CN112391360A

CN112391360A - 黄酮3β-羟化酶还原酶辅酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN112391360A
Application number: CN202011213591.2A
Authority: CN
Inventors: 曾伟主; 周景文; 高松; 陈坚; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-11-04
Filing date: 2020-11-04
Publication date: 2021-02-23
Anticipated expiration: 2040-11-04
Also published as: CN112391360B

Abstract

本发明公开了黄酮3β‑羟化酶还原酶辅酶突变体及其应用，属于基因工程技术领域。本发明通过对黄酮3β‑羟化酶还原酶辅酶进行突变，获得了能够提高催化和生产性能的黄酮3β‑羟化酶还原酶辅酶突变体，将得到的突变体在酿酒酵母中，协助黄酮3β‑羟化酶还原酶进行转化，能够使得圣草酚含量较亲本的805.6mg/L提高至980.9mg/L～1052.1mg/L，提高了21.8％～30.6％。因而本发明获得的黄酮3β‑羟化酶还原酶辅酶突变体具备广阔的应用前景。

Description

黄酮3β-羟化酶还原酶辅酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及黄酮3β-羟化酶还原酶辅酶突变体及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

圣草酚(Eriodictyol)是一种重要的黄酮类化合物，因其所具备的抗炎、抗衰老、抗氧化等更能，而被广泛应用于食品添加剂。此外，多种高附加值化合物，如黄杉素、花青素、水飞蓟及大风子素等，都需要以圣草酚为前体物质来合成。目前，对于圣草酚的制备，主要是依靠植物提取法，然而植物提取法有许多缺点，如需要高温、提取时间长、需要大量有机试剂等，提取过程需要消耗大量的能源，并且造成环境的污染，从而使得安全环保的微生物法展现出更大的优势。

根据目前的研究，可以将柚皮素经F3′H催化，从而制备得到圣草酚。而F3′H在行使功能时，还需要还原酶CPR辅助获得电子才具有催化功能，因此F3′H需要与CPR共表达才具有较好的催化功能。但目前对于F3′H以及还原酶CPR催化功能的研究还很少，即使是有被报道的，圣草酚产量也很低，如Amor等《Biotransformation of naringenin to eriodictyolby Saccharomyces cerevisiea functionally expressing flavonoid 3'hydroxylase》(公开于2010年)中，利用F3′H催化柚皮素获得圣草酚的最高产量仅200mg/L。在Zhu等《Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli.》(公开于2016年)中，公开了在大肠杆菌中合成圣草酚的产量最高仅107mg/L。

由此可见，如何利用微生物实现圣草酚的高产仍然是一个亟待解决的问题。

发明内容

本发明中出发基因为来源于水飞蓟的黄酮3β-羟化酶的还原酶SmCPR，因为SmCPR的结构未知，通过理性改造进一步提高SmCPR的酶活比较困难，为进一步提高圣草酚的合成，可以利用定向进化技术获得酶活提高的SmCPR突变子，以及相应的高产圣草酚菌株，这对实现工业化微生物法生产圣草酚具有十分重要的意义。

本发明提供了黄酮3β-羟化酶还原酶辅酶突变体，所述突变体以氨基酸序列如SEQID NO.1所示的酶为亲本，将亲本第626和641位同时突变，或是将亲本第453位的氨基酸突变。

在本发明的一种实施方式中，编码亲本的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将亲本第626位氨基酸突变为天冬酰胺并将第641位的氨基酸突变为天冬氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将亲本的第453位突变为缬氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明提供了编码所述突变体的基因，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示。

在本发明的一种实施方式中，编码基酸序列如SEQ ID NO.3所示的突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，编码基酸序列如SEQ ID NO.5所示的突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明提供了携带权利要求3所述基因的表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体以pY26-TEF-GPD为出发载体。

本发明提供了表达氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示的突变体，或含有所述编码所述突变体的基因的微生物细胞。

本发明提供了一种微生物细胞，在所述微生物细胞中还表达黄酮3β-羟化酶还原酶。

本发明提供了一种全细胞转化生产圣草酚的方法，以柚皮素为底物，在反应体系中加入所述还表达黄酮3β-羟化酶还原酶的微生物细胞。

在本发明的一种实施方式中，将所述微生物细胞在25-32℃，200-250rpm培养16-18h，获得种子培养基，将种子培养基以1-5mL/100mL的量加入反应体系中。

在本发明的一种实施方式中，每隔10-12小时向反应体系中补加柚皮素，反应70-80小时。

本发明提供了所述突变体，或所述基因，或所述表达载体，或所述微生物细胞在生产圣草酚中的应用。

有益效果：本发明通过对黄酮3β-羟化酶还原酶辅酶进行突变，获得了能够提高催化和生产性能的黄酮3β-羟化酶还原酶辅酶突变体，将得到的突变体在酿酒酵母中，协助黄酮3β-羟化酶还原酶进行转化，能够使得圣草酚含量较亲本的805.6mg/L提高至980.9mg/L～1052.1mg/L，提高了21.8％～30.6％。

附图说明

图1为通过随机突变对SmCRP进行定向进化的示意图。

图2为定向进化获得的高产菌株名称及产量。

图3为高通量筛选结果示意图。

具体实施方式

(1)YNB培养基：0.72g/L酵母氮源基础培养基、20g/L葡萄糖、50mg/L亮氨酸、50mg/L色氨酸、50mg/L组氨酸。

(2)YPD培养基：10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖。

固体培养基中添加2g/L的琼脂粉。

(3)质粒pY26-P05的构建：

使用引物mut-F和mut-R环化扩增原始质粒pY26-TEF-GPD，再经过自连接获得caaggtttataa，在质粒pY26-TEF-GPD-mut引入新的酶切位点PmlI，构建得到pY26-TEF-GPD-mut用于后续构建质粒。

