CN113832044B - 一种重组解脂耶氏酵母菌、其构建方法以及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法，该重组解脂耶氏酵母菌以解脂耶氏酵母菌为出发菌株，在解脂耶氏酵母的基因组中插入密码子优化的广藿香醇合酶编码基因PS，并将解脂耶氏酵母菌中内源性角鲨烯合酶ERG9的启动子替换为铜离子抑制启动子pCTR1；本发明也公开了上述重组解脂耶氏酵母菌的一种应用，利用廉价铜离子作为诱导剂，在弱化广藿香醇竞争性途径‑角鲨烯生产的同时，实现广藿香醇的高效生产。本发明通过优化解脂耶氏酵母菌实现生物合成广藿香醇的目的，适用于构建产广藿香醇的重组解脂耶氏酵母菌，构建出的重组解脂耶氏酵母菌可用于广藿香醇的生物合成。

Description

一种重组解脂耶氏酵母菌、其构建方法以及应用
技术领域
本发明属于生物工程的技术领域，涉及重组酵母菌，具体地说，是一种重组解脂耶氏酵母菌、其构建方法以及应用。
背景技术
合成生物学的目标是通过包括模块化设计在内的工程学科，构建新型基因装置和系统，如具有独特动态行为的基因电路，以及生产生物燃料和天然生物制品的微生物细胞工厂。设计一个以复杂方式完成特定任务的生物系统，需要特征明确的生物组件，并了解它们的相互作用，以便提高设计和组装的可预测性和效率，随着合成生物学的协同和发展，代谢工程领域得到了极大的拓展。
作为一种公认(GRAS)的安全生物体，解脂耶氏酵母正在成为代谢工程及合成生物学领域中一种至关重要的新型非模式微生物底盘细胞，与大肠杆菌相比，解脂耶氏酵母具有完整的内膜系统和与植物相类似的蛋白质翻译后修饰系统，更适合植物源蛋白质的表达；除此之外，与大肠杆菌和酿酒酵母相比，解脂耶氏酵母属于典型的产油酵母，细胞内脂肪酸(Fattyacid)、脂酰辅酶A(Fattyacyl-CoA)以及乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)的积累量较高。因此，该酵母在生产植物萜类化合物(乙酰辅酶A衍生物，Acetyl-CoAderivedproducts)方面具有明显优势，发展前景广阔，并已通过基因工程用于生产一系列高价值萜类化合物，如β-胡萝卜素，α-法尼烯、香叶醇。
在大多数研究中，外源基因在解脂耶氏酵母中的表达都采用组成型强的启动子，如常用的pTEF启动子，pFBAin启动子，pTEFin启动子等。采用组成型启动子的缺点在于，其表达强度不可调控，过多的基因组成型强表达，或者过早表达，会造成宿主的代谢负担，影响细胞的生长，最终影响目标产物的总产量，而采用诱导型启动子进行外源基因的表达是实现细胞产能最大化常用的方式。目前，从解脂耶氏酵母中分离的诱导型启动子如plip1的强度极大地依赖于碳源并受到葡萄糖的抑制，限制了它们的应用范围。
最近，有研究人员从解脂耶氏酵母中分离出的铜离子激活、抑制型启动子而受到广泛关注(可参考文献Xiong X，Chen S.Expanding Toolbox for Genes Expression ofYarrowia lipolytica to Include Novel Inducible，Repressible，and HybridPromoters.ACS Synth Biol.2020Aug 21；9(8)：2208-2213.)。然而，将上述铜离子调控启动子用以诱导、抑制目的基因的表达还未见报道。
在合成生物学领域，开发出一种简单、灵敏度高的增强外源基因表达、减弱主要竞争途径产物的构建方法是该领域研究人员一直努力的方向。
发明内容
本发明的目的，旨在提供一种重组解脂耶氏酵母菌，通过优化酵母菌株实现生物合成广藿香醇的目的；
本发明的另一个目的，旨在提供上述重组解脂耶氏酵母菌的一种构建方法，以达到对该菌株简便、快速、有效、精准构建的目标；
本发明还有一个目的，旨在提供上述重组解脂耶氏酵母菌的一种应用，以实现提高广藿香醇产量，同时降低副产物角鲨烯产量的目的。
本发明为实现上述目的，所采用的技术方案如下：
一种重组解脂耶氏酵母菌，所述重组解脂耶氏酵母菌，是在解脂耶氏酵母菌基因组中插入广藿香醇合酶编码基因PS表达盒，并将解脂耶氏酵母菌中的内源性ERG9启动子pERG9替换为铜离子抑制启动子pCTR1。
作为一种限定，所述广藿香醇合酶编码基因PS是密码子优化，且所述密码子优化的广藿香醇合酶编码基因PS序列如SEQ ID NO.1所示。
作为进一步限定，所述密码子优化的广藿香醇合酶编码基因PS的表达盒，启动子为解脂耶氏酵母菌的铜离子激活启动子pMT-2，终止子为解脂耶氏酵母菌的TXPR2T终止子；
所述解脂耶氏酵母菌的铜离子激活启动子pMT-2序列如SEQ ID NO.2所示；
所述解脂耶氏酵母菌的TXPR2T终止子序列如SEQ ID NO.3所示。
作为第二种限定，所述铜离子抑制启动子pCTR1如SEQ ID NO.4所示。
作为第三种限定，所述广藿香醇合酶编码基因PS的表达盒通过质粒形式导入、整合至解脂耶氏酵母菌基因组上。
作为第四种限定，所述解脂耶氏酵母菌为Yarrowia lipolytica Po1fΔku70。
本发明还提供了上述重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，该方法包括依次进行的以下步骤：
S1.重组质粒pUC-leu-A08-pMT2-PS的构建：
重组质粒pUC-leu-A08-pMT2-PS是以pUC-leu-A08质粒为骨架，在基因组的A08位点插入pMT-2-PS-TXPR2T基因表达盒，即得所述pUC-leu-A08-pMT2-PS重组质粒；
S2.重组质粒pUC-pERG9-HUH-pCTR1的构建：
重组质粒pUC-pERG9-HUH-pCTR1是以pUC-pERG9-HUH质粒为骨架，插入了铜离子抑制启动子pCTR1，即得所述pUC-pERG9-HUH-pCTR1重组质粒；
S3.产广藿香醇的重组解脂耶氏酵母菌株的构建方法
将质粒pUC-leu-A08-pMT2-PS导入Y.lipolytica Polf-Δku70中，得到重组菌1；将质粒pUC-pERG9-HUH-pCTR1导入重组菌1，将内源性ERG9启动子替换启动子pCTR1，即所述产广藿香醇的重组解脂耶氏酵母菌株。
