CN111434773A

CN111434773A - 一种高产檀香油的重组酵母菌及其构建方法与应用

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Publication number: CN111434773A
Application number: CN201910035457.9A
Authority: CN
Inventors: 张雁; 张立新; 胡逸灵
Original assignee: East China University of Science and Technology; Tianjin University
Current assignee: East China University of Science and Technology; Tianjin University
Priority date: 2019-01-15
Filing date: 2019-01-15
Publication date: 2020-07-21
Anticipated expiration: 2039-01-15
Also published as: CN111434773B

Abstract

本发明公开了一种高产檀香油的重组酵母菌及其构建方法与应用，方法为：1)利用同源重组的方式将强启动子驱动的酿酒酵母菌来源的乙酰乙酰‑CoA硫解酶基因等基因，以及弱启动子驱动的CYP450还原酶基因整合入出发菌株酿酒酵母BY4742基因组；2)替换重组菌体内角鲨烯合酶基因的启动子；敲除半乳糖调节蛋白80基因等基因；3)在多拷贝游离型质粒中插入强启动子驱动的檀香烯合酶基因和CYP450单加氧酶基因得到表达质粒，并导入步骤(2)获得的重组酿酒酵母菌中，得到高产檀香油的重组酿酒酵母菌。本发明克服了檀香油的生产均为从檀木中提取的不足，重组酵母菌株每升檀香油产量达到1g。满足工业化生产。

Description

一种高产檀香油的重组酵母菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种通过基因工程改造优化的高产檀香油的酵母菌株及其构建方法与应用。

背景技术

檀香油(Sandalwood Oil)属于倍半萜类化合物，主要存在于檀木的芯材中，是广泛应用的香料。檀香油主组分是四种醇的混合物，分别是α-檀香醇(α-santalol)，α-exo-bergamotol,epi-β-santalol和β-檀香醇(β-santalol)，其中，决定檀香油品质的是檀香醇的含量(Baldovini N,Delasalle C,Joulain D.Phytochemistry of the heartwood fromfragrant Santalum species:a review[J].Flavour and Fragrance Journal,2011,26(1):7-26.)，檀香油因其浓郁的芳香，广泛应用于化妆品、香水和芳香保健领域(Page T,Southwell I,Russell M,et al.Geographic and Phenotypic Variation in Heartwoodand Essential-Oil Characters in Natural Populations of Santalumaustrocaledonicumin Vanuatu[J].Chemistry&biodiversity,2010,7(8):1990-2006.)，而且，檀香油具有抗癌(皮肤癌、乳腺癌、口腔癌、前列腺癌)(Dwivedi C,Guan X,Harmsen WL,et al.Chemopreventive effects ofα-santalol on skin tumor development in CD-1and SENCAR mice[J].Cancer Epidemiology Biomarkers&Prevention,2003,12(2):151-156.Zhang X,Wei C,Guillermo R,et al.Alpha-santalol,a chemopreventive agentagainst skin cancer,causes G 2/M cell cycle arrest in both p53-mutated humanepidermoid carcinoma A431cells and p53wild-type human melanoma UACC-62cells[J].BMC Research Notes,2010,3(1):1-15.Banerjee S,Ecavade A,Rao A R.Modulatoryinfluence of sandalwood oil on mouse hepatic glutathione S-transferaseactivity and acid soluble sulphydryl level[J].Cancer Letters,1993,68(2-3):105-109.)、镇定和利尿的药用功能(Jones C,Plummer J,Barbour E,et al.GeneticDiversity of an Australian Santalum album Collection—Implications For TreeImprovement Potential[J].Silvae Genetica,2009,58(5):279.)，在中药，印度药和按摩精油和保健品中广泛应用。檀香油具有巨大的商业市场，是一种高价值植物天然产物(Kumar AA,Joshi G,Ram H M.Sandalwood:history,uses,present status and thefuture[J].Current Science,2012,103(12):1408-1416.Doroghazi J R,Albright J C,Goering AW,et al.Aroadmap for natural product discovery based on large-scalegenomics and metabolomics[J].Nature chemical biology,2014,10(11):963-968.)。由于檀香油的复杂环状结构和多个手性中心，化学合成法的大规模工业生产基本不可行。目前檀香油的制备主要依靠从檀木芯材中蒸馏萃取获得，檀木生长周期长，萃取得率低，环境破坏大。由于檀木的过度开发，印度已严格管控檀木砍伐。随着原木的价格节节攀升，檀香油的大额交易价格目前已突破4500美元/Kg(李钢.TFS檀香油打入皮肤病制药市场揽获巨额投资.[OL],http://www.acbnewsonline.com.au/html/2015/companynews_0112/12190.html.)。随着生物技术的不断革新，尤其是系统生物学和合成生物学的快速发展，使得利用微生物发酵生产檀香油成为可能。

异源微生物合成是将目标天然产物的生物合成途径导入到特定的异源宿主中，通过宿主的代谢途径优化，使得目标化合物异源高产。其中，酿酒酵母与其他常规宿主相比，因其很早就作为益生菌在酿酒和米面发酵上广泛应用，而具有独特的生物安全性。酿酒酵母宿主具有以下显著优势：1)通过特异性酶促反应得到的专一性产物有效降低纯化分离难度；2)发酵生产技术成熟、成本低廉；3)对生态环境的影响小；4)遗传背景清晰、生物安全；4)代谢工程、酶工程、发酵工程等成熟技术手段可以实现产物的大规模量产(Nielsen J,Larsson C,Van Maris A,et al.Metabolic engineering of yeast for production offuels and chemicals[J].Current opinion in biotechnology,2013,24(3):398-404.)。然而跨物种异源表达催化这类小分子合成所需的酶，存在很多技术壁垒，目前檀香油的微生物发酵工业生产未有任何成功案例。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高产檀香油的重组酵母菌。

本发明的第二个目的是提供一种高产檀香油的重组酵母菌的构建方法。

本发明的第三个目的是提供一种高产檀香油的重组酵母菌发酵生产檀香油的应用。

本发明的技术方案概述如下：

高产檀香油的重组酿酒酵母菌的构建方法，包括如下步骤：

1)利用同源重组的方式将强启动子驱动的酿酒酵母菌来源的乙酰乙酰-CoA硫解酶基因、HMG-CoA合酶基因、截短型HMG-CoA还原酶基因、甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、异戊烯基焦磷酸异构酶基因、法尼基焦磷酸合酶基因、人工合成的3-磷酸甘油脱氢酶基因，以及弱启动子驱动的CYP450还原酶基因整合入出发菌株酿酒酵母BY4742基因组；

2)用SEQ NO.1所示序列替换步骤(1)获得的重组菌体内角鲨烯合酶基因的启动子；敲除半乳糖调节蛋白80基因、第一种焦磷酸磷酸酶基因和第二种焦磷酸磷酸酶基因；

3)在多拷贝游离型质粒中插入强启动子驱动的檀香烯合酶基因和CYP450单加氧酶基因得到表达质粒，并导入步骤(2)获得的重组酿酒酵母菌中，得到高产檀香油的重组酿酒酵母菌。

强启动子是诱导型双向强启动子GAL1-10，所述诱导型双向强启动子GAL1-10的核苷酸序列如SEQ NO.2所示。

弱启动子为弱启动子GAL3，弱启动子GAL3的核苷酸序列如SEQ NO.3所示，所述乙酰乙酰-CoA硫解酶基因的NCBI数据库编号为856079，HMG-CoA合酶基因的NCBI数据库编号为854913，截短型HMG-CoA还原酶基因的核苷酸序列如SEQ NO.4所示，甲羟戊酸激酶基因的NCBI数据库编号为855248，磷酸甲羟戊酸激酶基因的NCBI数据库编号为855260，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因的NCBI数据库编号为855779，异戊烯基焦磷酸异构酶基因的NCBI数据库编号为855986，法尼基焦磷酸合酶基因的NCBI数据库编号为853272，人工合成的3-磷酸甘油脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ NO.5所示，CYP450还原酶基因的核苷酸序列如SEQ NO.6所示。

角鲨烯合酶基因的NCBI数据库编号为856597，所述角鲨烯合酶基因的启动子为所述角鲨烯合酶基因上游500个核苷酸序列，所述半乳糖调节蛋白80基因的NCBI数据库编号为854954，所述第一种焦磷酸磷酸酶基因的NCBI数据库编号为852114，所述第二种焦磷酸磷酸酶基因的NCBI数据库编号为851878。

多拷贝游离型质粒优选酿酒酵母多拷贝游离型质粒pRS426。

檀香烯合酶基因的核苷酸序列如SEQ NO.7或SEQ NO.8所示，所述CYP450单加氧酶基因的核苷酸序列如SEQ NO.9所示。

上述方法构建的高产檀香油的重组酿酒酵母菌。

上述高产檀香油的重组酿酒酵母菌发酵生产檀香油的方法，包括如下步骤：

1)将高产檀香油的重组酿酒酵母菌转接于活化平板培养基上，于30℃培养箱中静置培养48小时；

2)将将步骤(1)获得的重组酵母菌株形成的菌落接种至盛装5mL种子培养基的15mL容积的试管中，置于30℃、200转每分钟的摇床中培养12小时，然后将培养物接种至盛装500mL种子培养基的1L容积的摇瓶中，置于30℃、200转每分钟的摇床中培养16小时；

3)再将1L培养物接入含4L发酵培养基的10L工作体积的生物反应器中，控制pH值为6.0，控制温度30℃，控制最低溶氧水平40％，根据菌株对葡萄糖的消耗速率添加补料培养基，当葡萄糖浓度低于0.1g/L时开始添加补料培养基，控制葡萄糖浓度在0.1-0.05g/L之间；

4)发酵培养至培养液OD₆₀₀值为40.0时，加入800mL的正十二烷作为有机相，控制葡萄糖浓度在0.05g/L之下，继续发酵3天，静置和离心收集有机相用于后期产物的定量和纯化。

活化平板培养基的组份包括：6.7g/L酵母无氨基酸氮源基础，1.92g/L酵母合成培养基无尿嘧啶补充物，20g/L葡萄糖，2.0％琼脂粉；所述种子培养基的组份包括：19.5g/L葡萄糖，15g/L硫酸铵，8g/L磷酸二氢钾，6.2g/L七水合硫酸镁，12mL/L维生素水溶液，10mL/L微量元素水溶液，0.05M的琥珀酸；所述发酵培养基的组份包括：19.5g/L葡萄糖，15g/L硫酸铵，8g/L磷酸二氢钾，6.2g/L七水合硫酸镁，12mL/L维生素水溶液，10mL/L微量元素水溶液；所述补料培养基的组份包括：500g/L葡萄糖，9g/L磷酸二氢钾，5.12g/L七水合硫酸镁，3.5g/L硫酸钾，0.28g/L硫酸钠，12mL/L维生素水溶液，10mL/L微量元素水溶液。

维生素水溶液的组份包括：0.05g/L生物素，1g/L泛酸钙，1g/L烟酸，25g/L肌醇，1g/L维生素B1，1g/L维生素B6，0.2g/L对氨基苯甲酸，pH 6.5；

所述微量元素水溶液的组份包括：5.75g/L七水合硫酸锌，0.32g/L四水合氯化锰，0.32g/L硫酸铜，0.47g/L六水合氯化钴，0.48g/L二水合钼酸钠，2.9g/L二水合氯化钙，2.8g/L七水合硫酸亚铁，0.1g/L硼酸，0.1g/L碘化钾，40mM EDTA，pH 8.0。

本发明的优点：本发明为微生物发酵工业化生产檀香油的技术，克服了檀香油的生产均为从檀木中提取的不足，本发明用基因工程改造的酵母菌株每升檀香油产量达到1g。完全具备满足工业化生产的水平。