根据试剂盒(均购自赛默飞)说明书从水飞蓟花蕊中提取总RNA、逆转录获得cDNA。使用引物SmF3′H-F和SmF3′H-R，从cDNA中扩增SmF3′H，得到PCR产物，然后将得到的PCR产物克隆到pMD19T-simple中，得到pMD-T-SmF3′H。

使用BamHI和PmlI内切酶分别酶切pMD-T-SmF3′H和pY26-TEF-GPD-mut，将酶切后的片段分别回收并进行连接获得pY26-GR。使用NotI和PacI内切酶分别酶切pMD-T-SmCPR和pY26-GR，将酶切后的片段进行回收并进行连接获得pY26-THGR。

将包含上述启动子P_INO1(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)和P_TDH1(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)的质粒pMD19T-PINO1和pMD19T-PTDH1(具体构建见文献Gao,S.,et al.,Promoter-library-based pathway optimization for efficient(2S)-naringeninproduction from p-coumaric acid in Saccharomyces cerevisiae.J Agric FoodChem,2020.68(25):p.6884-6891.)上扩增启动子序列。

使用引物PINO1-homo-F和PINO1-homo-R和从质粒pMD19T-PINO1扩增下启动子序列P_INO1；

使用引物PTDH1-homo-F和PTDH1-homo-R和从质粒pMD19T-PTDH1扩增下启动子序列P_TDH1；

使用引物pY26-THGR-homo-F和pY26-THGR-homo-R从质粒pY26-THGR上扩增载体骨架(包含基因SmF3′H和SmCPR，但是不包含启动子P_TEF1和P_GPD1)；

将载体骨架、扩增的启动子PINO1片段和扩增的启动子PTDH1片段使用胶回收方式进行回收，然后将三种产物混合至50μL(启动子PINO1：启动子组PTDH1：载体骨架＝2：2：1，mol/mol/mol，总计约2-3μg)，将混合的体系通过醋酸锂高效转化法(具体转化方法参见文献：Gietz,R.D.and R.A.Woods,Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.Methods Enzymol,2002.350:p.87–96.)转化到酿酒酵母菌株C800(菌株C800的构建见文献Gao,S.,et al.,Promoter-library-based pathway optimization for efficient(2S)-naringenin productionfrom p-coumaric acid in Saccharomyces cerevisiae.J Agric Food Chem,2020.68(25):p.6884-6891.)中，片段会在酿酒酵母体内完成组装，将转化体系涂布在YNB琼脂平板上，将琼脂板在30℃下孵育3-4天，待长出单菌落后，挑取单菌落并进行测序，测序正确的即为阳性转化子，利用酵母质粒提取试剂盒(购自赛默飞公司)提取质粒，即得到载体pY26-P05。

表1所用引物序列

实施例1：SmCPR的定向进化

以出发质粒pY26-P05(pY26-P_INO1-SmF3′H-P_TDH1-SmCPR)为模板，使用易错PCR试剂盒GeneMorph II EZClone(Agilent，CA，US)对SmCPR进行定向进化。使用引物SmCPRm-F和SmCPRm-R扩增并随机突变SmCPR，同时使用引物9.5k-F/9.5k-R从质粒pY26-P05扩增载体骨架。PCR产物通过沉淀精制回收。随机突变的SmCPR序列与线性化的载体骨架DNA片段共享约40bp的同源臂用于同源重组。

将突变的SmCPR与线性化的载体骨架分别混合至50μL(2：1，mol/mol，总计约2-3μg)，通过酿酒酵母高效转化法(Gietz,R.D.and R.A.Woods,Transformation of yeast bylithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycolmethod.Methods Enzymol,2002.350:p.87–96)转化到酿酒酵母菌株C800中。将转化体系使用无菌水稀释后涂布在YNB琼脂平板上。突变的基因将通过同源重组插入载体骨架中并完成环化。将琼脂平板在30℃下孵育3-5天，直到出现菌落，即构建了SmCPR的突变子文库。

所有引物及基因序列均列在表1中。

实施例2：突变体的筛选及应用

从突变子文库中随机挑选10 000～20000个单菌落进行高通量筛选，获得的高产菌株再进行摇瓶复筛，确定产量增加的菌株进行测序检测突变位点。最后将最佳的SmCPR在250mL摇瓶水平进行发酵，检测圣草酚的产量。

对定向进化文库中的菌株，使用48深孔板进行培养：使用自动挑菌落仪器QPix420自动将平板上的菌落接种到48深孔板中。每个孔中添加1.5mL YNB液体培基，培养基中含有终浓度为250mg·L^-1的柚皮素。将深孔板转移到孔板摇床上(知楚，中国上海)，30℃，220rpm培养48小时。将深孔板置于桌面上2小时以沉淀细胞，上清液可用于高通量筛选。

高通量筛选：随机组装库中的菌株在48深孔板中发酵后，使用配备了酶标仪的自动工作站，自动取100μL的发酵上清液转移到96浅孔酶标板孔内，再加入100μL的4M KOH。大约5min后，混合物会变成紫色，紫色的深浅与圣草酚的浓度呈正比，可以通过目测直接筛选高产菌株，将颜色深的酶标板自动转移到酶标仪中在550nm下检测混合物的吸光值。选择吸光值高的菌株进入摇瓶复筛。菌株的圣草酚产量越高，则对应的孔的发酵液上清液颜色越深，如图3，仅有C7孔对应的发酵液上清液颜色较深，而H7孔为突变出发菌株的发酵液上清液处理后的颜色。绝大部分突变为负突变，仅有极少数菌株为正突变。