本发明还提供了上述重组解脂耶氏酵母菌的一种应用，所述产广藿香醇的重组解脂耶氏酵母菌通过发酵生产广藿香醇。
作为一种限定，所述产广藿香醇的重组解脂耶氏酵母菌发酵时，铜离子的浓度为70-100μmol。
作为另一种限定，所述发酵，为摇床培养，温度为28-30℃，时间为10-15h，转速为180-200rpm，发酵培养基中葡萄糖浓度为50-60g/L。
由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
①本发明使用的解脂耶氏酵母，是一种安全认证的产油酵母，可在胞内生成大量的油脂，且解脂耶氏酵母存在天然的萜类生成途径，生成的萜类化合物易溶于脂溶性环境，可以为广藿香醇的生产提供稳定的胞内环境；
②本发明构建的产广藿香醇的重组解脂耶氏酵母菌，是以敲除了ku70的解脂耶氏酵母菌株为出发菌株，将带有同源臂的基因导入该出发菌株，实现定点整合，可大幅度提高目标基因的遗传稳定性，操作简单；
③本发明构建的产广藿香醇的重组解脂耶氏酵母菌，通过引入广藿香醇合酶基因，利用解脂耶氏酵母内源萜类途径的前体物质，实现广藿香醇的异源合成；
④本发明构建的产广藿香醇的重组解脂耶氏酵母菌，使用铜离子激活启动子表达广藿香醇合酶基因，通过在培养基中添加不同浓度的铜离子，诱导并激活广藿香醇合酶基因的表达，同时细胞的生物量不受影响，具有较好的菌株稳定性，有效的提高了广藿香醇的产量；
⑤本发明构建的产广藿香醇的重组解脂耶氏酵母菌，使用铜离子抑制启动子替换角鲨烯合酶基因的内源性启动子，通过在培养基中添加不同浓度的铜离子，减弱角鲨烯合酶基因的表达，解决了在广藿香醇合酶基因高效表达时，副产物角鲨烯产量较高的问题；
⑥本发明的构建方法可以简便、快速、高效、精准地构建产广藿香醇的重组解脂耶氏酵母菌；
⑦本发明的发酵培养中，运用铜离子激活启动子pMT-2激活外源广藿香醇合酶基因，将其插入解脂耶氏酵母基因组中，可在铜离子的添加下诱导并激活广藿香醇合酶基因的高效表达。
本发明适用于构建产广藿香醇的重组解脂耶氏酵母菌，构建出的重组解脂耶氏酵母菌在提高广藿香醇生物合成量的同时，还可以减少副产物角鲨烯的产量。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
在附图中：
图1为本发明实施例2中重组质粒pUC-leu-A08-pMT2-PS的结构图，其中A08-up表示A08位点上游序列，A08-dn表示A08位点下游序列，pMT-2表示铜离子激活启动子，xpr2t表示终止子；
图2为本发明实施例4中重组质pUC-pERG9-HUH-tERG9的结构图，其中ERG9-up表示ERG9基因的启动子(ATG往上1500bp，不包含ATG)，ERG9-dn表示ERG9基因(ATG往下1500bp，包含ATG)，tERG9表示截短型ERG9启动子；
图3为本发明实施例5中重组质pUC-pERG9-HUH-pCTR1的结构图，其中ERG9-up表示ERG9基因的启动子(ATG往上1500bp，不包含ATG)，ERG9-dn表示ERG9基因(ATG往下1500bp，包含ATG)，pCTR1表示铜离子抑制启动子；
图4为本发明实施例15中广藿香醇标准品的色谱图；
图5为本发明实施例15中广藿香醇的标准曲线；
图6为本发明实施例15中角鲨烯标准品的色谱图；
图7为本发明实施例15中角鲨烯的标准曲线；
图8为本发明实施例15中使用内源性ERG9启动子与截短型ERG9启动子ptERG9后，对角鲨烯含量影响的变化图；
图9为本发明实施例16-20中不同铜离子浓度下广藿香醇产量图；
图10为本发明实施例21-25中不同铜离子浓度下广藿香醇与角鲨烯含量图。
具体实施方式
本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件；
生物材料：Yarrowia lipolytica Po1fΔku70(MatA，ura3-302，leu2-270，xpr2-322，axp2-delta，NU49，XPR2：：SUC2 MYA2613Δku70：：hisG)，为解脂耶氏酵母，原始菌株MYA2613购自于美国菌种保藏中心(ATCC)，并敲除了负责非同源重组的编码基因ku70，得到Y.lipolytica Po1fΔku70(MYA2613Δku70)。(可参考文献Gao S，Tong Y，Zhu L，etal.Iterative integration of multiple-copy pathway genes in Yarrowialipolytica for heterologousβ-carotene production[J].Metabolic Engineering，2017：192.)；
A08位点整合质粒，是将Y.lipolytica PolfΔku70基因组中染色体A上A08位点上游2521bp、下游2031bp的序列插入pUC-leu载体，得到pUC-leu-A08，该质粒可将插入的pMT-2-PS-TXPR2T基因表达盒整合到基因组的A08位点；
截短型ERG9启动子ptERG9整合质粒，是Y.lipolytica PolfΔku70基因组上ERG9基因的启动子(ATG往上1500bp，不包含ATG)、ERG9基因(ATG往下1500bp，包含ATG)的序列插入pUC-HUH载体中所得，ptERG9启动子在hi sG与ERG9-dn序列之间，两个hisG标签编码基因在ERG9位点上，下游序列之间；
铜离子抑制启动子pCTR1整合质粒，是Y.lipolytica PolfΔku70基因组上ERG9基因的启动子(ATG往上1500bp，不包含ATG)、ERG9基因(ATG往下1500bp，包含ATG)的序列插入pUC-HUH载体中所得，pCTR1启动子在hisG与ERG9-dn序列之间，两个hisG标签编码基因在ERG9位点上，下游序列之间；
下面将结合实施例作进一步详细说明。
实施例1广藿香醇合成所需基因元件的获得
①根据NCBI上提供的广藿香醇合酶编码基因PS的核苷酸序列(589912511)，经过特定的密码子优化后，委托擎科生物有限公司合成密码子优化后的广藿香醇合酶编码基因PS，并插入质粒pUC57中，得到质粒pUC57-PS，密码子优化后的PS的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