附图说明

图1本发明中酿酒酵母菌株中基因工程改造涉及的基因。

图2是本发明中基于分子生物学手段构建的基因片段和游离型表达质粒的示意图。

图3商品檀香油样品与菌株Santa-SaSSy和Santa-SanSyn经发酵后的有机相样品处理后经GC-MS分析后的色谱图。

图4为四种檀香烯和四种檀香醇的质谱色谱图。

图5A为α-檀香醇的总离子强度色谱曲线积分面积与标准浓度的线性关系。图5B是各菌株檀香烯和檀香醇的产量图。

具体实施方案

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。

实施例1高产檀香油的重组酿酒酵母菌的构建方法

本发明描述了一种高产檀香油的重组酿酒酵母菌的构建方法，方法包含大量的分子生物学实验技术，包括限制性内切酶对DNA分子的酶切、DNA片段的连接、DNA分子的大肠杆菌转化、大肠杆菌的培养，大肠杆菌质粒的抽提，酿酒酵母的转化等。若无特别指明，具体技术细节为本领域技术人员所熟知的常规手段。基因克隆工作中使用的大肠杆菌和质粒pUC19购于北京全式金生物技术有限公司，货号：CD101-02。质粒pEASY-Blunt Simple购于北京全式金生物技术有限公司，下文简称BluntSimple，货号：CD111-02。EasyGeno快速重组克隆试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，货号：VI201-02。

质粒pFA6a-kanMX6-PGAL1购于Addgene，编号41605；质粒pFA6a-His3MX6-PGAL1购于Addgene，编号41607；质粒pFA6a-LEU2MX6购于Addgene，编号33138；质粒pRS327购于Addgene，编号51787；质粒pRS426购于美国模式培养物集存库ATCC，编号77107；质粒pFA6a-5FLAG-hphMX6购于Addgene，编号19342。

由于檀香油的药用和保健价值，宿主菌株的安全性应为首要条件。本实施例中我们选择遗传背景清晰、生物安全度高的酿酒酵母菌株BY4742，分类学名：Saccharomycescerevisiae S288C BY4742，下文简称BY4742，购自美国模式培养物集存库ATCC，编号20138。本发明中最终重组酵母菌的整体构建设计如图1所示。其内容包括：

(1)利用同源重组的方式将强启动子驱动的酿酒酵母菌BY4742来源的乙酰乙酰-CoA硫解酶基因(ERG10，NCBI数据库编号为856079)、HMG-CoA合酶基因(ERG13，NCBI数据库编号为854913)、截短型HMG-CoA还原酶基因(tHMG1，核苷酸序列如SEQ NO.4所示)、甲羟戊酸激酶基因(ERG12，NCBI数据库编号为855248)、磷酸甲羟戊酸激酶基因(ERG8，NCBI数据库编号为855260)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因(ERG19，NCBI数据库编号为855779)、异戊烯基焦磷酸异构酶基因(IDI1，NCBI数据库编号为855986)、法尼基焦磷酸合酶基因(ERG20，NCBI数据库编号为853272)、丙酮丁醇梭菌来源的3-磷酸甘油脱氢酶基因(GPD，核苷酸序列如SEQ NO.5所示)和弱启动子驱动的CYP450还原酶基因(SaCPR2，核苷酸序列如SEQ NO.6所示)整合入出发菌株酿酒酵母BY4742基因组；

(2)用SEQ NO.1所示序列替换步骤(1)获得的重组菌体内角鲨烯合酶基因的启动子；敲除半乳糖调节蛋白80基因(GAL80，NCBI数据库编号为854954)，第一种焦磷酸磷酸酶基因(LPP1，NCBI数据库编号为852114)和第二种焦磷酸磷酸酶基因(DPP1，NCBI数据库编号为851878)；

(3)在多拷贝游离型质粒(多拷贝游离型质粒为酿酒酵母多拷贝游离型质粒pRS426)中插入强启动子驱动的檀香烯合酶基因(核苷酸序列如SEQ NO.7)(也可以用SEQNO.8所示)和CYP450单加氧酶基因(SaCYP450，核苷酸序列如SEQ NO.9所示)得到表达质粒，并导入步骤(2)获得的重组酿酒酵母菌中，得到高产檀香油的重组酿酒酵母菌。

SEQ NO.7所示的檀香烯合酶基因表达生成的多肽具有催化法尼基焦磷酸生成α-檀香烯或β-檀香烯的功能，其氨基酸序列如SEQ NO.10；

SEQ NO.8所示的檀香烯合酶基因表达生成的多肽具有催化法尼基焦磷酸生成α-檀香烯或β-檀香烯的功能，其氨基酸序列如SEQ NO.11；

CYP450单加氧酶基因表达生成的多肽具有催化α-檀香烯或β-檀香烯生成α-檀香醇或β-檀香醇的功能，其氨基酸序列如SEQ NO.12所示。

CYP450还原酶基因表达生成的多肽的氨基酸序列如SEQ NO.13所示。

图1中实线框转向标识为使用GAL1-10诱导型强启动子(核苷酸序列如SEQ NO.2所示)实现基因的强表达。每一个基因均为在原有基因组拷贝的基础上增加由GAL1-10启动子驱动的新的拷贝，其中，截短型HMG-CoA还原酶基因(tHMG1)增加三个拷贝。强启动子GAL1-10驱动的檀香烯合酶基因和CYP450单加氧酶基因插入多拷贝游离型质粒pRS426中，并导入酵母菌株。虚线框为整个基因的核苷酸编码序列从基因组敲除。虚线框方向标识为弱启动子GAL3(核苷酸序列如SEQ NO.3所示)。实线灰色填充方向标识为诱导型抑制表达，不增加拷贝数，在原有基因位点，用SEQ NO.1启动子序列替代原有启动子，实现在培养基中添加甲硫氨酸时抑制该基因的表达。

为实现以上菌株改造的工作，需要构建七个基因组整合片段和一个包含任一种檀香烯合酶的游离型表达质粒，如图2所示。

图2中：KAN、TRP1、LPP1、DPP1、GAL、ERG9和YPL为整合入基因组的片段；5’UTR和3’UTR为基因的上游非翻译区和下游非翻译区；SaCYP450为CYP450单加氧酶基因；SaCPR2为CYP450还原酶基因；G418R Marker为G418抗性筛选基因；Tryptophan Marker为色氨酸筛选标记基因；Histidine Marker为组氨酸筛选标记基因；leucine Marker为亮氨酸筛选标记基因；Lysine Marker为赖氨酸筛选标记基因；GAL80为半乳糖调节蛋白基因；PTH为氨基酰基-tRNA水解酶基因，NCBI数据库编号为856596；ori：大肠杆菌复制起始区；AmpR：安苄青霉素抗性筛选基因；2μori：酿酒酵母多拷贝复制区；Uracil Marker：尿嘧啶筛选标记基因。

(1)构建整合敲除单元KAN

本整合单元利用G418抗性筛选基因KANMX6在TRP1基因内部的整合破坏BY4742菌株TRP1基因的功能，该设计为了在BY4742中引入一个色氨酸的筛选标记。

以BY4742基因组为模板，由引物KANL-F(核苷酸序列见SEQ NO.14)和KANL-R(核苷酸序列见SEQ NO.15)经PCR获得KAN-L左臂片段，由引物KANR-F(核苷酸序列见SEQ NO.16)和TRP1-RR(核苷酸序列见SEQ NO.20)经PCR获得KAN-R右臂片段，使用引物KANL-F和TRP1-RR，加入KAN-L和KAN-R为模板经PCR获得KAN-LR片段，使用平末端连接方法将KAN-LR片段与BluntSimple质粒相连，构建Blunt-KAN-LR质粒，再使用限制性内切酶XmaI酶切该质粒，由引物KANMX6-GF(核苷酸序列见SEQ NO.21)和KANMX6-GR(核苷酸序列见SEQ NO.22)以pFA6a-kanMX6-PGAL1质粒为模板经PCR获得KANMX6-TRP1，与经XmaI酶切的Blunt-TRP1-LR质粒经EasyGeno快速重组克隆试剂盒提供的方法连接，获得质粒Blunt-KANMX6。由引物KANL-F和TRP1-RR以Blunt-KANMX6质粒为模板，PCR获得敲除片段KAN(如图2中KAN)，然后转化BY4742，筛选标记遗传霉素(G418)，获得TRP1敲除的酵母菌株BY4742-TRP1::KANMX6。

(2)整合敲除单元TRP1

本整合单元利用TRP1为标记基因，以色氨酸缺陷型，构建tHMG1和ERG20过表达的表达单元。

以BY4742基因组为模板，由引物TRP1-LF(核苷酸序列见SEQ NO.17)和TRP1-LR(核苷酸序列见SEQ NO.18)经PCR获得TRP-L左臂片段，由引物TRP1-RF(核苷酸序列见SEQNO.19)和TRP1-RR经PCR获得TRP-R右臂片段，由引物TRP1-LF和TRP1-RR，加入TRP-L和TRP-R为模板经PCR获得TRP1-LR片段，使用平末端连接方法将TRP1-LR片段与BluntSimple质粒相连，构建Blunt-TRP1-LR质粒，由引物tHMG1-F(核苷酸序列见SEQ NO.23)和tHMG1-GR(核苷酸序列见SEQ NO.24)以BY4742基因组为模板经PCR获得tHMG1片段；由引物GAL1p-TRP1-F(核苷酸序列见SEQ NO.25)和GAL10p-TRP1-R(核苷酸序列见SEQ NO.26)以BY4742基因组为模板经PCR获得GAL1-10的启动子区序列；由引物ERG20-F(核苷酸序列见SEQ NO.27)和ERG20-GR(核苷酸序列见SEQ NO.28)以BY4742基因组为模板经PCR获得ERG20序列片段，将三者序列和限制性内切酶XbaI酶切的Blunt-TRP1-LR质粒片段，经EasyGeno快速重组克隆试剂盒提供的方法连接，获得整合敲除质粒Blunt-TRP1，由引物TRP1-LF和TRP1-RR以Blunt-TRP1-GENES质粒为模板，PCR获得敲除片段(如图2中TRP1)，然后转化BY4742-TRP1::KANMX6，筛选标记为遗传霉素(G418)缺失和色氨酸，获得TRP1回补和tHMG1、ERG20过表达的酵母菌株BY4742-TRP1。

(3)整合敲除单元LPP1

本整合单元利用HIS3为标记基因，以组氨酸缺陷型，敲除FPP代谢支路基因LPP1，构建ERG19和ERG8过表达的表达单元。

以BY4742基因组为模板，由引物LPP1-LF(核苷酸序列见SEQ NO.29)和LPP1-LR(核苷酸序列见SEQ NO.30)经PCR获得LPP1-L左臂，由引物LPP1-RF(核苷酸序列见SEQ NO.31)和LPP1-RR(核苷酸序列见SEQ NO.32)经PCR获得LPP1-R右臂，由引物HIS-F(核苷酸序列见SEQ NO.33)和HIS-R(核苷酸序列见SEQ NO.34)，以pFA6a-His3MX6-PGAL1质粒为模板经PCR获得HIS3片段，用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切pUC19质粒，将酶切后的片段和上述三个片段经经EasyGeno快速重组克隆试剂盒提供的方法连接，获得pUC19-LPP1-HIS质粒；再将其用限制性内切酶XmaI酶切，以BY4742基因组为模板，由引物ERG8-F(核苷酸序列见SEQNO.35)和ERG8-R(核苷酸序列见SEQ NO.36)经PCR获得ERG8片段，由引物ERG19-F(核苷酸序列见SEQ NO.37)和ERG19-R(核苷酸序列见SEQ NO.38)经PCR获得ERG19片段，由引物GALp-HIS-F(核苷酸序列见SEQ NO.39)和GALp-HIS-R(核苷酸序列见SEQ NO.40)经PCR获得GAL1-10p片段，将三者序列和限制性内切酶XbaI酶切的pUC19-LPP1-HIS质粒片段经EasyGeno快速重组克隆试剂盒提供的方法连接，获得整合敲除单元pUC19-LPP1-HIS-GENES质粒，再将质粒经限制性内切酶DrdI酶切获得目的基因线性片段(即图2中LPP1)后转化BY4742-TRP1，筛选标记为色氨酸和组氨酸，获得酵母菌株BY4742-TRP1-LPP1。