250mL摇瓶复筛：挑取单菌落接种在含有20mL YNB液体培养基的250mL摇瓶中，30℃，220rpm培养16-18h，获得种子培养基。将种子培养基以2mL/100mL转接到装有20mL新鲜YPD液体培养基的250mL摇瓶中，30℃，220rpm培养72小时，在第0h，12h，24h和36h时，分别将终浓度为375mg·L^-1柚皮素加入YPD培养基中，发酵结束后检测圣草酚的产量。

使用高效液相检测(Agilent 1100，US)发酵液中圣草酚的产量，C18反相色谱柱(4.6mm×250mm,Thermo)，柱温25℃。流动相为甲醇：水(41:59)并添加3‰的磷酸。流速1mL/min，进样量10μL，检测波长为290nm。

经过检测，有两株圣草酚的产量提升显著，菌株名称为分别为302-5和302-8，两株菌的圣草酚产量分别为980.9mg/L和1052.1mg/L，而出发菌株圣草酚的产量为805.6mg/L。突变菌株302-5和302-8圣草酚的产量较出发菌株C800P05分别增产21.8％和30.6％，(图2)。

菌株302-5的突变位点为将原始SmCPR酶的第626位的异亮氨酸Ile突变为天冬酰胺Asn及将第641位的组氨酸His突变为天冬氨酸Asp，并在第1230位和第1711位发生同义突变；菌株302-8的突变位点为将原始SmCPR酶的第453位的异亮氨酸突变为缬氨酸，并且在核苷酸序列第96、819、837、1674位发生了同义突变。两株高产突变菌株对应的质粒为pY26-P05mut和pY26-P05mut2，对应的质粒的基因型为pY26-P_INO1-SmF3′H-P_TDH1-SmCPR^I626N,H641D和pY26-P_INO1-SmF3′H-P_TDH1-SmCPR^I453V。出发菌株C800P05对应的质粒命名为pY26-P05，基因型为pY26-P_INO1-SmF3′H-P_TDH1-SmCPR。所有增产突变菌株的碱基突变位点，以及导致了氨基酸突变的位点列在表2中。

表2突变菌株的基因型

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 黄酮3β-羟化酶还原酶辅酶突变体及其应用

<130> BAA201247A

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 710

<212> PRT

<213> Silybum marianum

<400> 1

Met Gln Ser Asp Ser Ser Leu Glu Thr Ser Ser Phe Asp Leu Ile Thr

1 5 10 15

Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ile Asp Thr Ala Asn Ala Ser Asp Ser

20 25 30

Gly Asp Ser Thr Met Pro Pro Ala Leu Ala Met Ile Leu Glu Asn Arg

35 40 45

Glu Leu Phe Met Met Leu Thr Thr Thr Val Ala Leu Leu Leu Gly Phe

50 55 60

Ile Val Val Ser Phe Trp Lys Arg Ser Ser Glu Lys Lys Ser Ala Lys

65 70 75 80

Asp Leu Glu Leu Pro Lys Ile Val Val Pro Lys Arg Gln Gln Glu Gln

85 90 95

Glu Val Asp Asp Gly Lys Lys Lys Val Thr Ile Leu Phe Gly Thr Gln

100 105 110

Thr Gly Thr Ala Glu Gly Phe Ala Lys Ala Leu Leu Glu Glu Ala Lys

115 120 125

Ala Arg Tyr Glu Lys Ala Thr Phe Lys Val Val Asp Leu Asp Asp Tyr

130 135 140

Ala Val Asp Asp Asp Glu Tyr Glu Glu Lys Leu Lys Lys Glu Ser Phe

145 150 155 160

Ala Phe Phe Phe Leu Ala Thr Tyr Gly Asp Gly Glu Pro Thr Asp Asn

165 170 175

Ala Ala Arg Phe Tyr Lys Trp Phe Thr Glu Gly Gly Glu Lys Gly Val

180 185 190

Trp Leu Glu Lys Leu Gln Tyr Gly Val Phe Gly Leu Gly Asn Arg Gln

195 200 205

Tyr Glu His Phe Asn Lys Ile Ala Lys Glu Val Asp Asp Gly Leu Ala

210 215 220

Glu Gln Gly Ala Lys Arg Leu Val Pro Val Gly Leu Gly Asp Asp Asp

225 230 235 240

Gln Ser Ile Glu Asp Asp Phe Thr Ala Trp Lys Glu Leu Val Trp Pro

245 250 255

Glu Leu Asp Glu Leu Leu Arg Asp Glu Asp Asp Lys Gly Val Ala Thr

260 265 270

Pro Tyr Thr Ala Ala Ile Pro Glu Tyr Arg Val Val Phe His Glu Lys

275 280 285

His Asp Thr Ser Ala Glu Asp Gln Ile Gln Thr Asn Gly His Ala Val

290 295 300

His Asp Ala Gln His Pro Cys Arg Ser Asn Val Ala Val Lys Lys Glu

305 310 315 320

Leu His Thr Pro Glu Ser Asp Arg Ser Cys Thr His Leu Glu Phe Asp

325 330 335

Ile Ser His Thr Gly Leu Ser Tyr Glu Thr Gly Asp His Val Gly Val

340 345 350

Tyr Cys Glu Asn Leu Ser Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Arg Leu Ile

