Val

450 455 460

Ala Lys Gly Glu Tyr Lys Glu Ser Ala

465 470

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccccggaatt cccgggtcga catgccaagc gccgaaagca t 41

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agtcagtcac gatgcggccg cgctagctta cagatcgcgc accacacg 48

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccccggaatt cccgggtcga catggttgcg accaccgttg ag 42

<210> 8

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agtcagtcac gatgcggccg cgctagctta ggcactctcc ttgtactcgc c 51

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgcgcgatct gtaagctagc ttgacaatta atcatcggct cg 42

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtcagtcacg atgcggccgc ttaggcactc tccttgtact c 41

Claims

1.麦角硫因合成基因在谷氨酸棒杆菌中重建麦角硫因代谢途径中的应用，其特征在于：所述麦角硫因合成基因包括Egt1和Egt2，所述Egt1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Egt2的核酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述麦角硫因合成基因为经过密码子优化适用于谷氨酸棒杆菌表达的序列，优化后所述Egt1的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述Egt2的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.适用于谷氨酸棒杆菌表达的粗糙脉孢菌麦角硫因合成基因，其特征在于：所述麦角硫因合成基因包括Egt1和Egt2，所述Egt1的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述Egt2的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.含有权利要求3所述适用于谷氨酸棒杆菌表达的粗糙脉孢菌麦角硫因合成基因的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述含有麦角硫因合成基因的表达载体为含有Egt1和Egt2的pXMJ19重组载体。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体具体构建过程如下：将SEQ ID NO.1所示序列通过SalI和NotI连入pXMJ19载体，得到pXMJ19-egt1质粒；将SEQ ID NO.2所示序列通过SalI和NotI连入pXMJ19载体，得到pXMJ19-egt2质粒；将构建的pXMJ19-egt1用NheI及NotI进行双酶切，酶切反后回收目的片段作为载体，将构建好的pXMJ19-egt2作为模板，扩增含有tac启动子的egt2基因，然后与酶切后的pXMJ19-egt1连接，得到重组表达载体pXMJ19-egt1-tac-egt2。

7.含有权利要求3所述适用于谷氨酸棒杆菌表达的粗糙脉孢菌麦角硫因合成基因的谷氨酸棒杆菌工程菌。

8.利用权利要求3所述适用于谷氨酸棒杆菌表达的粗糙脉孢菌麦角硫因合成基因在谷氨酸棒杆菌中生产麦角硫因的方法，其特征在于：构建含有麦角硫因合成基因的表达载体，然后转入谷氨酸棒杆菌中，发酵生产麦角硫因。

9.根据权利要求8所述适用于谷氨酸棒杆菌表达的粗糙脉孢菌麦角硫因合成基因在谷氨酸棒杆菌中生产麦角硫因的方法，其特征在于：所述发酵培养的方法是将粗糙脉孢菌工程菌接种至种子培养基中，30℃培养12h，再按1％的接种量接种至发酵培养基中30℃，220rpm，发酵72h。

10.根据权利要求8所述适用于谷氨酸棒杆菌表达的粗糙脉孢菌麦角硫因合成基因在谷氨酸棒杆菌中生产麦角硫因的方法，其特征在于：所述种子培养基各组分浓度如下：25g/L葡萄糖、5g/L硫酸铵、30g/L玉米浆、1g/L磷酸氢二钾、0.5g/L七水硫酸镁、10g/L碳酸钙；所述发酵培养基的各组分浓度如下：100g/L葡萄糖、45g/L硫酸铵、10g/L玉米浆、1g/L磷酸氢二钾、0.5g/L七水硫酸镁、10g/L碳酸钙、0.9g/L半胱氨酸、0.9g/L甲硫氨酸。