CN112391362B - 催化活性提高的黄酮3β-羟化酶突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了催化活性提高的黄酮3β‑羟化酶突变体及其应用，属于基因工程技术领域。本发明通过对水飞蓟来源的黄酮3β‑羟化酶进行突变，并筛选获得了使圣草酚产量提高的黄酮3β‑羟化酶突变体。将黄酮3β‑羟化酶突变体应用于圣草酚的生产中，可使得圣草酚的产量在摇瓶水平由出发菌株的805.6mg/L，分别提高到1017.8mg/L和1046.5mg/L，分别较原始黄酮3β‑羟化酶的产量提高26.3％和29.9％。

Description

催化活性提高的黄酮3β-羟化酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及催化活性提高的黄酮3β-羟化酶突变体及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
圣草酚(Eriodictyol)是一种重要的黄酮类化合物，对人体具有多种益处，如抗炎、抗衰老、抗氧化等作用，广泛应用于食品添加剂。同时也是多种高附加值化合物的前体，如黄杉素、花青素、水飞蓟及大风子素等。圣草酚主要来自于植物提取法，然而植物提取法有许多缺点，如需要高温、提取时间长、需要大量有机试剂等。而使用微生物法生产黄酮类化合物具有较高的潜力。
柚皮素(Naringenin)经过F3′H催化，可以在柚皮素3′引入羟基，从而获得圣草酚。由于F3′H属于P450酶(Cytochrome P450)，因此需要辅酶CPR辅助获得电子才具有催化功能，因此F3′H需要与CPR共表达才具有较好的催化功能。但是只有较少的F3′H及其辅酶CPR的催化功能被很好的验证，此外，由于F3′H/CPR需要锚定在内质网上才可以高效传递电子(图1)，因此大部分的F3′H/CPR在原核微生物中表达活性很低甚至没有活性。由于缺乏高效的F3′H/CPR，对F3′H/CPR表达模式的研究也较少，无法进一步对F3′H/CPR的表达强度进一步提高，目前已报道的使用F3′H催化柚皮素获得圣草酚的最高产量仅200mg/L(Amor,I.L.,et al.,Biotransformation of naringenin to eriodictyol by Saccharomycescerevisiea functionally expressing flavonoid3'hydroxylase.Nat Prod Commun,2010.5(12):p.1893–1898.)。在大肠杆菌中合成圣草酚的产量最高仅107mg/L(Zhu,S.,etal.,Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichiacoli.Appl Environ Microbiol,2014.80(10):p.3072–3080.)。
目前利用微生物法生产圣草酚的转化效率和产量都很低，限制了其在实际生产中的应用。
发明内容
本发明中出发基因为来源于水飞蓟的黄酮3β-羟化酶SmF3′H，因为SmF3′H的结构未知，通过理性改造进一步提高SmF3′H的酶活比较困难，为进一步提高圣草酚的合成，可以利用定向进化技术获得酶活提高的SmF3′H突变子，以及相应的高产圣草酚菌株，这对实现工业化微生物法生产圣草酚具有十分重要的意义。
本发明的第一个目的是提供黄酮3β-羟化酶突变体，所述突变体以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的黄酮3β-羟化酶为亲本，分别将亲本第344位，或第285位的氨基酸进行突变。
在本发明的一种实施方式中，亲本的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
在本发明的一种实施方式中，将亲本第344位氨基酸突变为丝氨酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，将亲本第285位氨基酸突变为天冬酰胺，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示黄酮3β-羟化酶突变体的编码基因序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，编码氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的黄酮3β-羟化酶突变体的编码基因序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明的第三个目的是提供携带编码所述突变体的基因的载体。
在本发明的一种实施方式中，所述载体为pY26-TEF-GPD。
本发明的第四个目的是提供表达所述突变体，或含有所述基因的微生物细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞为原核细胞或真核细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞为酿酒酵母。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞还表达黄酮3β-羟化酶辅酶，所述黄酮3β-羟化酶辅酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明的第五个目的是提供一种全细胞转化生产圣草酚的方法，将所述微生物细胞加入以柚皮素为底物的反应体系中。
在本发明的一种实施方式中，将所述微生物细胞在25-32℃，200-250rpm培养16-18h，获得种子培养基，将种子培养基以1-5mL/100mL的量加入反应体系中。
本发明的第六个目的是提供一种生产圣草酚的方法，将所述突变体加入含有柚皮素的反应体系中，与黄酮3β-羟化酶的辅酶共同作用，转化生产圣草酚。
本发明的第七个目的是提供所述突变体，或所述载体，或所述微生物细胞在生产圣草酚或以圣草酚为原料的产品中的应用。
有益效果：本发明通过对水飞蓟来源的黄酮3β-羟化酶进行突变，通过高通量的筛选方法，筛选到了能够使得圣草酚产量提高的黄酮3β-羟化酶突变体。在酿酒酵母中表达SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的编码黄酮3β-羟化酶突变体的基因，使黄酮3β-羟化酶催化柚皮素产圣草酚的能力提高，圣草酚产量由805.6mg/L分别提高至1017.8mg/L和1046.5mg/L，圣草酚的产量分别增加了26.3％和29.9％。通过将最佳突变体进行组合，在发酵罐水平首次获得了克级别的圣草酚积累，达到3.28g/L，是已报道最高产量的16.4倍。
附图说明
图1为通过随机突变对SmF3′H进行定向进化的示意图。
图2为定向进化获得的高产菌株及其圣草酚产量图。
图3为在5L发酵罐上进行发酵优化时圣草酚的产量变化图。
图4为高通量筛选示例。
具体实施方式
(1)YNB培养基：0.72g/L酵母氮源基础培养基、20g/L葡萄糖、50mg/L亮氨酸、50mg/L色氨酸、50mg/L组氨酸。
(2)YPD培养基：10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖。
固体培养基还需添加2g/L的琼脂粉。