(4)整合敲除单元DPP1

本整合单元利用LEU2为标记基因，以组氨酸缺陷型，敲除FPP代谢支路基因DPP1，构建ERG12和ERG10过表达的表达单元。

以BY4742基因组为模板，由引物DPP1-LF(核苷酸序列见SEQ NO.41)和DPP1-LR(核苷酸序列见SEQ NO.42)经PCR获得DPP1-L左臂，由引物DPP1-RF(核苷酸序列见SEQ NO.43)和DPP1-RR(核苷酸序列见SEQ NO.44)经PCR获得DPP1-R右臂，由引物LEU2-F(核苷酸序列见SEQ NO.45)和LEU2-R(核苷酸序列见SEQ NO.46)，以pFA6a-LEU2MX6质粒为模板经PCR获得LEU2片段，用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切pUC19质粒，将酶切后的片段和上述三个片段经EasyGeno快速重组克隆试剂盒提供的方法连接，获得pUC19-DPP1-LEU2质粒；再将其用限制性内切酶XmaI酶切，以BY4742基因组为模板，由引物ERG10-F(核苷酸序列见SEQNO.47)和ERG10-R(核苷酸序列见SEQ NO.48)经PCR获得ERG10片段，由引物ERG12-F(核苷酸序列见SEQ NO.49)和ERG12-R(核苷酸序列见SEQ NO.50)经PCR获得ERG12片段，由引物GALp-LEU-F(核苷酸序列见SEQ NO.51)和GALp-LEU-R(核苷酸序列见SEQ NO.52)经PCR获得GAL1-10p片段，将三者序列和限制性内切酶XbaI酶切的pUC19-DPP1-LEU2质粒片段经EasyGeno快速重组克隆试剂盒提供的方法连接，获得整合敲除单元pUC19-DPP1-LEU-GENES质粒，再将质粒经限制性内切酶DrdI酶切获得线性片段(即图2中DPP1)后转化BY4742-TRP1-LPP1，筛选标记为色氨酸、组氨酸和亮氨酸，获得酵母菌株BY4742-TRP1-LPP1-DPP1。

(5)整合敲除单元GAL

本整合单元利用LYS2为标记基因，以赖氨酸缺陷型，构建IDI1、tHMG1和SaCPR2过表达的表达单元，同时，敲除半乳糖代谢调控基因GAL80。

以BY4742基因组为模板，由引物GAL80-LF(核苷酸序列见SEQ NO.53)和GAL80-LR(核苷酸序列见SEQ NO.54)经PCR获得GAL-L左臂，由引物GAL80-RF(核苷酸序列见SEQNO.55)和GAL80-RR(核苷酸序列见SEQ NO.56)经PCR获得GAL-R右臂，由引物LYS2-F(核苷酸序列见SEQ NO.57)和LYS2-R(核苷酸序列见SEQ NO.58)，以pRS417-GAL1p质粒为模板经PCR获得LYS2片段，用EcoRI和HindIII酶切pUC19质粒，将酶切后的片段和上述三个片段经EasyGeno快速重组克隆试剂盒提供的方法连接，获得pUC19-GAL-LYS2质粒；再将其用XmaI酶切，以BY4742基因组为模板，由引物IDI1-F(核苷酸序列见SEQ NO.59)和IDI1-RG(核苷酸序列见SEQ NO.60)经PCR获得IDI1片段，以Blunt-TRP1-GENES质粒为模板由引物GALp-LYS-R(核苷酸序列见SEQ NO.61)和X-tHMG1-RG(核苷酸序列见SEQ NO.62)经PCR获得GAL1-10p和tHMG1片段，将二者序列和XmaI酶切的pUC19-GAL-LYS2质粒片段经EasyGeno快速重组克隆试剂盒提供的方法连接，获得pUC19-GAL-LYS-GENES质粒。以BY4742基因组为模板由引物GAL3p-F(核苷酸序列见SEQ NO.63)和GAL3p-R(核苷酸序列见SEQ NO.64)经PCR获得GAL3p启动子片段；以合成的含SaCPR2基因(核苷酸序列见SEQ NO.6)质粒为模板由引物SaCPR2-F(核苷酸序列见SEQ NO.65)和SaCPR2-R(核苷酸序列见SEQ NO.66)经PCR获得GAL3p片段；以BY4742基因组为模板由引物GAL-CYC1t-F(核苷酸序列见SEQ NO.67)和GAL-CYC1t-R(核苷酸序列见SEQ NO.68)经PCR获得CYC1终止子片段，将两个片段和XmaI酶切的pUC19-GAL-LYS2-GENES质粒片段经EasyGeno快速重组克隆试剂盒提供的方法连接，获得整合敲除单元pUC19-GAL-LYS-SaCPR2质粒，再将质粒经DrdI酶切获得线性片段(即图2中GAL)后转化BY4742-TRP1-LPP1-DPP1，筛选标记为色氨酸、组氨酸、亮氨酸和赖氨酸，获得酵母菌株BY4742-TRP1-LPP1-DPP1-GAL。

(6)整合敲除单元ERG9

本整合单元利用KANMX6为标记基因，构建ERG13和tHMG1过表达的表达单元，同时将ERG9基因启动子替换为ERG1p启动子。

以BY4742基因组为模板，由引物ERG9-LF(核苷酸序列见SEQ NO.69)和ERG9-LR(核苷酸序列见SEQ NO.70)经PCR获得ERG9-L左臂，由引物ERG9-RF(核苷酸序列见SEQ NO.71)和ERG9-RR(核苷酸序列见SEQ NO.72)经PCR获得ERG9-R右臂，由引物ERG13-F(核苷酸序列见SEQ NO.73)和ERG13-R(核苷酸序列见SEQ NO.74)经PCR获得ERG13片段，以Blunt-TRP1-GENES质粒为模板由引物GALp-KAN-R(核苷酸序列见SEQ NO.75)和tHMG1-KAN-R(核苷酸序列见SEQ NO.76)经PCR获得GAL-tHMG1片段，用EcoRI和HindIII酶切pUC19质粒，将酶切后的片段和上述四个片段经EasyGeno快速重组克隆试剂盒提供的方法连接，获得pUC19-ERG9-GENES质粒。再以BY4742基因组为模板，由引物ERG1-EXP-F(核苷酸序列见SEQ NO.77)和ERG1-EXP-R(核苷酸序列见SEQ NO.78)经PCR获得ERG1启动子片段，与经NcoI酶切的pUC19-ERG9-GENES质粒经EasyGeno快速重组克隆试剂盒提供的方法连接，获得质粒pUC19-ERG9-KAN-GENES。再将质粒经DrdI酶切获得线性片段(即图2中ERG9)后转化BY4742-TRP1-LPP1-DPP1-GAL，此时应使用YPD培养基，筛选标记为G418抗性，获得酵母菌株BY4742-MVA-SaCPR2。

(7)整合敲除单元YPL

本整合单元利用hphMX6为标记基因，以潮霉素B为抗性筛选标记，敲除ypl062w基因的同时，构建IDI1和GPD过表达的表达单元。

以BY4742基因组为模板，由引物YPL-LF(核苷酸序列见SEQ NO.79)和YPL-LR(核苷酸序列见SEQ NO.80)经PCR获得YPL-L左臂，由引物YPL-RF(核苷酸序列见SEQ NO.81)和YPL-RR(核苷酸序列见SEQ NO.82)经PCR获得YPL-R右臂，由引物HPH-F(核苷酸序列见SEQNO.83)和HPH-R(核苷酸序列见SEQ NO.84)，以pFA6a-5FLAG-hphMX6质粒为模板经PCR获得hphMX6片段，用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切pUC19质粒，将酶切后的片段和上述三个片段经EasyGeno快速重组克隆试剂盒提供的方法连接，获得pUC19-YPL-HPH质粒；再将其用限制性内切酶ScaI和KpnI酶切，以Blunt-TRP1-GENES质粒模板，由引物YPL-GAL-F(核苷酸序列见SEQ NO.85)和YPL-IDI1-R(核苷酸序列见SEQ NO.86)经PCR获得IDI1片段。以含合成基因GPD的质粒为模版，由引物GPD-F(核苷酸序列见SEQ NO.87)和GPD-R(核苷酸序列见SEQNO.88)经PCR获得GPD片段。以BY4742基因组为模版，由引物YPL-ADH-F(核苷酸序列见SEQNO.89)和YPL-ADH-R(核苷酸序列见SEQ NO.90)经PCR获得ADH1片段，将三者序列和限制性内切酶XmaI酶切的pUC19-YPL-HPH质粒片段经EasyGeno快速重组克隆试剂盒提供的方法连接，获得整合敲除单元pUC19-YPL-HPH-GENES质粒，再将质粒经限制性内切酶DrdI酶切获得线性片段(即图2中YPL)后转化BY4742-MVA-SaCPR2，潮霉素B为抗性筛选标记，获得过酵母菌株BY4742-ME。

(8)多拷贝游离型质粒表达檀香烯合酶和SaCYP450

选择pRS426为出发质粒，质粒经限制性内切酶SacI和KpnI酶切，得到骨架片段。以BY4742基因组为模版，用引物426-ADH1t-F(核苷酸序列见SEQ NO.91)和引物426-ADH1t-R(核苷酸序列见SEQ NO.92)经PCR获得ADH1终止子片段。以BY4742基因组为模版，用引物426-CYC1t-F(核苷酸序列见SEQ NO.93)和引物426-CYC1t-R(核苷酸序列见SEQ NO.94)经PCR获得ADH1终止子片段。用SEQ NO.9为模版，由引物SaCYP-F(核苷酸序列见SEQ NO.95)和SaCYP-R(核苷酸序列见SEQ NO.96)经PCR获得SaCYP450片段，将三个片段和限制性内切酶KpnI和SacI酶切的pRS426质粒片段经EasyGeno快速重组克隆试剂盒提供的方法连接，获得pRS426-Term质粒。用合成的檀香烯合酶序列SEQ NO.7为模版，由引物SaSSy-F(核苷酸序列见SEQ NO.97)和SaSSy-R(核苷酸序列见SEQ NO.98)经PCR获得SaSSy片段。用合成的檀香烯合酶序列SEQ NO.8为模版，由引物SanSyn-F(核苷酸序列见SEQ NO.99)和SanSyn-R(核苷酸序列见SEQ NO.100)经PCR获得SanSyn片段。以BY4742基因组为模版，用引物426-GALp-F(核苷酸序列见SEQ NO.101)和引物426-GALp-R(核苷酸序列见SEQ NO.102)经PCR获得GAL启动子片段。将pRS426-Term质粒经限制性内切酶XmaI的酶切获得骨架片段426-Term。

将骨架片段426-Term、GAL启动子片段和SaSSy片段经EasyGeno快速重组克隆试剂盒提供的方法连接，获得pRS426-SaSSy-SaCYP450质粒。

将骨架片段426-Term、GAL启动子片段和SanSyn片段经EasyGeno快速重组克隆试剂盒提供的方法连接，获得pRS426-SanSyn-SaCYP450质粒。

pRS426-SaSSy-SaCYP450质粒转化BY4742，筛选标记尿嘧啶，获得重组酿酒酵母菌株BY4742-SaSSy。

pRS426-SaSSy-SaCYP450质粒转化BY4742-TRP1，筛选标记尿嘧啶，获得重组酿酒酵母菌株TRP1-SaSSy。

pRS426-SaSSy-SaCYP450质粒转化BY4742-MVA-SaCPR2，筛选标记尿嘧啶，获得重组酿酒酵母菌株MVA-SaSSy。

pRS426-SaSSy-SaCYP450质粒转化BY4742-ME，筛选标记尿嘧啶，获得高产檀香油重组酿酒酵母菌株Santa-SaSSy。

pRS426-SanSyn-SaCYP450质粒转化BY4742-ME，筛选标记尿嘧啶，获得高产檀香油重组酿酒酵母菌株Santa-SanSyn。

实施例2发酵重组菌株生产檀香油

本研究中构建的高产檀香油重组酿酒酵母菌株采用合成培养基发酵条件，使用生物反应器发酵生产檀香油。涉及的培养基配方如下：

平板培养基的组份包括：6.7g/L酵母无氨基酸氮源基础，1.92g/L酵母合成培养基无尿嘧啶补充物，20g/L葡萄糖，2.0％琼脂粉。其中，酵母无氨基酸氮源基础，厂家名称：Yeast Nitrogen Base Without Amino Acids，品牌：SIGMA-ALDRICH，货号：V900895-100G。酵母合成培养基无尿嘧啶补充物：厂家名称Yeast Synthetic Drop-out MediumSupplements without uracil，品牌：SIGMA-ALDRICH，货号：Y1501-20G。