②根据NCB1上提供的Y.lipolytica中的3(B)-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因leu的核苷酸序列(M37309.1)，委托擎科生物科技有限公司合成leu，将3(B)-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因leu及Y.lipo/ytica PolfΔku70基因组中染色体A上A08位点上游2521bp、下游2031bp的序列插入pUC载体中，得到pUC-leu-A08；
③根据NCBI上提供的Y.lipolytica中的乳清酸核普-5′-磷酸脱浚酶编码基因ura的核苷酸序列(genebank登录号AJ306421.1)和hisG标签(genebank登录号AF324729.1)，委托擎科生物科技有限公司合成，将两个hisG标签编码基因序列插入质粒pUC中，具体使用pUC57作为骨架，使用ECORI和HindIII酶切后回收骨架，将hisG标签编码基因采用ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，构建得到质粒pUC-hisG-hisG，再以此为骨架，采用HindIII酶切后回收骨架，将ura编码基因采用ClonExpressMultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，构建得到两个hisG标签编码基因序列中，使得在两个hisG标签编码基因序列中插入乳清酸核-5′-磷酸脱羚酶编码基因，以便实现ura标记回收，得到质粒pUC-HUH；
④以Y.lipolytica Polf-Δku70基因组DNA为模板，以pMT-2-F(SEQ ID NO.6)和pMT-2-R(SEQ ID NO.7)为引物扩增铜离子激活启动子pMT-2，pMT-2的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；
⑤以Y.lipo/ytica Polf-Δku70基因组DNA为模板，以pCTR1-F(SEQ ID NO.18)和pCTR1-R(SEQ ID NO.19)为引物扩增铜离子抑制启动子pCTR1，pCTR1的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；
⑥以Y.lipolytica Polf-Δku70基因组DNA为模板，以tERG9-F(SEQ ID NO.16)和tERG9-R(SEQ ID NO.17)为引物扩增截短型角鲨烯合酶基因启动子ptERG9，ptERG9的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
⑦终止子TXPR2T核酸序列如SEQ IDNO.3所示。
实施例2重组质粒pUC-leu-A08-pMT2-PS的构建
本实施例提供一种重组质粒pUC-leu-A08-pMT2-PS的构建方法，该方法包括依次进行的以下步骤：
S1.将pMT-2-PS-TXPR2T表达盒(PS基因)，构建在pUC-Ieu-A08载体质粒的A08位点的上下同源臂之间，然后将这个质粒线性化之后，转入到解脂耶氏酵母感受态中，由于质粒上带有A08的同源臂，所以构建的pMT-2-PS-TXPR2T表达盒会定点整合到解脂耶氏酵母基因组中的A08位点，其中，表达PS基因的启动子为铜离子激活启动子pMT-2，结构如图1所示；
S2.以MT2-PS-F(SEQ ID NO.6)和MT2-PS-R(SEQ ID NO.7)为引物，以Y.lipolytica Polf-Δku70基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增PS表达盒启动子pMT2-PS；以xpr2t-PS-F(SEQ ID NO.8)和xpr2t-PS-R(SEQ ID N.9)为引物，以Y.lipolyticaPolf-Δku70基因组DNA为模板，进行PGR扩增，扩增PS表达盒终止子TXPR2T-PS；以PS-F(SEQID NO.10)和PS-R(SEQ ID NO.11)为引物，以质粒pUC57-PS为模板，进行PCR扩增，扩增两端分别带有启动子pMT2-PS和终止子TXPR2T-PS同源臂的PS基因表达盒；
其中，PCR扩增中所用PCR酶为TAKARA的PrimeSTAR MaxDNA聚合酶；PCR扩增体系如下表1：
表1 PGR扩增体系
试剂 使用量 终浓度
PrimeSTAR Max(2×) 25μl 1×
Primer 1 10-15pmol 0.2-0.3μmol
Primer 2 10-15pmol 0.2-0.3μ mol
Template <200ng
灭菌蒸馏水 Up to 50μl
其中PCR扩增的过程为：在98℃条件下变性处理10s，在55℃条件下退火10s后，在72℃条件下进行延伸，重复35个循环后，用AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit(购自康宁生命科学(吴江)有限公司)纯化回收各片段，
其中，延伸时间＝目标片段长度/1kb，单位min；
S3.将S1中制备的A08位点整合质粒用NEB公司的限制性内切酶SnaB1酶切后，用琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化A08位点整合质粒，将线性化A08位点整合质粒和S2中构建的PS基因表达盒(包括铜离子激活启动子pMT2-PS、终止子TXPR2T-PS、带有启动子pMT2-PS和终止子TXPR2T-PS同源臂的PS基因)，利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiSOne Step Cloning Kit实现一步克隆，反应体系如表2所示，将反应体系在50℃条件下孵育15min后，得到环状的重组载体，在A08位点的上下同源臂之间成功插入了PS基因表达盒和3(B)-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因表达盒(筛选标记)；