(3)补料A：葡萄糖400g·L-1，KH2PO4 18g·L-1，MgSO4·7H2O 10.24g·L-1，K2SO47g·L-1，Na2SO4 0.56g·L-1，金属盐母液20mL·L-1，维生素母液24mL·L-1，根据需要添加各种氨基酸1g·L-1。
金属盐母液：ZnSO4·7H2O 5.75g·L-1，MnCl2·4H2O 0.32g·L-1，CoCl2·6H2O0.47g·L-1，NaMoO4·2H2O 0.48g·L-1，CaCl2·2H2O 2.9g·L-1，FeSO4·7H2O 2.8g·L-1，80mL的0.5M EDTA(pH 8.0)。
维生素母液：生物素(Biotin)0.05g·L-1，泛酸钙(Calcium pantothenate)1g·L-1，烟酸(Nicotinic acid)1g·L-1，myo-肌醇(myo-Inositol)25g·L-1，盐酸硫胺素(Thiamine HCl)1g·L-1，盐酸吡哆醛(Pyridoxal HCl)1g·L-1，p-氨基苯甲酸(p-Aminobenzoic acid)0.02g·L-1。
(4)补料B：柚皮素浓度为50g·L-1的95％乙醇溶液，超声波助溶后过滤除菌备用。
(5)高通量检测方法：随机组装库中的菌株在48深孔板中发酵后，使用配备了酶标仪的自动工作站，自动取100μL的发酵上清液转移到96浅孔酶标板孔内，再加入100μL的4MKOH。大约5min后，混合物会变成紫色，紫色的深浅与圣草酚的浓度呈正比，可以通过目测直接筛选高产菌株。在本章节中将变色的酶标板自动转移到酶标仪中在550nm下检测混合物的吸光值。根据自动导出的数据，选择吸光值高的菌株进入摇瓶复筛。
(6)高效液相检测方法：经过高通量筛选后，将产量最高的6株突变菌株、出发菌株C800P05和组合菌株pY26-mut12在250mL摇瓶中进行发酵后，取100μL发酵液，添加900μL甲醇，震荡混合均匀后，13500rpm离心5min，取上清备用。使用高效液相检测(Agilent 1100，US)发酵液中圣草酚的产量。装备C18反相色谱柱(4.6mm×250mm,Thermo)，柱温25℃。流动相为甲醇：水(41:59)并添加3‰的磷酸。流速1mL/min，进样量10μL，检测波长为290nm。
(7)pY26-P05的构建：
使用引物mut-F和mut-R环化扩增原始质粒pY26-TEF-GPD，再经过自连接获得caaggtttataa，在质粒pY26-TEF-GPD-mut引入新的酶切位点PmlI，构建得到pY26-TEF-GPD-mut用于后续构建质粒。
使用BamHI和PmlI内切酶分别酶切pMD-T-SmF3′H和pY26-TEF-GPD-mut，将酶切后的片段分别回收并进行连接获得pY26-GR。使用NotI和PacI内切酶分别酶切pMD-T-SmCPR和pY26-GR，将酶切后的片段进行回收并进行连接获得pY26-THGR。
将包含上述启动子PINO1(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)和PTDH1(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)的质粒pMD19T-PINO1和pMD19T-PTDH1(质粒的构建具体构建见文献Gao,S.,et al.,Promoter-library-based pathway optimization for efficient(2S)-naringenin production from p-coumaric acid in Saccharomyces cerevisiae.JAgric Food Chem,2020.68(25):p.6884-6891.)上扩增启动子序列。
使用引物PINO1-homo-F和PINO1-homo-R和从质粒pMD19T-PINO1扩增下启动子序列PINO1；
使用引物PTDH1-homo-F和PTDH1-homo-R和从质粒pMD19T-PTDH1扩增下启动子序列PTDH1；
使用引物pY26-THGR-homo-F和pY26-THGR-homo-R从质粒pY26-THGR上扩增载体骨架(包含基因SmF3′H和SmCPR，但是不包含启动子PTEF1和PGPD1)；
将载体骨架、扩增的启动子PINO1片段和扩增的启动子PTDH1片段使用胶回收方式进行回收，然后将三种产物混合至50μL(启动子PINO1：启动子组PTDH1：载体骨架＝2：2：1，mol/mol/mol，总计约2-3μg)，将混合的体系通过醋酸锂高效转化法(具体转化方法参见文献：Gietz,R.D.and R.A.Woods,Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.Methods Enzymol,2002.350:p.87–96.)转化到酿酒酵母菌株C800中，片段会在酿酒酵母体内完成组装，将转化体系涂布在YNB琼脂平板上，将琼脂板在30℃下孵育3-4天，待长出单菌落后，挑取单菌落并进行测序，测序正确的即为阳性转化子，利用酵母质粒提取试剂盒(购自赛默飞公司)提取质粒，即得到载体pY26-P05。
表1所用引物序列
Figure BDA0002759689550000041
实施例1：SmF3′H的定向进化
以出发质粒pY26-P05(pY26-PINO1-SmF3′H-PTDH1-SmCPR)为模板，使用易错PCR试剂盒GeneMorph II EZClone(Agilent，CA，US)对SmF3′H进行定向进化。使用引物SmF3′Hm-F和SmF3′Hm-R扩增并随机突变SmF3′H，同时使用引物9.4k-F和9.4k-R从质粒pY26-P05扩增载体骨架。PCR产物通过沉淀精制回收。随机突变的SmF3′H序列与线性化的载体骨架DNA片段共享约40bp的同源臂用于在酿酒酵母中同源重组(同源重组方式参见文献Gibson,D.G.,Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlappingoligonucleotides.2009,Nucleic Acids Res 37(20),6984-90.)。将突变的SmF3′H与线性化的载体骨架分别混合至50μL(2：1，mol/mol，总计约2-3μg)，将混合后的液体通过酿酒酵母高效转化法(转化方法记载于文献Gietz,R.D.and R.A.Woods,Transformation ofyeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycolmethod.Methods Enzymol,2002.350:p.87–96)转化到酿酒酵母菌株C800(菌株C800的构建见文献Gao,S.,et al.,Promoter-library-based pathway optimization for efficient(2S)-naringenin production from p-coumaric acid in Saccharomyces cerevisiae.JAgric Food Chem,2020.68(25):p.6884-6891.)中，将转化后的菌液使用无菌水稀释后涂布在YNB琼脂平板上。将琼脂平板在30℃下孵育3-5天，直到出现菌落，即构建了SmF3′H的突变子文库。
所有引物及基因序列均列在表1中。
实施例2：突变的筛选及应用