种子培养基的组份包括：19.5g/L葡萄糖，15g/L硫酸铵，8g/L磷酸二氢钾，6.2g/L七水合硫酸镁，12mL/L维生素水溶液，10mL/L微量元素水溶液，0.05M的琥珀酸。

发酵培养基的组份包括：19.5g/L葡萄糖，15g/L硫酸铵，8g/L磷酸二氢钾，6.2g/L七水合硫酸镁，12mL/L维生素水溶液，10mL/L微量元素水溶液。

补料培养基的组份包括：500g/L葡萄糖，9g/L磷酸二氢钾，5.12g/L七水合硫酸镁，3.5g/L硫酸钾，0.28g/L硫酸钠，12mL/L维生素水溶液，10mL/L微量元素水溶液。

维生素水溶液的组份包括：50mg/L生物素，1g/L泛酸钙，1g/L烟酸，25g/L肌醇，1g/L维生素B1，1g/L维生素B6，0.2g/L对氨基苯甲酸，pH 6.5。

微量元素水溶液的组份包括：5.75g/L七水合硫酸锌，0.32g/L四水合氯化锰，0.32g/L硫酸铜，0.47g/L六水合氯化钴，0.48g/L二水合钼酸钠，2.9g/L二水合氯化钙，2.8g/L七水合硫酸亚铁，0.1g/L硼酸，0.1g/L碘化钾，40mM EDTA，pH 8.0。

具体流程：

2)将步骤(1)获得的重组酵母菌株形成的菌落接种至盛装5mL种子培养基的15mL容积的试管中，置于30℃、200转每分钟的摇床中培养12小时，然后将培养物接种至盛装500mL种子培养基的1L容积的摇瓶中，置于30℃、200转每分钟的摇床中培养16小时；

3)再将1L培养物接入含4L发酵培养基的10L工作体积的生物反应器中，控制pH值为6.0，控制温度30℃，控制最低溶氧水平40％，根据菌株对葡萄糖的消耗速率添加补料培养基，当葡萄糖浓度低于0.1g/L时开始添加补料培养基，控制葡萄糖浓度在50-100mg/L之间；

4)发酵培养至培养液OD₆₀₀值为40.0时，加入800mL的正十二烷作为有机相，控制葡萄糖浓度在50mg/L之下，继续发酵3天，静置和离心收集有机相用于后期产物的定量和纯化。

实施例3高产檀香油菌株的GC-MS检测及其檀香油产量的定量

(1)样品的GC-MS检测方法

檀香油样品处理：发酵液有机相部分经0.22μm滤膜过滤后，可直接送测，定量时，应根据预估浓度，以正十二烷为溶剂做适当稀释后，置于样品瓶中送样检测，确保定量时检测浓度在标准曲线的线性范围内，GC-MS定量过程中内标物选择购于Sigma-Aldrich的α-Humulene。参照品为商业购买的檀香油，经提纯后作为定性和定量参照。GC-MS采用Shimadzu QP2010GC-MS检测系统，离子扫描模式(扫描范围：m/z 41-250)。色谱柱是：Rxi-1ms(30m×0.25mm ID×0.25μm df)。进样器设置splitless模式，温度维持250℃。氦气作为载气，流速1.48毫升每分钟，pulsed pressure设为25psi 0.5min。柱温控制：10℃/min的速度由50℃升至130℃，然后5℃/min的速度升至180℃，维持3分钟，再10℃/min的速度升至250℃，250℃条件保持5min。组分检测的MS数据和NIST library数据库以及参照物对比来确认成分信息。

(2)檀香烯和檀香醇产物的定性分析

天然檀香油中主要包含四种檀香醇：α-檀香醇(α-santalol)，α-exo-bergamotol,epi-β-檀香醇(epi-β-santalol)和β-檀香醇(β-santalol)，其中，α-檀香醇和β-檀香醇是檀香油香氛作用和药物活性的主要组分，对应的α-檀香烯(α-santalene)，α-exo-bergamotene,epi-β-檀香烯(epi-β-santalene)和β-檀香烯(β-santalene)则是重要的代谢中间物。

商品檀香油样品与菌株Santa-SaSSy和Santa-SanSyn经发酵后的有机相样品处理后经GC-MS分析后的色谱图如图3所示。其中，四种檀香烯和四种檀香醇的质谱色谱图见图4所示。从图中可以发现应用SaSSy檀香烯合酶产生了四种檀香烯和四种檀香醇，其中α-檀香烯和β-檀香烯是檀香烯中的主要成分，α-檀香醇和β-檀香醇是檀香醇中的主要成分，且α-檀香醇占比在四种檀香醇中最高。而应用SanSyn檀香烯合酶则只产生了一种檀香烯：α-檀香烯，并且只生成了四种檀香醇中一种檀香醇：α-檀香醇。

(3)重组菌株的檀香醇产量分析

我们从商业檀香油中出发，使用正己烷对样品进行萃取，然后使用硅胶薄层层析的方式制备α-檀香醇，以正十二烷为溶剂，配制浓度梯度，作为定量标准，建立α-檀香醇的总离子强度色谱曲线积分面积与标准浓度的线性关系如图5A所示，R²＝0.999。由于檀香烯和檀香醇的分子差异性较小，理化性质较为接近，而且分别获得单一组分的成本较高，本实例中以α-檀香醇作为四种檀香烯和四种檀香醇的定量标准。

为了验证系列代谢途径改造对终产物产量的促进作用，以重要中间物檀香烯和目标物檀香醇作为衡量标准，选取经各级遗传改造的酵母菌株，

包括：野生型(BY4742-SaSSy)、部分MVA途径改造后的菌株(TRP1-SaSSy)、整个MVA途径改造后的菌株(MVA-SaSSy)、在MVA改造后经辅因子调整的菌株(Santa-SaSSy)。经过发酵后，各菌株檀香烯和檀香醇的产量见图5B所示(图中檀香烯的产量是四种檀香烯之和，檀香醇的产量是四种檀香醇之和。)，为平行比较各菌株的产量，图中檀香烯和檀香醇的产量对比均以种檀香烯和四种檀香醇分别经积分后累加计算所得。从图中数据可以看到，随着代谢改造的深入，檀香烯的产量有了极大的提升(从BY4742-SaSSy菌株到MVA-SaSSy菌株，檀香烯的产量共提升111倍)，在MVA-SaSSy菌株里同时引入SaCYP450和SaCPR2时，檀香醇得以产生(MVA-SaSSy菌株)，再经过辅因子的优化，檀香烯的产量又有了1.2倍提升(Santa-SaSSy)。说明本案例的菌株改造直接使得利用重组酿酒酵母菌株产生了植物来源的檀香烯和檀香醇，即檀香油的组份。而且也进一步验证了本案例中的代谢改造对高产檀香油的直接贡献。经计算Santa-SaSSy在前述发酵条件下产生了0.98g/L的檀香醇，Santa-SanSyn菌株在前述发酵条件下产生了1.2g/L的檀香醇，具有工业化生产能力。

上述实施例为本发明的较佳实施方案，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式。都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 天津大学

华东理工大学

<120> 一种高产檀香油的重组酵母菌及其构建方法与应用

<160> 102

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 801

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 1

gtcgaatact actatgaccg ctttttagaa tcgtacgaca acggtgacca cttgattggt 60

ctgggggtcc tacaacttga ttttatcgtt gaaaacaaga atatagacag ccttcttgcc 120

aactcttatt tgcaccagca aagaggcggt gcaatcatca gtaatacagg acttgtctcg 180

caagatacga ccaagccgta ctacgttcgg gatttaatct tctcgcagtc tgcaggcgcc 240

ttgagatttg cgttcggcct aaacgtttgc tccacaaacg tgaatggtat gaacatggac 300

atgagcgtgg ttcagggcac tctacgggat cgtggcgaat gggaatcgtt ctgcaagctc 360

ttctaccaaa ccatcggcga atttgcgtcg ctttaatgcg atactgccgt agcgggcctt 420

cgtatagctc ggccgagctc gtacaaaagg caagcagtgt atcggacaga gctgatataa 480

cacaatacgc tcgtagtcga tgcatgccgt ggctgctctc ggtcgggtat aagtcttaga 540

caatagtctt acctcgcatg tataataaat cttttgtatt taatctatta tatgtttcta 600

tgcttttttt tcctattgtt gtttgctttt ccttttcctt atttctttct agcttctaat 660

tttctttctt tttttttttt ttttcattga aaattatata tatatatata tatcagaaca 720

attgtccagt attgaacaat acaggttatt tcgaacaatt gaaaaaaaaa aatcacagaa 780

aaacatatcg agaaaagggt c 801

<210> 2

<211> 668

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 2

tatagttttt tctccttgac gttaaagtat agaggtatat taacaatttt ttgttgatac 60

ttttatgaca tttgaataag aagtaataca aactgaaaat gttgaaagta ttagttaaag 120

tggttatgca gcttttccat ttatatatct gttaatagat caaaaatcat cgcttcgctg 180

attaattacc ccagaaataa ggctaaaaaa ctaatcgcat tatcatccta tggttgttaa 240

tttgattcgt taatttgaag gtttgtgggg ccaggttact gccaattttt cctcttcata 300

accataaaag ctagtattgt agaatcttta ttgttcggag cagtgcggcg cgaggcacat 360

ctgcgtttca ggaacgcgac cggtgaagac gaggacgcac ggaggagagt cttccgtcgg 420

agggctgtcg cccgctcggc ggcttctaat ccgtacttca atatagcaat gagcagttaa 480

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catttccaca acatataagt aagattagat atggatatgt atatggtggt aatgccatgt 600