355 360 365

Gly Leu Pro Ser Asp Thr Tyr Phe Ser Val His Thr Asp Asn Glu Asp

370 375 380

Gly Thr Pro Leu Gly Gly Ala Ser Leu Leu Pro Pro Phe Pro Pro Cys

385 390 395 400

Thr Leu Arg Lys Ala Leu Ala Asn Tyr Ala Asp Val Leu Thr Ser Pro

405 410 415

Lys Lys Ser Ala Leu Ile Ala Leu Ala Ala His Ala Ser Asp Pro Thr

420 425 430

Glu Ala Glu Arg Leu Lys Phe Leu Ala Ser Pro Ala Gly Lys Asp Glu

435 440 445

Tyr Ser Gln Trp Ile Ile Ala Ser Gln Arg Ser Leu Leu Glu Val Met

450 455 460

Glu Ala Phe Pro Ser Ala Lys Pro Pro Leu Gly Val Phe Phe Ala Ala

465 470 475 480

Ile Ala Pro Arg Leu Gln Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser Ser Ser Pro

485 490 495

Lys Met Ala Pro Ser Arg Ile His Val Thr Cys Ala Leu Val Tyr Glu

500 505 510

Lys Thr Pro Ala Gly Arg Leu His Lys Gly Ile Cys Ser Thr Trp Met

515 520 525

Lys Asn Ala Val Pro Met Thr Glu Ser Gln Asp Cys Ser Trp Ala Pro

530 535 540

Ile Phe Val Arg Thr Ser Asn Phe Arg Leu Pro Thr Asp Pro Lys Val

545 550 555 560

Pro Val Ile Met Ile Gly Pro Gly Thr Gly Leu Ala Pro Phe Arg Gly

565 570 575

Phe Leu Gln Glu Arg Leu Ala Leu Lys Glu Ala Gly Thr Glu Leu Gly

580 585 590

Ser Ser Ile Leu Phe Phe Gly Cys Arg Asn Arg Lys Val Asp Phe Ile

595 600 605

Tyr Glu Asn Glu Leu Lys Asp Phe Val Glu Asn Gly Ala Val Ser Glu

610 615 620

Leu Ile Val Ala Phe Ser Arg Glu Gly Pro Asn Lys Glu Tyr Val Gln

625 630 635 640

His Lys Met Ser Asp Arg Ala Ser Asp Leu Trp Asn Leu Leu Ser Glu

645 650 655

Gly Ala Tyr Leu Tyr Val Cys Gly Asp Ala Lys Gly Met Ala Lys Asp

660 665 670

Val His Arg Thr Leu His Thr Ile Val Gln Glu Gln Gly Ser Leu Asp

675 680 685

Ser Ser Lys Ala Glu Leu Tyr Val Lys Asn Leu Gln Met Ser Gly Arg

690 695 700

Tyr Leu Arg Asp Val Trp

705 710

<210> 2

<211> 2133

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgcaatcgg actcgtctct ggaaacgtcg tcgtttgatt tgattaccgc agctcttaag 60