从突变子文库中随机挑选10 000-20000个单菌落进行高通量筛选，获得的高产菌株再进行摇瓶复筛，确定产量增加的菌株进行测序检测突变位点。
对定向进化文库中的菌株，使用48深孔板进行培养：使用自动挑菌落仪器QPix420自动将平板上的菌落接种到48深孔板中。每个孔中添加1.5mL YNB液体培基，培养基中含有终浓度为250mg·L-1的柚皮素。将深孔板转移到孔板摇床上(知楚，中国上海)，30℃，220rpm培养48小时。将深孔板置于桌面上2小时以沉淀细胞，上清液可用于高通量筛选。图4为高通量筛选结果示意，菌株的圣草酚产量越高，则孔板对应位置的发酵液上清液就颜色就越深。图4中C10孔所对应的菌株为潜在的高产菌株。C4孔对应的菌株为出发菌株。从图4可见，绝大部分突变菌株为负突变，极少数菌株为正突变。
经高通量筛选获得的菌株，进行250mL摇瓶复筛：挑取单菌落接种在含有20mL YNB液体培养基的250mL摇瓶中，30℃，220rpm培养16-18h，获得种子培养基。将种子培养基以2mL/100mL转接到装有20mL新鲜YPD液体培养基的250mL摇瓶中，30℃，220rpm培养72小时后检测圣草酚的产量。在第0h，12h，24h和36h时，分别将375mg·L-1柚皮素加入YPD培养基中，总共发酵72h。
经过检测，有两株圣草酚的产量提升显著，菌株名称为分别为204-5E和307-2G，两株菌的圣草酚产量分别为1017.8mg/L和1046.5mg/L，而出发菌株圣草酚的产量为805.6mg/L。突变菌株204-5E和307-2G圣草酚的产量较出发菌株C800P05分别增产26.3％和29.9％(图2)。菌株204-5E的突变位点为将第344位的精氨酸突变为丝氨酸；菌株307-2G的突变位点为将第285位的天冬氨酸突变为天冬酰胺。两株高产突变菌株对应的质粒为pY26-P05mut和pY26-P05mut1，pY26-P05mut的基因型为pY26-PINO1-SmF3′HR344S-PTDH1-SmCPR，pY26-P05mut1的基因型为pY26-PINO1-SmF3′HD285N-PTDH1-SmCPR。出发菌株C800P05对应的质粒命名为pY26-P05，基因型为pY26-PINO1-SmF3′H-PTDH1-SmCPR。
所有增产突变菌株的碱基及氨基酸突变列在表2中。
表2突变菌株的基因型
Figure BDA0002759689550000051
实施例3：突变菌株的发酵优化
将此突变体载体pY26-P05mut(pY26-PINO1-SmF3′HR344S-PTDH1-SmCPR)中的SmCPR第453位氨基酸突变为缬氨酸，获得质粒pY26-P05mut12(pY26-PINO1-SmF3′HR344S-PTDH1-SmCPRI453V)，将质粒pY26-P05mut12转化入菌株C800，获得菌株C800P05mut12。
挑取至少10个菌株C800P05mut12的单菌落接种在含有20mL YNB液体培养基的250mL摇瓶中，30℃，220rpm培养16-18h，获得种子培养基。将种子培养基以2mL/100mL转接到到装有20mL新鲜YPD液体培养基的250mL摇瓶中，30℃，220rpm培养72小时后检测圣草酚的产量。在第0h，12h，24h和36h时，分别将375mg·L-1柚皮素加入YPD培养基中。
在5L发酵罐水平对菌株C800P05mut12进行发酵优化：种子培养物的制备与在250-mL发酵条件下制备种子液相同，将种子发酵液以2mL/100mL转接到到装有2.5L新鲜的YPD培养基的5-L发酵罐中。控制温度为30℃，转速600rpm，通气速率为3vvn。在15小时后，用4MNaOH维持pH＝5.5±0.1，并同时开始补充流加培养基A和流加培养基B，流速根据优化条件设定为2.5mL·h-1和5mL·h-1、3.8mL·h-1和7.5mL·h-1、5mL·h-1和10mL·h-1。当在YPD培养基中流加的柚皮素总浓度达到5.00g·L-1时，同时停止补料A和B。
组合菌株C800P05mut12在在5L发酵罐进行发酵优化。在流加培养基A和B的补料速度分别为2.5和5.0mL·h-1、3.8和7.5mL·h-1和5.0和10.0mL·h-1时，圣草酚的产量为2.68g·L-1(图3A)、3.28g·L-1(图3B)和3.07g·L-1(图3C)。柚皮素的转化率分别为50.6％，62.0％和58.0％。发酵液OD600的最大值分别为218、170和232。本发明中中，首次获得了克级别的圣草酚产量，达到3.28g·L-1，为目前已知的最高产量，是已报道最高产量的16.4倍。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 催化活性提高的黄酮3β-羟化酶突变体及其应用
<130> BAA201246A
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 518
<212> PRT
<213> Silybum marianum
<400> 1
Met Thr Ile Leu Pro Leu Leu Leu Tyr Ala Ser Ile Thr Gly Leu Leu
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
His Leu Gly Arg Ile Pro His His Ala Leu Ala Ala Met Ala Thr Lys
50 55 60
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180 185 190
Val Phe Val Asp Gly Ser Glu Gly Asn Arg Asp Ala Asp Glu Phe Lys
195 200 205
Asp Met Val Val Glu Val Met Val Leu Ala Gly Glu Phe Asn Ile Gly
210 215 220
Asp Phe Ile Pro Ala Leu Asp Trp Leu Asp Leu Gln Ser Val Thr Lys
225 230 235 240
Lys Met Lys Lys Leu His Leu Arg Phe Asp Ser Phe Leu Asn Lys Ile
245 250 255
Leu Glu Asp His Arg Asn Gly Gly Asp Val Thr Ser Gly Asn Val Asp
260 265 270
Leu Leu Ser Thr Leu Ile Ser Leu Lys Asp Asp Ala Asp Gly Glu Gly
275 280 285
Gly Lys Leu Ser Asp Ile Glu Ile Lys Ala Leu Leu Leu Asn Leu Phe
290 295 300
Thr Ala Gly Thr Asp Thr Ser Ser Ser Thr Val Glu Trp Ala Met Ala
305 310 315 320
Glu Leu Ile Arg His Pro Gln Leu Leu Lys Gln Ala Gln Glu Glu Leu
325 330 335
Asp Thr Val Val Gly Lys Asp Arg Leu Val Ser Glu Leu Asp Leu Ser
340 345 350