aatatgatta ttaaacttct ttgcgtccat ccaaaaaaaa agtaagaatt tttgaaaatt 660

caatataa 668

<210> 3

<211> 660

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 3

ttgctagcct tttctcggtc ttgcaaacaa ccgccggcag cttagtatat aaatacacat 60

gtacatacct ctctccgtat cctcgtaatc attttcttgt atttatcgtc ttttcgctgt 120

aaaaacttta tcacacttat ctcaaataca cttattaacc gcttttacta ttatcttcta 180

cgctgacagt aatatcaaac agtgacacat attaaacaca gtggtttctt tgcataaaca 240

ccatcagcct caagtcgtca agtaaagatt tcgtgttcat gcagatagat aacaatctat 300

atgttgataa ttagcgttgc ctcatcaatg cgagatccgt ttaaccggac cctagtgcac 360

ttaccccacg ttcggtccac tgtgtgccga acatgctcct tcactatttt aacatgtgga 420

attcttgaaa gaatgaaatc gccatgccaa gccatcacac ggtcttttat gcaattgatt 480

gaccgcctgc aacacatagg cagtaaaatt tttactgaaa cgtatataat catcataagc 540

gacaagtgag gcaacacctt tgttaccaca ttgacaaccc caggtattca tacttcctat 600

tagcggaatc aggagtgcaa aaagagaaaa taaaagtaaa aaggtagggc aacacatagt 660

<210> 4

<211> 1584

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 4

atggctgcag accaattggt gaaaactgaa gtcaccaaga agtcttttac tgctcctgta 60

caaaaggctt ctacaccagt tttaaccaat aaaacagtca tttctggatc gaaagtcaaa 120

agtttatcat ctgcgcaatc gagctcatca ggaccttcat catctagtga ggaagatgat 180

tcccgcgata ttgaaagctt ggataagaaa atacgtcctt tagaagaatt agaagcatta 240

ttaagtagtg gaaatacaaa acaattgaag aacaaagagg tcgctgcctt ggttattcac 300

ggtaagttac ctttgtacgc tttggagaaa aaattaggtg atactacgag agcggttgcg 360

gtacgtagga aggctctttc aattttggca gaagctcctg tattagcatc tgatcgttta 420

ccatataaaa attatgacta cgaccgcgta tttggcgctt gttgtgaaaa tgttataggt 480

tacatgcctt tgcccgttgg tgttataggc cccttggtta tcgatggtac atcttatcat 540

ataccaatgg caactacaga gggttgtttg gtagcttctg ccatgcgtgg ctgtaaggca 600

atcaatgctg gcggtggtgc aacaactgtt ttaactaagg atggtatgac aagaggccca 660

gtagtccgtt tcccaacttt gaaaagatct ggtgcctgta agatatggtt agactcagaa 720

gagggacaaa acgcaattaa aaaagctttt aactctacat caagatttgc acgtctgcaa 780

catattcaaa cttgtctagc aggagattta ctcttcatga gatttagaac aactactggt 840

gacgcaatgg gtatgaatat gatttctaaa ggtgtcgaat actcattaaa gcaaatggta 900

gaagagtatg gctgggaaga tatggaggtt gtctccgttt ctggtaacta ctgtaccgac 960

aaaaaaccag ctgccatcaa ctggatcgaa ggtcgtggta agagtgtcgt cgcagaagct 1020

actattcctg gtgatgttgt cagaaaagtg ttaaaaagtg atgtttccgc attggttgag 1080

ttgaacattg ctaagaattt ggttggatct gcaatggctg ggtctgttgg tggatttaac 1140

gcacatgcag ctaatttagt gacagctgtt ttcttggcat taggacaaga tcctgcacaa 1200

aatgttgaaa gttccaactg tataacattg atgaaagaag tggacggtga tttgagaatt 1260

tccgtatcca tgccatccat cgaagtaggt accatcggtg gtggtactgt tctagaacca 1320

caaggtgcca tgttggactt attaggtgta agaggcccgc atgctaccgc tcctggtacc 1380

aacgcacgtc aattagcaag aatagttgcc tgtgccgtct tggcaggtga attatcctta 1440

tgtgctgccc tagcagccgg ccatttggtt caaagtcata tgacccacaa caggaaacct 1500

gctgaaccaa caaaacctaa caatttggac gccactgata taaatcgttt gaaagatggg 1560

tccgtcacct gcattaaatc ctaa 1584

<210> 5

<211> 1005

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggctaaaa tcgctattaa cggttttggt agaattggta gattggcttt gagaagaatt 60

ttagaagttc caggtttaga agttgttgca attaatgatt tgaccgatgc aaaaatgttg 120

gctcatttgt ttaaatacga ctcatcacaa ggtagattca atggtgaaat tgaagttaaa 180

gagggtgctt ttgttgttaa tggtaaagaa gttaaggtgt ttgctgaagc agatccagaa 240

aaattgcctt ggggtgactt gggtattgat gttgttttag aatgtactgg tttctttaca 300

aagaaggaaa aagcagaagc acatgttaga gcaggtgcta aaaaagttgt tatttcagct 360

ccagcaggta atgatttgaa aactattgtt ttcaacgtga acaacgaaga tttggatggt 420

acagaaactg ttatttctgg tgcttcttgt actactaatt gtttagctcc aatggctaaa 480

gttttaaatg ataaattcgg catcgagaaa ggttttatga ctactattca tgcattcact 540

aacgatcaaa atacattgga tggtccacat agaaaaggtg acttaagaag agctagagct 600

gcagcagttt ctattattcc aaattctaca ggtgctgcaa aagcaatttc tcaagttatt 660

ccagatttgg ctggtaaatt ggatggtaat gcacaaagag ttccagttcc aacaggttct 720

attactgaat tggtttcagt tttaaagaag aaggttacag ttgaagaaat caatgctgca 780

atgaaagaag cagctgatga atcttttggt tatactgaag atccaatcgt ttcagctgat 840

gttgttggta ttaattatgg ttctttgttc gatgctactt taactaaaat cgttgatgtt 900

aacggttcac aattagttaa aacagctgct tggtatgata atgaaatgtc ttatacatcc 960

cagttagtta gaacattagc atattttgca aagatcgcta aataa 1005

<210> 6

<211> 2115

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgcaattat cttctgttaa attgattcca ttggatttga tgactgctat ttttaatggt 60

ggtggttctc cagctggttc tggtgaagct ctatctatgt tattggaaaa tagagaagtt 120

gttgttgctt tgacaacttc tttagctgtt ttgattggtt gtgtttttgc ttatttgtgg 180

agattttctt cttctcaaaa agctgttgct gctgctaaag gtgttgaagt tgctagaaaa 240

ccagttatag gtaaagaatc tgaagctgct gaagttgatg atggtaaaaa aaaagttact 300

attttttttg gtactcaaac tggtactgct gaaggttttg ctaaagctct agttgaagaa 360

gctaaagcta gatatgaaaa agctattttt aaattggttg atttggatga ttatgctgct 420

gaagatgatg aatatgaaga aaaattgaaa aaagaaaaat ttgctttgtt ttttttggct 480

acttatggtg atggtgaacc aacagataat gctgctagat tttataaatg gtttacagaa 540

gaaaatgaat ctggtgaatg gttacaaaaa ttgcaatttg gtgtttttgg tttgggtaat 600

agacaatatg aacattttaa taaagttgct aaagttgttg atgaaatttt ggctgaacaa 660

ggtggtaaaa gattggttcc agttggtttg ggtgatgatg atcaatgtat tgaagatgat 720

tttactgctt ggagagaatt agtttggcca gaattagata aattattgtt ggatgaagat 780

gatgctactg tttctactcc atatactgct tctgttccag aatatagagt tgtttttcat 840

gattctccag atgattattt gcaaaaaaat tcttctaatg ctaatggtca ttctatgcat 900

gatgctcaac atccatgtag agctaatgtt gctgttagaa gagaattgca ttctccatta 960

tctgatagat catgtactca tttggaattt gatattgctg gtactggttt ggcttatgaa 1020

acaggtgatc atgttggtgt ttgttgtgaa aatttgccag aagttgttga agaagctgaa 1080

agagttttgg gtttatctcc aggtatttat ttttctattc atgctgataa agaagatggt 1140

actccattgg gttcttcttt gccaccattg tttccaccat gtacattgag aacagcttta 1200

actcaacatg ctgatttgtt atcttttcca aaaaaagctg ctttgttggc tttagctgct 1260

catgcttctg atccatctga agctgataga ttaaaatatt tggcttctcc agctggtaaa 1320

gatgaatatg ctcaatgggt tgttgcttct caaagatcat tattggaagt tatggctgaa 1380

tttccatctg ctaaaccacc attaggtgtt ttatttgctg ctgttgctcc aagattacaa 1440

ccaagatttt attctatttc ttcttctcca aaaattgctc catctaggat tcatgttact 1500

tgtgctttgg tttatgataa aacaccaaca ggtagaatac ataaaggtgt ttgttctaca 1560

tggatgaaaa atgctatgcc aagagaagaa tctcatgatt gttcttgggc tccaattttt 1620

gttagacaat ctaattttaa attaccatct aatacatctg ttccagttat tatgattggt 1680

ccaggtacag gtttagctcc atttagaggt tttttacaag aaagattagc tttaaaagaa 1740

gctggtgttg aattaggtcc agctatttta ttttttggtt gtagaaatag aaaaatggat 1800

tatatttatg aagatgaatt agctcatttt gttgaagctg gtgctttatc tgaattaatt 1860

gttgcttttt ctagggaagg tccagctaaa caatatgttc aacataaaat gatggaaaaa 1920

gctagtgaaa tttggaatat gatttctgat ggtggttatg tttatgtttg tggtgatgct 1980

aaaggtatgg ctaaagatgt tcatagagct ttacatacaa tagttcatga acaaggttct 2040

ttagataatt ctaaaacaga atctatggtt aaaaatttac aaatgaatgg tagatattta 2100

agagatgttt ggtaa 2115

<210> 7

<211> 1710

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggatagtt ctactgctac cgctatgacc gctcctttta ttgaccctac agaccacgtt 60

aatttgaaga ctgacaccga tgcctccgaa aatagaagga tgggtaacta taagccttca 120

atttggaatt acgatttctt gcaatccctc gcaactcatc acaacatcgt tgaagagcgt 180

catcttaagt tggccgagaa gttgaaagga caagtgaaat tcatgtttgg ggcacctatg 240

gaaccattgg ccaagttgga acttgttgac gttgtgcaga gattgggact caatcacctt 300

ttcgaaacag agattaagga agctcttttc tctatctata aggatggatc aaacgggtgg 360

tggtttggac atcttcacgc aacctctttg cgtttcagac ttttgagaca gtgtggtctt 420

tttattccac aagatgtttt caagacattc cagaataaga ccggagaatt tgatatgaag 480

ttgtgcgaca acgtgaaagg gctccttagc ctctatgagg ctagttacct tggctggaag 540

ggtgaaaata ttctcgatga ggccaaggct ttcactacaa agtgtttgaa atccgcttgg 600

gaaaacatca gcgagaagtg gcttgcaaag agagttaaac atgcacttgc cttgcctctc 660

cactggaggg tgccacgtat tgaagctagg tggttcatcg aggcttacga acaagaggca 720

aatatgaacc ctactttgct caagttggct aaattggatt tcaacatggt tcagtccatc 780

catcaaaagg aaatcggcga gcttgcacgt tggtgggtga ccactggtct cgacaaactt 840

gctttcgcaa gaaataacct tttgcagagt tatatgtggt cttgcgccat tgcttcagat 900

ccaaagttta aacttgctag ggaaactatt gttgagatcg gttctgtgtt gacagttgtg 960

gatgacggat atgacgttta cgggagcatc gatgaacttg acttgtacac ttcttcagtt 1020

gaacgttggt catgtgtgga gattgataag ttgcctaata ccctcaaact tatcttcatg 1080

tccatgttca ataagactaa cgaagttggc ttgagagtgc aacatgagag gggttataac 1140

agtattccaa cattcatcaa agcctgggtt gaacagtgca agtcttacca aaaagaggct 1200

aggtggtttc atggtggaca cactcctcca cttgaagagt atagtttgaa tggcctcgtt 1260

tctattggtt tccctctcct tttgattaca ggttacgttg caatcgccga aaacgaggct 1320

gcattggaca aggtgcatcc tctccccgac ttgcttcact attccagctt gctcagcagg 1380

cttattaacg atatcggaac aagtccagac gagatggctc gtggggataa tttgaagtct 1440

atccattgtt acatgaacga aaccggtgcc tcagaagagg ttgctagaga gcacattaag 1500

ggtgtgatcg aagagaattg gaaaattctt aaccagtgtt gcttcgatca aagccagttt 1560

caagaacctt tcatcacctt taatttgaac tcagttaggg gttcccattt cttttatgag 1620

ttcggggacg gctttggtgt gactgattca tggacaaagg tggacatgaa aagcgtgttg 1680

attgacccta tccctctcgg tgaagaatga 1710

<210> 8

<211> 1656

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgtcaacac aacaagtttc atctgaaaat attgttagaa atgctgctaa ttttcatcca 60