gagaaagtta ttgatacagc aaacgcatct gatagtggag attcaacgat gcctccggct 120

ttggcgatga ttttggaaaa ccgtgagctg tttatgatgc tgactacaac agtggctctt 180

ttgcttggat ttattgtcgt ttcgttctgg aagagatctt ctgagaagaa gtcggctaag 240

gatttggagc taccgaagat cgttgtgcct aagagacagc aggaacagga ggttgatgac 300

ggtaagaaga aggttacgat tctttttgga acgcagaccg gaacggcgga aggtttcgct 360

aaggcactgt tggaagaagc taaagcgcga tatgaaaagg cgacctttaa agtagtcgat 420

ttggatgatt atgctgttga tgatgatgag tacgaagaga aactaaagaa ggagtcattt 480

gctttcttct tcttggctac atatggagat ggtgagccaa ctgataatgc tgccagattt 540

tataaatggt ttacagaggg aggtgagaaa ggagtttggc ttgaaaagct tcaatatgga 600

gtatttggcc ttggcaatag acaatacgag catttcaaca agattgcaaa agaggttgac 660

gatggtctcg cagagcaggg tgcaaagcgc cttgttccag ttggccttgg agatgatgat 720

caatccattg aagatgattt tactgcatgg aaagagttag tgtggcctga gttggatgaa 780

ttgcttcgtg acgaggatga caaaggcgtt gctactcctt acacagctgc tattccggaa 840

taccgagttg tgtttcatga gaaacatgat acatctgctg aagatcaaat tcagacaaat 900

ggtcatgctg ttcatgatgc tcaacatcca tgcagatcca atgtggctgt taaaaaggag 960

ctccataccc ctgaatctga tcgctcttgc acgcatctgg aatttgacat ctcacacact 1020

ggactatcat acgaaactgg ggaccatgtt ggtgtctact gtgagaactt aagtgaagtt 1080

gtggaggagg ctgagaggtt aataggttta ccatcggata cttatttctc agttcacacg 1140

gataacgaag atggaacacc acttggtgga gcttccttac tacctccttt ccctccatgc 1200

actttaagaa aagcattggc taattacgcg gatgtattga cttctcccaa aaagtcggcc 1260

ttgattgctc tagctgctca tgcttctgat cctactgaag ctgaacgact aaaatttctt 1320

gcatctcctg ctgggaagga tgaatattct caatggatta ttgcaagcca aagaagcctg 1380

cttgaggtca tggaagcttt cccatcggct aagcctccac ttggggtttt ctttgcagct 1440

attgctccac gcttacagcc tcgatactac tctatttctt cctccccgaa gatggcacct 1500

agcaggattc atgttacttg tgcattagtt tatgagaaaa cacctgcagg ccgtctccat 1560

aaaggaatct gttcaacctg gatgaagaat gctgtgccta tgacggaaag tcaggattgc 1620

agctgggcac ctattttcgt tagaacgtct aacttcagac ttcccactga tcctaaagtt 1680

cctgttatca tgattggccc tggaaccgga ctggctccgt tcagaggttt tcttcaagaa 1740

agattagctc tgaaggaagc cggaactgaa ctgggatcat ccattttatt cttcggatgt 1800

agaaatcgca aagtggattt catatatgag aatgaactga aagactttgt tgagaatggt 1860

gctgtttccg agcttaatgt tgccttctcc cgtgaaggcc ccaataagga atatgtgcaa 1920

gataaaatga gcgatagggc ttcggatcta tggaacttgc tttcggaggg agcatattta 1980

tacgtttgtg gtgatgccaa aggcatggct aaagatgtac accggaccct tcacacaatt 2040

gtgcaagaac agggatctct agactcgtca aaggcagagc tgtatgtgaa gaatctacaa 2100

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<211> 710

<212> PRT

<213> 人工序列

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1 5 10 15

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20 25 30

Gly Asp Ser Thr Met Pro Pro Ala Leu Ala Met Ile Leu Glu Asn Arg

35 40 45

Glu Leu Phe Met Met Leu Thr Thr Thr Val Ala Leu Leu Leu Gly Phe

50 55 60

Ile Val Val Ser Phe Trp Lys Arg Ser Ser Glu Lys Lys Ser Ala Lys

65 70 75 80

Asp Leu Glu Leu Pro Lys Ile Val Val Pro Lys Arg Gln Gln Glu Gln

85 90 95

Glu Val Asp Asp Gly Lys Lys Lys Val Thr Ile Leu Phe Gly Thr Gln

100 105 110

Thr Gly Thr Ala Glu Gly Phe Ala Lys Ala Leu Leu Glu Glu Ala Lys

115 120 125

Ala Arg Tyr Glu Lys Ala Thr Phe Lys Val Val Asp Leu Asp Asp Tyr

130 135 140

Ala Val Asp Asp Asp Glu Tyr Glu Glu Lys Leu Lys Lys Glu Ser Phe

145 150 155 160

Ala Phe Phe Phe Leu Ala Thr Tyr Gly Asp Gly Glu Pro Thr Asp Asn

165 170 175

Ala Ala Arg Phe Tyr Lys Trp Phe Thr Glu Gly Gly Glu Lys Gly Val

180 185 190

Trp Leu Glu Lys Leu Gln Tyr Gly Val Phe Gly Leu Gly Asn Arg Gln

195 200 205

Tyr Glu His Phe Asn Lys Ile Ala Lys Glu Val Asp Asp Gly Leu Ala

210 215 220

Glu Gln Gly Ala Lys Arg Leu Val Pro Val Gly Leu Gly Asp Asp Asp

225 230 235 240

Gln Ser Ile Glu Asp Asp Phe Thr Ala Trp Lys Glu Leu Val Trp Pro

245 250 255

Glu Leu Asp Glu Leu Leu Arg Asp Glu Asp Asp Lys Gly Val Ala Thr

260 265 270

Pro Tyr Thr Ala Ala Ile Pro Glu Tyr Arg Val Val Phe His Glu Lys

275 280 285

His Asp Thr Ser Ala Glu Asp Gln Ile Gln Thr Asn Gly His Ala Val

290 295 300

His Asp Ala Gln His Pro Cys Arg Ser Asn Val Ala Val Lys Lys Glu

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Gly Thr Pro Leu Gly Gly Ala Ser Leu Leu Pro Pro Phe Pro Pro Cys

385 390 395 400

Thr Leu Arg Lys Ala Leu Ala Asn Tyr Ala Asp Val Leu Thr Ser Pro

405 410 415

Lys Lys Ser Ala Leu Ile Ala Leu Ala Ala His Ala Ser Asp Pro Thr

420 425 430

Glu Ala Glu Arg Leu Lys Phe Leu Ala Ser Pro Ala Gly Lys Asp Glu

435 440 445

Tyr Ser Gln Trp Ile Ile Ala Ser Gln Arg Ser Leu Leu Glu Val Met

450 455 460

Glu Ala Phe Pro Ser Ala Lys Pro Pro Leu Gly Val Phe Phe Ala Ala

465 470 475 480

Ile Ala Pro Arg Leu Gln Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser Ser Ser Pro