Arg Leu Thr Phe Leu Glu Ala Ile Val Lys Glu Thr Phe Arg Leu His
355 360 365
Pro Ser Thr Pro Leu Ser Leu Pro Arg Ile Ala Ser Glu Ser Cys Glu
370 375 380
Val Asp Gly Tyr Tyr Ile Pro Lys Gly Thr Thr Leu Leu Val Asn Val
385 390 395 400
Trp Ala Ile Ala Arg Asp Pro Lys Met Trp Thr Asp Pro Leu Glu Phe
405 410 415
Arg Pro Thr Arg Phe Leu Pro Gly Gly Glu Lys Pro Asn Ala Asn Val
420 425 430
Lys Gly Asn Asp Phe Glu Ile Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile
435 440 445
Cys Ala Gly Met Ser Leu Gly Leu Arg Met Val Gln Leu Leu Thr Ala
450 455 460
Thr Leu Val His Ala Phe Asp Trp Lys Leu Ala Asn Gly Leu Asp Pro
465 470 475 480
Glu Lys Leu Asn Met Glu Glu Ala Tyr Gly Leu Thr Leu Gln Arg Ala
485 490 495
Ala Pro Leu Met Val His Pro Thr Pro Arg Leu Ala Pro His Leu Tyr
500 505 510
Glu Ser Ser Gln Gly Leu
515
<210> 2
<211> 518
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Thr Ile Leu Pro Leu Leu Leu Tyr Ala Ser Ile Thr Gly Leu Leu
1 5 10 15
Ile Tyr Val Leu Leu Asn Leu Arg Thr Thr Pro Arg Ser Asn His Leu
20 25 30
Pro Leu Pro Pro Gly Pro Thr Pro Trp Pro Ile Ile Gly Asn Leu Pro
35 40 45
His Leu Gly Arg Ile Pro His His Ala Leu Ala Ala Met Ala Thr Lys
50 55 60
Tyr Gly Pro Leu Met His Leu Arg Leu Gly Val Val Asp Val Val Val
65 70 75 80
Ala Ala Ser Ala Ser Val Ala Ala Gln Phe Leu Lys Val His Asp Ala
85 90 95
Asn Phe Ala Ser Arg Pro Pro Asn Ser Gly Ala Lys His Ile Ala Tyr
100 105 110
Asn Tyr Gln Asp Leu Val Phe Ala Pro Tyr Gly Gln Lys Trp Arg Met
115 120 125
Leu Arg Lys Ile Cys Ser Val His Leu Phe Ser Asn Lys Ala Leu Asp
130 135 140
Asp Phe Arg His Val Arg Gln Glu Glu Val Ala Ile Leu Val Arg Ala
145 150 155 160
Leu Ala Gly Ala Gly Arg Ser Thr Ala Ala Ala Leu Gly Gln Leu Leu
165 170 175
Asn Val Cys Thr Thr Asn Ala Leu Ala Arg Val Met Leu Gly Arg Arg
180 185 190
Val Phe Val Asp Gly Ser Glu Gly Asn Arg Asp Ala Asp Glu Phe Lys
195 200 205
Asp Met Val Val Glu Val Met Val Leu Ala Gly Glu Phe Asn Ile Gly
210 215 220
Asp Phe Ile Pro Ala Leu Asp Trp Leu Asp Leu Gln Ser Val Thr Lys
225 230 235 240
Lys Met Lys Lys Leu His Leu Arg Phe Asp Ser Phe Leu Asn Lys Ile
245 250 255
Leu Glu Asp His Arg Asn Gly Gly Asp Val Thr Ser Gly Asn Val Asp
260 265 270
Leu Leu Ser Thr Leu Ile Ser Leu Lys Asp Asp Ala Asp Gly Glu Gly
275 280 285
Gly Lys Leu Ser Asp Ile Glu Ile Lys Ala Leu Leu Leu Asn Leu Phe
290 295 300
Thr Ala Gly Thr Asp Thr Ser Ser Ser Thr Val Glu Trp Ala Met Ala
305 310 315 320
Glu Leu Ile Arg His Pro Gln Leu Leu Lys Gln Ala Gln Glu Glu Leu
325 330 335
Asp Thr Val Val Gly Lys Asp Ser Leu Val Ser Glu Leu Asp Leu Ser
340 345 350
Arg Leu Thr Phe Leu Glu Ala Ile Val Lys Glu Thr Phe Arg Leu His
355 360 365
Pro Ser Thr Pro Leu Ser Leu Pro Arg Ile Ala Ser Glu Ser Cys Glu
370 375 380
Val Asp Gly Tyr Tyr Ile Pro Lys Gly Thr Thr Leu Leu Val Asn Val
385 390 395 400
Trp Ala Ile Ala Arg Asp Pro Lys Met Trp Thr Asp Pro Leu Glu Phe
405 410 415
Arg Pro Thr Arg Phe Leu Pro Gly Gly Glu Lys Pro Asn Ala Asn Val
420 425 430
Lys Gly Asn Asp Phe Glu Ile Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile
435 440 445
Cys Ala Gly Met Ser Leu Gly Leu Arg Met Val Gln Leu Leu Thr Ala
450 455 460
Thr Leu Val His Ala Phe Asp Trp Lys Leu Ala Asn Gly Leu Asp Pro
465 470 475 480