aatatttggg gtaatcattt tttaacttgt ccatctcaaa ctattgattc ttggactcaa 120

caacatcata aagaattgaa agaagaagtt agaaaaatga tggtttctga tgctaataaa 180

ccagcacaaa gattaagatt gattgatact gttcaaagat tgggtgttgc ttatcatttt 240

gaaaaagaaa ttgatgatgc attagaaaaa attggtcatg atccatttga tgataaagat 300

gatttatata ttgtttcttt atgttttaga ttattaagac aacatggtat taaaatttct 360

tgtgatgttt ttgaaaaatt taaagatgat gatggtaaat ttaaagctag tttaatgaat 420

gatgttcaag gtatgttatc tttgtatgaa gcagctcatt tggctattca tggtgaagat 480

attttggatg aagctattgt ttttactaca actcatttaa aatctactgt ttctaattct 540

ccagttaatt ctacttttgc agaacaaatt agacattctt taagagttcc attgagaaaa 600

gctgttccaa gattagaatc tcgttatttt ttggatattt attctcgtga tgatttacat 660

gataaaactt tattaaattt tgctaaatta gattttaata ttttacaagc tatgcatcaa 720

aaagaagcta gtgaaatgac tagatggtgg agagattttg attttttgaa aaaattgcca 780

tatattagag atagagttgt tgaattatat ttttggattt tagttggtgt ttcttatcaa 840

ccaaaatttt ctactggtag aattttttta tctaaaatta tttgtttaga aactttagtt 900

gatgatacat ttgatgctta tggtacattt gatgaattgg ctatttttac agaagctgtt 960

acaagatggg atttaggtca tagagatgca ttgccagaat atatgaaatt tatttttaaa 1020

acattaattg atgtttattc tgaagctgaa caagaattag ctaaagaagg tagatcatat 1080

tctattcatt atgctattag atcatttcaa gaattagtta tgaaatattt ttgtgaagct 1140

aaatggttaa ataaaggtta tgttccatca ttggatgatt ataaatctgt ttcattaaga 1200

tcaatcggtt ttttaccaat cgctgttgct tcttttgttt ttatgggtga tattgcaaca 1260

aaagaagttt ttgaatggga aatgaataat ccaaaaatta ttattgcagc agaaacaatt 1320

tttagatttt tggatgatat tgcaggtcat agatttgaac aaaaaagaga acattcacca 1380

tcagcaatcg aatgttataa aaatcaacat ggtgtttcag aagaagaagc agttaaagca 1440

ttgtcattgg aagttgcaaa ttcatggaaa gatattaatg aagaattgtt gttgaatcca 1500

atggcaattc cattgccatt gttgcaagtt attttggatt tgtcaagatc agcagatttt 1560

atgtatggta atgcacaaga tagatttaca cattcaacaa tgatgaaaga tcaagttgat 1620

ttggttttga aagatccagt taaattggat gattaa 1656

<210> 9

<211> 1503

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgtctccag ctactgctgt tattttgact ttgttggttg ctttgggttt gtccatcttg 60

ttgagaagaa gacaaaagag aaacaacttg ccaccaggtc caccagcttt gcctattatt 120

ggtaacattc atatcttggg tactttgcca caccaatcct tgtataattt ggccaagaaa 180

tacggtccaa tcatgtctat gagattgggt ttggttccag ccgttgttat ttcttcacca 240

gaagctgctg aattggtttt gaaaacccat gatatcgttt tcgcctcaag accaagattg 300

caagttgctg attatttcca ctatggtact aagggtgtta tcttgactga atacggtact 360

tattggagaa acatgagaag attgtgcacc gtcaagttgt tgaacaccgt taagattgat 420

tctttcgccg gtactagaaa gaaagaagtt gcttctttcg ttcaatcctt gaaagaagcc 480

tctgttgctc ataagatggt taacttgtct gctagagttg ccaacgttat cgaaaacatg 540

gtttgcttga tggtcatcgg tagatcatct gacgaaagat tcaagttgaa agaagtcatt 600

caagaagctg cccaattagc tggtgctttt aacattggtg attacgtccc atttttgatg 660

ccattggact tgcaaggttt gaccagaaga atcaaatctg gttctaaggc cttcgatgat 720

atcttggaag ttattatcga tgaacacgtc caagacatca aggatcatga tgatgaacaa 780

cacggtgatt tcatcgatgt tttgttggct atgatgaaca agccaatgga ttcaagagaa 840

ggtttgtcta tcatcgacag aactaacatt aaggccatct tggttgatat gattggtgct 900

gctatggata cttctacttc tggtgttgaa tgggccattt ccgaattgat caaacatcca 960

agagtcatga agaaattgca agacgaagtt aagaccgtta tcggtatgaa cagaatggtt 1020

gaagaagctg atttgccaaa gttgccatac ttggatatgg ttgtcaaaga aaccatgaga 1080

ttgcatccac ctggtccatt attggttcca agagaatcta tggaagatat caccatcaac 1140

ggttactaca tccctaagaa gtccagaatt atcgttaacg cttgggctat tggtagagat 1200

acaaatgctt ggtctaacaa cgcccatgaa tttttcccag aaagattcat gtcctccaac 1260

gttgacttac aaggtcaaga cttccaatta atcccattcg gttctggtag aagaggttgt 1320

ccaggtatga gattaggttt aactaccgtt agattggtct tggctcaatt aattcactgc 1380

ttcgatttgg aattgccaaa gggtactgtt gctactgatt tggatatgtc tgaaaagttc 1440

ggtttggcta tgccaagagc acaacatttg ttagcttttc caacctacag attggaatct 1500

taa 1503

<210> 10

<211> 569

<212> PRT

<213> 白檀木(Santalum album L)

<400> 10

Met Asp Ser Ser Thr Ala Thr Ala Met Thr Ala Pro Phe Ile Asp Pro

1 5 10 15

Thr Asp His Val Asn Leu Lys Thr Asp Thr Asp Ala Ser Glu Asn Arg

20 25 30

Arg Met Gly Asn Tyr Lys Pro Ser Ile Trp Asn Tyr Asp Phe Leu Gln

35 40 45

Ser Leu Ala Thr His His Asn Ile Val Glu Glu Arg His Leu Lys Leu

50 55 60

Ala Glu Lys Leu Lys Gly Gln Val Lys Phe Met Phe Gly Ala Pro Met

65 70 75 80

Glu Pro Leu Ala Lys Leu Glu Leu Val Asp Val Val Gln Arg Leu Gly

85 90 95

Leu Asn His Leu Phe Glu Thr Glu Ile Lys Glu Ala Leu Phe Ser Ile

100 105 110

Tyr Lys Asp Gly Ser Asn Gly Trp Trp Phe Gly His Leu His Ala Thr

115 120 125

Ser Leu Arg Phe Arg Leu Leu Arg Gln Cys Gly Leu Phe Ile Pro Gln

130 135 140

Asp Val Phe Lys Thr Phe Gln Asn Lys Thr Gly Glu Phe Asp Met Lys

145 150 155 160

Leu Cys Asp Asn Val Lys Gly Leu Leu Ser Leu Tyr Glu Ala Ser Tyr

165 170 175

Leu Gly Trp Lys Gly Glu Asn Ile Leu Asp Glu Ala Lys Ala Phe Thr

180 185 190

Thr Lys Cys Leu Lys Ser Ala Trp Glu Asn Ile Ser Glu Lys Trp Leu

195 200 205

Ala Lys Arg Val Lys His Ala Leu Ala Leu Pro Leu His Trp Arg Val

210 215 220

Pro Arg Ile Glu Ala Arg Trp Phe Ile Glu Ala Tyr Glu Gln Glu Ala

225 230 235 240

Asn Met Asn Pro Thr Leu Leu Lys Leu Ala Lys Leu Asp Phe Asn Met

245 250 255

Val Gln Ser Ile His Gln Lys Glu Ile Gly Glu Leu Ala Arg Trp Trp

260 265 270

Val Thr Thr Gly Leu Asp Lys Leu Ala Phe Ala Arg Asn Asn Leu Leu

275 280 285

Gln Ser Tyr Met Trp Ser Cys Ala Ile Ala Ser Asp Pro Lys Phe Lys

290 295 300

Leu Ala Arg Glu Thr Ile Val Glu Ile Gly Ser Val Leu Thr Val Val

305 310 315 320

Asp Asp Gly Tyr Asp Val Tyr Gly Ser Ile Asp Glu Leu Asp Leu Tyr

325 330 335

Thr Ser Ser Val Glu Arg Trp Ser Cys Val Glu Ile Asp Lys Leu Pro

340 345 350

Asn Thr Leu Lys Leu Ile Phe Met Ser Met Phe Asn Lys Thr Asn Glu

355 360 365

Val Gly Leu Arg Val Gln His Glu Arg Gly Tyr Asn Ser Ile Pro Thr

370 375 380

Phe Ile Lys Ala Trp Val Glu Gln Cys Lys Ser Tyr Gln Lys Glu Ala

385 390 395 400

Arg Trp Phe His Gly Gly His Thr Pro Pro Leu Glu Glu Tyr Ser Leu

405 410 415

Asn Gly Leu Val Ser Ile Gly Phe Pro Leu Leu Leu Ile Thr Gly Tyr

420 425 430

Val Ala Ile Ala Glu Asn Glu Ala Ala Leu Asp Lys Val His Pro Leu

435 440 445

Pro Asp Leu Leu His Tyr Ser Ser Leu Leu Ser Arg Leu Ile Asn Asp

450 455 460

Ile Gly Thr Ser Pro Asp Glu Met Ala Arg Gly Asp Asn Leu Lys Ser

465 470 475 480

Ile His Cys Tyr Met Asn Glu Thr Gly Ala Ser Glu Glu Val Ala Arg

485 490 495

Glu His Ile Lys Gly Val Ile Glu Glu Asn Trp Lys Ile Leu Asn Gln

500 505 510

Cys Cys Phe Asp Gln Ser Gln Phe Gln Glu Pro Phe Ile Thr Phe Asn

515 520 525

Leu Asn Ser Val Arg Gly Ser His Phe Phe Tyr Glu Phe Gly Asp Gly

530 535 540

Phe Gly Val Thr Asp Ser Trp Thr Lys Val Asp Met Lys Ser Val Leu

545 550 555 560

Ile Asp Pro Ile Pro Leu Gly Glu Glu

565

<210> 11

<211> 551

<212> PRT

<213> 黄皮(Clausena lansium)