表2一步克隆体系
组分 重组反应
线性化载体 X μl
N个插入片段 Y<sub>1</sub>+Y<sub>2</sub>+…Y<sub>n</sub>μl
2×ClonExpress Mix 5μl
ddH<sub>2</sub>O To 10μl
将环状的重组载体，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，通过氨苄抗性的平板筛选并通过菌落PGR及测序验证，得到阳性重组质粒pUC-leu-A08-pMT2-PS。
实施例3重组质粒pUC-pERG9-HUH的构建
本实施例提供一种重组质粒pUC-pERG9-HUH的构建方法，该方法包括依次进行的以下步骤：
S1.重组质粒pUC-pERG9-HUH是以pUC-HUH为骨架，插入Y.lipo/ytica Polf-Δku70中的ERG9基因的上下游同源臂，上同源臂ERG9-up为ERG9基因的启动子(ATG往上1500bp，不包含ATG)，下同源臂ERG9-dn为ERG9基因(ATG往下1500bp，包含ATG)；在ERG9-dn和hisG之间插入截短型角鲨烯合酶启动子ptERG9，乳清酸核-5’-磷酸脱酶编码基因表达盒也在上下游同源臂之间；
S2.以Y.lipolytica Polf-Δku70基因组DNA为模板，以pERG9-F1(SEQ ID NO.12)和pERG9-R1(SEQ ID NO.13)为引物、以pERG9-F2(SEQ ID NO.14)和pERG9-R2(SEQ IDNO.15)为引物扩增ERG9基因的上下游同源臂；
S3.将S1中制备的pUC-HUH质粒用NEB公司的限制性内切酶Pacl酶切后，用琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化pUC-HUH质粒，将线性化pUC-HUH质粒和S2中扩增的ERG9上下同源臂基因利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pUC-pERG9-HUH，具体步骤同重组质粒pUC-leu-A08-pMT2-PS的构建步骤。
实施例4重组质粒pUC-pERG9-HUH-tERG9的构建
本实施例提供一种重组质粒pUC-pERG9-HUH-tERG9的构建方法，该方法包括依次进行的以下步骤：
S1.重组质粒pUC-pERG9-HUH-tERG9是以pUC-pERG9-HUH为骨架，在ERG9-dn和hisG之间插入了100bp的ERG9启动子ptERG9，乳清酸核-5’-磷酸脱酶编码基因表达盒也在上下游同源臂之间，具体结构如图2所示；
S2.以Y.lipolytica Polf-Δku70基因组DNA为模板，以tERG9-F(SEQ ID NO.16)和tERG9-R(SEQ ID NO.17)为引物，扩增截短型角鲨烯合酶基因启动子ptERG9；
S3.将S1中制备的pUC-pERG9-HUH质粒用NEB公司的限制性内切酶Pacl酶切后，用琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化pUC-pERG9-HUH质粒，将线性化pUC-pERG9-HUH质粒和扩增的ptERG9启动子基因利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One StepCloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pUC-pERG9-HUH-tERG9，具体步骤同重组质粒pUC-leu-A08-pMT2-PS的构建步骤。
实施例5重组质粒pUC-pERG9-HUH-pCTR1的构建
本实施例提供一种重组质粒pUC-pERG9-HUH-pCTR1的构建方法，该方法包括依次进行的以下步骤：
S1.重组质粒pUC-pERG9-HUH-pCTR1是以pUC-pERG9-HUH为骨架，在ERG9-dn和hisG之间插入了铜离子抑制启动子pCTR1，乳清酸核-5’-磷酸脱酶编码基因表达盒也在上下游同源臂之间，具体结构如图3所示；
S2.以Y.lipolytica Polf-Δku70基因组DNA为模板，以pCTR1-F(SEQ ID NO.18)和pCTR1-R(SEQ ID NO.19)为引物扩增铜离子抑制启动子pCTR1；
S3.将S1中制备的pUC-pERG9-HUH质粒用NEB公司的限制性内切酶Pacl酶切后，用琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化pUC-pERG9-HUH质粒，将线性化pUC-pERG9-HUH质粒和S2中扩增的ptERG9启动子基因利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS OneStep Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pUC-pERG9-HUH-pCTR1，具体步骤同重组质粒pUC-leu-A08-pMT2-PS的构建步骤。
实施例6实施例2-5中构建的重组质粒和引物
实施例2-5中构建的重组质粒如表3所示，使用的引物序列如表4所示。
表3实施例2-5中构建的重组质粒中插入的序列
质粒名称 插入序列
pUC-leu-A08-pMT2-PS PS表达盒(pMT-2-PS-T<sub>xpr2t</sub>)
pUC-pERC9-HUH ERG9上下同源臂基因
pUC-pERG9-HUH-tERG9 tERG9基因
pUC-pERG9-HUH-pCTR1 pCTR1基因
表4实施例2-5中引物序列
Figure BDA0003263348640000111
Figure BDA0003263348640000121
实施例7一种重组解脂耶氏酵母的构建方法
本实施例提供一种重组解脂耶氏酵母的构建方法，该方法包括依次进行的以下步骤：
S1.重组菌1的构建
将含有PS基因表达盒的质粒pUC-leu-A08-pMT2-PS导入Yarrowia lipolyticaPolf-Δku70中，PS表达盒整合到基因组A08位点处，得到重组菌1，具体方法如下：