Glu Lys Leu Asn Met Glu Glu Ala Tyr Gly Leu Thr Leu Gln Arg Ala
485 490 495
Ala Pro Leu Met Val His Pro Thr Pro Arg Leu Ala Pro His Leu Tyr
500 505 510
Glu Ser Ser Gln Gly Leu
515
<210> 3
<211> 518
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Thr Ile Leu Pro Leu Leu Leu Tyr Ala Ser Ile Thr Gly Leu Leu
1 5 10 15
Ile Tyr Val Leu Leu Asn Leu Arg Thr Thr Pro Arg Ser Asn His Leu
20 25 30
Pro Leu Pro Pro Gly Pro Thr Pro Trp Pro Ile Ile Gly Asn Leu Pro
35 40 45
His Leu Gly Arg Ile Pro His His Ala Leu Ala Ala Met Ala Thr Lys
50 55 60
Tyr Gly Pro Leu Met His Leu Arg Leu Gly Val Val Asp Val Val Val
65 70 75 80
Ala Ala Ser Ala Ser Val Ala Ala Gln Phe Leu Lys Val His Asp Ala
85 90 95
Asn Phe Ala Ser Arg Pro Pro Asn Ser Gly Ala Lys His Ile Ala Tyr
100 105 110
Asn Tyr Gln Asp Leu Val Phe Ala Pro Tyr Gly Gln Lys Trp Arg Met
115 120 125
Leu Arg Lys Ile Cys Ser Val His Leu Phe Ser Asn Lys Ala Leu Asp
130 135 140
Asp Phe Arg His Val Arg Gln Glu Glu Val Ala Ile Leu Val Arg Ala
145 150 155 160
Leu Ala Gly Ala Gly Arg Ser Thr Ala Ala Ala Leu Gly Gln Leu Leu
165 170 175
Asn Val Cys Thr Thr Asn Ala Leu Ala Arg Val Met Leu Gly Arg Arg
180 185 190
Val Phe Val Asp Gly Ser Glu Gly Asn Arg Asp Ala Asp Glu Phe Lys
195 200 205
Asp Met Val Val Glu Val Met Val Leu Ala Gly Glu Phe Asn Ile Gly
210 215 220
Asp Phe Ile Pro Ala Leu Asp Trp Leu Asp Leu Gln Ser Val Thr Lys
225 230 235 240
Lys Met Lys Lys Leu His Leu Arg Phe Asp Ser Phe Leu Asn Lys Ile
245 250 255
Leu Glu Asp His Arg Asn Gly Gly Asp Val Thr Ser Gly Asn Val Asp
260 265 270
Leu Leu Ser Thr Leu Ile Ser Leu Lys Asp Asp Ala Asn Gly Glu Gly
275 280 285
Gly Lys Leu Ser Asp Ile Glu Ile Lys Ala Leu Leu Leu Asn Leu Phe
290 295 300
Thr Ala Gly Thr Asp Thr Ser Ser Ser Thr Val Glu Trp Ala Met Ala
305 310 315 320
Glu Leu Ile Arg His Pro Gln Leu Leu Lys Gln Ala Gln Glu Glu Leu
325 330 335
Asp Thr Val Val Gly Lys Asp Arg Leu Val Ser Glu Leu Asp Leu Ser
340 345 350
Arg Leu Thr Phe Leu Glu Ala Ile Val Lys Glu Thr Phe Arg Leu His
355 360 365
Pro Ser Thr Pro Leu Ser Leu Pro Arg Ile Ala Ser Glu Ser Cys Glu
370 375 380
Val Asp Gly Tyr Tyr Ile Pro Lys Gly Thr Thr Leu Leu Val Asn Val
385 390 395 400
Trp Ala Ile Ala Arg Asp Pro Lys Met Trp Thr Asp Pro Leu Glu Phe
405 410 415
Arg Pro Thr Arg Phe Leu Pro Gly Gly Glu Lys Pro Asn Ala Asn Val
420 425 430
Lys Gly Asn Asp Phe Glu Ile Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile
435 440 445
Cys Ala Gly Met Ser Leu Gly Leu Arg Met Val Gln Leu Leu Thr Ala
450 455 460
Thr Leu Val His Ala Phe Asp Trp Lys Leu Ala Asn Gly Leu Asp Pro
465 470 475 480
Glu Lys Leu Asn Met Glu Glu Ala Tyr Gly Leu Thr Leu Gln Arg Ala
485 490 495
Ala Pro Leu Met Val His Pro Thr Pro Arg Leu Ala Pro His Leu Tyr
500 505 510
Glu Ser Ser Gln Gly Leu
515
<210> 4
<211> 1557
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgactatcc tacccctgct actctacgcc tccataactg gtttactaat ctatgtattg 60
cttaacctac gcaccacccc tcgttctaac cacctcccac tcccacccgg cccaacccca 120
tggccaatca tcggaaactt acctcatctt ggaagaatac cgcaccatgc gctggcggcc 180
atggctacaa agtacggccc gttgatgcat ctccggctcg gcgtcgttga cgtggtggtg 240
gcggcgtctg cgtcggtggc ggcacagttt ttgaaggttc atgacgccaa tttcgcgagt 300
aggccgccga actccggcgc gaaacacatc gcgtataatt atcaggatct ggtgtttgca 360