<400> 11

Met Ser Thr Gln Gln Val Ser Ser Glu Asn Ile Val Arg Asn Ala Ala

1 5 10 15

Asn Phe His Pro Asn Ile Trp Gly Asn His Phe Leu Thr Cys Pro Ser

20 25 30

Gln Thr Ile Asp Ser Trp Thr Gln Gln His His Lys Glu Leu Lys Glu

35 40 45

Glu Val Arg Lys Met Met Val Ser Asp Ala Asn Lys Pro Ala Gln Arg

50 55 60

Leu Arg Leu Ile Asp Thr Val Gln Arg Leu Gly Val Ala Tyr His Phe

65 70 75 80

Glu Lys Glu Ile Asp Asp Ala Leu Glu Lys Ile Gly His Asp Pro Phe

85 90 95

Asp Asp Lys Asp Asp Leu Tyr Ile Val Ser Leu Cys Phe Arg Leu Leu

100 105 110

Arg Gln His Gly Ile Lys Ile Ser Cys Asp Val Phe Glu Lys Phe Lys

115 120 125

Asp Asp Asp Gly Lys Phe Lys Ala Ser Leu Met Asn Asp Val Gln Gly

130 135 140

Met Leu Ser Leu Tyr Glu Ala Ala His Leu Ala Ile His Gly Glu Asp

145 150 155 160

Ile Leu Asp Glu Ala Ile Val Phe Thr Thr Thr His Leu Lys Ser Thr

165 170 175

Val Ser Asn Ser Pro Val Asn Ser Thr Phe Ala Glu Gln Ile Arg His

180 185 190

Ser Leu Arg Val Pro Leu Arg Lys Ala Val Pro Arg Leu Glu Ser Arg

195 200 205

Tyr Phe Leu Asp Ile Tyr Ser Arg Asp Asp Leu His Asp Lys Thr Leu

210 215 220

Leu Asn Phe Ala Lys Leu Asp Phe Asn Ile Leu Gln Ala Met His Gln

225 230 235 240

Lys Glu Ala Ser Glu Met Thr Arg Trp Trp Arg Asp Phe Asp Phe Leu

245 250 255

Lys Lys Leu Pro Tyr Ile Arg Asp Arg Val Val Glu Leu Tyr Phe Trp

260 265 270

Ile Leu Val Gly Val Ser Tyr Gln Pro Lys Phe Ser Thr Gly Arg Ile

275 280 285

Phe Leu Ser Lys Ile Ile Cys Leu Glu Thr Leu Val Asp Asp Thr Phe

290 295 300

Asp Ala Tyr Gly Thr Phe Asp Glu Leu Ala Ile Phe Thr Glu Ala Val

305 310 315 320

Thr Arg Trp Asp Leu Gly His Arg Asp Ala Leu Pro Glu Tyr Met Lys

325 330 335

Phe Ile Phe Lys Thr Leu Ile Asp Val Tyr Ser Glu Ala Glu Gln Glu

340 345 350

Leu Ala Lys Glu Gly Arg Ser Tyr Ser Ile His Tyr Ala Ile Arg Ser

355 360 365

Phe Gln Glu Leu Val Met Lys Tyr Phe Cys Glu Ala Lys Trp Leu Asn

370 375 380

Lys Gly Tyr Val Pro Ser Leu Asp Asp Tyr Lys Ser Val Ser Leu Arg

385 390 395 400

Ser Ile Gly Phe Leu Pro Ile Ala Val Ala Ser Phe Val Phe Met Gly

405 410 415

Asp Ile Ala Thr Lys Glu Val Phe Glu Trp Glu Met Asn Asn Pro Lys

420 425 430

Ile Ile Ile Ala Ala Glu Thr Ile Phe Arg Phe Leu Asp Asp Ile Ala

435 440 445

Gly His Arg Phe Glu Gln Lys Arg Glu His Ser Pro Ser Ala Ile Glu

450 455 460

Cys Tyr Lys Asn Gln His Gly Val Ser Glu Glu Glu Ala Val Lys Ala

465 470 475 480

Leu Ser Leu Glu Val Ala Asn Ser Trp Lys Asp Ile Asn Glu Glu Leu

485 490 495

Leu Leu Asn Pro Met Ala Ile Pro Leu Pro Leu Leu Gln Val Ile Leu

500 505 510

Asp Leu Ser Arg Ser Ala Asp Phe Met Tyr Gly Asn Ala Gln Asp Arg

515 520 525

Phe Thr His Ser Thr Met Met Lys Asp Gln Val Asp Leu Val Leu Lys

530 535 540

Asp Pro Val Lys Leu Asp Asp

545 550

<210> 12

<211> 500

<212> PRT

<213> 白檀木(Santalum album L)

<400> 12

Met Ser Pro Ala Thr Ala Val Ile Leu Thr Leu Leu Val Ala Leu Gly

1 5 10 15

Leu Ser Ile Leu Leu Arg Arg Arg Gln Lys Arg Asn Asn Leu Pro Pro

20 25 30

Gly Pro Pro Ala Leu Pro Ile Ile Gly Asn Ile His Ile Leu Gly Thr

35 40 45

Leu Pro His Gln Ser Leu Tyr Asn Leu Ala Lys Lys Tyr Gly Pro Ile

50 55 60

Met Ser Met Arg Leu Gly Leu Val Pro Ala Val Val Ile Ser Ser Pro

65 70 75 80

Glu Ala Ala Glu Leu Val Leu Lys Thr His Asp Ile Val Phe Ala Ser

85 90 95

Arg Pro Arg Leu Gln Val Ala Asp Tyr Phe His Tyr Gly Thr Lys Gly

100 105 110

Val Ile Leu Thr Glu Tyr Gly Thr Tyr Trp Arg Asn Met Arg Arg Leu

115 120 125

Cys Thr Val Lys Leu Leu Asn Thr Val Lys Ile Asp Ser Phe Ala Gly

130 135 140

Thr Arg Lys Lys Glu Val Ala Ser Phe Val Gln Ser Leu Lys Glu Ala

145 150 155 160

Ser Val Ala His Lys Met Val Asn Leu Ser Ala Arg Val Ala Asn Val

165 170 175

Ile Glu Asn Met Val Cys Leu Met Val Ile Gly Arg Ser Ser Asp Glu

180 185 190

Arg Phe Lys Leu Lys Glu Val Ile Gln Glu Ala Ala Gln Leu Ala Gly

195 200 205

Ala Phe Asn Ile Gly Asp Tyr Val Pro Phe Leu Met Pro Leu Asp Leu

210 215 220

Gln Gly Leu Thr Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Lys Ala Phe Asp Asp

225 230 235 240

Ile Leu Glu Val Ile Ile Asp Glu His Val Gln Asp Ile Lys Asp His

245 250 255

Asp Asp Glu Gln His Gly Asp Phe Ile Asp Val Leu Leu Ala Met Met

260 265 270

Asn Lys Pro Met Asp Ser Arg Glu Gly Leu Ser Ile Ile Asp Arg Thr

275 280 285

Asn Ile Lys Ala Ile Leu Val Asp Met Ile Gly Ala Ala Met Asp Thr

290 295 300

Ser Thr Ser Gly Val Glu Trp Ala Ile Ser Glu Leu Ile Lys His Pro

305 310 315 320

Arg Val Met Lys Lys Leu Gln Asp Glu Val Lys Thr Val Ile Gly Met

325 330 335

Asn Arg Met Val Glu Glu Ala Asp Leu Pro Lys Leu Pro Tyr Leu Asp

340 345 350

Met Val Val Lys Glu Thr Met Arg Leu His Pro Pro Gly Pro Leu Leu

355 360 365

Val Pro Arg Glu Ser Met Glu Asp Ile Thr Ile Asn Gly Tyr Tyr Ile

370 375 380

Pro Lys Lys Ser Arg Ile Ile Val Asn Ala Trp Ala Ile Gly Arg Asp

385 390 395 400

Thr Asn Ala Trp Ser Asn Asn Ala His Glu Phe Phe Pro Glu Arg Phe

405 410 415

Met Ser Ser Asn Val Asp Leu Gln Gly Gln Asp Phe Gln Leu Ile Pro

420 425 430

Phe Gly Ser Gly Arg Arg Gly Cys Pro Gly Met Arg Leu Gly Leu Thr

435 440 445

Thr Val Arg Leu Val Leu Ala Gln Leu Ile His Cys Phe Asp Leu Glu

450 455 460

Leu Pro Lys Gly Thr Val Ala Thr Asp Leu Asp Met Ser Glu Lys Phe

465 470 475 480

Gly Leu Ala Met Pro Arg Ala Gln His Leu Leu Ala Phe Pro Thr Tyr

485 490 495

Arg Leu Glu Ser

500

<210> 13

<211> 704

<212> PRT

<213> 白檀木(Santalum album L)

<400> 13

Met Gln Leu Ser Ser Val Lys Leu Ile Pro Leu Asp Leu Met Thr Ala

1 5 10 15

Ile Phe Asn Gly Gly Gly Ser Pro Ala Gly Ser Gly Glu Ala Leu Ser

20 25 30

Met Leu Leu Glu Asn Arg Glu Val Val Val Ala Leu Thr Thr Ser Leu

35 40 45

Ala Val Leu Ile Gly Cys Val Phe Ala Tyr Leu Trp Arg Phe Ser Ser

50 55 60

Ser Gln Lys Ala Val Ala Ala Ala Lys Gly Val Glu Val Ala Arg Lys

65 70 75 80

Pro Val Ile Gly Lys Glu Ser Glu Ala Ala Glu Val Asp Asp Gly Lys

85 90 95

Lys Lys Val Thr Ile Phe Phe Gly Thr Gln Thr Gly Thr Ala Glu Gly

100 105 110

Phe Ala Lys Ala Leu Val Glu Glu Ala Lys Ala Arg Tyr Glu Lys Ala

115 120 125

Ile Phe Lys Leu Val Asp Leu Asp Asp Tyr Ala Ala Glu Asp Asp Glu

130 135 140

Tyr Glu Glu Lys Leu Lys Lys Glu Lys Phe Ala Leu Phe Phe Leu Ala

145 150 155 160

Thr Tyr Gly Asp Gly Glu Pro Thr Asp Asn Ala Ala Arg Phe Tyr Lys

165 170 175

Trp Phe Thr Glu Glu Asn Glu Ser Gly Glu Trp Leu Gln Lys Leu Gln

180 185 190

Phe Gly Val Phe Gly Leu Gly Asn Arg Gln Tyr Glu His Phe Asn Lys

195 200 205

Val Ala Lys Val Val Asp Glu Ile Leu Ala Glu Gln Gly Gly Lys Arg

210 215 220

Leu Val Pro Val Gly Leu Gly Asp Asp Asp Gln Cys Ile Glu Asp Asp

225 230 235 240

Phe Thr Ala Trp Arg Glu Leu Val Trp Pro Glu Leu Asp Lys Leu Leu

245 250 255

Leu Asp Glu Asp Asp Ala Thr Val Ser Thr Pro Tyr Thr Ala Ser Val

260 265 270

Pro Glu Tyr Arg Val Val Phe His Asp Ser Pro Asp Asp Tyr Leu Gln

275 280 285

Lys Asn Ser Ser Asn Ala Asn Gly His Ser Met His Asp Ala Gln His

290 295 300

Pro Cys Arg Ala Asn Val Ala Val Arg Arg Glu Leu His Ser Pro Leu

305 310 315 320

Ser Asp Arg Ser Cys Thr His Leu Glu Phe Asp Ile Ala Gly Thr Gly

325 330 335

Leu Ala Tyr Glu Thr Gly Asp His Val Gly Val Cys Cys Glu Asn Leu

340 345 350

Pro Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Ser Pro Gly

355 360 365

Ile Tyr Phe Ser Ile His Ala Asp Lys Glu Asp Gly Thr Pro Leu Gly

370 375 380

Ser Ser Leu Pro Pro Leu Phe Pro Pro Cys Thr Leu Arg Thr Ala Leu

385 390 395 400

Thr Gln His Ala Asp Leu Leu Ser Phe Pro Lys Lys Ala Ala Leu Leu

405 410 415

Ala Leu Ala Ala His Ala Ser Asp Pro Ser Glu Ala Asp Arg Leu Lys

420 425 430

Tyr Leu Ala Ser Pro Ala Gly Lys Asp Glu Tyr Ala Gln Trp Val Val

435 440 445

Ala Ser Gln Arg Ser Leu Leu Glu Val Met Ala Glu Phe Pro Ser Ala

450 455 460

Lys Pro Pro Leu Gly Val Leu Phe Ala Ala Val Ala Pro Arg Leu Gln

465 470 475 480

Pro Arg Phe Tyr Ser Ile Ser Ser Ser Pro Lys Ile Ala Pro Ser Arg

485 490 495

Ile His Val Thr Cys Ala Leu Val Tyr Asp Lys Thr Pro Thr Gly Arg

500 505 510

Ile His Lys Gly Val Cys Ser Thr Trp Met Lys Asn Ala Met Pro Arg

515 520 525

Glu Glu Ser His Asp Cys Ser Trp Ala Pro Ile Phe Val Arg Gln Ser

530 535 540

Asn Phe Lys Leu Pro Ser Asn Thr Ser Val Pro Val Ile Met Ile Gly

545 550 555 560

Pro Gly Thr Gly Leu Ala Pro Phe Arg Gly Phe Leu Gln Glu Arg Leu

565 570 575

Ala Leu Lys Glu Ala Gly Val Glu Leu Gly Pro Ala Ile Leu Phe Phe

580 585 590

Gly Cys Arg Asn Arg Lys Met Asp Tyr Ile Tyr Glu Asp Glu Leu Ala

595 600 605

His Phe Val Glu Ala Gly Ala Leu Ser Glu Leu Ile Val Ala Phe Ser

610 615 620

Arg Glu Gly Pro Ala Lys Gln Tyr Val Gln His Lys Met Met Glu Lys

625 630 635 640

Ala Ser Glu Ile Trp Asn Met Ile Ser Asp Gly Gly Tyr Val Tyr Val

645 650 655

Cys Gly Asp Ala Lys Gly Met Ala Lys Asp Val His Arg Ala Leu His

660 665 670

Thr Ile Val His Glu Gln Gly Ser Leu Asp Asn Ser Lys Thr Glu Ser

675 680 685

Met Val Lys Asn Leu Gln Met Asn Gly Arg Tyr Leu Arg Asp Val Trp

690 695 700

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cctgctttga attagtcgcg ct 22

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cgccgccatc cagtttaaac actttcacca atggaccaga actac 45

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

acgaggcaag ctaaacagat cttgcggctt gcagagcaca g 41

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tactattagc tgaattgcca ct 22

<210> 18

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agaaaagctc cggatcaaga ttgtacccgg gtgtcagctc ttttagatcg g 51