S11.将Y.lipolytica Polf-Δku70于YPD液体培养基(含有2％蛋白胨、1％酵母提取物和2％葡萄糖)中培养12h，至OD600为0.8；
812.利用Zymo Research Corporation的Zymogen Frozen EZ YeastTransformation Kit II将pUC-leu-A08-pMT2-PS转化Y.lipolytica Polf-Δku70，进行同源重组，制备感受态细胞(试剂盒：Zymogen Frozen EZ Yeast Transformation Kit II，厂家：Zymo Research Corporation)；
S13.采用筛选培养基SD-Leu筛选，将PCR鉴定正确的阳性克隆，命名为重组菌1；
其中，筛选培养基SD-Leu含有：葡萄糖20g/L，Yeast Nitrogen Base(YNB，无氨基酵母氮源)6.7g/L，CSM-Leu 0.67g/L，琼脂粉23g/L；
S2.目标菌株的构建
将重组质粒pUC-pERG9-HUH-pCTR1导入重组菌1，铜离子抑制启动子pCTR1会整合至基因组ERG9位点，利用同源重组的方法对其内源性ERG9启动子进行替换得到重组菌3，具体方法如下：
S21.将重组菌1于YPD液体培养基(含有2％蛋白胨，1％酵母提取物，2％葡萄糖)中培养11h，至OD600为0.9；
S22.利用Zymo Research Corporation的Zymogen Frozen EZ YeastTransformation Kit II将重组质粒pUC-pERG9-HUH-pCTR1转化入重组菌1中，进行同源重组制备感受态细胞；
S23.采用筛选培养基SD-Leu-Ura筛选，得PCR鉴定正确的阳性克隆，命名为重组菌3，即为所述重组解脂耶氏酵母菌株；
其中，筛选培养基SD-Leu-Ura的成分为：葡萄糖20g/L，YNB 6.7g/L，CSM-Leu-Ura0.67g/L，琼脂粉23g/L。
实施例8-12重组解脂耶氏酵母的构建方法
实施例8-12分别为一种产广藿香醇的重组解脂耶氏酵母的构建方法，它们的步骤与实施例1基本相同，不同之处仅在于相关参数的不同，具体详见表5：
表5
Figure BDA0003263348640000131
实施例13预期减弱角鲨烯生成的重组解脂耶氏酵母菌的构建
本实施例提供一种预期减弱角鲨烯生成的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，该方法包括依次进行的以下步骤：
S1.重组菌1的构建
将含有PS基因表达盒的质粒pUC-leu-A08-pMT2-PS导入Yarrowia lipolyticaPolf-Δku70中，PS表达盒整合到基因组A08位点处，得到重组菌1，具体方法如下：
S11.将Y.lipolytica Polf-Δku70于YPD液体培养基(含有2％蛋白胨、1％酵母提取物和2％葡萄糖)中培养12h，至OD600为1.0；
S12.利用Zymo Research Corporation的Zymogen Frozen EZ YeastTransformation Kit II将pUC-leu-A08-pMT2-PS转化Y.lipolytica Polf-Δku70，进行同源重组，制备感受态细胞(试剂盒：Zymogen Frozen EZ Yeast Transformation Kit II，厂家：Zymo Research Corporation)；
S13.采用筛选培养基SD-Leu筛选，将PCR鉴定正确的阳性克隆，命名为重组菌1；
其中，筛选培养基SD-Leu含有：葡萄糖20g/L，Yeast Nitrogen Base(YNB，无氨基酵母氮源)6.7g/L，CSM-Leu 0.67g/L，琼脂粉23g/L；
S2.预期减弱角鲨烯生成的重组解脂耶氏酵母菌的构建
将重组质粒pUC-pERG9-HUH-tERG9导入重组菌1，截短型角鲨烯合酶启动子ptERG9会整合至基因组ERG9位点，利用同源重组的方法对其内源性ERG9启动子进行替换得到重组菌2，具体方法如下：
S21.将重组菌1于YPD液体培养基(含有2％蛋白胨，1％酵母提取物，2％葡萄糖)中培养12h，至OD600为1.0；
S22.利用Zymo Research Corporation的Zymogen Frozen EZ YeastTransformati on Kit II将重组质粒pUC-pERG9-HUH-tERG9转化入重组菌1中，进行同源重组，制备感受态细胞；
S23.采用筛选培养基SD-Leu-Ura筛选，将PCR鉴定正确的阳性克隆，命名为重组菌2，即为所述预期减弱角鲨烯生成的重组解脂耶氏酵母菌；
其中筛选培养基SD-Leu-Ura的成分为：葡萄糖20g/L，YNB 6.7g/L，CSM-Leu-Ura0.67g/L，琼脂粉23g/L。
实施例14重组菌1、2和3在生产广藿香醇中的应用
本实施例提供一种重组菌生产广藿香醇的方法，该方法包括依次进行的以下步骤：
S1.活化重组菌
在YPD液体培养基中，于30℃、220rpm条件下分别培养重组菌1、重组菌2和重组菌3，得到重组菌1种子液、重组菌2种子液和重组菌3种子液；
S2.重组菌发酵
分别将重组菌1种子液、重组菌2种子液和重组菌3种子液，以1％体积比的接种量接种于三个50ml发酵培养基中，标记为培养基I-III，其中，发酵培养基中葡萄糖的浓度为60g/L；
将培养基I-III在30℃、220rpm震荡培养24h后，加入发酵液体积25％的正十二烷，同时加入CuSO4，使培养基I中铜离子的浓度为120μmol，培养基II中铜离子的浓度为120μmol，培养基III中铜离子的浓度为90μmol，继续震荡培养72h。
实施例15重组菌1，2和3发酵培养产物分析
将培养基I-III转移至50ml离心管，5000rpm离心15min，收集上层有机相，得重组菌发酵液I-III；
S1.广藿香醇的定性定量分析
将重组菌发酵液I-III过0.22μmol的有机尼龙滤膜后，用GC-MS检测；
检测条件：进样口温度250℃，进样体积1ul，分流比为20：1；
色谱柱：HP-5ms(30m*0.25mM)；
色谱条件：初始温度为60℃，按照10℃/min的速度上升到150℃，然后20℃/min上升到280℃，保持2min；