ccttatggtc agaaatggcg gatgcttagg aagatttgct ccgtgcatct gttctctaac 420
aaagcactcg atgatttccg tcacgttcgt caggaggagg tggcgattct ggtgcgcgct 480
ttggccggag ccggtcgatc tacggcggcg gcgttaggtc aactacttaa cgtttgcacc 540
acaaacgcgt tggcacgagt gatgttaggt cggagagtgt tcgtggacgg aagtgaaggc 600
aatcgagacg cggatgaatt caaggatatg gtggttgaag tgatggtatt ggccggagaa 660
ttcaacatcg gcgacttcat tccggcgctt gattggctgg atctgcaaag cgtgacgaag 720
aagatgaaga aactccatct ccgattcgat tcgtttctta acaaaatcct ggaagaccat 780
agaaatggag gtgacgtcac ttcgggtaac gtggatttgc tgagcacgtt gatttcgctc 840
aaggatgacg ccgatggaga gggcgggaag ctttcagata tcgaaatcaa agctttgctt 900
ctgaatttat tcactgcggg aacagacaca tcatctagta cggtggaatg ggcaatggct 960
gaactcattc gccatccgca attattgaag caagcccaag aagaattgga cactgttgtt 1020
ggtaaagaca gccttgtatc cgaattggac ctgagtagac taacattcct cgaagccatt 1080
gtgaaggaaa ccttcaggct ccacccatcg accccactct ctttgccacg gattgcatca 1140
gagagctgtg aagtcgatgg gtattacatt cctaagggaa ccacacttct tgttaacgtg 1200
tgggccattg cccgagaccc aaaaatgtgg accgacccgc ttgaattccg acccacccgg 1260
ttcttgccgg gaggtgaaaa gccgaatgct aatgtaaagg gaaatgattt tgaaataata 1320
ccgtttgggg ctggtcgaag gatttgtgcg ggtatgagcc tagggttacg gatggttcag 1380
ttgctcactg cgactctggt tcatgccttt gattggaaat tggctaacgg gttagaccca 1440
gagaagctca atatggaaga agcttatggg ttgacccttc aaagggctgc acccttgatg 1500
gtgcacccaa ccccacggtt agctccccat ttgtatgaaa gcagtcaagg tttataa 1557
<210> 5
<211> 1557
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgactatcc tacccctgct actctacgcc tccataactg gtttactaat ctatgtattg 60
cttaacctac gcaccacccc tcgttctaac cacctcccac tcccacccgg cccaacccca 120
tggccaatca tcggaaactt acctcatctt ggaagaatac cgcaccatgc gctggcggcc 180
atggctacaa agtacggccc gttgatgcat ctccggctcg gcgtcgttga cgtggtggtg 240
gcggcgtctg cgtcggtggc ggcacagttt ttgaaggttc atgacgccaa tttcgcgagt 300
aggccgccga actccggcgc gaaacacatc gcgtataatt atcaggatct ggtgtttgca 360
ccttatggtc agaaatggcg gatgcttagg aagatttgct ccgtgcatct gttctctaac 420
aaagcactcg atgatttccg tcacgttcgt caggaggagg tggcgattct ggtgcgcgct 480
ttggccggag ccggtcgatc tacggcggcg gcgttaggtc aactacttaa cgtttgcacc 540
acaaacgcgt tggcacgagt gatgttaggt cggagagtgt tcgtggacgg aagtgaaggc 600
aatcgagacg cggatgaatt caaggatatg gtggttgaag tgatggtatt ggccggagaa 660
ttcaacatcg gcgacttcat tccggcgctt gattggctgg atctgcaaag cgtgacgaag 720
aagatgaaga aactccatct ccgattcgat tcgtttctta acaaaatcct ggaagaccat 780
agaaatggag gtgacgtcac ttcgggtaac gtggatttgc tgagcacgtt gatttcgctc 840
aaggatgacg ccaatgggga gggcgggaag ctttcagata tcgaaatcaa agctttgctt 900
ctgaatttat tcactgcggg aacagacaca tcatctagta cggtggaatg ggcaatggct 960
gaactcattc gccatccgca attattgaag caagcccaag aagaattgga cactgttgtt 1020
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ttcttgccgg gaggtgaaaa gccgaatgct aatgtaaagg gaaatgattt tgaaataata 1320
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ttgctcactg cgactctggt tcatgccttt gattggaaat tggctaacgg gttagaccca 1440
gagaagctca atatggaaga agcttatggg ttgacccttc aaagggctgc acccttgatg 1500
gtgcacccaa ccccacggtt agctccccat ttgtatgaaa gcagtcaagg tttataa 1557
<210> 6
<211> 510
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gaagacgatg aggccggtgc cgatgtgccc ttgatggaca acaaacaaca gctctcttcc 60