<210> 19

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ccgatctaaa agagctgaca cccgggtaca atcttgatcc ggagcttttc t 51

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggcgtcagtc caccagctaa ca 22

<210> 21

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gagcacagag gccgcagaat gtgctctaga gtttaaactg gatggcggcg tt 52

<210> 22

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

aatacccagc aagtcagcat cggaatctag agtttagctt gcctcgtccc c 51

<210> 23

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

taacgtcaag gagaaaaaac tataatggct gcagaccaat tggtgaaaac t 51

<210> 24

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

agccccgatc taaaagagct gacacccggg agttatgaca attacaacaa c 51

<210> 25

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

agttttcacc aattggtctg cagccattat agttttttct ccttgacgtt a 51

<210> 26

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tcctaatttc tttttctgaa gccatttata ttgaattttc aaaaatt 47

<210> 27

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

aatttttgaa aattcaatat aaatggcttc agaaaaagaa attagga 47

<210> 28

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gaaaagctcc ggatcaagat tgtacccggg ttaaaaaaaa tccttggact a 51

<210> 29

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

cgacgttgta aaacgacggc cagtggccac gtgaaacctg acaacttata g 51

<210> 30

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ctggtcgcta tactgcgcct gttagggcag cattt 35

<210> 31

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cctccatgtc cccgggggct tggacatttg caagcaga 38

<210> 32

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

aacagctatg accatgatta cgccacgacc agatgaatca catgtgaaga tg 52

<210> 33

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ctaacaggcg cagtatagcg accagcattc acatacg 37

<210> 34

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

tgtccaagcc cccggggaca tggaggccca gaataccc 38

<210> 35

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gaaaattcaa tataaatgtc agagttgaga gccttcagtg 40

<210> 36

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

agtctgcttg caaatgtcca agccctcctc atcctagtat gtatagcttg taccc 55

<210> 37

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

gaaaaaacta taatgaccgt ttacacagca tccg 34

<210> 38

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

gagggtattc tgggcctcca tgtccgtttc tcattcaagt ggtaactgct gtt 53

<210> 39

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

tgtaaacggt cattatagtt ttttctcctt gacg 34

<210> 40

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

aactctgaca tttatattga attttcaaaa attcttactt 40

<210> 41

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

cgacgttgta aaacgacggc cagtgtaaat gcagcacgcc tggc 44

<210> 42

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

atggtgcact ctcatgacgt tcgaacggtt gttggt 36

<210> 43

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

aactgcggtc acccgggtga aagctttgca ggactggg 38

<210> 44

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

aacagctatg accatgatta cgccaggccc ttgcacgtca agat 44

<210> 45

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

aagctttcac ccgggtgacc gcagttaact gtgggaat 38

<210> 46

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

gttcgaacgt catgagagtg caccatatcg actacg 36

<210> 47

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

aattcaatat aaatgtctca gaacgtttac attgtatcga ct 42

<210> 48

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

taacccagtc ctgcaaagct ttcacagtat cacccggcca gcttg 45

<210> 49

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

aaaaactata atgtcattac cgttcttaac ttctgcacc 39

<210> 50

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

tattcccaca gttaactgcg gtcacgggtg gaaggacctt gtgga 45

<210> 51

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

gaacggtaat gacattatag ttttttctcc ttgacg 36

<210> 52

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

cgttctgaga catttatatt gaattttcaa aaattcttac tt 42

<210> 53

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

cgacgttgta aaacgacggc cagtgcctcc tccagatgga atcccttc 48

<210> 54

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

tatggtgcac tctcggacgg gagtggaaag aacggg 36

<210> 55

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

aagtggaatt cccgggaagc atcttgccct gtgcttg 37

<210> 56

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

aacagctatg accatgatta cgccacatgc taccttccat ggttgagc 48

<210> 57

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

tttcccgttc tttccactcc cgtccgagag tgcaccatat agcttcgc 48

<210> 58

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

aagcacaggg caagatgctt cccgggaatt ccacttgcaa ttacat 46

<210> 59

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

aattcaatat aaatgactgc cgacaacaat ag 32

<210> 60

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

ggccaagcac agggcaagat gcttccagtg ggaaacattc aagaggcc 48

<210> 61

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

tgtcggcagt catttatatt gaattttcaa aaattcttac 40

<210> 62

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

ttttatgtaa ttgcaagtgg aattcccggg agttatgaca attacaacaa 50

<210> 63

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

ttttatgtaa ttgcaagtgg aattcttgct agccttttct cggtc 45

<210> 64

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

ttaacagaag ataattgcat actatgtgtt gccctacctt 40

<210> 65

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

aaggtagggc aacacatagt atgcaattat cttctgttaa 40

<210> 66

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

tgacataact aattacatga ttaccaaaca tctcttaaat atc 43

<210> 67

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

gatatttaag agatgtttgg taatcatgta attagttatg tca 43

<210> 68

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

tgttgtaatt gtcataactc gcaaattaaa gccttcgagc gtc 43

<210> 69

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

cgacgttgta aaacgacggc cagtgcgggc ggcaaagtgc attatat 47

<210> 70

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

ttgtcataac tcccaaaacc gataacgcct tcc 33

<210> 71

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

gcccaaccga ttccatggga aagctattac aattggc 37

<210> 72

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

aacagctatg accatgatta cgccaggttt gcaacccatt caagtt 46

<210> 73

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

aaattcaata taaatgaaac tctcaactaa actttgttgg 40

<210> 74

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

agctttccca tggaatcggt tgggcttaac tttaaag 37

<210> 75

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

tgagagtttc atttatattg aattttcaaa aattcttact t 41

<210> 76

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

ttatcggttt tgggagttat gacaattaca aca 33

<210> 77

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

gctaaacaga tcgtcgaata ctactatgac cgctttt 37

<210> 78

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 78

gcaatgccaa ttgtaatagc tttcccatga cccttttctc gatatgtttt tc 52

<210> 79

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 79

cgacgttgta aaacgacggc cagtgctcga gtatctacgt atctatgtgt g 51

<210> 80

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 80

cctccatgtc gagctcggta ccgcccttac gtga 34

<210> 81

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 81

gtcgctatac tgcaccgacc atgtgggcaa attc 34

<210> 82

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 82

aacagctatg accatgatta cgccactcga gcattcgata gcatattcaa c 51

<210> 83

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 83

taccgagctc gacatggagg cccagaatac cc 32

<210> 84

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 84

gcccacatgg tcggtgcagt atagcgacca gcattcaca 39

<210> 85

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 85

atagcgattt tagccattat agttttttct ccttgacgtt aa 42

<210> 86

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 86

actgcccctc acgtaagggc ggtacccagt gggaaacatt caagag 46

<210> 87

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 87

ggagaaaaaa ctataatggc taaaatcgct attaacggt 39

<210> 88

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 88

aagaaattcg cttatttagc gatctttgca aaatatgct 39

<210> 89

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 89

aaagatcgct aaataagcga atttcttatg atttatgatt t 41

<210> 90

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 90

gtattctggg cctccatgtc gagctcccgg tagaggtgtg gtcaataag 49

<210> 91

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 91

actcactata gggcgaattg ggtaccgcaa attaaagcct tcgagc 46

<210> 92

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 92

acagcagtag ctggagacat cccgggtcat gtaattagtt atgtcacgc 49

<210> 93

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 93

cctacagatt ggaatcttaa gcgaatttct tatgatttat gatt 44

<210> 94

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 94

actaaaggga acaaaagctg gagctcccgg tagaggtgtg gtcaat 46

<210> 95

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 95

atgtctccag ctactgctgt 20

<210> 96

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 96

ttaagattcc aatctgtagg ttgga 25

<210> 97

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 97

ttaacgtcaa ggagaaaaaa ctataatgga tagttctact gctaccgc 48

<210> 98

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 98

agcgtgacat aactaattac atgactcatt cttcaccgag agggata 47

<210> 99

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 99

ttaacgtcaa ggagaaaaaa ctataatgtc aacacaacaa gtttcatctg 50

<210> 100

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 100

agcgtgacat aactaattac atgacttaat catccaattt aactg 45

<210> 101

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 101

tatagttttt tctccttgac gttaa 25

<210> 102

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 102

aataacagca gtagctggag acatcttata ttgaattttc aaaaattctt ac 52

Claims

1.高产檀香油的重组酿酒酵母菌的构建方法，其特征包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征是所述强启动子是诱导型双向强启动子GAL1-10，所述诱导型双向强启动子GAL1-10的核苷酸序列如SEQ NO.2所示。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征是所述弱启动子为弱启动子GAL3，弱启动子GAL3的核苷酸序列如SEQ NO.3所示，所述乙酰乙酰-CoA硫解酶基因的NCBI数据库编号为856079，HMG-CoA合酶基因的NCBI数据库编号为854913，截短型HMG-CoA还原酶基因的核苷酸序列如SEQ NO.4所示，甲羟戊酸激酶基因的NCBI数据库编号为855248，磷酸甲羟戊酸激酶基因的NCBI数据库编号为855260，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因的NCBI数据库编号为855779，异戊烯基焦磷酸异构酶基因的NCBI数据库编号为855986，法尼基焦磷酸合酶基因的NCBI数据库编号为853272，人工合成的3-磷酸甘油脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ NO.5所示，CYP450还原酶基因的核苷酸序列如SEQ NO.6所示。

4.如权利要求1所述的构建方法，其特征是所述角鲨烯合酶基因的NCBI数据库编号为856597，所述角鲨烯合酶基因的启动子为所述角鲨烯合酶基因上游500个核苷酸序列，所述半乳糖调节蛋白80基因的NCBI数据库编号为854954，所述第一种焦磷酸磷酸酶基因的NCBI数据库编号为852114，所述第二种焦磷酸磷酸酶基因的NCBI数据库编号为851878。

5.如权利要求1所述的构建方法，其特征是所述多拷贝游离型质粒为酿酒酵母多拷贝游离型质粒pRS426。

6.如权利要求1所述的构建方法，其特征是所述檀香烯合酶基因的核苷酸序列如SEQNO.7或SEQ NO.8所示，所述CYP450单加氧酶基因的核苷酸序列如SEQ NO.9所示。

7.权利要求1-6之一的方法构建的高产檀香油的重组酿酒酵母菌。

8.权利要求7的高产檀香油的重组酿酒酵母菌发酵生产檀香油的方法，其特征包括如下步骤：

9.如权利要求8所述的方法，其特征是所述活化平板培养基的组份包括：6.7g/L酵母无氨基酸氮源基础，1.92g/L酵母合成培养基无尿嘧啶补充物，20g/L葡萄糖，2.0％琼脂粉；所述种子培养基的组份包括：19.5g/L葡萄糖，15g/L硫酸铵，8g/L磷酸二氢钾，6.2g/L七水合硫酸镁，12mL/L维生素水溶液，10mL/L微量元素水溶液，0.05M的琥珀酸；所述发酵培养基的组份包括：19.5g/L葡萄糖，15g/L硫酸铵，8g/L磷酸二氢钾，6.2g/L七水合硫酸镁，12mL/L维生素水溶液，10mL/L微量元素水溶液；所述补料培养基的组份包括：500g/L葡萄糖，9g/L磷酸二氢钾，5.12g/L七水合硫酸镁，3.5g/L硫酸钾，0.28g/L硫酸钠，12mL/L维生素水溶液，10mL/L微量元素水溶液。

10.如权利要求8所述的方法，其特征是所述维生素水溶液的组份包括：0.05g/L生物素，1g/L泛酸钙，1g/L烟酸，25g/L肌醇，1g/L维生素B1，1g/L维生素B6，0.2g/L对氨基苯甲酸，pH 6.5；所述微量元素水溶液的组份包括：5.75g/L七水合硫酸锌，0.32g/L四水合氯化锰，0.32g/L硫酸铜，0.47g/L六水合氯化钴，0.48g/L二水合钼酸钠，2.9g/L二水合氯化钙，2.8g/L七水合硫酸亚铁，0.1g/L硼酸，0.1g/L碘化钾，40mM EDTA，pH 8.0。