485 490 495

Lys Met Ala Pro Ser Arg Ile His Val Thr Cys Ala Leu Val Tyr Glu

500 505 510

Lys Thr Pro Ala Gly Arg Leu His Lys Gly Ile Cys Ser Thr Trp Met

515 520 525

Lys Asn Ala Val Pro Met Thr Glu Ser Gln Asp Cys Ser Trp Ala Pro

530 535 540

Ile Phe Val Arg Thr Ser Asn Phe Arg Leu Pro Thr Asp Pro Lys Val

545 550 555 560

Pro Val Ile Met Ile Gly Pro Gly Thr Gly Leu Ala Pro Phe Arg Gly

565 570 575

Phe Leu Gln Glu Arg Leu Ala Leu Lys Glu Ala Gly Thr Glu Leu Gly

580 585 590

Ser Ser Ile Leu Phe Phe Gly Cys Arg Asn Arg Lys Val Asp Phe Ile

595 600 605

Tyr Glu Asn Glu Leu Lys Asp Phe Val Glu Asn Gly Ala Val Ser Glu

610 615 620

Leu Asn Val Ala Phe Ser Arg Glu Gly Pro Asn Lys Glu Tyr Val Gln

625 630 635 640

Asp Lys Met Ser Asp Arg Ala Ser Asp Leu Trp Asn Leu Leu Ser Glu

645 650 655

Gly Ala Tyr Leu Tyr Val Cys Gly Asp Ala Lys Gly Met Ala Lys Asp

660 665 670

Val His Arg Thr Leu His Thr Ile Val Gln Glu Gln Gly Ser Leu Asp

675 680 685

Ser Ser Lys Ala Glu Leu Tyr Val Lys Asn Leu Gln Met Ser Gly Arg

690 695 700

Tyr Leu Arg Asp Val Trp

705 710

<210> 4

<211> 2133

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgcaatcgg actcgtctct ggaaacgtcg tcgtttgatt tgattaccgc agctcttaag 60

gagaaagtta ttgatacagc aaacgcatct gatagcggag attcaacgat gcctccggct 120

ttggcgatga ttttggaaaa ccgtgagctg tttatgatgc tgactacaac agtggctctt 180

ttgcttggat ttattgtcgt ttcgttctgg aagagatctt ctgagaagaa gtcggctaag 240

gatttggagc taccgaagat cgttgtgcct aagagacagc aggaacagga ggttgatgac 300

ggtaagaaga aggttacgat tctttttgga acgcagaccg gaacggcgga aggtttcgct 360

aaggcactgt tggaagaagc taaagcgcga tatgaaaagg cgacctttaa agtagtcgat 420

ttggatgatt atgctgttga tgatgatgag tacgaagaga aactaaagaa ggagtcattt 480

gctttcttct tcttggctac atatggagat ggtgagccaa ctgataatgc tgccagattt 540

tataaatggt ttacagaggg aggtgagaaa ggagtttggc ttgaaaagct tcaatatgga 600

gtatttggcc ttggcaatag acaatacgag catttcaaca agattgcaaa agaggttgac 660

gatggtctcg cagagcaggg tgcaaagcgc cttgttccag ttggccttgg agatgatgat 720

caatccattg aagatgattt tactgcatgg aaagagttag tgtggcctga gttggatgaa 780

ttgcttcgtg acgaggatga caaaggcgtt gctactccct acacagctgc tattccagaa 840

taccgagttg tgtttcatga gaaacatgat acatctgctg aagatcaaat tcagacaaat 900

ggtcatgctg ttcatgatgc tcaacatcca tgcagatcca atgtggctgt taaaaaggag 960

ctccataccc ctgaatctga tcgctcttgc acgcatctgg aatttgacat ctcacacact 1020

ggactatcat acgaaactgg ggaccatgtt ggtgtctact gtgagaactt aagtgaagtt 1080

gtggaggagg ctgagaggtt aataggttta ccatcggata cttatttctc agttcacacg 1140

gataacgaag atggaacacc acttggtgga gcttccttac tacctccttt ccctccatgc 1200

actttaagaa aagcattggc taattacgca gatgtattga cttctcccaa aaagtcggcc 1260

ttgattgctc tagctgctca tgcttctgat cctactgaag ctgaacgact aaaatttctt 1320

gcatctcctg ctgggaagga tgaatattct caatgggtta ttgcaagcca aagaagcctg 1380

cttgaggtca tggaagcttt cccatcggct aagcctccac ttggggtttt ctttgcagct 1440

attgctccac gcttacagcc tcgatactac tctatttctt cctccccgaa gatggcacct 1500

agcaggattc atgttacttg tgcattagtt tatgagaaaa cacctgcagg ccgtctccat 1560

aaaggaatct gttcaacctg gatgaagaat gctgtgccta tgacggaaag tcaggattgc 1620

agctgggcac ctattttcgt tagaacgtct aacttcagac ttcccactga tccaaaagtt 1680

cctgttatca tgattggccc tggaaccgga ttggctccgt tcagaggttt tcttcaagaa 1740

agattagctc tgaaggaagc cggaactgaa ctgggatcat ccattttatt cttcggatgt 1800

agaaatcgca aagtggattt catatatgag aatgaactga aagactttgt tgagaatggt 1860

gctgtttccg agcttattgt tgccttctcc cgtgaaggcc ccaataagga atatgtgcaa 1920

cataaaatga gcgatagggc ttcggatcta tggaacttgc tttcggaggg agcatattta 1980

tacgtttgtg gtgatgccaa aggcatggct aaagatgtac accggaccct tcacacaatt 2040

gtgcaagaac agggatctct agactcgtca aaggcagagc tgtatgtgaa gaatctacaa 2100

atgtcaggaa gatacctccg tgatgtttgg tag 2133

<210> 5

<211> 710

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Gln Ser Asp Ser Ser Leu Glu Thr Ser Ser Phe Asp Leu Ile Thr

1 5 10 15

Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ile Asp Thr Ala Asn Ala Ser Asp Ser