ggccgtactt agtgatcgga acgagctctt tatcaccgta gttctaaata acacatagag 120
taaattattg cctttttctt cgttcctttt gttcttcacg tcctttttat gaaatacgtg 180
ccggtgttcc ggggttggat gcggaatcga aagtgttgaa tgtgaaatat gcggaggcca 240
agtatgcgct tcggcggcta aatgcggcat gtgaaaagta ttgtctattt tatcttcatc 300
cttctttccc agaatattga acttatttaa ttcacatgga gcagagaaag cgcacctctg 360
cgttggcggc aatgttaatt tgagacgtat ataaattgga gctttcgtca cctttttttg 420
gcttgttctg ttgtcgggtt cctaatgtta gttttatcct tgatttattc tgtttcattc 480
cctttttttt ccagtgaaaa agaagtaaca 510
<210> 7
<211> 530
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gaaaccacac cgtggggcct tgttgcgcta ggaataggat atgcgacgaa gacgcttctg 60
cttagtaacc acaccacatt ttcagggggt cgatctgctt gcttccttta ctgtcacgag 120
cggcccataa tcgcgctttt tttttaaaag gcgcgagaca gcaaacagga agctcgggtt 180
tcaaccttcg gagtggtcgc agatctggag actggatctt tacaatacag taaggcaagc 240
caccatctgc ttcttaggtg catgcgacgg tatccacgtg cagaacaaca tagtctgaag 300
aaggggggga ggagcatgtt cattctctgt agcagtaaga gcttggtgat aatgaccaaa 360
actggagtct cgaaatcata taaatagaca atatattttc acacaatgag atttgtagta 420
cagttctatt ctctctcttg cataaataag aaattcatca agaacttggt ttgatatttc 480
accaacacac acaaaaaaca gtacttcact aaatttacac acaaaacaaa 530
<210> 8
<211> 2133
<212> DNA
<213> Silybum marianum
<400> 8
atgcaatcgg actcgtctct ggaaacgtcg tcgtttgatt tgattaccgc agctcttaag 60
gagaaagtta ttgatacagc aaacgcatct gatagtggag attcaacgat gcctccggct 120
ttggcgatga ttttggaaaa ccgtgagctg tttatgatgc tgactacaac agtggctctt 180
ttgcttggat ttattgtcgt ttcgttctgg aagagatctt ctgagaagaa gtcggctaag 240
gatttggagc taccgaagat cgttgtgcct aagagacagc aggaacagga ggttgatgac 300
ggtaagaaga aggttacgat tctttttgga acgcagaccg gaacggcgga aggtttcgct 360
aaggcactgt tggaagaagc taaagcgcga tatgaaaagg cgacctttaa agtagtcgat 420
ttggatgatt atgctgttga tgatgatgag tacgaagaga aactaaagaa ggagtcattt 480
gctttcttct tcttggctac atatggagat ggtgagccaa ctgataatgc tgccagattt 540
tataaatggt ttacagaggg aggtgagaaa ggagtttggc ttgaaaagct tcaatatgga 600
gtatttggcc ttggcaatag acaatacgag catttcaaca agattgcaaa agaggttgac 660
gatggtctcg cagagcaggg tgcaaagcgc cttgttccag ttggccttgg agatgatgat 720
caatccattg aagatgattt tactgcatgg aaagagttag tgtggcctga gttggatgaa 780
ttgcttcgtg acgaggatga caaaggcgtt gctactcctt acacagctgc tattccggaa 840
taccgagttg tgtttcatga gaaacatgat acatctgctg aagatcaaat tcagacaaat 900
ggtcatgctg ttcatgatgc tcaacatcca tgcagatcca atgtggctgt taaaaaggag 960
ctccataccc ctgaatctga tcgctcttgc acgcatctgg aatttgacat ctcacacact 1020
ggactatcat acgaaactgg ggaccatgtt ggtgtctact gtgagaactt aagtgaagtt 1080
gtggaggagg ctgagaggtt aataggttta ccatcggata cttatttctc agttcacacg 1140
gataacgaag atggaacacc acttggtgga gcttccttac tacctccttt ccctccatgc 1200
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ttgattgctc tagctgctca tgcttctgat cctactgaag ctgaacgact aaaatttctt 1320
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cttgaggtca tggaagcttt cccatcggct aagcctccac ttggggtttt ctttgcagct 1440
attgctccac gcttacagcc tcgatactac tctatttctt cctccccgaa gatggcacct 1500
agcaggattc atgttacttg tgcattagtt tatgagaaaa cacctgcagg ccgtctccat 1560
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agctgggcac ctattttcgt tagaacgtct aacttcagac ttcccactga tcctaaagtt 1680