用广藿香醇的标准品进行定性定量，结果如图4所示；由图4可知：
选用不同浓度的广藿香醇标准品进行气质检测，广藿香醇标准品在13.04分出峰，且不同浓度的广藿香醇出峰面积如表6所示
表6
广藿香醇浓度(mg/L) 10 30 50 100 200 400
峰面积 325735 922318 1537718 3036934 5861880 11261813
标准曲线如图5所示，将重组菌I-III处理后的发酵液进行气质检测，将出峰面积代入标准曲线，得到相应的产量如表7所示
表7
Figure BDA0003263348640000161
由上表可知，广藿香醇的产量随着铜离子浓度的增加而增加，
S2.角鲨烯的定性定量分析
分别从重组菌发酵液I-III中收集4个OD单位的液体酵母细胞，于13200rpm条件下离心5min，将细胞成球后完全抽出水分，用500μL浓度为0.5M甲醇钠(溶于纯甲醇的氢氧化钠)重悬细胞球；细胞球与重悬液混合物在1200rpm的室温下摇晃2小时，以使脂质完全皂化并加入400μL己烷提取角鲨烯，在室温下旋转10min，将正己烷相直接注入气相色谱fid(GC-FID)分析各重组酵母细胞中角鲨烯；
检测条件：进样口温度250℃，进样体积1ul，分流比为20∶1；
色谱柱：HP-5(30m×320μm×0.25μm)；
色谱条件：175℃升温3min，20℃/min升温至200℃保温3min，20℃/min升温至260℃保温4min；
用角鲨烯的标准品进行定性定量，结果如图6所示；
由图6可知，选用不同浓度的角鲨烯标准品进行气相检测，角鲨烯标准品在22.32分出峰；不同浓度的角鲨烯出峰面积如表8所示
表8
角鲨烯浓度(g/L) 0.02 0.06 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8
峰面积 466451 1545002 2757130 5488973 11979555 17786721 23524991
标准曲线如图7所示，将重组菌I-III处理后的发酵液进行气相检测，将出峰面积代入标准曲线得到角鲨烯相应的产量如表9所示：
表9
Figure BDA0003263348640000171
由表9可知，重组株III中角鲨烯的含量变化受铜离子影响较明显，由图8可知，当培养基I和培养基II中CuSO4的添加量均为120μmol，且其他培养条件相同时，与重组菌株I相比，培养基II中产角鲨烯含量并未有所下降；
S3.DCW(细胞干重)的测定
将培养基I-III转移至50ml离心管，5000rpm离心15min，取下层湿菌体部分，重组菌菌体I-III；
将重组菌菌体I-III置于-80℃冷冻4h后，转移至真空冷冻干燥机干燥12h，得重组菌菌体I-III干菌体，后用分析天平称重，结果如表10所示：
表10
Figure BDA0003263348640000181
由表10可知，重组菌3中铜离子浓度较大使，角鲨烯的抑制效果增强，影响了细胞的正常生长，导致细胞干重降低。
实施例16-20重组菌1在生产广藿香醇中的应用
实施例16-20分别为重组菌1在生产广藿香醇中的一种应用方法，它们的步骤与实施例14基本相同，不同之处仅在于培养基I中铜离子浓度不同，具体详见表11：
表11
Figure BDA0003263348640000182
通过实施例15中的检测方法，对实施例16-20中广藿香醇和角鲨烯进行定性定量分析，结果如图9所示；
由图9可知，当CuSO4的添加为120μmol时，广藿香醇的表达量最高、角鲨烯含量也较高。
实施例21-25重组菌3在生产广藿香醇中的应用
实施例21-25分别为重组菌3在生产广藿香醇中的一种应用方法，它们的步骤与实施例14基本相同，不同之处仅在于培养基III中铜离子浓度不同，具体详见表12：
表12
Figure BDA0003263348640000191
通过实施例15中的检测方法，对实施例21-25中广藿香醇和角鲨烯进行定性定量分析，结果如图10所示；
由图10可知，与重组菌株2相比，当CuSO4的添加为90μmol时，重组菌3中广藿香醇的表达量最高、角鲨烯含量显著降低。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京师范大学
<120> 一种重组解脂耶氏酵母菌、其构建方法以及应用
<130> 20210913
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1659
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母菌（ Yarrowia lipolytica ）
<400> SEQ ID NO.1
atggagctgt atgctcaaag cgttggcgtt ggtgccgcat cgcgccctct agccaacttc 60
cacccgtgtg tatggggaga caagttcatc gtctacaacc cccaaagctg tcaggccgga 120
gagcgtgaag aagccgagga gctgaaggtg gagcttaagc gggagctcaa ggaggctagt 180
gacaactaca tgcggcaact aaagatggtg gatgctatcc agcgactcgg aattgactac 240
ttgtttgtgg aggatgtgga cgaggctctg aaaaacctct ttgagatgtt cgatgctttc 300
tgcaagaaca accacgacat gcacgctaca gccttgtcct tccgactgct acgacagcac 360
ggttaccgag tctcttgcga ggtttttgag aagtttaagg acggaaagga tggattcaag 420
gttcccaatg aagacggcgc tgtggctgtg ctggaattct ttgaggcaac tcatctccgt 480
gtacatggcg aagacgtgct cgataatgct tttgacttca ctagaaatta cctcgagtcg 540