20 25 30

Gly Asp Ser Thr Met Pro Pro Ala Leu Ala Met Ile Leu Glu Asn Arg

35 40 45

Glu Leu Phe Met Met Leu Thr Thr Thr Val Ala Leu Leu Leu Gly Phe

50 55 60

Ile Val Val Ser Phe Trp Lys Arg Ser Ser Glu Lys Lys Ser Ala Lys

65 70 75 80

Asp Leu Glu Leu Pro Lys Ile Val Val Pro Lys Arg Gln Gln Glu Gln

85 90 95

Glu Val Asp Asp Gly Lys Lys Lys Val Thr Ile Leu Phe Gly Thr Gln

100 105 110

Thr Gly Thr Ala Glu Gly Phe Ala Lys Ala Leu Leu Glu Glu Ala Lys

115 120 125

Ala Arg Tyr Glu Lys Ala Thr Phe Lys Val Val Asp Leu Asp Asp Tyr

130 135 140

Ala Val Asp Asp Asp Glu Tyr Glu Glu Lys Leu Lys Lys Glu Ser Phe

145 150 155 160

Ala Phe Phe Phe Leu Ala Thr Tyr Gly Asp Gly Glu Pro Thr Asp Asn

165 170 175

Ala Ala Arg Phe Tyr Lys Trp Phe Thr Glu Gly Gly Glu Lys Gly Val

180 185 190

Trp Leu Glu Lys Leu Gln Tyr Gly Val Phe Gly Leu Gly Asn Arg Gln

195 200 205

Tyr Glu His Phe Asn Lys Ile Ala Lys Glu Val Asp Asp Gly Leu Ala

210 215 220

Glu Gln Gly Ala Lys Arg Leu Val Pro Val Gly Leu Gly Asp Asp Asp

225 230 235 240

Gln Ser Ile Glu Asp Asp Phe Thr Ala Trp Lys Glu Leu Val Trp Pro

245 250 255

Glu Leu Asp Glu Leu Leu Arg Asp Glu Asp Asp Lys Gly Val Ala Thr

260 265 270

Pro Tyr Thr Ala Ala Ile Pro Glu Tyr Arg Val Val Phe His Glu Lys

275 280 285

His Asp Thr Ser Ala Glu Asp Gln Ile Gln Thr Asn Gly His Ala Val

290 295 300

His Asp Ala Gln His Pro Cys Arg Ser Asn Val Ala Val Lys Lys Glu

305 310 315 320

Leu His Thr Pro Glu Ser Asp Arg Ser Cys Thr His Leu Glu Phe Asp

325 330 335

Ile Ser His Thr Gly Leu Ser Tyr Glu Thr Gly Asp His Val Gly Val

340 345 350

Tyr Cys Glu Asn Leu Ser Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Arg Leu Ile

355 360 365

Gly Leu Pro Ser Asp Thr Tyr Phe Ser Val His Thr Asp Asn Glu Asp

370 375 380

Gly Thr Pro Leu Gly Gly Ala Ser Leu Leu Pro Pro Phe Pro Pro Cys

385 390 395 400

Thr Leu Arg Lys Ala Leu Ala Asn Tyr Ala Asp Val Leu Thr Ser Pro

405 410 415

Lys Lys Ser Ala Leu Ile Ala Leu Ala Ala His Ala Ser Asp Pro Thr

420 425 430

Glu Ala Glu Arg Leu Lys Phe Leu Ala Ser Pro Ala Gly Lys Asp Glu

435 440 445

Tyr Ser Gln Trp Val Ile Ala Ser Gln Arg Ser Leu Leu Glu Val Met

450 455 460

Glu Ala Phe Pro Ser Ala Lys Pro Pro Leu Gly Val Phe Phe Ala Ala

465 470 475 480

Ile Ala Pro Arg Leu Gln Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser Ser Ser Pro

485 490 495

Lys Met Ala Pro Ser Arg Ile His Val Thr Cys Ala Leu Val Tyr Glu

500 505 510

Lys Thr Pro Ala Gly Arg Leu His Lys Gly Ile Cys Ser Thr Trp Met

515 520 525

Lys Asn Ala Val Pro Met Thr Glu Ser Gln Asp Cys Ser Trp Ala Pro

530 535 540

Ile Phe Val Arg Thr Ser Asn Phe Arg Leu Pro Thr Asp Pro Lys Val

545 550 555 560

Pro Val Ile Met Ile Gly Pro Gly Thr Gly Leu Ala Pro Phe Arg Gly

565 570 575

Phe Leu Gln Glu Arg Leu Ala Leu Lys Glu Ala Gly Thr Glu Leu Gly

580 585 590

Ser Ser Ile Leu Phe Phe Gly Cys Arg Asn Arg Lys Val Asp Phe Ile

595 600 605

Tyr Glu Asn Glu Leu Lys Asp Phe Val Glu Asn Gly Ala Val Ser Glu

610 615 620

Leu Ile Val Ala Phe Ser Arg Glu Gly Pro Asn Lys Glu Tyr Val Gln

625 630 635 640

His Lys Met Ser Asp Arg Ala Ser Asp Leu Trp Asn Leu Leu Ser Glu

645 650 655

Gly Ala Tyr Leu Tyr Val Cys Gly Asp Ala Lys Gly Met Ala Lys Asp

660 665 670

Val His Arg Thr Leu His Thr Ile Val Gln Glu Gln Gly Ser Leu Asp

675 680 685

Ser Ser Lys Ala Glu Leu Tyr Val Lys Asn Leu Gln Met Ser Gly Arg

690 695 700

Tyr Leu Arg Asp Val Trp

705 710

<210> 6

<211> 510

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaagacgatg aggccggtgc cgatgtgccc ttgatggaca acaaacaaca gctctcttcc 60

ggccgtactt agtgatcgga acgagctctt tatcaccgta gttctaaata acacatagag 120

taaattattg cctttttctt cgttcctttt gttcttcacg tcctttttat gaaatacgtg 180

ccggtgttcc ggggttggat gcggaatcga aagtgttgaa tgtgaaatat gcggaggcca 240

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cttctttccc agaatattga acttatttaa ttcacatgga gcagagaaag cgcacctctg 360