cctgttatca tgattggccc tggaaccgga ttggctccgt tcagaggttt tcttcaagaa 1740
agattagctc tgaaggaagc cggaactgaa ctgggatcat ccattttatt cttcggatgt 1800
agaaatcgca aagtggattt catatatgag aatgaactga aagactttgt tgagaatggt 1860
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cataaaatga gcgatagggc ttcggatcta tggaacttgc tttcggaggg agcatattta 1980
tacgtttgtg gtgatgccaa aggcatggct aaagatgtac accggaccct tcacacaatt 2040
gtgcaagaac agggatctct agactcgtca aaggcagagc tgtatgtgaa gaatctacaa 2100
atgtcaggaa gatacctccg tgatgtttgg tag 2133
<210> 9
<211> 1557
<212> DNA
<213> Silybum marianum
<400> 9
atgactatcc tacccctgct actctacgcc tccataactg gtttactaat ctatgtattg 60
cttaacctac gcaccacccc tcgttctaac cacctcccac tcccacccgg cccaacccca 120
tggccaatca tcggaaactt acctcatctt ggaagaatac cgcaccatgc gctggcggcc 180
atggctacaa agtacggccc gttgatgcat ctccggctcg gcgtcgttga cgtggtggtg 240
gcggcgtctg cgtcggtggc ggcacagttt ttgaaggttc atgacgccaa tttcgcgagt 300
aggccgccga actccggcgc gaaacacatc gcgtataatt atcaggatct ggtgtttgca 360
ccttatggtc agaaatggcg gatgcttagg aagatttgct ccgtgcatct gttctctaac 420
aaagcactcg atgatttccg tcacgttcgt caggaggagg tggcgattct ggtgcgcgct 480
ttggccggag ccggtcgatc tacggcggcg gcgttaggtc aactacttaa cgtttgcacc 540
acaaacgcgt tggcacgagt gatgttaggt cggagagtgt tcgtggacgg aagtgaaggc 600
aatcgagacg cggatgaatt caaggatatg gtggttgaag tgatggtatt ggccggagaa 660
ttcaacatcg gcgacttcat tccggcgctt gattggctgg atctgcaaag cgtgacgaag 720
aagatgaaga aactccatct ccgattcgat tcgtttctta acaaaatcct ggaagaccat 780
agaaatggag gtgacgtcac ttcgggtaac gtggatttgc tgagcacgtt gatttcgctc 840
aaggatgacg ccgatggaga gggcgggaag ctttcagata tcgaaatcaa agctttgctt 900
ctgaatttat tcactgcggg aacagacaca tcatctagta cggtggaatg ggcaatggct 960
gaactcattc gccatccgca attattgaag caagcccaag aagaattgga cactgttgtt 1020
ggtaaagacc ggcttgtatc cgaattggac ctgagtagac taacattcct cgaagccatt 1080
gtgaaggaaa ccttcaggct ccacccatcg accccactct ctttgccacg gattgcatca 1140
gagagctgtg aagtcgatgg gtattacatt cctaagggaa ccacacttct tgttaacgtg 1200
tgggccattg cccgagaccc aaaaatgtgg accgacccgc ttgaattccg acccacccgg 1260
ttcttgccgg gaggtgaaaa gccgaatgct aatgtaaagg gaaatgattt tgaaataata 1320
ccgtttgggg ctggtcgaag gatttgtgcg ggtatgagcc tagggttacg gatggttcag 1380
ttgctcactg cgactctggt tcatgccttt gattggaaat tggctaacgg gttagaccca 1440
gagaagctca atatggaaga agcttatggg ttgacccttc aaagggctgc acccttgatg 1500
gtgcacccaa ccccacggtt agctccccat ttgtatgaaa gcagtcaagg tttataa 1557

Claims (9)

1.黄酮3β-羟化酶突变体，其特征在于，所述突变体以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的黄酮3β-羟化酶为亲本，将亲本第344位的精氨酸突变为丝氨酸，或将第285位的天冬氨酸突变为天冬酰胺。
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的载体。
4.表达权利要求1所述突变体、或含有权利要求2所述基因的微生物细胞。
5.根据权利要求4所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞还表达黄酮3β-羟化酶辅酶。
6.一种全细胞转化生产圣草酚的方法，其特征在于，将权利要求4或5所述微生物细胞加入以柚皮素为底物的反应体系中。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将所述微生物细胞在25-32℃，200-250rpm培养16-18h，获得种子液，将种子液以1-5mL/100mL的量加入反应体系中。
8.一种生产圣草酚的方法，其特征在于，将权利要求1所述突变体加入含有柚皮素的反应体系中，与黄酮3β-羟化酶的辅酶共同作用，转化生产圣草酚。
9.权利要求1所述突变体、或权利要求3所述载体、或权利要求4或5所述微生物细胞在生产圣草酚或以圣草酚为原料的产品中的应用。
CN202011213884.0A 2020-11-04 2020-11-04 催化活性提高的黄酮3β-羟化酶突变体及其应用 Active CN112391362B (zh)

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