gtgtacgcca cgctgaatga ccccacggcc aagcaggtcc acaacgccct caacgagttc 600
tcctttcgta gaggcttgcc acgggtcgag gcgcgaaagt acattagcat ctacgagcag 660
tacgcctcgc atcacaaggg tctattgaag cttgctaaac tggatttcaa cctggtgcag 720
gctctgcacc gccgggagct gtctgaagac agtagatggt ggaagacttt gcaggtgcct 780
accaagttgt cgtttgtgcg agatcgactc gttgaatcct acttctgggc ctctggctca 840
tactttgagc ccaactactc tgtggcacgg atgattctcg ccaagggcct ggccgttctg 900
tctctcatgg acgatgtcta cgatgcatat ggaaccttcg aggaattgca aatgtttacc 960
gatgccattg agcgatggga cgcctcctgt ctggacaagc ttcctgacta catgaagatt 1020
gtttacaaag cgttgctgga cgtgtttgag gaggtcgatg aggagctgat caagctggga 1080
gcgccttatc gagcgtacta cggaaaagag gcaatgaagt atgcagctcg agcatatatg 1140
gaggaggccc agtggagaga acagaagcac aagcccacca ctaaggagta catgaaactc 1200
gctacaaaga cctgcgggta catcactctc atcatccttt cttgtctggg tgtagaagaa 1260
ggtatcgtga ccaaggaagc cttcgactgg gtcttctctc ggcctccctt cattgaagcg 1320
acacttatca ttgctagact cgtcaacgac ataaccggcc acgagtttga aaagaagcga 1380
gaacatgtgc gtactgctgt cgagtgctac atggaagagc acaaagtcgg taagcaggag 1440
gtggtttccg agttttacaa ccagatggag tcagcctgga aagatatcaa cgaagggttc 1500
ctgcgccctg ttgagttccc catccccctg ctgtatctta ttctgaactc cgtgcgaacg 1560
cttgaggtca tttataagga gggcgactcc tacacccatg tcggccctgc catgcagaac 1620
attattaaac agctctacct tcatccggtc ccatactga 1659
<210> 2
<211> 942
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母菌（Yarrowia lipolytica）
<400> SEQ ID NO.2
tatgtgcgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 60
tgtgtgtgtg agtgtgtgac aaccgaattg cggatctcgt ctcctattta tatctgctgc 120
tgctgttgcg aagagcacat attgcaatct ggtaattttt cactttttta ctaattattt 180
cagccgcagc gataatctcg catctcgcat acaagcgaaa ccttagcagc ataaacccct 240
cgaatgctcc agtgatgcgc cgtaaaatac cactgaaacg gggctaaatt cggccaaacg 300
gcattaataa tgaaatatct cacaataata gcccctccta gtgtttcgga gtccgaatgt 360
ctagcatcat gtggacttgt gcgttttcgg agtcctattg gaatatacac ttcggaactt 420
tgacgagaga tctacaatat gtacgatgca cctgacacag acgttggaag aatggagaag 480
gatagagact tgagtggcac gcttataatg acatgagttc gagtcgagtg tcaaagtagg 540
tgaatcgaat ccacatagtc caggttgagt tgcttctcgt acacccttgt acaattacta 600
tccttcacac ctttacacat ttccattctc tttcagaccc ttctagcaag ttctacaaag 660
acattgttta ctttagcgcc acctaaatct tagtcaatca ttggagatat gagaggtttg 720
tgccacggct gtgtcttttt tctttgtcta accgcattct ttgcgacatt agtgctactg 780
ccgatgcaga tgcgtgcttt gcgctgcggc tgaatacaac tgtatcttga agatctagga 840
acgggaaaat ctataaatac ggccagatgt ccctcctttt ctcactgcac agacatcttt 900
tcattcacca ctctcaacac tacttccaaa ctcactatct ca 942
<210> 3
<211> 516
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母菌（Yarrowia lipolytica）
<400> SEQ ID NO.3
gatccaacta cggaacttgt gttgatgtct ttgcccccgg ctccgatatc atctctgcct 60