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cctttttttt ccagtgaaaa agaagtaaca 510

<210> 7

<211> 530

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaaaccacac cgtggggcct tgttgcgcta ggaataggat atgcgacgaa gacgcttctg 60

cttagtaacc acaccacatt ttcagggggt cgatctgctt gcttccttta ctgtcacgag 120

cggcccataa tcgcgctttt tttttaaaag gcgcgagaca gcaaacagga agctcgggtt 180

tcaaccttcg gagtggtcgc agatctggag actggatctt tacaatacag taaggcaagc 240

caccatctgc ttcttaggtg catgcgacgg tatccacgtg cagaacaaca tagtctgaag 300

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actggagtct cgaaatcata taaatagaca atatattttc acacaatgag atttgtagta 420

cagttctatt ctctctcttg cataaataag aaattcatca agaacttggt ttgatatttc 480

accaacacac acaaaaaaca gtacttcact aaatttacac acaaaacaaa 530

<210> 8

<211> 2133

<212> DNA

<213> Silybum marianum

<400> 8

atgcaatcgg actcgtctct ggaaacgtcg tcgtttgatt tgattaccgc agctcttaag 60

gagaaagtta ttgatacagc aaacgcatct gatagtggag attcaacgat gcctccggct 120

ttggcgatga ttttggaaaa ccgtgagctg tttatgatgc tgactacaac agtggctctt 180

ttgcttggat ttattgtcgt ttcgttctgg aagagatctt ctgagaagaa gtcggctaag 240

gatttggagc taccgaagat cgttgtgcct aagagacagc aggaacagga ggttgatgac 300

ggtaagaaga aggttacgat tctttttgga acgcagaccg gaacggcgga aggtttcgct 360

aaggcactgt tggaagaagc taaagcgcga tatgaaaagg cgacctttaa agtagtcgat 420

ttggatgatt atgctgttga tgatgatgag tacgaagaga aactaaagaa ggagtcattt 480

gctttcttct tcttggctac atatggagat ggtgagccaa ctgataatgc tgccagattt 540

tataaatggt ttacagaggg aggtgagaaa ggagtttggc ttgaaaagct tcaatatgga 600

gtatttggcc ttggcaatag acaatacgag catttcaaca agattgcaaa agaggttgac 660

gatggtctcg cagagcaggg tgcaaagcgc cttgttccag ttggccttgg agatgatgat 720

caatccattg aagatgattt tactgcatgg aaagagttag tgtggcctga gttggatgaa 780

ttgcttcgtg acgaggatga caaaggcgtt gctactcctt acacagctgc tattccggaa 840

taccgagttg tgtttcatga gaaacatgat acatctgctg aagatcaaat tcagacaaat 900

ggtcatgctg ttcatgatgc tcaacatcca tgcagatcca atgtggctgt taaaaaggag 960

ctccataccc ctgaatctga tcgctcttgc acgcatctgg aatttgacat ctcacacact 1020

ggactatcat acgaaactgg ggaccatgtt ggtgtctact gtgagaactt aagtgaagtt 1080

gtggaggagg ctgagaggtt aataggttta ccatcggata cttatttctc agttcacacg 1140

gataacgaag atggaacacc acttggtgga gcttccttac tacctccttt ccctccatgc 1200

actttaagaa aagcattggc taattacgca gatgtattga cttctcccaa aaagtcggcc 1260

ttgattgctc tagctgctca tgcttctgat cctactgaag ctgaacgact aaaatttctt 1320

gcatctcctg ctgggaagga tgaatattct caatggatta ttgcaagcca aagaagcctg 1380

cttgaggtca tggaagcttt cccatcggct aagcctccac ttggggtttt ctttgcagct 1440

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aaaggaatct gttcaacctg gatgaagaat gctgtgccta tgacggaaag tcaggattgc 1620

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cctgttatca tgattggccc tggaaccgga ttggctccgt tcagaggttt tcttcaagaa 1740

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gtgcaagaac agggatctct agactcgtca aaggcagagc tgtatgtgaa gaatctacaa 2100

atgtcaggaa gatacctccg tgatgtttgg tag 2133

Claims

1.黄酮3β-羟化酶还原酶辅酶突变体，其特征在于，以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的酶为亲本，将亲本第626和641位同时突变，或是将亲本第453位的氨基酸突变。

2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体是将亲本第626位氨基酸突变为天冬酰胺并将第641位的氨基酸突变为天冬氨酸；或是将亲本的第453位突变为缬氨酸。

3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。

4.携带权利要求3所述基因的表达载体。

5.表达权利要求1或2所述突变体，或含有权利要求3所述基因的微生物细胞。

6.一种微生物细胞，其特征在于，在权利要求5所述微生物细胞中表达黄酮3β-羟化酶还原酶。

7.一种全细胞转化生产圣草酚的方法，其特征在于，以柚皮素为底物，在反应体系中加入权利要求6所述微生物细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将所述微生物细胞在25-32℃，200-250rpm培养16-18h，获得种子液，将种子液以1-5mL/100mL的量加入反应体系中。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，每隔10-12小时向反应体系中补加柚皮素，反应70-80小时。

10.权利要求1或2所述突变体，或权利要求3所述基因，或权利要求4所述表达载体，或权利要求5或6所述微生物细胞在生产圣草酚中的应用。