cttaccagtc cgactctggt actttggtct actccggtac ctccatggcc tgtccccacg 120
ttgccggtct tgcctcctac tacctgtcca tcaatgacga ggttctcacc cctgcccagg 180
tcgaggctct tattactgag tccaacaccg gtgttcttcc caccaccaac ctcaagggct 240
ctcccaacgc tgttgcctac aacggtgttg gcatttaggc aattaacaga tagtttgccg 300
gtgataattc tcttaacctc ccacactcct ttgacataac gatttatgta acgaaactga 360
aatttgacca gatattgttg taaatagaaa atctggcttg taggtggcaa aatcccgtct 420
ttgttcatca attccctctg tgactactcg tcatcccttt atgttcgact gtcgtatttt 480
tattttccat acatacgcaa gtgagatgcc cgtgtc 516
<210> 4
<211> 791
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母菌（Yarrowia lipolytica）
<400> SEQ ID NO.4
gatcagaact aagctaacac tacagtagaa acagaagaga agccacgaga ggagaaaagg 60
tcacgtgatc cacgagataa caccctccct gatatgttac gtcacgtggc acattctatc 120
ccttctgtgc aatgtcacgt gcctgacctt tctcttcgac cgagagtcct acttttactt 180
gcagctttct cgccgcaccc tctaaatttg ctcgtcggtg catttacgat gtacagttgc 240
gaatctcggg tgattttttg ctcacatttt ggcggtagag cacttctttc cggtgcgaaa 300
tccgtcaaaa tgcaagttcg gggtatttgc gactatggtg atagttttgg aagtgtttct 360
gagtcaatta ctttgggatt ctccttctca ttcccttttg tatatggtat tctatggcat 420
gtatcatggc ttggagttgt ctgaaactca aaatacacct tgataaaatc tgattatctt 480
taacctaaaa gaggtagatc ggaagagtac gaagatagtt ttccggaaca gctacggaaa 540
acggtttgtg aatattaagg gaagttgggg accatggttt tcgtgtcaca tgatctacaa 600
gttgtgtccc ctgtgtgtgt tttgtgtcct gcagtttctg taacgcagtt gtatgtacag 660
tatgtacagt accaggacat actcctaacg ggcctcctct tgcacctgca cctggacgag 720
caaatttcga gcagatatcg agttaccatg caaagatcgg cgtatatata gacaggagct 780
tgggcctatg t 791
<210> 5
<211> 100
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母菌（Yarrowia lipolytica）
<400> SEQ ID NO.5
cgaccctcct cgaattgttc tgaagttttt atttggcgtt tagagttcag ggacacaaac 60
tcgcttgttc accaacttcg aaccaccact ttcagccacc 100

Claims (6)

1.一种重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于，所述重组解脂耶氏酵母菌，是在解脂耶氏酵母菌基因组中插入广藿香醇合酶编码基因PS表达盒，并将解脂耶氏酵母菌中的内源性ERG9启动子pERG9替换为铜离子抑制启动子pCTR1；
所述广藿香醇合酶编码基因PS是密码子优化的，且所述密码子优化的广藿香醇合酶编码基因PS序列如SEQ ID NO.1所示；
所述密码子优化的广藿香醇合酶编码基因PS的表达盒，启动子为解脂耶氏酵母菌的铜离子激活启动子pMT-2，终止子为解脂耶氏酵母菌的TXPR2T终止子；
所述解脂耶氏酵母菌的铜离子激活启动子pMT-2序列如SEQ ID NO.2所示；
所述解脂耶氏酵母菌的TXPR2T终止子序列如SEQ ID NO.3所示；
所述铜离子抑制启动子pCTR1序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于，所述广藿香醇合酶编码基因PS的表达盒通过质粒形式导入、整合至解脂耶氏酵母菌基因组上。
3.根据权利要求1或2所述的重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于，所述解脂耶氏酵母菌为Yarrowia lipolytica Po1fΔku70。
4.权利要求 1-3中任一项所述的重组解脂耶氏酵母菌的应用，其特征在于，所述重组解脂耶氏酵母菌通过发酵生产广藿香醇。
5.根据权利要求4所述的重组解脂耶氏酵母菌的应用，其特征在于，所述重组解脂耶氏酵母菌发酵时，铜离子的浓度为70-100μmol/L。
6.根据权利要求4或5所述的重组解脂耶氏酵母菌的应用，其特征在于，所述发酵，为摇床培养，温度为28-30℃，时间为10-15h，转速为180-200rpm，发酵培养基中葡萄糖浓度为50-60g/L。
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